CN109593863A - 一种链置换型dna聚合酶诱导等温循环扩增反应检测肉类来源的方法 - Google Patents

一种链置换型dna聚合酶诱导等温循环扩增反应检测肉类来源的方法 Download PDF

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CN109593863A CN201811600989.4A CN201811600989A CN109593863A CN 109593863 A CN109593863 A CN 109593863A CN 201811600989 A CN201811600989 A CN 201811600989A CN 109593863 A CN109593863 A CN 109593863A
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Abstract

本发明公开了一种应用链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应检测肉类来源的方法，属于食品安全检测技术领域。本发明通过多重序列对比确定了肉类的检测靶核酸，设计了特异性的分子信标探针和引物，以肉类基因组DNA为模板，建立了实时荧光SDPICA体系，进行等温核酸扩增，并且验证了SDPICA方法的特异性、灵敏度和检出限，还通过实际样品的检测确定了本发明建立的方法具有实际可行性。本发明方法对于肉类掺假的检测具有通用性，可以是猪肉、羊肉、牛肉、鸡肉、鸭肉等。

Description

一种链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应检测肉类来 源的方法
技术领域
本发明涉及一种应用链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应检测肉类来源的方法，属于食品安全检测技术领域。
背景技术
自从2013年涉及欧洲16国的“马肉风波”曝光以来，肉类掺假成为世界各国共同关注的热点问题。在国内，一些不法商贩将相对廉价的马肉、猪肉、鸭肉等肉类原料掺入到牛肉、羊肉进行销售以谋取不当利益，从而严重侵犯消费者的合法权益。近年来国内发生的肉类掺假事件的主要掺假方式是在高价肉中掺入廉价的肉类原料，尤其突出的是在羊肉、牛肉、猪肉中掺假，这种掺假方式消费者普遍关注。事实上，肉类掺假的方式涉及到肉类生产、加工、经营的各个环节、方式五花八门，尤其是猪肉掺假最为常见。有的是肉品标注的性别、年龄、养殖方式、地理溯源及饲料摄取等与事实不符；有的是将廉价肉品或者劣质/过期肉替换或掺入高价/健康肉品。这些低价/劣质肉品可能是低价可食用肉类，如猪肉、鸭肉掺入羊肉；也可能是非食用肉类掺假，如马肉、狐狸肉、甚至猫肉、老鼠肉掺入可食用肉中，这种掺假方式最为恶劣，消费者可能因为食用这些未经检验检疫的肉品而产生严重的健康隐患。非肉类成分添加可能涉及着色剂、防腐剂、香味剂的添加，以及注水、加入大豆粉等方式。
掺假肉的出现不仅会影响消费者的身体健康和生命安全，而且掺假肉出口到国外会严重损害食品企业形象及国家信誉。因此，近年来，我国从两个方面入手狠抓肉类掺假，一方面是通过制定《中华人民共和国食品安全法》、《中华人民共和国农产品质量安全法》等严格的法律法规约束生产者和经营者的行为；另一方面不断开发运用更准确、有效的检测方法，为食品监管提供有力的技术保障和支持。
目前肉类掺假鉴别形成了以蛋白质检测和以核酸检测为基础的两大主要检测体系。以蛋白质检测为基础的肉类本质鉴别技术包括免疫分析技术、蛋白质组学技术。在不同的前提条件下，各种方法有着自己的优点和局限性，但缺乏灵敏度高、特异性强、耗时短、费用低、操作简单等特点又能满足基本检验要求的方法。以核酸检测为基础的肉类掺假鉴别技术是基于DNA序列特异性的分子生物技术，以动物种属间遗传信息差异作为物种鉴别检测靶标的核酸检测方法如今被广泛应用。与蛋白质检测方法相比，DNA的热稳定性及酸碱稳定性均优于蛋白质，因此在加工后肉类的鉴别检测中具有明显优势，而核酸检测方法的高灵敏度和特异性也是蛋白检测方法无法比拟的。DNA探针杂交是最早用于食品中肉类成分鉴别的核酸检测方法。
