CN109557159B - 一种碳化钛三维复合材料及其制备方法以及在构建凝血酶适体传感器中的应用 - Google Patents

一种碳化钛三维复合材料及其制备方法以及在构建凝血酶适体传感器中的应用 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种碳化钛三维复合材料及其制备方法以及在构建凝血酶适体传感器中的应用，利用一步水热法在Ti3C2TX表面自生长TiO2纳米棒形成三维复合材料基底TiO2/Ti3C2TX，同时在三维材料表面还原贵金属纳米颗粒(M NPs)得到三维复合材料M NPs/TiO2/Ti3C2TX。由于一步实现了多种增强，因此该材料的电流强度最大。复合材料的三维结构可以提供特别大的可到达表面积，这有利于M NPs的锚定。过渡金属碳氮化物(MXenes)和金属纳米颗粒的引入可以提高电荷分离效率并加速电子转移速率。通过M NPs和适体链的组合，成功建立了灵敏的无标记适体用于测定酶蛋白。所提出的适体传感器具有良好的电化学性能，较宽的线性范围，相对较低的检测限，表明M NPs/TiO2/Ti3C2TX将有希望用于电化学生物传感器中的电极材料。

Description

一种碳化钛三维复合材料及其制备方法以及在构建凝血酶适 体传感器中的应用
技术领域
本公开具体涉及一种碳化钛三维复合材料及其制备方法以及在构建凝血酶适体传感器中的应用。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。
凝血酶可以将纤维蛋白原转化为纤维蛋白。局部施用后，作用于病变表面的血液迅速形成稳定的凝块，用于控制毛细血管，静脉出血，或作为皮肤和组织移植物的粘合和固定剂，并且涉及各种疾病，例如血栓栓塞性疾病，白血病和炎症反应。为了适应全球健康问题，特别是在发展中国家，非常希望开发用于定量检测凝血酶的简单，低成本和有效的方法。一些用于蛋白质分析的常规方法，例如酶联免疫吸附测定，蛋白质印迹和极化测定，通常面临昂贵的仪器或复杂的程序，这限制了它们在常规临床诊断中的广泛应用。此外，在不同的可用信号读取装置中，电化学检测在其低成本，固有信号稳定性和易于校准方面表现出优异的性能。此外，它可以与一些小型化设备或片上实验室平台轻松集成，因此便携式和即时护理生物传感器的制造潜力巨大。然而，大多数电化学适体传感器使用基于酶或标记信号的信号放大方法，它们不仅昂贵而且操作复杂。
为了构建电化学适体传感器，电极基板材料的选择是关键的。Ti3C2TX是一种二维过渡金属碳化物或碳氮化物(MXenes)，一种类似于石墨烯的二维纳米材料。MXenes作为电化学传感器的修饰电极材料具有许多优点，因为它们具有大量可接近的活性位点和短的扩散距离路径.Yu等人基于NH3和Ti3C2TX之间的大吸附能量，产生了一种对NH3显示出良好响应的传感器。刘等人已经合成了一种二维层状Ti3C2TX基材料，用于固定血红蛋白(Hb)，制备的生物传感器在检测亚硝酸盐方面表现出良好的性能，具有宽的线性范围，并且具有极低的检测限。正如这些研究所表明的那样，这种MXenes新兴材料由于其特殊的电子特性和稳定性而成为传感应用的潜在候选材料。
由于具有许多独特的功能，MXenes材料已经被证明是用于传感应用的高灵敏度和选择性检测平台。然而，MXenes片材在过滤过程中容易重新堆叠，并且它们的小间隙间隔限制了电解质离子，特别是大离子的可接近性，这阻碍了表面积的充分利用，导致差的电化学行为。MXenes材料的片材结构易于堆叠，因此在使用Ti3C2TX构建电化学传感器时需要解决片材堆叠的问题。为了解决这个问题，研究人员经常在片材中间***碳纳米管和离子液体(ILs)等材料，以防止片材堆叠。这些方法中的大多数是堆叠不同的纳米材料。制备材料的过程繁琐复杂。
发明内容
针对现有技术中检测凝血酶方法的不足，本公开开发了一种无酶和无标记的电化学适体传感器，用于检测凝血酶。
