CN109576186A - 一种石油烃类降解复合菌剂及其制备方法 - Google Patents

一种石油烃类降解复合菌剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种石油烃类降解复合菌剂及其制备方法，该方法包括如下步骤：1)制备降解菌悬液：将分支杆菌CSC‑6、门多萨假单胞菌PM、施氏假单胞菌JN4、施氏假单胞菌JN5、地衣芽孢杆菌Y‑1、短小芽孢杆菌L‑2、不动杆菌XH‑2和琼氏不动杆菌BD分别培养至对数生长期；之后将各个菌悬液混合得到降解菌悬液；2)向所述步骤1)得到的降解菌悬液中加入吸附剂和海藻酸钠；3)将所述步骤2)得到的中间物加入造粒机中造粒；4)制备包膜乳液；5)将所述步骤4)得到的包膜乳液喷涂至所述步骤3)得到的颗粒表面，从而得到石油烃类降解复合菌剂。该方法制备的复合菌剂能够有效降解土壤中的石油，达到治理石油污染土壤的目的。

Description

一种石油烃类降解复合菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于土壤改良技术领域，尤其是涉及一种石油烃类降解复合菌剂及其制备方法。
背景技术
石油是现代社会的最主要能源之一，被称作“工业的血液”、“黑色的金子”。石油被广泛应用于制备天然气、汽油、煤油、挥发油、润滑油、石蜡和沥青等工业领域。在原油的加工、使用及运输过程中容易造成溢洒及泄漏事故，导致石油进入水体、土壤等环境中造成石油污染。石油是由多种烃类、少量非烃化合物组成的复杂混合物，它在环境中难以被降解，其组分中的多环芳烃是一种持久性有机污染物(POPs)。石油污染物有致癌、致畸、致突变的危害。
国内外处理石油污染有物理方法、化学方法、生物方法三类。物理、化学方法存在处理成本高、污染物处理不彻底的问题，而生物修复技术是近年来发展的一项清洁环境的新兴技术，它是利用特定的动物、植物、微生物等的生命活动清除环境中的污染物，但微生物在污染物降解中的作用最大，而且微生物降解已被证实是一种非常有效的石油污染清除技术，其具有经济高效、环境友好、不产生二次污染等优点。但目前用于石油烃类降解复合菌剂虽然也含有一些能够降解石油的微生物，但这些复合菌剂的降解效果差强人意，并不能很好的改善土壤的状况，并不利于作物的生长。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种能够有效降解土壤中的石油，达到治理石油污染土壤的目的的石油烃类降解复合菌剂及其制备方法。
本发明所采用的菌株均为现有已保藏菌株，其中，分支杆菌CSC-6保藏编号为CCTCC NO.M 2017726，门多萨假单胞菌PM保藏编号为CCTCC NO：M2017347，施氏假单胞菌JN4保藏号为CGMCC NO.14975，施氏假单胞菌JN5保藏号为CGMCC NO.14976，地衣芽孢杆菌Y-1保藏号为CGMCC No.11019，短小芽孢杆菌L-2保藏号为CCTCC M 2015438，琼氏不动杆菌BD的保藏号为CGMCC NO.13206。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种石油烃类降解复合菌剂的制备方法，该方法包括如下步骤：
1)制备降解菌悬液：将分支杆菌CSC-6、门多萨假单胞菌PM、施氏假单胞菌JN4、施氏假单胞菌JN5、地衣芽孢杆菌Y-1、短小芽孢杆菌L-2、不动杆菌XH-2和琼氏不动杆菌BD分别培养至对数生长期，用分别用生理盐水将菌体洗净后，再用生理盐水将菌体调配成菌悬液，使菌悬液的OD600＝0.5-1；之后将分支杆菌CSC-6、门多萨假单胞菌PM、施氏假单胞菌JN4、施氏假单胞菌JN5、地衣芽孢杆菌Y-1、短小芽孢杆菌L-2、不动杆菌XH-2和琼氏不动杆菌BD的菌悬液按照体积比1-1.5:1-1.2:0.5-1:0.5-1:0.1-0.5:0.1-0.5:0.1-0.5:0.1-0.5混合得到降解菌悬液；
2)向所述步骤1)得到的降解菌悬液中加入吸附剂和海藻酸钠，混匀后干燥；