实时荧光定量PCR需要通过反复的热循环扩增，耗时较多；而环介导等温扩增法(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)的引物容易产生二聚体，而且复杂的反应体系容易产生假阳性，其在应用范围上受到了限制。目前缺乏能够同时快速定量检测肉类掺假的方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种快速检测肉类来源的方法。该方法是以含有与肉类特定基因组序列互补的特异性分子信标为模板，配制链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应(Strand-displacement DNA polymerase induces isothermal circularamplification reaction,SDPICA)体系，置于酶标仪中，在特异性探针和循环引物的作用下进行恒温扩增，根据扩增曲线及荧光相对强度实现对肉类的定性和(或)定量检测。具体地说，本发明方法通过多重序列对比确定了针对肉类的检测靶核酸序列，并设计了特异性的分子信标探针(特异性探针)和引物(循环引物)，以动物肉类DNA为模板，建立了实时荧光SDPICA检测体系，进行等温核酸扩增，根据扩增后的样品荧光强度验证SDPICA方法的特异性，根据扩增曲线测定实时荧光定量SDPICA方法的灵敏度和检出限，确定了本发明所建立的方法具有实际可行性。
本发明中所述的肉类是指可检测出DNA序列的动物肉类，比如可以是猪肉、羊肉、牛肉、鸡肉、鸭肉、兔肉、马肉、驴肉等；优选猪肉、牛肉，其中猪肉部分可以是里脊肉、后退肉、五花肉、奶脯肉等，牛肉部分可以是腱子肉、外脊、颈部、上脑、胸口肉等。
上述方法中，所述分子信标探针的核苷酸序列(5’-3’)由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三部分依次组成，Ⅰ与Ⅲ互补配对。对于猪肉来讲，Ⅰ为TCTTGATCTCC、TCTTGCATCAG；Ⅲ为GGAGATCAAGA、CTGATGCAAGA等；对于牛肉来讲，Ⅰ为TCTTGCGCTTT、TCTTGCCTTCT；Ⅲ为AGAAGGCAAGA、AAAGCGCAAGA等。Ⅱ为与肉类特异性基因组序列互补配对的探针环序列。
所述分子信标探针的序列两端修饰有荧光基团与淬灭基团。荧光基团与淬灭基团为本领域常用的基团，比如用FAM荧光素修饰于序列的5’端，Dabcyl淬灭基团修饰于序列的3’端。
所述含有肉类目标序列的DNA是指含有检测靶核酸片段的核苷酸序列，其为肉类的基因组DNA，并且它是依据线粒体Cyt b基因设计。
所述与目标序列互补配对的肉类探针环序列为(5’-3’)，以实际肉类的DNA序列进行互补配对获得，比如对于猪肉来讲为CCTCAATGGTATGCCACAAC、TTACACACATTTGTCGAGACGT等；对于牛肉来讲为CCACTTTATCCTTCCATTTATC、GCTCACAGTAATAGCCACAG等。
所述循环引物为本领域技术人员熟知的能维持SDPICA循环反应的循环引物，比如(对于猪肉)可以是TCTTGATC、TCTTGCAT，或者是(对于牛肉)TCTTGCGC、TCTTGCCT等。
所述解链引物为本领域技术人员熟知的可以与目标链特异性结合的引物，比如(对于牛肉)可以是TGATCGCTTTGATAAATGGAAGGAT、GTCCTCATGGTAGGACGTATCC等，或者是(对于猪肉)ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG、ATTTACGTCTCGACAAATGTGTGTA等。
所述SDPICA反应体系中Mg2+浓度为4～10mmol/L，甜菜碱浓度为0.8～1.5mol/L，dNTPs的浓度为1.2～2mmol/L，解链引物浓度为0.1～0.5μmol/L，Klenow聚合酶浓度为1～4U，分子信标探针浓度为0.1～0.5μmol/L，循环引物浓度为0.5～1μmol/L，Bst DNA聚合酶为12～18U。