本公开具体采用以下技术方案：
在本公开的第一个方面，提供一种M NPs/TiO2/Ti3C2TX复合材料的制备方法，该方法包括：
将层状Ti3C2TX、贵金属盐和水混合均匀，然后在160～200℃下水热反应12～16小时，冷却后静置12～15h，即可制备得到M NPs/TiO2/Ti3C2TX复合材料。
在本公开的第二个方面，提供一种采用上述方法制备得到的M NPs/TiO2/Ti3C2TX复合材料。
在本公开的第三个方面，提供一种凝血酶适体传感器，该传感器包括：
基体电极；
所述M NPs/TiO2/Ti3C2TX复合材料，所述M NPs/TiO2/Ti3C2TX复合材料附着在基体电极上，形成M NPs/TiO2/Ti3C2TX改性的基体电极；以及，
以及，凝血酶适体，所述凝血酶适体通过共价键与所述M NPs/TiO2/Ti3C2TX改性的基体电极中的M NPs相连。
在本公开的第四个方面，提供一种所述凝血酶适体传感器的制备方法，该方法包括以下步骤：
将M NPs/TiO2/Ti3C2TX复合材料的悬浮液滴涂至基体电极上，制备得到M NPs/TiO2/Ti3C2TX改性的基体电极；
将凝血酶适体滴到M NPs/TiO2/Ti3C2TX改性的基体电极上进行连接反应，反应结束后，洗涤，然后采用牛血清白蛋白封闭未反应的活性位点，得到凝血酶适体传感器。
在本公开的第五个方面，提供所述M NPs/TiO2/Ti3C2TX复合材料或者所述凝血酶适体传感器在检测凝血酶中的应用。
在本公开的第六个方面，提供一种检测凝血酶的方法，该方法包括：采用所述凝血酶适体传感器选择性识别凝血酶，识别之后，将凝血酶适体传感器浸入亚甲基蓝溶液中，没有与凝血酶识别的适体吸附亚甲基蓝，利用亚甲基蓝的电化学信号来检测凝血酶。
与本发明人知晓的相关技术相比，本公开其中的一个技术方案具有如下有益效果：
本公开采用水热法合成了一种三维(3D)复合材料M NPs/TiO2/Ti3C2TX，利用一步水热法在Ti3C2TX表面自生长TiO2纳米棒形成三维复合材料基底TiO2/Ti3C2TX，同时在三维材料表面还原贵金属纳米颗粒(M NPs)得到三维复合材料M NPs/TiO2/Ti3C2TX。由于一步实现了多种增强，因此该材料的电流强度最大。该复合材料的三维结构可以提供特别大的可到达表面积，这有利于M NPs的锚定。过渡金属碳氮化物(MXenes)和金属纳米颗粒的引入可以提高电荷分离效率并加速电子转移速率。通过M NPs和适体链的组合，成功建立了灵敏的无标记适体用于测定酶蛋白。所提出的适体传感器具有良好的电化学性能，具有5fM～500nM的较宽线性范围，具有2fM的较低检测限，表明M NPs/TiO2/Ti3C2TX将有希望用于电化学生物传感器中的电极材料。
附图说明
构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1是M NPs/TiO2/Ti3C2TX的合成示意图。
图2是TiO2/Ti3C2TX的SEM图像。
图3是M NPs/TiO2/Ti3C2TX的TEM图像。
图4在含有0.1M KCl的5.0mM[Fe(CN)6]4-/3-溶液中电化学阻抗谱测试结果图。
图5：(A)空白(曲线a)，5nM TB标准温育(b)在0.1M PBS(pH＝7.4)中的CV表征；(B)空白的DPV表征(曲线a)，5nM TB标准温育(b)在0.1M PBS(pH＝7.4)中的表征。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中检测凝血酶的方法存在一定的不足，为了解决如上的技术问题，本公开设计了一种基于MXenes纳米复合材料的无标记凝血酶生物传感器。在该提出的策略中，通过一锅水热法合成了新型三维纳米复合材料M NPs/TiO2/Ti3C2TX，并用M NPs交联了适体链以实现凝血酶的特异性检测。该方法具有简单，成本低，灵敏度高，用途广泛的优点。此外，Ti3C2TX在这一战略中发挥了重要作用。作为平台，TiO2/Ti3C2TX构建三维基板。该材料的三维结构不仅提高了质子传输速率，而且使负载基板具有更大的比表面积，以加载更多的贵金属纳米颗粒。贵金属纳米颗粒通过稳定的M-S化学键固定适体链以实现特异性检测凝血酶。此外，将适体链上的G碱基吸附到MB上可以实现凝血酶的无标记电化学检测。最后，我们成功设计了一种凝血酶标记的适体传感器，可以推动Ti3C2TX在无标记适体生物传感器中的应用。