3)将所述步骤2)得到的中间物加入造粒机中造粒；
4)制备包膜乳液：将葡萄糖、复合酶、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、Na2HPO4、蛋白胨、琼脂、酵母粉按照重量份数比30-50：10-25：1-10:1-8:2-5：1-5:3-6:40-50:10-15:20-40混匀，得到混合粉体；将该粉体与水按重量份数比1:5混合，然后球磨混合6-8h，得到包膜乳液；
5)将所述步骤4)得到的包膜乳液喷涂至所述步骤3)得到的颗粒表面，从而得到石油烃类降解复合菌剂。
进一步，所述复合菌剂中，分支杆菌CSC-6的活菌含量为1×108～1×1010cfu/g，门多萨假单胞菌PM的活菌含量为1×108～7×109cfu/g，施氏假单胞菌JN4的活菌含量为1×107～3×108cfu/g，施氏假单胞菌JN5的活菌含量为1×107～3×108cfu/g，地衣芽孢杆菌Y-1的活菌含量为1×105～2×107cfu/g，短小芽孢杆菌L-2的活菌含量为1×105～1×107cfu/g，不动杆菌XH-2的活菌含量为1×105～3×107cfu/g和琼氏不动杆菌BD的活菌含量为1×105～2.5×107cfu/g。
进一步，所述复合酶包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶、纤维素酶和β-葡萄糖酶。
进一步，所述步骤5)中的包膜乳液喷涂4-6次，每次喷涂厚度为0.1-0.2mm，每次喷涂结束在真空度为1-3kpa、温度为-5～-2℃下冷冻20-25分钟后再进行下一次喷涂。
进一步，所述步骤3)得到的颗粒的粒径为3-4mm。
进一步，所述步骤2)中干燥温度为25-35℃。
进一步，所述步骤4)球磨的速度为1000-1500r/min。
本发明还提供了一种利用上述的制备方法制备得到的石油烃类降解复合菌剂。
本发明还提供了一种使用上述的石油烃类降解复合菌剂修复石油污染土壤的方法，该方法包括如下步骤：对石油污染土壤进行翻耕预处理，将复合菌剂按照10g/m3加入到石油污染土壤中，再翻耕混匀；整个土壤修复过程中使土壤含水量保持在25％～35％。
相对于现有技术，本发明所述的石油烃类降解复合菌剂及其制备方法具有以下优势：
(1)本发明所述的石油烃类降解复合菌剂采用了多种菌复合对土壤中的石油进行处理，其中，分支杆菌CSC-6既能够降解较低浓度和较高浓度石油污染物，又对长链烃具有较高降解作用；施氏假单胞菌JN4对n-C10～n-C30具有明显的降解能力，且该菌株对环烷烃萘烷、茚烷、高雄烃的降解能力较强；施氏假单胞菌JN5对n-C10～n-C26的直链石油烃具有较强的降解能力；地衣芽孢杆菌Y-1、短小芽孢杆菌L-2、不动杆菌XH-2和琼氏不动杆菌BD这几种菌能利用石油烃作为单一碳源生长，且有较高的石油降解能力，同时可生产性能优秀的生物表面活性剂，生物表面活性剂中含有既亲水又亲油的基团的物质，相较于化学表面活性剂，庞大而复杂的化学结构使得表面活性和乳化能力更强，而且微生物所产的生物表面活性剂一般毒性都较低，而且很容易被生物降解，其结构种类也较多，是典型的“绿色”工艺，具有低毒性、环境友好等特性，同时还有助于石油降解微生物的生长。
(2)本发明所述的石油烃类降解复合菌剂制成球形颗粒，有助于运输和贮存，为微生物修复石油污染土壤的实际运用提供了技术支持。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面将结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
一种石油烃类降解复合菌剂的制备方法，该方法包括如下步骤：
1)制备降解菌悬液：将分支杆菌CSC-6、门多萨假单胞菌PM、施氏假单胞菌JN4、施氏假单胞菌JN5、地衣芽孢杆菌Y-1、短小芽孢杆菌L-2、不动杆菌XH-2和琼氏不动杆菌BD分别培养至对数生长期，用分别用生理盐水将菌体洗净后，再用生理盐水将菌体调配成菌悬液，使菌悬液的OD600＝0.6；之后将分支杆菌CSC-6、门多萨假单胞菌PM、施氏假单胞菌JN4、施氏假单胞菌JN5、地衣芽孢杆菌Y-1、短小芽孢杆菌L-2、不动杆菌XH-2和琼氏不动杆菌BD的菌悬液按照体积比1:1:0.6:0.6:0.3:0.2:0.4:0.14混合得到降解菌悬液；