所述酶标仪进行实时荧光SDPICA扩增的终点信号检测，激发波长为496nm、发射波长为521nm，底部检测，增益100，延迟100msec，检测高度7mm。
所述方法的扩增时间为10～30min，扩增温度为37～38℃。此外，该方法还包括预先测定荧光信号强度与反应时间的关系，从而建立肉类浓度与荧光信号强度之间的回归曲线关系；检测待测样品时，提取基因组DNA，进行SDPICA反应，检测荧光信号强度，代入回归曲线即可获知待测样品中肉类的浓度。
所述基因组DNA的提取方法为本领域常规提取方法，比如可以是试剂盒法、传统DNA抽提法(酚-氯仿法)、浓盐法、CTAB法、SDS法、热裂解法；优选试剂盒法。
本发明与现有的技术相比，其显著优点在于：
本发明方法基于实时荧光SDPICA反应，原理简单易懂，操作简单且可实时监控，对反应条件的要求不高。
特异性探针以及两种特异性引物的选择性提高了检测方法对靶向目标物的特异性识别能力。
本发明方法克服了传统PCR反应需要通过反复热循环扩增的缺点，避免了反复升降温的耗时过程，可实现恒温条件下的连续快速扩增，具有操作简单、快速、特异性强的特点。通过链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应实现核酸扩增，靶向目标物含量较低时同样能实现检测，提高了本方法灵敏度，降低了检出限。
附图说明
图1：链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应(SDPICA)检测原理图。
图2：猪源性成分检测体系的特异性验证图；其中(a)为猪源性成分检测体系在检测不同肉类时荧光强度随时间的变化曲线、(b)为猪源性成分检测体系在检测不同肉类时20min的荧光强度对比图。
图3：本发明方法检测猪肉成分灵敏度考察图。
图4：本发明方法检测猪肉成分检出限考察图。
图5：牛源性成分检测体系的特异性验证图；其中(a)为牛源性成分检测体系在检测不同肉类时荧光强度随时间的变化曲线、(b)为牛源性成分检测体系在检测不同肉类时20min的荧光强度对比图。
图6：本发明方法检测牛肉成分灵敏度考察图。
图7：本发明方法检测牛肉成分检出限考察图。
具体实施方案
结合实例对本发明做进一步描述：
如图1所示，为SDPICA扩增原理示意图。
从肉制品中提取所得的基因组DNA在Bst DNA聚合酶和特异性解链引物的作用下，释放出靶核苷酸片段，SDPICA反应通过靶核酸片段与分子信标环序列的杂交打开分子信标探针的茎环结构，并在引物和DNA聚合酶的作用下形成MB-cDNA结构，保留已打开的分子信标探针信号，cDNA形成过程中释放靶核酸片段触发下一个循环，通过扩增实现信号的逐级放大，达到灵敏检测的目的。
实施例1：
1、猪肉制品基因组DNA提取(改良氯化钠法)
称取0.5g猪肉生鲜肉，将样品置于匀浆机上混匀，放于研钵中，加入1mL TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0)；将匀浆液分装于不同的50mL离心管备用；将样品匀浆液溶解于8mL的lysis缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0；2mM EDTA，pH8.0；0.4M NaCl)和800μL20％的SDS，并置于涡旋混匀器上混合均匀；向其中加入40μL 20mg/mL的蛋白酶K，然后置于65℃水浴锅温育1h；温育后，向其中加入6mL 5M的NaCl(沉淀蛋白质，DNA在此浓度溶解度增加，而蛋白质溶解度降低)，然后置于涡旋混匀器上混匀30s；将上述混合液置于10,000×g的离心机上离心30min，然后将其上清液转移至另一干净的离心管；加入等体积的异丙醇(沉淀DNA)，上下颠倒混匀后置于-20℃冰箱冷冻20min；再置于16,000×g的离心机上离心20min，将上清液移除，加1mL TE缓冲液溶解沉淀物，溶解后将DNA转移至微量离心管，即为实际样品中提取到的DNA。
2、链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应(SDPICA)体系的构建
(1)反应体系1的构建
