CN105274099B

CN105274099B - 快速鉴定食品或饲料中9种动物源性成分的引物、探针组合物、试剂盒及其检测方法和应用

Info

Publication number: CN105274099B
Application number: CN201510695558.0A
Authority: CN
Inventors: 步迅; 张全芳; 刘艳艳; 范阳阳
Original assignee: Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-10-23
Filing date: 2015-10-23
Publication date: 2018-08-10
Anticipated expiration: 2035-10-23
Also published as: CN105274099A

Abstract

本发明提供一种快速鉴定食品或饲料中9种动物源性成分的引物、探针组合物、试剂盒及其检测方法和应用，利用本发明的引物、探针组合物以及实时荧光PCR联合检测试剂盒可以同时快速鉴定出含有上述多个物种的食品或饲料的源成分。属于分子生物学技术领域。以16SrDNA为靶基因设计通用引物，分别设计9种物种的特异探针，设计构建扩增内标，针对内标序列设计特异探针，分3组PCR反应体系进行，通过相应荧光探针信号及Ct值直接判读各物种源性成分。该方法成本低、省时、高效，可同时实现多物种鉴别。

Description

快速鉴定食品或饲料中9种动物源性成分的引物、探针组合物、试剂盒及其检测方法和应用

技术领域

本发明涉及快速鉴定食品或饲料中9种动物源性成分的引物、探针组合物、试剂盒及其检测方法和应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

2012年欧洲的马肉风波引起了各国对于肉类真伪掺假的高度重视，2013年以来，国内高档次肉类掺假低劣质肉类的事件也频频出现，媒体相继报道了山东滨州、内蒙、上海、西安、深圳等地查处假羊肉事件。经调查，我国肉类掺假的主要问题是：在羊肉、牛肉等高档昂贵的肉类中掺入猪肉、鸡肉、鸭肉、马肉、老鼠肉、狐狸肉、水貂肉等易于养殖而且价格更低廉的肉类，以次充好、欺骗消费者。这不仅严重侵害了消费者利益，而且更严重的是造成恶劣的社会影响，对整个肉类产业也造成巨大伤害。同时，严重的国际肉类食品掺假情况给我国带来了极大的安全隐患，如果没有可靠的快速真伪鉴别技术，将会使我国肉类进口企业蒙受巨大的经济损失。

饲料安全已与动物生产、环境污染和人类健康密切相关。自英国出现首例疯牛病后，世界上许多国家都通过法律、法规等对动物源性饲料产品的生产和使用进行控制。我国也出台了相应的法律法规，如《饲料原料目录》(农业部1773号公告)，要求生产动物源性饲料的原料必须来源于可食用动物，且必须来源于同一种动物。但是，目前动物源性饲料生产企业的原料来源非常复杂，并且存在很大的安全隐患。主要表现为动物源性饲料产品的生产中使用了非可食用动物原料。如生产猪、鸡、鸭、鱼、牛、羊肉粉或骨粉使用了水貂、狐狸和貉子的屠宰下脚料。目前动物源性饲料原料种类繁多，生产企业的规模大小不一，企业的管理水平也相差甚大。因此，很有必要对饲料和单一动物源性饲料进行动物源性成分的检测，以便更有力的规范和监督动物源性饲料产品的生产和使用。

目前，用于动物源性鉴定方法的主要有蛋白质鉴定(等电点聚焦电泳、ELASA酶联免疫吸附法、高效液相色谱法、液质联用法等)和DNA鉴定技术两类，其中以物种间基因差异为基础的DNA鉴定技术是近年来研究热点，其原因在于生物基因具有独一无二的可重复性，DNA序列在生物个体发育过程中不会改变的，同种生物不同生长期的DNA序列信息是相同的，即使经过加工，形态发生变化，DNA序列信息也不会改变。因此采用DNA进行种源性鉴定具有很高的准确性，是目前最为理想的方法。而近5年出现的实时荧光PCR技术，以其高特异性、高灵敏性、闭管操作无污染等优点，越来越多的应用于动物源性鉴别中。当前基于多重PCR技术的动物源性成分检测主要依靠PCR后利用琼脂糖凝胶电泳分辨出不同长度的扩增片段来实现，申请号为201510061793.2和201510300666.3的专利均采用了多重RT-PCR的熔解曲线分析技术来达到肉与肉制品中多种源性成分的快速鉴别，但该方法仅通过熔解曲线温度TM值范围不能区分如狐狸、貉子等同科动物同源性很近的物种，另外该方法对设计的引物要求很强的特异性，多对引物容易引起交叉反应和非特异性扩增。

因此，建立高效广泛的多物种动物源性成分联合检测方法，对提高突发事件的应急处理能力，提升食品、畜禽产品和饲料安全监测水平和监管能力具有重要实践意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种快速鉴定食品或饲料中牛、马、羊、猪、鸡、鸭、狐狸、水貂和鼠9种动物源性成分的引物、探针组合物以及实时荧光PCR联合检测试剂盒，利用本发明的引物、探针组合物以及实时荧光PCR联合检测试剂盒可以同时快速鉴定出含有上述多个物种的食品或饲料的源成分。