2)向所述步骤1)得到的降解菌悬液中加入吸附剂和海藻酸钠，混匀后干燥，干燥温度为28℃；
3)将所述步骤2)得到的中间物加入造粒机中造粒，得到的颗粒的粒径为3.2mm；
4)制备包膜乳液：将葡萄糖、复合酶、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、Na2HPO4、蛋白胨、琼脂、酵母粉按照重量份数比30:15:5:3:2:5:4:40:11:20混匀，得到混合粉体；将该粉体与水按重量份数比1:5混合，然后在1200r/min下球磨混合6.5h，得到包膜乳液；
其中，复合酶包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶、纤维素酶和β-葡萄糖酶；
5)将所述步骤4)得到的包膜乳液喷涂至所述步骤3)得到的颗粒表面，其中，包膜乳液喷涂4次，每次喷涂厚度为0.1mm，每次喷涂结束在真空度为1.5kpa、温度为-5℃下冷冻20分钟后再进行下一次喷涂，最后得到石油烃类降解复合菌剂。
最终得到的复合菌剂中，分支杆菌CSC-6的活菌含量为1×108cfu/g，门多萨假单胞菌PM的活菌含量为1×108cfu/g，施氏假单胞菌JN4的活菌含量为1×107cfu/g，施氏假单胞菌JN5的活菌含量为1×107cfu/g，地衣芽孢杆菌Y-1的活菌含量为1×105cfu/g，短小芽孢杆菌L-2的活菌含量为1×106cfu/g，不动杆菌XH-2的活菌含量为1×106cfu/g和琼氏不动杆菌BD的活菌含量为1×105cfu/g。
实施例2
一种石油烃类降解复合菌剂的制备方法，该方法包括如下步骤：
1)制备降解菌悬液：将分支杆菌CSC-6、门多萨假单胞菌PM、施氏假单胞菌JN4、施氏假单胞菌JN5、地衣芽孢杆菌Y-1、短小芽孢杆菌L-2、不动杆菌XH-2和琼氏不动杆菌BD分别培养至对数生长期，用分别用生理盐水将菌体洗净后，再用生理盐水将菌体调配成菌悬液，使菌悬液的OD600＝0.85；之后将分支杆菌CSC-6、门多萨假单胞菌PM、施氏假单胞菌JN4、施氏假单胞菌JN5、地衣芽孢杆菌Y-1、短小芽孢杆菌L-2、不动杆菌XH-2和琼氏不动杆菌BD的菌悬液按照体积比1.2:1:0.7:0.6:0.1:0.3:0.5:0.2混合得到降解菌悬液；
2)向所述步骤1)得到的降解菌悬液中加入吸附剂和海藻酸钠，混匀后干燥，干燥温度为30℃；
3)将所述步骤2)得到的中间物加入造粒机中造粒，得到的颗粒的粒径为3.5mm；
4)制备包膜乳液：将葡萄糖、复合酶、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、Na2HPO4、蛋白胨、琼脂、酵母粉按照重量份数比40:10:3:5:4:3:5:45:10:28混匀，得到混合粉体；将该粉体与水按重量份数比1:5混合，然后在1200r/min下球磨混合7h，得到包膜乳液；
其中，复合酶包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶、纤维素酶和β-葡萄糖酶；
5)将所述步骤4)得到的包膜乳液喷涂至所述步骤3)得到的颗粒表面，其中，包膜乳液喷涂4次，每次喷涂厚度为0.15mm，每次喷涂结束在真空度为1kpa、温度为-3℃下冷冻22分钟后再进行下一次喷涂，最后得到石油烃类降解复合菌剂。
最终得到的复合菌剂中，分支杆菌CSC-6的活菌含量为5×109cfu/g，门多萨假单胞菌PM的活菌含量为1×108cfu/g，施氏假单胞菌JN4的活菌含量为2×107cfu/g，施氏假单胞菌JN5的活菌含量为1×107cfu/g，地衣芽孢杆菌Y-1的活菌含量为1×105cfu/g，短小芽孢杆菌L-2的活菌含量为1.2×106cfu/g，不动杆菌XH-2的活菌含量为1.5×106cfu/g和琼氏不动杆菌BD的活菌含量为1×105cfu/g。