为获得目标猪肉特异性DNA片段，构建了反应体系1。其具体构建过程如下：Mg2+浓度为8mmol/L，甜菜碱浓度为1mol/L，dNTPs的浓度为1.8mmol/L，解链引物浓度为0.8μmol/L，Bst DNA聚合酶浓度为16U，基因组DNA为5μL。
(2)反应体系2的构建
为实现猪肉DNA的灵敏检测，构建了反应体系2。其具体构建过程如下：循环引物浓度为0.5μmol/L，Klenow聚合酶浓度为0.24U，dNTPs的浓度为1.2mmol/L，分子信标探针浓度为0.2μmol/L，DMSO为6μL，DNA为5μL。
(3)反应体系1与反应体系2的联结
反应体系1获得的猪肉单链DNA片段与反应体系2中的分子信标探针的特定部位互补配对，分子信标探针被打开由环状结构变成直链结构，荧光基团与淬灭基团随即分开，产生荧光信号。
3、猪肉DNA的特异性检测
将反应液置于96孔板中，置于酶标仪进行实时荧光SDPICA扩增的终点信号检测，激发波长为480～497nm、发射波长为520～525nm，底部检测，增益100，延迟100msec，检测高度7mm。
实施例2：
1、猪肉制品基因组DNA提取(SDS法)
称取0.5g待测猪肉生鲜肉样品，组织块剪碎研磨后转移至离心管中。向样品中加入7mL细胞裂解液，然后加入40μL的蛋白酶K溶液，混匀，65℃消化3h-5h至无明显组织块。向消化裂解液中加入700μL乙酸钾溶液，混匀冰浴15min，4℃，12,000×g离心10min，取上清至新的50mL离心管。加入等体积Tris-饱和酚，缓慢颠倒混匀10min，4℃，1,200×g离心10min。取上清液转移至新离心管，加入0.5体积氯仿-异戊醇(24:1)，缓慢颠倒混匀10min，4℃，1,200×g离心10min。多次重复上述步骤至两相中间不能看见变性蛋白质为止，取上清液至新的离心管中。加入二倍体积-20℃预冷的无水乙醇，轻轻摇晃至絮状沉淀析出，1,200×g离心10min，倒掉上清液。加入6000μL70％乙醇洗涤沉淀，1,200×g离心3min，吸取上清液。重复上一步骤1～2次。室温下放置使残余乙醇完全挥发，加入500μLTE缓冲溶液溶解DNA沉淀。-20℃保存DNA溶液。
2、链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应(SDPICA)体系的构建
(1)反应体系1的构建
为获得目标猪肉特异性DNA片段，构建了反应体系1。其具体构建过程如下：Mg2+浓度为10mmol/L，甜菜碱浓度为1mol/L，dNTPs的浓度为2mmol/L，解链引物浓度为0.8μmol/L，Bst DNA聚合酶浓度为18U，基因组DNA为5μL。
(2)反应体系2的构建
为实现猪肉DNA的灵敏检测，构建了反应体系2。其具体构建过程如下：循环引物浓度为0.3μmol/L，Klenow聚合酶浓度为0.3U，dNTPs的浓度为1.5mmol/L，分子信标探针浓度为0.3μmol/L，DMSO为6μL，DNA为5μL。
(3)反应体系1与反应体系2的联结
反应体系1获得的猪肉单链DNA片段与反应体系2中的分子信标探针的特定部位互补配对，分子信标探针被打开由环状结构变成直链结构，荧光基团与淬灭基团随即分开，产生荧光信号。
3、猪肉DNA的特异性检测
将反应液置于96孔板中，置于酶标仪进行实时荧光SDPICA扩增的终点信号检测，激发波长为480～497nm、发射波长为520～525nm，底部检测，增益100，延迟100msec，检测高度7mm。
实施例3：
1、猪肉制品基因组DNA提取(试剂盒法)
称取一定的待测猪肉生鲜肉，依试剂盒说明进行操作。
2、链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应(SDPICA)体系的构建
(1)反应体系1的构建
为获得目标猪肉特异性DNA片段，构建了反应体系1。其具体构建过程如下：Mg2+浓度4～10mmol/L，甜菜碱浓度为1.5mol/L，dNTPs的浓度为1.8mmol/L，解链引物浓度为0.8μmol/L，Bst DNA聚合酶浓度为18U，基因组DNA为6μL。
(2)反应体系2的构建