本发明通过以下技术方案实现：

鉴定食品或饲料中9种动物源性成分的引物、探针组合物，包括以下引物和探针，其核苷酸序列如下：

(1)引物

通用引物序列：

上游序列：UN-F：AAGACGAGAAGACCCATGGACTCTA，如SEQ ID NO.1所示；

下游序列：UN-R：GATTGCGCGGTTATCCCTAGGGTA，如SEQ ID NO.2所示；

马源特异引物：

上游序列：LMF：TTTCTCCTCGCATAAGCCTATATC，如SEQ ID NO.3所示；

下游序列：LMR：GTTCCTTTTACTTCTTTTAATCTTTCCT，如SEQ ID NO.4所示；

(2)所述9种动物源性成分探针：

羊源性特异探针(MYP)：5’-CCACCAAGGGATAACAACACTCTGGTGG-3’，如SEQ ID NO.5所示；

牛源性特异探针(NP)：5’-CGGCGGTAACTAACCAACCCAAAGAGAATCCGCCG-3’，如SEQ IDNO.6所示；

马源性特异探针(MP)：5’-CAGCGAAGATAGGGATAATCCAAAAACTAATCACGCTG-3’，如SEQID NO.7所示；

狐狸源性探针(HP)：5’-CAGACCGATGAAATCCAAACCCCTCGGTCTG-3’，如SEQ ID NO.8所示；

水貂源性探针(SDP)：5’-CGGCGAGGTCTAACACAACATTATTACTGGTCGCCG-3’，如SEQ IDNO.9所示；

猪源性探针(ZP)：5’-CAGTGATGTTATGGTTATTTTGACTGGTTTGCATCACTG-3’，如SEQ IDNO.10所示；

鼠源性探针(SP)：5'-CGCGCGTCCTCCGAATGATTTTAACCTAGACTCGCGCG-3’，如SEQ IDNO.11所示；

鸡源性探针(JP)：5’-CGGGTCTGGTTACTGTTGGTACTTTGAGAGACCCG-3’，如SEQ IDNO.12所示；

鸭源性探针(YP)：5’-CGCGAACCTAAGACTAAACCCACCGGGTTCGCG-3’，如SEQ ID NO.13所示；

其中，所有探针的5’端修饰有荧光报告基团，所述各探针的荧光报告基团为FAM、JOE、CY3、CY5或ROX中的任意一种，各探针的3’端修饰有淬灭基团为TAMRA、DABCYL、BHQ1和BHQ2中的任意一种。

优选的，所有所述探针的5’端修饰的荧光报告基团和3’端修饰的淬灭基团分别是：

羊源性特异探针(MYP)、牛源性特异探针(NP)和猪源性探针(ZP)的荧光报告基团均用JOE标记；马源性特异探针(MP)、鼠源性探针(SP)和狐狸源性特异探针(HP)的荧光报告基团均用FAM标记；水貂源性探针(SDP)、鸡源性探针(JP)和鸭源性探针(YP)的荧光报告基团均用CY3标记；所有探针的3’端的淬灭基团均用DABCYL修饰。

优选的：还包括内标基因及对应的外源性内标引物(IMF)和外源性内标探针(IMP)，其内标基因核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

外源性内标引物(IMF)：

上游序列：5’-AGACCACCAAATGCCCCTATC-3’，如SEQ ID NO.15所示；

下游序列：5’-GTTCCTTTTACTTCTTTTAATCTTTCCT-3’，如SEQ ID NO.16所示；

外源性内标探针(IMP)：5’-GCGAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGC-3’，如SEQ IDNO.17所示；

其中，外源性内标探针(IMP)的5’端修饰有荧光报告基团，所述荧光报告基团为FAM、JOE、CY3、CY5或ROX，外源性内标探针(IMP)的3’端修饰有淬灭基团，为TAMRA、DABCYL、BHQ1或BHQ2。

优选的，所述内标以重组质粒的形式存在，所述重组质粒为将内标片段连接到PMD18-T载体上形成。

本发明提供了引物探针混合物、Taq热启动酶1U，10×PCR缓冲液、阳性标准品、阴性标准品的试剂盒，该试剂盒使用方便、快捷、高效。

一种鉴定食品或饲料中9种动物源性成分的实时荧光PCR联合检测试剂盒，包括所述引物、探针组合物，所述重组质粒及对应的所述外源性内标引物(IMF/R)和外源性内标探针(IMP)，以及PCR反应所必需的反应原料和试剂。

优选的，所述PCR联合检测试剂盒分为三个PCR反应体系，分别是A体系、B体系和C体系，每个体系共用所述试剂盒中的通用引物，重组质粒及对应的所述外源性内标引物对和外源性内标探针(IMP)以及PCR反应所必需的反应原料和试剂，A体系包括上述的羊源性特异探针(MYP)、狐狸源性探针(HP)和鸡源性探针(JP)，B体系包括包括上述的牛源性特异探针(NP)、马源性特异探针(MP)和鸭源性探针(YP)以及所述马源特异引物，C体系包括包括上述的水貂源性探针(SDP)、猪源性探针(ZP)和鼠源性探针(SP)，其中，每个体系内的三种特异性探针所标记的荧光基团各不相同。

所述PCR反应所必需的反应原料和试剂包括：10×PCR缓冲液、dNTPs，Taq酶和超纯水；

所述试剂盒中各组分构成一个20μl的反应体系：Taq热启动酶1U，10×PCR缓冲液(包含600mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液Tris-Cl(pH8.9),500mmol/L氯化钾(KCl)，25mmol/L氯化镁(MgCl₂),10mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，2.5mmol/L dNTPs)，各引物对终浓度为0.2～0.5μmol/L，各探针浓度为0.05～0.5μmol/L，含有内标的重组质粒DNA浓度0.1～1pg。

本发明还提供了利用上述引物、探针组合物或者试剂盒同时鉴别牛、马、羊、猪、鸡、鸭、狐狸、水貂和鼠9种动物源性成分的中的应用以及多重实时荧光PCR检测方法，该方法快速方便、准确度高，通量大。

一种鉴定食品或饲料中9种动物源性成分的实时荧光PCR联合检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待检样品的基因组DNA，备用；

(2)利用所述引物、探针组合物，或所述的PCR联合检测试剂盒对步骤(1)中提取的基因组DNA进行PCR扩增，收集荧光信号，进行判断，所述PCR扩增程序为：95℃3min预变性，95℃5s，60℃20s～60s，在此收集荧光信号，共计45个循环，扩增阶段反应可在5通道的任何型号的荧光定量PCR仪上进行,根据不同仪器反应时间可作相应的调整；