实施例3
一种石油烃类降解复合菌剂的制备方法，该方法包括如下步骤：
1)制备降解菌悬液：将分支杆菌CSC-6、门多萨假单胞菌PM、施氏假单胞菌JN4、施氏假单胞菌JN5、地衣芽孢杆菌Y-1、短小芽孢杆菌L-2、不动杆菌XH-2和琼氏不动杆菌BD分别培养至对数生长期，用分别用生理盐水将菌体洗净后，再用生理盐水将菌体调配成菌悬液，使菌悬液的OD600＝0.9；之后将分支杆菌CSC-6、门多萨假单胞菌PM、施氏假单胞菌JN4、施氏假单胞菌JN5、地衣芽孢杆菌Y-1、短小芽孢杆菌L-2、不动杆菌XH-2和琼氏不动杆菌BD的菌悬液按照体积比1.5:1.2:0.8:1:0.5:0.35:0.3:0.4混合得到降解菌悬液；
2)向所述步骤1)得到的降解菌悬液中加入吸附剂和海藻酸钠，混匀后干燥，干燥温度为30℃；
3)将所述步骤2)得到的中间物加入造粒机中造粒，得到的颗粒的粒径为4mm；
4)制备包膜乳液：将葡萄糖、复合酶、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、Na2HPO4、蛋白胨、琼脂、酵母粉按照重量份数比50:25:9:6:5:3:6:50:15:40混匀，得到混合粉体；将该粉体与水按重量份数比1:5混合，然后在1500r/min下球磨混合8h，得到包膜乳液；
其中，复合酶包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶、纤维素酶和β-葡萄糖酶；
5)将所述步骤4)得到的包膜乳液喷涂至所述步骤3)得到的颗粒表面，其中，包膜乳液喷涂6次，每次喷涂厚度为0.2mm，每次喷涂结束在真空度为3kpa、温度为-2℃下冷冻35分钟后再进行下一次喷涂，最后得到石油烃类降解复合菌剂。
最终得到的复合菌剂中，分支杆菌CSC-6的活菌含量为9×109cfu/g，门多萨假单胞菌PM的活菌含量为7×109cfu/g，施氏假单胞菌JN4的活菌含量为4×107cfu/g，施氏假单胞菌JN5的活菌含量为1.5×108cfu/g，地衣芽孢杆菌Y-1的活菌含量为6×106cfu/g，短小芽孢杆菌L-2的活菌含量为2×106cfu/g，不动杆菌XH-2的活菌含量为8×105cfu/g和琼氏不动杆菌BD的活菌含量为1×107cfu/g。
对比例1
在实施例3的基础上不添加地衣芽孢杆菌Y-1、短小芽孢杆菌L-2、不动杆菌XH-2和琼氏不动杆菌BD，其他步骤同实施例3。
对比例2
在实施例3的基础上不添加分支杆菌CSC-6、施氏假单胞菌JN4和施氏假单胞菌JN5，其他步骤同实施例3。
使用上述实施例1～3以及对比例1～2中的复合菌剂对受有机物如石油烃污染的土壤中的污染物进行处理，通过对土壤中的有机污染物如石油烃标准化检测。
对土壤的处理：
1)取加油站污染土壤，破碎，筛分，去除污染土壤中植物根系和大石块等杂质，同时将大块土进行破碎，将土壤pH调整到6.5～7.5的范围内。
2)将步骤1)处理后的土壤平均分成18份分别置于消毒后的容器中，将18份灭菌后的土壤分成6组，分别对应实施例1～3、对比例1～2和不作任何处理的对照例，每组3份。每个实施例/对比例制得的复合菌剂对应加入到其中一组土壤中，混合均匀，其中复合菌剂按照10g/m3加入到石油污染土壤中。
3)一个月后检测经处理后的土壤中VPH、EPA和TPH去除率。VPH相当于汽油，主要为C5～C10的脂肪烃、芳烃、烯烃和环烷烃；EPH相当于柴油，主要为C10～C40间能被二氯甲烷萃取且不被硅酸镁吸附的有机物总和；TPH为总石油烃(VPH和EPH之和)。每组3份取平均值，结果如表1：
表1不同复合菌剂对受污染土壤处理结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种石油烃类降解复合菌剂的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