在实验过程中，我们发现在特定的条件下，Ti3C2TX中层状Ti可被氧化进而生长为TiO2纳米棒，而贵金属盐在水热条件下还原为贵金属纳米颗粒(M NPs)，形成三维(3D)复合纳米材料M NPs/TiO2/Ti3C2TX。在Ti3C2TX层表面生长的TiO2纳米棒和负载在TiO2/Ti3C2TX中的贵金属纳米粒子可以防止Ti3C2TX片的堆积并提高质子传输速率，同时具有很好生物相容性的TiO2可以为酶等生物分子屏蔽微环境以保持其稳定性和活性。此外，M NPs/TiO2/Ti3C2TX具有良好的导电性，有利于其在电化学测定中的应用。Ti3C2TX含有大量的亲水性羟基(-OH)，它可以改善材料表面的亲水性。贵金属纳米颗粒(M NPs)具有良好的导电性和较大的比表面积，可以通过M-S键固定适体链。此外，据报道，装载到基底材料上的M NPs显示出优异的抗微生物活性。考虑到3D-MXenes可以增强界面化学和高导电性这一事实，这两种材料的组合可以用作电化学生物传感器的理想电极基板。
利用3D TiO2/Ti3C2TX的多功能性和M NPs的电导率，我们制备了一种基于3D TiO2/Ti3C2TX的电化学循环伏安法(CV)或差分脉冲伏安法(DPV)检测凝血酶(TB)的新型适体传感器，如图1所示。通过一锅水热法将M NP包封在3D复合纳米材料M NPs/TiO2/Ti3C2TX中，得到复合纳米材料M NPs/TiO2/Ti3C2TX。其次，将复合纳米材料M NPs/TiO2/Ti3C2TX到ITO表面，然后通过金属-硫键固定凝血酶适体(TBA)。第三，为了避免可能的非特异性蛋白质吸附，使用牛血清白蛋白作为封闭剂以覆盖电极表面上的活性位点。最后，TBA/M NPs/TiO2/Ti3C2TX修饰的铟锡氧化物电极(ITO)用于选择性识别凝血酶。第四，将TB/TBA/M NPs/TiO2/Ti3C2TX修饰的ITO浸入亚甲基蓝(MB)溶液中，没有与凝血酶识别的适体可以吸附MB，利用MB的电化学信号来检测凝血酶。使用CV或DPV技术研究分析性能，结果显示即使在稀释的人血清样品中，适体传感器显示出令人满意的凝血酶检测性能。
具体包括以下几个方面的技术方案：
在本公开的第一个典型的实施方式中，提供一种用以构建无标记凝血酶电化学生物传感器的M NPs/TiO2/Ti3C2TX复合材料的制备方法，该方法包括：
将层状Ti3C2TX、贵金属盐和水混合均匀，然后在160～200℃下水热反应12～16小时，冷却后静置12～15h，即可制备得到M NPs/TiO2/Ti3C2TX复合材料。
本公开采用的是一锅水热法直接将贵金属纳米颗粒(M NPs)还原到复合材料TiO2/Ti3C2TX中，同时在水热反应结束后进行TiO2纳米棒的生长，获得的TiO2为纳米棒结构且尺寸比较大，发明人意外发现该结构更有利于撑开Ti3C2TX层状结构，有利于提高质子传输速率，从而更有利于凝血酶的检测。
水热反应完成后保持反应釜密闭且勿移动，进行冷却静止12h以上来促进片层材料上的TiO2晶种生长为TiO2纳米棒。
在本公开的一个或一些实施方式中，通过使用氢氟酸(HF)从Ti3AlC2选择性蚀刻Al来制备层状Ti3C2TX。