(3)结果判读：收集PCR过程中的荧光信号，通过相应的荧光信号扩增曲线、Ct值鉴别待检样本中是否含有所述9种动物源性成分。

上述方法中，所述待检样本可以为冷鲜肉、冻肉、肉类加工制品、动物油脂、饲料原料肉骨粉等。

基于荧光探针标记多重实时荧光PCR检测技术是设计通用引物和特异性探针，通过不同荧光探针信号来鉴别动物源性成分，在反应体系中加外源性内标(IAC)质控体系对反应体系进行监测，可避免假阴性结果的产生，能提高检测准确性。为了达到同时检测食品及饲料中牛、马、山羊、绵羊、猪、鸡、鸭、狐狸、水貂和鼠9种动物源性成分的目的，选用特异性好灵敏度高的引物及探针是本发明的关键，为了克服多对引物对多重PCR反应体系带来的引物之间相互干扰的弊端，本发明选择了9种动物的共有的一对引物。根据食品饲料深度加工导致DNA高度降解的特点，采用动物线粒体DNA作为靶基因，其原因在于线粒体DNA在遗传上相对独立，相对核基因拷贝数相当高等特点，因此用线粒体DNA分子标记鉴别动物源性成分具有灵敏度高、精确度高、降解小(加工过程中线粒体DNA保持相对完整)、稳定易操作等优势。根据相关文献报道选用线粒体上的16SrDNA基因具有高度保守型，被广泛用于多物种源性鉴定，使用Primer5.0软件对上述物种的16SrDNA基因序列在保守区设计通用引物，在可变区设计相应的特异性探针，设计的探针必须满足种间特异种内保守原则。另外由于在选取的通用引物扩增范围内马与驴同源性非常近，只有个别碱基差异，所以需单独设计专属马与驴的引物及特异探针。

本发明与现有的检测技术相比其优点在于：

a.本发明采用多重实时荧光PCR技术对肉、肉类加工食品及饲料原料肉骨粉中鉴别牛、马、羊、猪、鸡、鸭、狐狸、水貂和鼠等9种动物源性成分。以线粒体16SrDNA为靶基因设计通用引物，分别设计9种物种的特异性及强的分子信标探针，设计构建扩增内标，针对内标序列设计特异探针，分3组PCR反应体系进行，通过相应荧光探针信号及Ct值直接判读各物种源性成分。该方法成本低、省时、高效，可同时实现多物种鉴别。

b.本发明的试剂盒中仅含有一对通用引物，降低了多对引物对荧光定量PCR体系产生干扰的风险；内标质控体系的加入能有效指示假阴性出现，提高检测的准确性；该试剂盒4重多色荧光定量PCR检测，通过3组PCR体系可完成9种动物源性定性检测，特别适合混合样本检测。

c.本发明全程闭管操作，不易污染，具有准确稳定、操作简单、灵敏度高，特异性强，通量大等优势。

附图说明

图1.多重PCR体系A对绵羊基因组DNA的特异性扩增曲线图。

图2.多重PCR体系A对山羊基因组DNA的特异性扩增曲线图。

图3.多重PCR体系A对狐狸基因组DNA的特异性扩增曲线图。

图4.多重PCR体系A对鸡基因组DNA的特异性扩增曲线图。

图5.多重PCR体系A对其它物种的基因组DNA无特异性扩增曲线，仅有内标质控曲线。

图6.多重PCR体系B对牛基因组DNA的特异性扩增曲线图。

图7.多重PCR体系B对鸭基因组DNA的特异性扩增曲线图。

图8.多重PCR体系B对马基因组DNA的特异性扩增曲线图。

图9.多重PCR体系B对其它物种的基因组DNA无特异性扩增曲线，仅有内标质控曲线。

图10.多重PCR体系C对猪基因组DNA的特异性扩增曲线图。

图11.多重PCR体系C对水貂基因组DNA的特异性扩增曲线图。

图12.多重PCR体系C对鼠基因组DNA的特异性扩增曲线图。

图13.多重PCR体系C对其它物种的基因组DNA无特异性扩增曲线，仅有内标质控曲线。

图14.当马的基因组DNA含量为0.01ng、0.005ng时Ct值<35当DNA含量0.0025ng时有的Ct值＞35，所以本方法的灵敏度DNA含量为0.005ng。

图15.当牛的基因组DNA含量为0.01ng、0.005ng时Ct值<35当含有0.0025ng时有的Ct值＞35，所以本方法的灵敏度DNA含量为0.005ng。

图16.当鸭的基因组DNA含量为0.01ng、0.005ng时Ct值<35当含有0.0025ng时有的Ct值＞35，所以本方法的灵敏度DNA含量为0.005ng。

图17.当猪的基因组DNA含量为0.01ng、0.005ng时Ct值<35当含有0.0025ng时有的Ct值＞35，所以本方法的灵敏度DNA含量为0.005ng。

图18.当水貂的基因组DNA含量为0.01ng、0.005ng时Ct值<35当含有0.0025ng时有的Ct值＞35，所以本方法的灵敏度DNA含量为0.005ng。

图19.当属的基因组DNA含量为0.01ng、0.005ng时Ct值<35当含有0.0025ng时有的Ct值＞35，所以本方法的灵敏度DNA含量为0.005ng。

图20.当狐狸的基因组DNA含量为0.01ng、0.005ng时Ct值<35当含有0.0025ng时有的Ct值＞35，所以本方法的灵敏度DNA含量为0.005ng。

图21.当羊的基因组DNA含量为0.01ng、0.005ng时Ct值<35当含有0.0025ng时有的Ct值＞35，所以本方法的灵敏度DNA含量为0.005ng。

图22.当鸡的基因组DNA含量为0.01ng、0.005ng时Ct值<35当含有0.0025ng时有的Ct值＞35，所以本方法的灵敏度DNA含量为0.005ng。

图23.为样品中同时检出羊、鸡和狐狸源性成分。

图24.为样品中同时检出牛、马和鸭源性成分。

图25.为样品中同时检出猪、水貂和老鼠源性成分。

图26.为样品中同时检出鸡、鸭和羊源性成分。

具体实施方式

以下将参照附图说明对本发明的优先实施例进行详细描述。这些实施例仅用于说明而不用于限制本发明的范围。为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步详细描述。

