CN109601254B - 一种培养产物与基质完全分离的牛樟芝培养方法 - Google Patents

一种培养产物与基质完全分离的牛樟芝培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种培养产物与基质完全分离的牛樟芝培养方法，其选用谷物与牛樟树木屑混合作为培养基质，将不同谷物混匀后置于下层，少量牛樟树木屑铺于其上，接种时在培养基中间打一个圆柱体槽，将菌种块接入其中。培养完成后，培养基质表面形成了一层致密且有一定厚度的菌丝层，该菌丝层可轻易剥离，同时在圆柱体槽内形成一个类似于菌柄的菌丝体，将其上半部分取样，剩余菌丝体还可继续生长。利用此法，本发明不仅解决了固体培养法培养产物较难与基质完全分离的问题，还可除去培养产物中混有的木屑并提升其产量及三萜类成分含量，为牛樟芝固态发酵培养方面的实践提供了参考帮助，同时也为后续大规模发酵培养提供了基础，其成本低廉、操作简易。

Description

一种培养产物与基质完全分离的牛樟芝培养方法
技术领域
本发明涉及一种牛樟芝的培育方法，特指一种培养产物与基质完全分离的牛樟芝培养方法。
背景技术
牛樟芝 (Antrodia camphorata)属于多孔菌科、薄孔菌属，是中国台湾特有的一种珍稀药用真菌。2016年6月广东省人民政府办公厅印发了《广东省推动中药材保护和发展实施方案(2016－2020) 的通知》［粤府办(2016)61］，将牛樟芝列为加强中药材资源保护、建设濒危稀缺中药材种植养殖基地、开展20种重点保护和发展的特色中药资源评价及繁育技术研究的品种之一。牛樟芝的菌丝体及子实体均含有丰富的生理活性物质，包括三萜类化合物、多糖、马来酸和琥珀酸衍生物等。现代学者研究发现，牛樟芝不仅对化学性引起的肝损伤具有保护作用，同时还具有抗癌、抗氧化、抗炎及免疫调节等作用。
牛樟芝功效显著，市场需求量剧增，野生牛樟芝生长缓慢，产量极低，且牛樟芝的唯一宿主牛樟树为国家保育类树种，故现多采用人工培育的方式培养牛樟芝。人工培养的方法主要有椴木培养法、固体培养法、液体培养法。椴木培养法生长周期长，质量较难控制，但可培养得到与野生牛樟芝成分相近的牛樟芝子实体；液体培养法培养周期短，产量高，但培养产物有效成分含量较低，无法培养得到牛樟芝子实体；固体培养法生长周期适中，质量可控，培养达到一定时间时可得到与野生牛樟芝成分相近的牛樟芝子实体，但培养产物往往较难与基质分离。
发明内容
本发明的目的在于针对已有的技术现状，提供一种低成本、工艺简单、产质量佳，且可使培养产物与基质完全分离的牛樟芝培养方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明为一种培养产物与基质完全分离的牛樟芝培养方法，主要包括以下步骤：
（1）活化接种原料：取4℃保存的牛樟芝菌种于PDA平板培养基上活化培养15-30d后在靠近菌丝层边缘处打孔，打孔器直径为0.8cm，得到菌丝块用于接种；
（2）制备固态发酵培养基：称取一定量的谷物原料及牛樟树木屑放于培养瓶中，谷物原料混匀后置于培养瓶下层，牛樟树木屑平铺于其上；另将葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O溶于一定量的蒸馏水形成含有葡萄糖与无机盐的溶液，随后将该溶液倒入培养瓶中浸泡固体物料，使培养基的最终含水量为50%-70%，浸泡时间为2h，然后放入高压灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，时间为30min；
（3）打孔接种：用玻璃棒在固体培养基中心位置打一个2cm左右深的圆柱形槽，将原料菌丝块含有菌丝的一面贴着培养基质接种在圆柱形槽孔内，并置于恒温培养箱中28℃暗培养；
（4）无菌超净台取样：培养一定时间后，在基质表面形成厚度为3-5cm左右可轻松剥离的致密菌丝层，在无菌超净台中取样，培养基中剩余的菌丝体还可继续生长。