为实现猪肉DNA的灵敏检测，构建了反应体系2。其具体构建过程如下：循环引物浓度为0.5μmol/L，Klenow聚合酶浓度为0.4U，dNTPs的浓度为2.2mmol/L，分子信标探针浓度为0.2μmol/L，DMSO为6μL，DNA为6μL。
(3)反应体系1与反应体系2的联结
反应体系1获得的猪肉单链DNA片段与反应体系2中的分子信标探针的特定部位互补配对，分子信标探针被打开由环状结构变成直链结构，荧光基团与淬灭基团随即分开，产生荧光信号。
3、猪肉DNA的特异性检测
将反应液置于96孔板中，置于酶标仪进行实时荧光SDPICA扩增的终点信号检测，激发波长为480～497nm、发射波长为520～525nm，底部检测，增益100，延迟100msec，检测高度7mm。
实施例4：
根据上述建立的链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应(SDPICA)体系，分别以牛肉等的随机序列基因组DNA按照上述实施例的DNA提取方法进行提取后，作为反应的模板DNA，检测引物和探针的特异性。实验结果如下图2所示，结果显示，猪肉来源的基因组DNA扩增结果显示为阳性，其他随机性序列均无出现扩增。可见，针对目标物种的引物和探针特异性良好。
实施例5：
根据上述建立的链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应(SDPICA)体系，将提取得到的猪肉基因组DNA进行10倍系列稀释，以考察该方法的灵敏度。实验结果如下图3所示，结果显示，当链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应体系中模板量为1pg时，存在荧光信号的增加，则该检测体系的检测下限为1pg。
实施例6：
根据上述建立的链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应(SDPICA)体系，分别检测不同质量百分比的猪肉(0.01％、0.1％、1％、10％、100％)和空白体系，以测定该方法的检出限。实验结果如下图4所示，结果显示，当体系中的目标物的质量百分比为0.1％时，存在明显的扩增曲线，则该检测体系的检测下限为0.1％。
实施例7：
1、牛肉制品基因组DNA提取(改良氯化钠法)
称取0.5g牛肉生鲜肉，将样品置于匀浆机上混匀，放于研钵中，加入1mL TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0)；将匀浆液分装于不同的50mL离心管备用；将样品匀浆液溶解于8mL的lysis缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0；2mM EDTA，pH8.0；0.4M NaCl)和800μL20％的SDS，并置于涡旋混匀器上混合均匀；向其中加入40μL 20mg/mL的蛋白酶K，然后置于65℃水浴锅温育1h；温育后，向其中加入6mL 5M的NaCl(沉淀蛋白质，DNA在此浓度溶解度增加，而蛋白质溶解度降低)，然后置于涡旋混匀器上混匀30s；将上述混合液置于10,000×g的离心机上离心30min，然后将其上清液转移至另一干净的离心管；加入等体积的异丙醇(沉淀DNA)，上下颠倒混匀后置于-20℃冰箱冷冻20min；再置于16,000×g的离心机上离心20min，将上清液移除，加1mLTE缓冲液溶解沉淀物，溶解后将DNA转移至微量离心管，即为实际样品中提取到的DNA。
2、链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应(SDPICA)体系的构建
(1)反应体系1的构建
为获得目标牛肉特异性DNA片段，构建了反应体系1。其具体构建过程如下：Mg2+浓度为10mmol/L，甜菜碱浓度为1.5mol/L，dNTPs的浓度为2.0mmol/L，解链引物浓度为0.3μmol/L，Bst DNA聚合酶浓度为16U，基因组DNA为5μL。
(2)反应体系2的构建
为实现牛肉DNA的灵敏检测，构建了反应体系2。其具体构建过程如下：循环引物浓度为0.4μmol/L，Klenow聚合酶浓度为0.3U，dNTPs的浓度为2.5mmol/L，分子信标探针浓度为0.5μmol/L，DMSO为6μL，DNA为5μL。