实验材料：牛、马、羊、猪、鸡、鸭标准品有山东省农科院畜牧所提供，狐狸、水貂和鼠来自山东省饲料质量检验所，待检样本来源于山东省食品药品检验研究院及购自济南各大超市、农贸市场，取样的近300份样品，包括鲜肉、冷冻肉(整块肉、碎肉、压缩肉卷、肉片等各种类型)，肉类加工食品、饲料原料肉骨粉。

仪器：4通道以上实时荧光定量PCR仪如ABI7500等，紫外分光光度计，电子天平，最高转速15000rpm台式离心机，水浴锅，高压灭菌锅等常规仪器。

实施例1

1.引物探针设计：根据Genebank数据库中已公布的牛、羊、猪、鸡、狐狸、水貂、马、鸭和鼠的线粒体基因组序列信息，根据相关文献报道选用线粒体上的16SrDNA基因，使用Primer5.0软件对上述物种的16SrDNA基因序列在保守区设计通用引物，使用ABI PrimerExpress软件在可变区设计相应的特异性分子信标探针，设计的探针必须满足种间特异种内保守原则。本发明中，所述牛、马、山羊、绵羊、猪、鸡、鸭、狐狸、水貂和鼠特异探针和内标探针的5’端均修饰有报告基团，所述报告基团可以为FAM、JOE、CY3、CY5等，3’端均修饰有淬灭基团，所述淬灭基团可以为TAMRA、BHQ1、BHQ2、DABCYL等。

所用通用引物及探针序列如下：

2.本发明还提供了一种鉴别牛、马、山羊、绵羊、猪、鸡、鸭、狐狸、水貂和鼠的多重实时荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：a.一对通用引物、一对马源特异引物、一对内标特异引物组合物；b.牛、马、羊、猪、鸡、鸭、狐狸、水貂和鼠特异探针和内标探针组合物；c.内标重组质粒；d.10×TaqMan Master mix(包含Taq热启动酶、MgCL₂、dNTP等组份)；e.包含牛、马、山羊、绵羊、猪、鸡、鸭、狐狸、水貂和鼠阳性对照品；f.包含9种以外的其他物种DNA作为阴性对照品；g.双蒸水。

所述试剂盒中，各成分的用量可以参照现有技术中公开的用量规则来选择，当试剂盒PCR反应体系为20μl时，体系中各成分可以按照以下用量选择：10×TaqMan Mastermix 2μl，通用引物对终浓度为0.2～0.5μmol/L，探针浓度为0.05～0.5μmol/L，含有内标质粒DNA浓度0.1～1pg/μl。

所述最佳反应条件为95℃3min；95℃5s，60℃35s(收集荧光信号)，45cycles。

实施例2

采用本发明试剂盒和多重实时荧光PCR检测方法检测肉、肉类加工食品及饲料原料肉骨粉中多物种动物源性联合检测的方法步骤如下：

1.DNA提取：

根据样品类型不同，按以下方式之一进行预处理：

a)样品为整块肉时，按照样品制备方法混匀后，取适量肉块，将试样用生理盐水清洗后，在液氮中充分研磨成粉末，称取0.03g装入2mL的离心管中，加入400μL的DNA提取细胞裂解液，10μL蛋白酶K混匀，56℃水浴2h，期间不时轻微摇匀。加入10μL RNA酶，37℃酶解1h。

b)样品为碎肉、肉片或肉卷等冷冻混合肉类或肉类加工制品以及饲料原料肉骨粉时，按照样品制备方法混匀后，称取适量样品，将试样用生理盐水清洗后，在液氮中充分研磨成粉末，称取5g样品于50mL离心管中，加入10mLDNA提取细胞裂解液和200μL蛋白酶K，混匀，56℃水浴消化过夜。取3次1mL的裂解液分别加入到3个1.5mL的EP管中，加入10μL RNA酶，37℃酶解1h。

c)向裂解液中加入等体积氯仿：异戊醇(24∶1)，缓慢颠倒混匀10min，4℃，12000g离心10min，取上清液转移到新的1.5mL离心管中。加入等体积氯仿，充分混匀，4℃，12000g离心10min。将上清转至新的EP管中，加入2.5倍体积的4℃预冷的无水乙醇和0.1倍体积的乙酸钠缓冲液，轻轻颠倒混匀，可见白色DNA絮状沉淀析出，4℃，12000g，离心5min，沉淀DNA，弃上清液。加入1mL4℃预冷的70％乙醇洗涤，12000g，离心3min，弃去乙醇洗涤液，重复洗涤一次。室温下放置使残余乙醇完全挥发，加入50μLTE溶解DNA，-20℃保存备用。

2核酸浓度及纯度测定

用紫外分光光度计对提取的DNA进行核酸浓度与纯度检测，OD₂₆₀nm和OD₂₈₀nm处测定其吸光值，OD₂₆₀/₂₈₀比值控制在1.7～1.9，试验用DNA浓度控制在0.1～50ng/μL之间。

3实时荧光PCR反应

本发明分A、B、C 3组PCR反应体系进行多重实时荧光PCR反应，见表1。每组PCR反应体系中包含3种动物源性的特异探针，并加入外源质控体系，排除由抑制成分造成的假阴性的可能，实现9种动物源性成分的定性检测。

表1 PCR反应体系

A组体系：

试剂名称	终浓度
		Taq酶	1U
10×PCRBuffer	1×
		UNF	0.2～0.5μmol/L
UNR	0.2～0.5μmol/L
		MY-P-(JOE)	0.05～0.2μmol/L
H-P(FAM)	0.20～0.4μmol/L
		J-Probe(CY3)	0.25～0.5μmol/L
内标上游引物IMF	0.05～0.2μmol/L
		内标下游引物IMR	0.05～0.2μmol/L
内标探针IMP(CY5)	0.05～0.2μmol/L
		10^-3内标质粒(原始浓度为1ng/μL)	1μL
DNA模板	2μL
		ddH₂O	To20μL