上述方案中，牛樟树木屑的处理方法为置于室外暴晒后用高压灭菌锅灭菌，灭菌温度为121℃，时间为2h，灭菌后将其放入烘箱中80℃烘干。
进一步的，谷物原料为大米50g、麸皮2.5g，将干料混匀后装入培养瓶中，培养瓶体积为450mL。
进一步的，牛樟树木屑是将牛樟树木材粉碎成0.5cm左右的片状木屑，称取烘干的牛樟树木屑0.5-7g平铺于谷物基质表面。
进一步的，含有葡萄糖与无机盐的溶液中，葡萄糖为5g，KH2PO4为0.5g，MgSO4·7H2O为 0.5g。
本发明的有益效果为：选用谷物与牛樟树木屑混合作为培养基质，该配方既为牛樟芝生长提供了必要的营养物质，又加入其在野外生长时必需的牛樟树木屑，使培养基成分更全面。之后选定培养基含水量为70%，随着培养基含水量的升高，牛樟芝菌丝体的生长逐渐趋于在基质表面积累，其菌丝不再长入培养基中，为使菌丝体充分利用培养基中的营养，接种时在培养基中间处打孔形成一个圆柱形槽，将菌种块接入其中。培养完成后，培养基质表面形成一层致密且有一定厚度的菌丝层，该菌丝层可轻易从基质剥离，同时在圆柱形槽内菌丝结合形成一个类似于菌柄的菌丝体，将其上半部分取样，剩余菌丝体还可继续在基质中生长。该方法可在基质表面收获大量的培养产物，并且培养产物在取样后冷冻干燥，得到的菌饼中混有少量木屑，可轻易除去。
附图说明：
附图1为不同含水量基础培养基上牛樟芝生长情况（50d），从左到右含水量依次为50%、60%、70%；
附图2为添加不同牛樟树木屑培养基上牛樟芝生长情况(60d)，1-5的牛樟树木屑添加量分别为0.5g/瓶、1g/瓶、3g/瓶、5g/瓶、7g/瓶；
附图3为在培养瓶中生长的牛樟芝，左边为谷物培养基，右边为谷物加木屑培养基；
附图4为冷冻干燥后得到的牛樟芝菌饼。
具体实施方式：
实施例1：
一种培养产物与基质完全分离的牛樟芝培养方法，主要包括以下步骤：
（1）活化接种原料：取4℃保存的牛樟芝菌种于PDA平板培养基活化培养15d后在打孔器中心距离菌丝层外边缘0.4cm处打孔，得到菌丝块用于接种；
（2）制备固态发酵培养基：称取一定量的谷物原料及牛樟树木屑放于培养瓶中，谷物原料为大米50g、麸皮2.5g，将干料混匀后装入培养瓶中，培养瓶体积为450mL，谷物原料混匀后置于培养瓶下层，牛樟树木屑平铺于其上；另将葡萄糖5g,KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g溶于一定量的蒸馏水形成含有葡萄糖与无机盐的溶液，随后将该溶液倒入培养瓶中浸泡固体物料，使培养基的最终含水量为60%，浸泡时间为2h，然后放入高压灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，时间为30min；
牛樟树木屑的处理方法为置于室外暴晒后用高压灭菌锅灭菌，灭菌温度为121℃，时间为2h，灭菌后将其放入烘箱中80℃烘干。牛樟树木屑是将牛樟树木材粉碎成0.5cm左右的片状木屑，称取烘干的牛樟树木屑3g平铺于谷物基质表面。
（3）打孔接种：用玻璃棒在固体培养基中心位置打一个2cm左右深的圆柱形槽，将原料菌丝块含有菌丝的一面贴着培养基质接种在圆柱形槽孔内并置于恒温培养箱中28℃暗培养；
（4）无菌超净台取样：培养一定时间后，在基质表面形成厚度为3-5cm左右可轻松剥离的致密菌丝层，在无菌超净台中取样，培养基中剩余的菌丝体还可继续生长。
实施例2：
一种培养产物与基质完全分离的牛樟芝培养方法，主要包括以下步骤：
（1）活化接种原料：取4℃保存的牛樟芝菌种于PDA平板培养基上活化培养20d后在打孔器中心距离菌丝层外边缘0.4cm处打孔，得到菌丝块用于接种；