(3)反应体系1与反应体系2的联结
反应体系1获得的牛肉单链DNA片段与反应体系2中的分子信标探针的特定部位互补配对，分子信标探针被打开由环状结构变成直链结构，荧光基团与淬灭基团随即分开，产生荧光信号。
3、牛肉DNA的特异性检测
将反应液置于96孔板中，置于酶标仪进行实时荧光SDPICA扩增的终点信号检测，激发波长为480～497nm、发射波长为520～525nm，底部检测，增益100，延迟100msec，检测高度7mm。
实施例8：
1、牛肉肉制品基因组DNA提取(SDS法)
称取0.5g待测牛肉生鲜肉样品，组织块剪碎研磨后转移至离心管中。向样品中加入7mL细胞裂解液，然后加入40μL的蛋白酶K溶液，混匀，65℃消化3h-5h至无明显组织块。向消化裂解液中加入700μL乙酸钾溶液，混匀冰浴15min，4℃，12,000×g离心10min，取上清至新的50mL离心管。加入等体积Tris-饱和酚，缓慢颠倒混匀10min，4℃，1,200×g离心10min。取上清液转移至新离心管，加入0.5体积氯仿-异戊醇(24:1)，缓慢颠倒混匀10min，4℃，1,200×g离心10min。多次重复上述步骤至两相中间不能看见变性蛋白质为止，取上清液至新的离心管中。加入二倍体积-20℃预冷的无水乙醇，轻轻摇晃至絮状沉淀析出，1,200×g离心10min，倒掉上清液。加入6000μL70％乙醇洗涤沉淀，1,200×g离心3min，吸取上清液。重复上一步骤1～2次。室温下放置使残余乙醇完全挥发，加入500μLTE缓冲溶液溶解DNA沉淀。-20℃保存DNA溶液。
2、链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应(SDPICA)体系的构建
(1)反应体系1的构建
为获得目标牛肉特异性DNA片段，构建了反应体系1。其具体构建过程如下：Mg2+浓度为8mmol/L，甜菜碱浓度为1mol/L，dNTPs的浓度为1.8mmol/L，解链引物浓度为1.5μmol/L，Bst DNA聚合酶浓度为14U，基因组DNA为6μL。
(2)反应体系2的构建
为实现牛肉DNA的灵敏检测，构建了反应体系2。其具体构建过程如下：循环引物浓度为0.5μmol/L，Klenow聚合酶浓度为0.24U，dNTPs的浓度为1.8mmol/L，分子信标探针浓度为0.5μmol/L，DMSO为8μL，DNA为8μL。
(3)反应体系1与反应体系2的联结
反应体系1获得的牛肉单链DNA片段与反应体系2中的分子信标探针的特定部位互补配对，分子信标探针被打开由环状结构变成直链结构，荧光基团与淬灭基团随即分开，产生荧光信号。
3、牛肉DNA的特异性检测
将反应液置于96孔板中，置于酶标仪进行实时荧光SDPICA扩增的终点信号检测，激发波长为480～497nm、发射波长为520～525nm，底部检测，增益100，延迟100msec，检测高度7mm。
实施例9：
1、牛肉肉制品基因组DNA提取(试剂盒法)
称取一定的待测牛肉生鲜肉，依试剂盒说明进行操作。
2、链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应(SDPICA)体系的构建
(1)反应体系1的构建
为获得目标牛肉特异性DNA片段，构建了反应体系1。其具体构建过程如下：Mg2+浓度为6mmol/L，甜菜碱浓度为1.5mol/L，dNTPs的浓度为2.5mmol/L，解链引物浓度为0.6μmol/L，Bst DNA聚合酶浓度为15U，基因组DNA为6μL。
(2)反应体系2的构建
为实现牛肉DNA的灵敏检测，构建了反应体系2。其具体构建过程如下：循环引物浓度为0.5μmol/L，Klenow聚合酶浓度为0.4U，dNTPs的浓度为2.2mmol/L，分子信标探针浓度为0.8μmol/L，DMSO为8μL，DNA为6μL。
(3)反应体系1与反应体系2的联结
反应体系1获得的牛肉单链DNA片段与反应体系2中的分子信标探针的特定部位互补配对，分子信标探针被打开由环状结构变成直链结构，荧光基团与淬灭基团随即分开，产生荧光信号。
3、牛肉DNA的特异性检测