B组体系：

试剂名称	终浓度
		Taq酶	1U
10×PCRBuffer	1×
		UNF	0.2～0.5μmol/L
UNR	0.2～0.5μmol/L
		LMF1	0.2～0.5μmol/L
LMR1	0.2～0.5μmol/L
		N-P(JOE)	0.05～0.2μmol/L
MP(FAM)	0.05～0.1μmol/L
		Y-Probe(CY3)	0.25～0.5μmol/L
内标上游引物IMF	0.05～0.2μmol/L
		内标下游引物IMR	0.05～0.2μmol/L
内标探针IMP(CY5)	0.05～0.2μmol/L
		10^-3内标质粒(原始浓度为1ng/μL)	1μL
DNA模板	2μL
		ddH₂O	To20μL

C组体系：

试剂名称	终浓度
		Taq酶	1U
10×PCRBuffer	1×
		UNF	0.2～0.5μmol/L
UNR	0.2～0.5μmol/L
		Rat-P2(FAM)	0.05～0.2μmol/L
SD-Probe(CY3)	0.2～0.5μmol/L
		Z-Probe(JOE)	0.05～0.2μmol/L
内标上游引物IMF	0.05～0.2μmol/L

内标下游引物IMR	0.05～0.2μmol/L
		内标探针IMP(CY5)	0.05～0.2μmol/L
10^-3内标质粒(原始浓度为1ng/μL)	1μL
		DNA模板	2μL
ddH₂O	To20μL

每个PCR反应设置3次平行。在试样PCR反应的同时，设置阴性对照、空白对照和阳性对照。

阴性对照品:以9种动物之外的哺乳动物基因组DNA为阴性对照；

空白对照品：以DNA提取过程中以水代替样品设置提取作为空白对照；

阳性对照品：以羊、狐狸、鸡、牛、马、鸭、猪、水貂和鼠基因组DNA作为阳性对照，其中将羊、狐狸和鸡基因组DNA等浓度等体积混合作为A体系的阳性对照品，将牛、马和鸭基因组DNA等浓度等体积混合作为B体系的阳性对照品，将猪、水貂和鼠基因组DNA等浓度等体积混合作为C体系的阳性对照品。

4实时荧光PCR反应循环参数

实时荧光PCR反应条件根据仪器型号不同略有改变，一般为：42℃5min；95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃退火延伸35s(收集荧光信号)，45个循环。

5结果分析与表述

5.1PCR的有效性判定

空白对照：A、B、C 3组PCR体系对应的反应孔均无FAM，JOE，CY3荧光信号，相应Ct值>40.0，有CY5质控探针的荧光信号，且Ct值≤35.0说明PCR体系有效性。

阴性对照：A、B、C 3组PCR体系对应的反应孔均无FAM，JOE，CY3荧光信号，相应Ct值>40.0，有CY5质控探针的荧光信号，且Ct值≤35.0说明PCR体系有效性。

阳性对照：A、B、C 3组PCR体系对应的反应孔中均有FAM，JOE，CY3荧光信号S型扩增曲线，且Ct值≤35.0说明PCR体系有效性。

5.2DNA提取有效性判定

在同时进行的空白、阴性对照和阳性对照实验结果正常的情况下，被检测样品应有相应荧光信号检出，且相应荧光通道出现明显的扩增曲线，满足Ct值≤35.0。

5.3样品检测结果分析和表述

在符合5.1和5.2的情况下，使用A、B、C 3组PCR反应体系对被检样品进行羊、狐狸、鸡、牛、马、鸭、猪、水貂和鼠9种动物源性成分鉴定：

如有FAM，JOE，CY3荧光扩增曲线检出，且Ct值≤35.0，则判定样品检出相应的动物源性成分；

如Ct值>40.0，则判定为未检出相应的动物源性成分；

如35.0<Ct值≤40.0，则需要重复实验，再次扩增后的Ct值仍<40，且阴性对照、空白对照和阳性对照结果正常，则判定该样品检出相应的动物源性成分；再次扩增后Ct值≥40，且阴性对照、空白对照和阳性对照结果正常，则判定该样品未检出相应的动物源性成分。

实施例3试剂盒特异性验证

用建立好的多重PCR体系对牛(N)、山羊(SY)、绵羊(MY)、狐狸(H)，水貂(Sd)，鸭(Ya)，鸡(J)、猪(Z)、马(M)及鼠肉(S)、驴(L)、兔(R)、貉子(HZ)、狗(G)、鱼(Yu)共15种物种的基因组DNA进行检测，用Nanodrop紫外分光光度计检测浓度，统一稀释到10ng水平，进行特异性验证实验，扩增结果表明：

(1)多重PCR体系A(包括羊、狐狸和鸡混合探针)，只相应的对羊，狐狸和鸡DNA为模板时才有相应的扩增曲线，其他物种除质控探针的扩增曲线外，无相应的扩增，表明PCR扩增体系具有良好的扩增特异性，见图1至图5；

(2)多重PCR体系B(包括牛、马和鸭混合探针)，只相应的对牛，马和鸭DNA为模板时才有相应的扩增曲线，其他物种除质控探针的扩增曲线外，无相应的扩增，表明PCR扩增体系具有良好的扩增特异性，见图6至图9；

(3)多重PCR体系C(包含水貂，猪和鼠混合探针)，只相应的对水貂，猪及鼠的DNA为模板时才有相应的扩增曲线，其他物种除质控探针的扩增曲线外，无相应的扩增，表明PCR扩增体系具有良好的扩增特异性，见图10至图13。

实施例4试剂盒灵敏度验证

将牛肉(N)、羊肉(Y)、狐狸(H)、水貂(Sd)、鸭(Ya)、鸡肉(J)、猪肉(Z)、马肉(M)及鼠肉(R)共9种肉的基因组DNA分别定量到0.002ng/μL、0.001ng/μL、0.0005ng/μL、0.0002ng/μL每个反应加量为5μL，即9种肉的基因组DNA含量分别为0.01ng、0.005ng、0.0025ng、0.001ng，9种肉的各个浓度梯度的样品均设置5个平行样进行PCR扩增，进一步评价检测方法的灵敏度。图14-图22所示，9种物种肉类基因组DNA含量0.01ng、0.005ng时Ct值<35，当含有0.0025ng时有的Ct值＞35，所以本方法的灵敏度DNA含量为0.005ng。