（2）制备固态发酵培养基：称取一定量的谷物原料及牛樟树木屑放于培养瓶中，谷物原料为大米50g、麸皮2.5g，将干料混匀后装入培养瓶中，培养瓶体积为450mL，谷物原料混匀后置于培养瓶下层，牛樟树木屑平铺于其上；另将葡萄糖5g,KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g溶于一定量的蒸馏水形成含有葡萄糖与无机盐的溶液，随后将该溶液倒入培养瓶中浸泡固体物料，使培养基的最终含水量为70%，浸泡时间为2h，然后放入高压灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，时间为30min；
牛樟树木屑的处理方法为置于室外暴晒后用高压灭菌锅灭菌，灭菌温度为121℃，时间为2h，灭菌后将其放入烘箱中80℃烘干。牛樟树木屑是将牛樟树木材粉碎成0.5cm左右的片状木屑，称取烘干的牛樟树木屑1g平铺于谷物基质表面。
（3）打孔接种：用玻璃棒在固体培养基中心位置打一个2cm左右深的圆柱形槽，将原料菌丝块含有菌丝的一面贴着培养基质接种在圆柱形槽孔内并置于恒温培养箱中28℃暗培养；
（4）无菌超净台取样：培养一定时间后，在基质表面形成厚度为3-5cm左右可轻松剥离的致密菌丝层，在无菌超净台中取样，培养基中剩余的菌丝体还可继续生长。
实施例3：
一种培养产物与基质完全分离的牛樟芝培养方法，主要包括以下步骤：
（1）活化接种原料：取4℃保存的牛樟芝菌种于PDA平板培养基上活化培养25d后在打孔器中心距离菌丝层外边缘1.2cm处打孔，得到菌丝块用于接种；
（2）制备固态发酵培养基：称取一定量的谷物原料及牛樟树木屑放于培养瓶中，谷物原料为大米50g、麸皮2.5g，将干料混匀后装入培养瓶中，培养瓶体积为450mL，谷物原料混匀后置于培养瓶下层，牛樟树木屑平铺于其上；另将葡萄糖5g,KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g溶于一定量的蒸馏水形成含有葡萄糖与无机盐的溶液，随后将该溶液倒入培养瓶中浸泡固体物料，使培养基的最终含水量为50%，浸泡时间为2h，然后放入高压灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，时间为30min；
牛樟树木屑的处理方法为置于室外暴晒后用高压灭菌锅灭菌，灭菌温度为121℃，时间为2h，灭菌后将其放入烘箱中80℃烘干。牛樟树木屑是将牛樟树木材粉碎成0.5cm左右的片状木屑，称取烘干的牛樟树木屑5g平铺于谷物基质表面。
（3）打孔接种：用玻璃棒在固体培养基中心位置打一个2cm左右深的圆柱形槽，将原料菌丝块含有菌丝的一面贴着培养基质接种在圆柱形槽孔内并置于恒温培养箱中28℃暗培养；
（4）无菌超净台取样：培养一定时间后，在基质表面形成厚度为3-5cm左右可轻松剥离的致密菌丝层，在无菌超净台中取样，培养基中剩余的菌丝体还可继续生长。
实施例4：
一种培养产物与基质完全分离的牛樟芝培养方法，主要包括以下步骤：
（1）活化接种原料：取4℃保存的牛樟芝菌种于PDA平板培养基上活化培养30d后在打孔器中心距离菌丝层外边缘1.2cm处打孔，得到菌丝块用于接种；
（2）制备固态发酵培养基：称取一定量的谷物原料及牛樟树木屑放于培养瓶中，谷物原料为大米50g、麸皮2.5g，将干料混匀后装入培养瓶中，培养瓶体积为450mL，谷物原料混匀后置于培养瓶下层，牛樟树木屑平铺于其上；另将葡萄糖5g,KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g溶于一定量的蒸馏水形成含有葡萄糖与无机盐的溶液，随后将该溶液倒入培养瓶中浸泡固体物料，使培养基的最终含水量为60%，浸泡时间为2h，然后放入高压灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，时间为30min；