进一步，本公开提供一种结构较为稳定和表面亲水性羟基基团较为丰富的层状Ti3C2TX的制备方法，该方法具体包括：将2g至4g Ti3AlC2加入20mL至40mL的4℃至6℃的9MHF溶液中，得到混合溶液；将混合溶液在4℃至6℃下搅拌10～30分钟，然后在42～47℃下搅拌22～26小时，得到Ti3C2TX薄片的悬浮液；然后将其离心直至悬浮液的pH达到6～7；通过超声处理10～12小时获得层状Ti3C2TX的胶体溶液，然后离心除去沉淀物。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述贵金属盐包括但不限于硝酸银(AgNO3)，六水合氯金酸，六水合氯铂酸等。
在本公开的一个或一些实施方式中，层状Ti3C2TX、贵金属盐和水的比例为(30～120)mg：(15～30)mL：(50～80)mg。经过试验验证，该范围的原料比例能够使最终的传感器获得更高灵敏度的检测效果。
在本公开的一个或一些实施方式中，提供一种M NPs/TiO2/Ti3C2TX复合材料的具体制备方法，该方法包括以下步骤：
将15～20mL(2～6mg/mL)Ti3C2TX溶液分散在5mL水中，加入50～80mg贵金属盐，超声处理1～1.5小时以获得均匀的悬浮液；
然后，将悬浮液转移到高压釜中并在160～200℃下加热12～16小时；
冷却至室温后，使其静置12～15小时以形成TiO2纳米棒的生长；
合成的三维复合纳米材料M NPs/TiO2/Ti3C2TX用水洗涤，然后储存在纯水中。
在本公开的第二个典型的实施方式中，提供采用上述方法制备得到的M NPs/TiO2/Ti3C2TX复合材料，其中M为贵金属的简称，包括但不限于银(Ag)、金(At)、铂(Pt)等，Ti3C2TX中的TX是指表面基团(如O-、OH-、F-等)。
所述M NPs/TiO2/Ti3C2TX复合材料的微观形貌为：TiO2纳米棒紧密均匀的附着或穿插在层状Ti3C2TX上，M NPs均匀的附着在TiO2纳米棒和层状Ti3C2TX上，其中TiO2纳米棒的直径为5～30nm，直径与长度的比例为1：(3～8)，M NPs大小为12～18nm。经试验验证，该特定形貌的M NPs/TiO2/Ti3C2TX复合材料有助于提高凝血酶的检测灵敏度。
在本公开的第三个典型的实施方式中，提供一种凝血酶适体传感器，该传感器包括：
基体电极；
所述M NPs/TiO2/Ti3C2TX复合材料，所述M NPs/TiO2/Ti3C2TX复合材料附着在基体电极上，形成M NPs/TiO2/Ti3C2TX改性的基体电极；
以及，凝血酶适体，所述凝血酶适体通过共价键与所述M NPs/TiO2/Ti3C2TX改性的基体电极中的M NPs相连。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述基体电极为铟锡氧化物电极(ITO电极)，其制备可采用本领域的常规技术手段。经试验验证，采用ITO电极作为基体电极，有助于提高凝血酶的检测灵敏度。
本公开中的凝血酶适体是指能够以高的亲和力和特异性与凝血酶结合的一段寡核苷酸序列，本公开的一个或一些实施方式中，包括但不限于以下序列：5'-SH-(CH2)6-GGTTGGTGTGGT TGG-3'。
进一步的，所述M NPs连接5′端修饰巯基的凝血酶适体，二者通过M-S键连接。
在本公开的第四个典型的实施方式中，提供一种所述凝血酶适体传感器的制备方法，该方法包括以下步骤：
将M NPs/TiO2/Ti3C2TX复合材料的悬浮液滴涂至基体电极上，制备得到M NPs/TiO2/Ti3C2TX改性的基体电极；
将凝血酶适体滴到M NPs/TiO2/Ti3C2TX改性的基体电极上进行连接反应，反应结束后，洗涤，然后采用牛血清白蛋白封闭未反应的活性位点，得到凝血酶适体传感器。
在本公开的第五个典型的实施方式中，提供所述M NPs/TiO2/Ti3C2TX复合材料或者所述凝血酶适体传感器在检测凝血酶中的应用。