实施例5掺假检出限验证

按照常见肉类食品掺假情况来模拟掺假检测，牛肉中分别掺入1％，

2％，5％，10％，20％，50％的马肉、鸭肉、猪肉、水貂肉；

羊肉中分别掺入1％，2％，5％，10％，20％，50％的狐狸肉、鼠肉、鸭肉、鸡肉，见表2。对上述样品充分混匀，提取基因组DNA，进行多重实时荧光PCR检测，每个样品设4个平行样。

表2牛羊肉类掺假比例表

结果分析，当牛肉中分别掺入1％，2％，5％，10％，20％，50％的马肉、鸭肉、猪肉、水貂肉；羊肉中分别掺入1％，2％，5％，10％，20％，50％的狐狸肉、鼠肉、鸭肉、鸡肉时，均能被检出，所以肉类掺假检出限为1％。1％掺假肉添加量，对于违法商户来说，没有任何添加意义，因此，1％检出限适用于肉类真伪的真实性鉴定，见表3-表6。

表3牛肉分别掺假马肉和鸭肉检出限

掺假比例	牛	马	鸭	结果判定
					牛肉中掺入0％的马肉	18.25	N	N	检出牛源性成分
牛肉中掺入1％的马肉	25.62	33.56	N	检出牛源性和马源性成分
					牛肉中掺入20％的马肉	22.69	24.14	N	检出牛源性和马源性成分
牛肉中掺入50％的马肉	20.17	19.46	N	检出牛源性和马源性成分
					牛肉中掺入0％的鸭肉	19.45	N	N	检出牛源性成分
牛肉中掺入1％的鸭肉	18.75	N	30.65	检出牛源性和鸭源性成分
					牛肉中掺入20％的鸭肉	21.45	N	27.66	检出牛源性和鸭源性成分
牛肉中掺入50％的鸭肉	20.41	N	21.52	检出牛源性和鸭源性成分

表4牛肉分别掺假猪肉和水貂肉检出限

掺假比例	牛	猪	水貂	结果判定
					牛肉中掺入0％的猪肉	18.33	N	N	检出牛源性成分
牛肉中掺入1％的猪肉	18.75	31.12	N	检出牛源性和猪源性成分
					牛肉中掺入20％的猪肉	20.17	26.43	N	检出牛源性和猪源性成分
牛肉中掺入50％的猪肉	22.46	20.79	N	检出牛源性和猪源性成分
					牛肉中掺入0％的水貂肉	17.54	N	N	检出牛源性成分
牛肉中掺入1％的水貂肉	17.26	32.59	N	检出牛源性和水貂源性分
					牛肉中掺入20％的水貂肉	20.37	25.46	N	检出牛源性和水貂源性分
牛肉中掺入50％的水貂肉	19.56	18.97	N	检出牛源性和水貂源性分

表5羊肉分别掺假狐狸肉和鸡肉检出限

掺假比例	羊	狐狸	鸡	结果判定
					羊肉中掺入0％的狐狸肉	16.98	N	N	检出羊源性成分
羊肉中掺入1％的狐狸肉	17.82	25.14	N	检出羊源性和狐狸源性成分
					羊肉中掺入20％的狐狸肉	18.69	19.27	N	检出羊源性和狐狸源性成分
羊肉中掺入50％的狐狸肉	17.96	18.13	N	检出羊源性和狐狸源性成分
					羊肉中掺入0％的鸡肉	17.09	N	N	检出羊源性成分
羊肉中掺入1％的鸡肉	17.28	N	27.63	检出羊源性和鸡源性成分
					羊肉中掺入20％的鸡肉	17.25	N	20.69	检出羊源性和鸡源性成分
羊肉中掺入50％的鸡肉	18.68	N	19.14	检出羊源性和鸡源性成分

表6羊肉分别掺假鸭肉和鼠肉检出限

掺假比例	羊	鸭	鼠	结果判定
					羊肉中掺入0％的鸭肉	16.33	N	N	检出羊源性成分
羊肉中掺入1％的鸭肉	17.26	31.26	N	检出羊源性和鸭源性成分
					羊肉中掺入20％的鸭肉	19.66	23.56	N	检出羊源性和鸭源性成分

羊肉中掺入50％的鸭肉	18.64	20.46	N	检出羊源性和鸭源性成分
					羊肉中掺入0％的鼠肉	17.99	N	N	检出羊源性成分
羊肉中掺入1％的鼠肉	17.45	N	30.21	检出羊源性和鼠源性成分
					羊肉中掺入20％的鼠肉	19.22	N	25.91	检出羊源性和鼠源性成分
羊肉中掺入50％的鼠肉	18.75	N	20.37	检出羊源性和鼠源性成分

实施例6实际样品检测

未知样本来源于市场抽检取样的近300份样品，包括鲜肉、冷冻肉(整块肉、碎肉、压缩肉卷、肉片等各种类型)，肉类加工食品、饲料原料肉骨粉去掉包装后作为盲样，采用本方法对300份样本进行检测，检测结果通过测序验证。其中同时检测出羊肉和猪肉源性成分样品1份，同时检出猪肉和鸡肉成分样品1份，同时检出羊和鸭成分样品3份(见表7及图23-图26)。