牛樟树木屑的处理方法为置于室外暴晒后用高压灭菌锅灭菌，灭菌温度为121℃，时间为2h，灭菌后将其放入烘箱中80℃烘干。牛樟树木屑是将牛樟树木材粉碎成0.5cm左右的片状木屑，称取烘干的牛樟树木屑0.5g平铺于谷物基质表面。
（3）打孔接种：用玻璃棒在固体培养基中心位置打一个2cm左右深的圆柱形槽，将原料菌丝块含有菌丝的一面贴着培养基质接种在圆柱形槽孔内并置于恒温培养箱中28℃暗培养；
（4）无菌超净台取样：培养一定时间后，在基质表面形成厚度为3-5cm左右可轻松剥离的致密菌丝层，在无菌超净台中取样，培养基中剩余的菌丝体还可继续生长。
实施例5：
一种培养产物与基质完全分离的牛樟芝培养方法，主要包括以下步骤：
（1）活化接种原料：取4℃保存的牛樟芝菌种于PDA平板培养基上活化培养20d后在打孔器中心距离菌丝层外边缘0.4cm处打孔，得到菌丝块用于接种；
（2）制备固态发酵培养基：称取一定量的谷物原料及牛樟树木屑放于培养瓶中，谷物原料为大米50g、麸皮2.5g，将干料混匀后装入培养瓶中，培养瓶体积为450mL，谷物原料混匀后置于培养瓶下层，牛樟树木屑平铺于其上；另将葡萄糖5g,KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g溶于一定量的蒸馏水形成含有葡萄糖与无机盐的溶液，随后将该溶液倒入培养瓶中浸泡固体物料，使培养基的最终含水量为70%，浸泡时间为2h，然后放入高压灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，时间为30min；
牛樟树木屑的处理方法为置于室外暴晒后用高压灭菌锅灭菌，灭菌温度为121℃，时间为2h，灭菌后将其放入烘箱中80℃烘干。牛樟树木屑是将牛樟树木材粉碎成0.5cm左右的片状木屑，称取烘干的牛樟树木屑7g平铺于谷物基质表面。
（3）打孔接种：用玻璃棒在固体培养基中心位置打一个2cm左右深的圆柱形槽，将原料菌丝块含有菌丝的一面贴着培养基质接种在圆柱形槽孔内并置于恒温培养箱中28℃暗培养；
（4）无菌超净台取样：培养一定时间后，在基质表面形成厚度为3-5cm左右可轻松剥离的致密菌丝层，在无菌超净台中取样，培养基中剩余的菌丝体还可继续生长。
实施例6：
一种培养产物与基质完全分离的牛樟芝培养方法，主要包括以下步骤：
（1）活化接种原料：取4℃保存的牛樟芝菌种于PDA平板培养基上活化培养20d后在打孔器中心距离菌丝层外边缘1.2cm处打孔，得到菌丝块用于接种；
（2）制备固态发酵培养基：称取一定量的谷物原料及牛樟树木屑放于培养瓶中，谷物原料为大米50g、麸皮2.5g，将干料混匀后装入培养瓶中，培养瓶体积为450mL，谷物原料混匀后置于培养瓶下层，牛樟树木屑平铺于其上；另将葡萄糖5g,KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g溶于一定量的蒸馏水形成含有葡萄糖与无机盐的溶液，随后将该溶液倒入培养瓶中浸泡固体物料，使培养基的最终含水量为60%，浸泡时间为2h，然后放入高压灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，时间为30min；
牛樟树木屑的处理方法为置于室外暴晒后用高压灭菌锅灭菌，灭菌温度为121℃，时间为2h，灭菌后将其放入烘箱中80℃烘干。牛樟树木屑是将牛樟树木材粉碎成0.5cm左右的片状木屑，称取烘干的牛樟树木屑1g平铺于谷物基质表面。
（3）打孔接种：用玻璃棒在固体培养基中心位置打一个2cm左右深的圆柱形槽，将原料菌丝块含有菌丝的一面贴着培养基质接种在圆柱形槽孔内并置于恒温培养箱中28℃暗培养；
（4）无菌超净台取样：培养一定时间后，在基质表面形成厚度为3-5cm左右可轻松剥离的致密菌丝层，在无菌超净台中取样，培养基中剩余的菌丝体还可继续生长。
比较不同活化时间（15d、20d、25d、30d），及打孔中心距离菌丝层边缘0.4cm及1.2cm的牛樟芝菌丝体长势差别，具体如下表1：