1)制备降解菌悬液：将分支杆菌CSC-6、门多萨假单胞菌PM、施氏假单胞菌JN4、施氏假单胞菌JN5、地衣芽孢杆菌Y-1、短小芽孢杆菌L-2、不动杆菌XH-2和琼氏不动杆菌BD分别培养至对数生长期，用分别用生理盐水将菌体洗净后，再用生理盐水将菌体调配成菌悬液，使菌悬液的OD600＝0.5-1；之后将分支杆菌CSC-6、门多萨假单胞菌PM、施氏假单胞菌JN4、施氏假单胞菌JN5、地衣芽孢杆菌Y-1、短小芽孢杆菌L-2、不动杆菌XH-2和琼氏不动杆菌BD的菌悬液按照体积比1-1.5:1-1.2:0.5-1:0.5-1:0.1-0.5:0.1-0.5:0.1-0.5:0.1-0.5混合得到降解菌悬液；
2)向所述步骤1)得到的降解菌悬液中加入吸附剂和海藻酸钠，混匀后干燥；
3)将所述步骤2)得到的中间物加入造粒机中造粒；
4)制备包膜乳液：将葡萄糖、复合酶、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、Na2HPO4、蛋白胨、琼脂、酵母粉按照重量份数比30-50：10-25：1-10:1-8:2-5：1-5:3-6:40-50:10-15:20-40混匀，得到混合粉体；将该粉体与水按重量份数比1:5混合，然后球磨混合6-8h，得到包膜乳液；
5)将所述步骤4)得到的包膜乳液喷涂至所述步骤3)得到的颗粒表面，从而得到石油烃类降解复合菌剂。
2.根据权利要求1所述的石油烃类降解复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述复合菌剂中，分支杆菌CSC-6的活菌含量为1×108～1×1010cfu/g，门多萨假单胞菌PM的活菌含量为1×108～7×109cfu/g，施氏假单胞菌JN4的活菌含量为1×107～3×108cfu/g，施氏假单胞菌JN5的活菌含量为1×107～3×108cfu/g，地衣芽孢杆菌Y-1的活菌含量为1×105～2×107cfu/g，短小芽孢杆菌L-2的活菌含量为1×105～1×107cfu/g，不动杆菌XH-2的活菌含量为1×105～3×107cfu/g和琼氏不动杆菌BD的活菌含量为1×105～2.5×107cfu/g。
3.根据权利要求1述的石油烃类降解复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述复合酶包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶、纤维素酶和β-葡萄糖酶。
4.根据权利要求1所述的石油烃类降解复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤5)中的包膜乳液喷涂4-6次，每次喷涂厚度为0.1-0.2mm，每次喷涂结束在真空度为1-3kpa、温度为-5～-2℃下冷冻20-25分钟后再进行下一次喷涂。
5.根据权利要求1所述的石油烃类降解复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤3)得到的颗粒的粒径为3-4mm。
6.根据权利要求1所述的石油烃类降解复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中干燥温度为25-35℃。
7.根据权利要求1所述的石油烃类降解复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤4)球磨的速度为1000-1500r/min。
8.一种利用权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到的石油烃类降解复合菌剂。
9.一种使用如权利要求8所述的石油烃类降解复合菌剂修复石油污染土壤的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：对石油污染土壤进行翻耕预处理，将复合菌剂按照10g/m3加入到石油污染土壤中，再翻耕混匀；整个土壤修复过程中使土壤含水量保持在25％～35％。
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