表7.未知样本检测结果

样本编

羊

狐狸

鸡

牛

鸭

马

鼠

水貂Ct

猪

结果判定

1

N

22.72

N

检出牛源性

2

N

16.18

N

检出牛源性

3

N

15.24

N

检出牛源性

4

N

29.51

N

检出牛源性

10

N

19.15

N

检出鸡源性

11

N

15.43

N

检出牛源性

12

N

15.39

N

检出牛源性

27

N

15.57

N

检出牛源性

29

N

17.27

N

检出鸭源性

30

N

15.87

N

检出牛源性

31

N

15.34

N

检出牛源性

32

18.53

N

检出羊源性

33

17.54

N

检出羊源性

39

21.09

N

检出羊源性

40

N

20.17

N

检出牛源性

41

N

14.06

N

检出牛源性

46

N

13.83

N

检出牛源性

47

N

15.66

检出猪源性

48

N

15.54

N

检出牛源性

49

N

13.54

N

检出牛源性

50

N

34.46

N

检出牛源性

51

N

32.38

N

检出牛源性

52

N

23.74

N

检出牛源性

53

26.43

N

检出羊源性

524

31.99

N

检出羊源性

525

N

25.13

N

检出牛源性

526

N

34.99

N

检出牛源性

538

20.16

N

检出羊源性

539

25.96

N

检出羊源性

545

21.21

N

检出羊源性

546

N

20.40

检出猪源性

547

21.85

N

检出羊源性

548

N

18.73

检出猪源性

553

N

23.01

N

检出牛源性

554

N

17.76

N

检出牛源性

575

22.11

N

检出羊源性

579

N

17.29

N

检出牛源性

580

N

21.36

检出猪源性

581

22.60

N

检出羊源性

582

16.20

N

检出牛源性

583

N

21.33

N

21.81

检出鸡源性

584

23.17

N

检出羊源性

585

22.71

N

22.97

N

检出羊源性

587

21.17

N

检出羊源性

588

N

16.99

N

检出牛源性

590

21.59

N

检出羊源性

591

23.58

N

检出羊源性

594

N

23.37

N

检出牛源性

595

23.38

N

检出羊源性

668

20.32

N

检出羊源性

670

N

18.82

N

检出牛源性

673

20.64

N

检出羊源性

674

21.37

N

检出羊源性

693

N

25.77

N

检出牛源性

716

24.18

N

检出羊源性

718

26.03

N

18.58

N

检出羊源性

719

N

16.36

N

检出牛源性

720

18.44

N

检出羊源性

721

N

15.94

N

检出牛源性

723

20.97

N

检出羊源性

724

20.35

N

检出羊源性

731

21.03

N

检出羊源性

738

23.49

N

检出羊源性

741

19.54

N

检出羊源性

742

21.95

N

检出羊源性

744

23.84

N

检出羊源性

746

N

18.86

检出猪源性

751

20.77

N

检出羊源性

752

19.77

N

检出羊源性

761

21.46

N

检出羊源性

767

20.00

N

检出羊源性

768

20.37

N

检出羊源性

769

N

18.99

N

检出鸭源性

770

22.30

N

检出羊源性

776

19.42

N

检出羊源性

789

22.35

N

检出羊源性

790

20.63

N

检出羊源性

795

21.13

N

检出羊源性

809

N

25.57

N

检出牛源性

813

N

16.34

检出猪源性

814

19.24

N

检出羊源性

840

18.31

N

检出羊源性

842

24.60

N

检出羊源性

843

N

21.50

N

检出鸭源性

851

N

17.28

N

检出牛源性

853

N

15.56

N

检出牛源性

855

N

17.78

N

检出牛源性

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农科院生物技术研究中心

<120> 快速鉴定食品或饲料中9种动物源性成分的引物、探针组合物、试剂盒及其检测方法和应用

<130> 2015

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagacgagaa gacccatgga ctcta 25

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gattgcgcgg ttatccctag ggta 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tttctcctcg cataagccta tatc 24

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gttcctttta cttcttttaa tctttcct 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccaccaaggg ataacaacac tctggtgg 28

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cggcggtaac taaccaaccc aaagagaatc cgccg 35

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cagcgaagat agggataatc caaaaactaa tcacgctg 38

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cagaccgatg aaatccaaac ccctcggtct g 31

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cggcgaggtc taacacaaca ttattactgg tcgccg 36

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cagtgatgtt atggttattt tgactggttt gcatcactg 39

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgcgcgtcct ccgaatgatt ttaacctaga ctcgcgcg 38

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgggtctggt tactgttggt actttgagag acccg 35

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgcgaaccta agactaaacc caccgggttc gcg 33

<210> 14

<211> 570

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tgcactcctc ctgcatatag accaccaaat gcccctatct tatcaacact tccggaaact 60

actgttgtta gacgaagagg caggtcccct agaagaagaa ctccctcgcc tcgcagacga 120

aggtctcaat cgccgcgtcg cagaagatct caatctcggg aatctcaatg ttagtattcc 180

ttggacacat aaggtgggaa actttacggg gctttattct tctacggtac cttgctttaa 240

tcctaaatgg caaactcctt cttttcctga cattcatttg caggaggaca ttgttgatag 300

atgtaagcaa tttgtggggc cccttacagt aaatgaaaac aggagactaa aattaattat 360

gcctgctagg ttttatccca atgttactaa atatttgccc ttagataaag ggatcaaacc 420

gtattatcca gagtatgtag ttaatcatta cttccagacg agacattatt tacacactct 480

ttggaaggcg gggatcttat ataaaagaga gtccacacgt agcgcctcat tttgcgggtc 540

accatattct tgggaacaaa gagctacaaa 570

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agaccaccaa atgcccctat c 21

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gttcctttta cttcttttaa tctttcct 28

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gcgaggtccc ctagaagaag aactccctcg c 31