Figure DEST_PATH_IMAGE002A
表1不同活化方法接种原料生长30d生长直径（cm）
由表1可以看出，采用活化培养20d，在打孔器中心距菌丝层边缘0.4cm（即靠近菌丝层外边缘）处打孔获得接种块的方式所得牛樟芝菌丝体长势最佳。
考察不同含水量的基础培养基（50%、60%、70%）以及向基础培养基中添加不同浓度的牛樟树木屑（0.5g/瓶、1g/瓶、3g/瓶、5g/瓶、7g/瓶）对牛樟芝生长情况的影响，对培养产物进行冷冻干燥，比较各组培养基每瓶可培养得到的牛樟芝干重，具体如图1、图2。
之后以熊果酸为对照品，采用香草醛-冰醋酸法测定培养产物的粗三萜含量，可选出牛樟芝产量高且三萜类成分含量高的培养基，具体如表2、表3：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
表2 不同含水量基础培养基上牛樟芝干重及粗三萜含量（50d）
Figure DEST_PATH_IMAGE006
表3 添加不同牛樟树木屑培养基上牛樟芝干重及粗三萜含量（60d）
由表2、表3可以看出，培养基含水量在70%、牛樟树木屑添加量为1g/瓶，所得牛樟芝干重最高，且培养产物的粗三萜含量最多。
如图3所示，培养一定时间后，在基质表面形成厚度为3-5cm左右可轻松剥离的致密菌丝层；
如图4所示，在无菌超净台中用取样后冷冻干燥，培养90d每瓶可得到干重约15g的牛樟芝产物。
当然，以上仅为本发明的较佳实施方式，并非以此限定本发明的使用范围，故，凡是在本发明原理上做等效改变均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种培养产物与基质完全分离的牛樟芝培养方法，其特征在于：主要包括以下步骤：
（1）活化接种原料：取4℃保存的牛樟芝菌种于PDA平板培养基上活化培养20d后在靠近菌丝层边缘0.4cm处打孔得到菌丝块用于接种；
（2）制备固态发酵培养基：称取一定量的谷物原料及牛樟树木屑放于培养瓶中，谷物原料混匀后置于培养瓶下层，牛樟树木屑平铺于其上；另将葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O溶于一定量的蒸馏水形成含有葡萄糖与无机盐的溶液，随后将该溶液倒入培养瓶中浸泡固体物料，使培养基的最终含水量为50%-70%，浸泡时间为2h，然后放入高压灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，时间为30min；
（3）打孔接种：用玻璃棒在固体培养基中心位置打一个2cm深的圆柱形槽，将原料菌丝块含有菌丝的一面贴着培养基质接种在圆柱形槽孔内，并置于恒温培养箱中28℃暗培养；
（4）无菌超净台取样：培养一定时间后，在基质表面形成厚度为3-5cm可轻松剥离的致密菌丝层，在无菌超净台中取样，培养基中剩余的菌丝体还可继续生长；
所述的牛樟树木屑的处理方法为置于室外暴晒后用高压灭菌锅灭菌，灭菌温度为121℃，时间为2h，灭菌后将其放入烘箱中80℃烘干；
所述的谷物原料为大米50g、麸皮2.5g，将干料混匀后装入培养瓶中，培养瓶体积为450mL；
所述的牛樟树木屑是将牛樟树木材粉碎成0.5cm的片状木屑，称取烘干的牛樟树木屑1-5g平铺于谷物基质表面；
所述含有葡萄糖与无机盐的溶液中，葡萄糖为5g，KH2PO4为0.5g，MgSO4·7H2O为 0.5g。
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CN108901611A (zh) * 2018-06-14 2018-11-30 广东食品药品职业学院 一种牛樟芝培养基及其制备方法和应用

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