将反应液置于96孔板中，置于酶标仪进行实时荧光SDPICA扩增的终点信号检测，激发波长为480～497nm、发射波长为520～525nm，底部检测，增益100，延迟100msec，检测高度7mm。
实施例10：
根据上述建立的链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应(SDPICA)体系，分别将牛肉等肉制品的基因组DNA按照上述实施例的DNA提取方法进行提取后，作为反应的模板DNA，检测引物和探针的特异性。实验结果如下图5所示，结果显示，牛肉来源的基因组DNA扩增结果显示为阳性，其他随机性序列均无出现扩增。可见，针对目标物种的引物和探针特异性良好。
实施例11：
根据上述建立的链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应(SDPICA)体系，将提取得到的牛肉基因组DNA进行10倍系列稀释，以考察该方法的灵敏度。实验结果如下图6所示，结果显示，当链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应体系中模板量为1pg时，存在荧光信号的增加，则该检测体系的检测下限为1pg。
实施例12：
根据上述建立的链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应(SDPICA)体系，分别检测不同质量百分比的牛肉体系(0.01％、0.1％、1％、10％、100％)和空白体系，以测定该方法的检出限。实验结果如下图7所示，结果显示，当体系中的目标物的质量百分比为0.1％时，存在明显的扩增曲线，则该检测体系的检测下限为0.1％。

Claims (8)

1.一种链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应检测肉类来源的方法，其特征在于：该方法是以含有与肉类基因组序列互补的特异性分子信标为模板，配制链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应体系，在分子信标探针和循环引物的作用下进行恒温扩增，根据扩增曲线及荧光相对强度实现对肉类的定性和/或定量检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：分子信标探针的核苷酸序列(5’-3’)由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三部分依次组成，Ⅰ与Ⅲ互补配对，Ⅱ为与肉类特异性基因组序列互补配对的探针环序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述分子信标探针的序列两端修饰有荧光基团与淬灭基团。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该方法利用解链引物和Bst DNA聚合酶可在恒温条件对目标双链DNA进行边解旋边扩增，释放出后续反应的目标单链DNA，目标链与分子信标探针的特定部位互补配对，分子信标探针被打开由环状结构变成直链结构，荧光基团与淬灭基团随即分开，产生荧光信号。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该方法利用循环引物和Klenow酶与分子信标探针特定部分互补配对形成双链DNA并释放出目标单链DNA进入下一轮循环扩增，从而实现高灵敏度检测。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有肉类目标序列的DNA是指含有检测靶核酸片段的核苷酸序列。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有肉类目标序列是线粒体Cytb基因设计。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述肉类根据其特定的基因序列可以检测猪肉、羊肉、牛肉、鸡肉、鸭肉等多种肉源。
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