Claims

1.鉴定食品或饲料中9种动物源性成分的引物、探针组合物，其特征在于，包括以下引物和探针，其核苷酸序列如下：

(1)引物

通用引物序列：

上游序列：UN-F：AAGACGAGAAGACCCATGGACTCTA，如SEQ ID NO.1所示；

下游序列：UN-R：GATTGCGCGGTTATCCCTAGGGTA，如SEQ ID NO.2所示；

马源特异引物：

上游序列：LMF：TTTCTCCTCGCATAAGCCTATATC，如SEQ ID NO.3所示；

下游序列：LMR：GTTCCTTTTACTTCTTTTAATCTTTCCT，如SEQ ID NO.4所示；

(2)所述9种动物源性成分探针：

羊源性特异探针MYP：5’-CCACCAAGGGATAACAACACTCTGGTGG-3’，如SEQ ID NO.5所示；

牛源性特异探针NP：5’-CGGCGGTAACTAACCAACCCAAAGAGAATCCGCCG-3’，如SEQ ID NO.6所示；

马源性特异探针MP：5’-CAGCGAAGATAGGGATAATCCAAAAACTAATCACGCTG-3’，如SEQIDNO.7所示；

狐狸源性探针HP：5’-CAGACCGATGAAATCCAAACCCCTCGGTCTG-3’，如SEQ ID NO.8所示；

水貂源性探针SDP：5’-CGGCGAGGTCTAACACAACATTATTACTGGTCGCCG-3’，如SEQ ID NO.9所示；

猪源性探针ZP：5’-CAGTGATGTTATGGTTATTTTGACTGGTTTGCATCACTG-3’，如SEQ ID NO.10所示；

鼠源性探针SP：5'-CGCGCGTCCTCCGAATGATTTTAACCTAGACTCGCGCG-3’，如SEQ ID NO.11所示；

鸡源性探针JP：5’-CGGGTCTGGTTACTGTTGGTACTTTGAGAGACCCG-3’，如SEQ ID NO.12所示；

鸭源性探针YP：5’-CGCGAACCTAAGACTAAACCCACCGGGTTCGCG-3’，如SEQ ID NO.13所示；

其中，所有所述探针的5’端修饰有荧光报告基团，所述各探针的荧光报告基团为FAM、JOE、CY3、CY5和ROX中的任意一种，所述各探针的3’端修饰有淬灭基团，为TAMRA、DABCYL、BHQ1和BHQ2中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的鉴定食品或饲料中9种动物源性成分的引物、探针组合物，其特征在于，所有所述探针的5’端修饰的荧光报告基团和3’端修饰的淬灭基团分别是：

羊源性特异探针MYP、牛源性特异探针NP和猪源性探针ZP的荧光报告基团均用JOE标记；马源性特异探针MP、鼠源性探针SP和狐狸源性特异探针HP的荧光报告基团均用FAM标记；水貂源性探针SDP、鸡源性探针JP和鸭源性探针YP的荧光报告基团均用CY3标记；所有探针的3’端的淬灭基团均用DABCYL修饰。

3.根据权利要求1或2所述的鉴定食品或饲料中9种动物源性成分的引物、探针组合物，其特征在于，还包括内标基因及对应的外源性内标引物IMF和IMR和外源性内标探针IMP，其内标基因核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

外源性内标引物：

上游序列IMF：5’-AGACCACCAAATGCCCCTATC-3’，如SEQ ID NO.15所示；

下游序列IMR：5’-GTTCCTTTTACTTCTTTTAATCTTTCCT-3’，如SEQ ID NO.16所示；

外源性内标探针IMP：5’-GCGAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGC-3’，如SEQ ID NO.17所示；

其中，外源性内标探针IMP的5’端修饰有荧光报告基团，所述荧光报告基团为FAM、JOE、CY3、CY5或ROX，外源性内标探针IMP的3’端修饰有淬灭基团，所述淬灭基团为TAMRA、DABCYL、BHQ1或BHQ2。

4.根据权利要求3所述的鉴定食品或饲料中9种动物源性成分的引物、探针组合物，其特征在于，所述内标基因以重组质粒的形式存在，所述重组质粒为将内标基因片段连接到PMD18-T载体上形成。

5.一种鉴定食品或饲料中9种动物源性成分的实时荧光PCR联合检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述引物、探针组合物，权利要求4所述引物、探针组合物中的重组质粒及权利要求3所述引物、探针组合物中的外源性内标引物IMF和外源性内标探针IMP，以及PCR反应所必需的试剂。

6.根据权利要求5所述的鉴定食品或饲料中9种动物源性成分的实时荧光PCR联合检测试剂盒，其特征在于，所述PCR联合检测试剂盒分为三个PCR反应体系，分别是A体系、B体系和C体系，每个体系共用所述试剂盒中的通用引物，重组质粒及对应的所述外源性内标引物对和外源性内标探针IMP以及PCR反应所必需的试剂，A体系包括上述的羊源性特异探针MYP、狐狸源性探针HP和鸡源性探针JP，B体系包括上述的牛源性特异探针NP、马源性特异探针MP和鸭源性探针YP以及所述马源特异引物，C体系包括上述的水貂源性探针SDP、猪源性探针ZP和鼠源性探针SP，其中，每个体系内的三种特异性探针所标记的荧光基团各不相同。

7.根据权利要求5或6所述的鉴定食品或饲料中9种动物源性成分的实时荧光PCR联合检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应所必需的试剂包括：PCR缓冲液，MgCl₂、dNTPs，Taq酶和超纯水；所述试剂盒中各组分构成一个20μl的反应体系：10×TaqMan Master mix 2μl，各引物对终浓度为0.2～0.5μmol/L，各探针浓度为0.05～0.5μmol/L，重组质粒DNA浓度0.1～1pg/μl。

8.权利要求1或2所述的鉴定食品或饲料中9种动物源性成分的引物、探针组合物在鉴定食品或饲料中9种动物源性成分中的应用。

9.权利要求5～7中任一项所述的食品或饲料中9种动物源性成分的实时荧光PCR联合检测试剂盒在鉴定食品或饲料中9种动物源性成分中的应用。

10.一种鉴定食品或饲料中9种动物源性成分的实时荧光PCR联合检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待检样品的基因组DNA，备用；

(2)利用权利要求1-4中任一项所述引物、探针组合物，或权利要求5-7中任一项所述的PCR联合检测试剂盒对步骤(1)中提取的基因组DNA进行PCR扩增，收集荧光信号，进行判断，所述PCR扩增程序为：95℃3min预变性，95℃5s，60℃35s，在此收集荧光信号，共计45个循环；