在本公开的第六个典型的实施方式中，提供一种检测凝血酶的方法，该方法包括：采用所述凝血酶适体传感器选择性识别凝血酶，识别之后，将凝血酶适体传感器浸入亚甲基蓝溶液中，没有与凝血酶识别的适体吸附亚甲基蓝，利用亚甲基蓝的电化学信号来检测凝血酶。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
下述实施例中使用的试剂、材料和仪器：
试剂和材料：
具有5'-SH-(CH2)6-GGT TGGTGTGGT TGG-3'序列的凝血酶适体购自SangonBiotech Co.，Ltd。(中国上海，http：//www.sangon.com/)。凝血酶，牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)购自Sangon Biotech Co.，Ltd。(中国上海，http：//www.sangon.com/)。
MAX-Ti3AlC2粉末来自Forsman Scientific Co.，Ltd(中国北京)，氯化钾(KCl)，氢氟酸(HF)，二氯化钠(NaCl)来自国药化学试剂有限公司。(上海，中国)。贵金属盐【硝酸银(Ag NO3)，六水合氯金酸，六水合氯铂酸】，所有化学品均为分析试剂级，按原样使用。在本实验中，选择由NaH2PO4和Na2HPO4制备的pH 7.4的0.1M磷酸盐缓冲溶液(PBS)作为电解质溶液。在整个实验过程中使用双蒸水。
仪器和测量：
在具有常规三电极***的CHI660E电化学工作站上进行电化学实验和测量。使用曝光或改性的ITO作为工作电极，使用铂柱作为对电极，并使用饱和甘汞电极(SCE)作为参考。扫描电子显微镜(SEM)图像在JEOL JSM-6700F上以5.0kV收集。通过使用DX2700粉末X射线衍射(XRD)图案表征催化剂的相。电化学阻抗谱(EIS)测量由普林斯顿电化学工作站(USA)进行。
实施例1
MXenes-Ti3C2TX的合成
将3g Ti3AlC2缓慢加入30mL的5℃的9M HF溶液中，得到混合溶液。将混合溶液在5℃下搅拌20分钟，然后在45℃下搅拌24小时，得到Ti3C2TX薄片的悬浮液。然后将其离心直至悬浮液的pH达到6.5，通过超声处理11小时获得层状Ti3C2TX的胶体溶液，然后以3500rpm离心35分钟以除去沉淀物。
TiO2/Ti3C2TX水凝胶的合成
将20mL(4mg/mL)Ti3C2TX溶液分散在5mL水中，超声处理1.2小时以获得均匀的悬浮液。然后，将悬浮液转移到Teflon密封的高压釜中并在180℃下加热14小时。冷却至室温后，使其静置14小时以形成TiO2纳米棒的生长。合成的三维复合纳米材料TiO2/Ti3C2TX用水洗涤，然后储存在纯水中。
得到TiO2/Ti3C2TX材料的SEM图像如图2所示，其显示了TiO2纳米棒紧密均匀地锚定在Ti3C2TX基底上。TiO2纳米棒的直径在5-30nm的范围内。此外，这些纳米棒均匀地覆盖Ti3C2TX基板的表面。还清楚地观察到许多TiO2纳米棒也很好地嵌入相邻Ti3C2TX纳米片层之间的空间中。TiO2纳米棒可以避免Ti3C2TX堆叠。该复合材料独特的纳米结构提供了大的接触界面和丰富的离子传输通道，确保了TiO2/Ti3C2TX纳米复合材料具有高导电性。
Ag NPs/TiO2/Ti3C2TX水凝胶的合成
将20mL(4mg/mL)Ti3C2TX溶液分散在5mL水中，加入60mg硝酸银，超声处理1.2小时以获得均匀的悬浮液。然后，将悬浮液转移到Teflon密封的高压釜中并在180℃下加热14小时。冷却至室温后，使其静置14小时以形成TiO2纳米棒的生长。合成的三维复合纳米材料MNPs/TiO2/Ti3C2TX用水洗涤，然后储存在纯水中。
TEM用于进一步研究合成的Ag NPs/TiO2/Ti3C2TX样品的微观结构。从图3可以看出，一些TiO2纳米棒支撑在Ti3C2TX基底上。图3显示Ag NPs均匀地附着在TiO2/Ti3C2TX的表面上，并具有约15nm的尺寸。TiO2/Ti3C2TX纳米结构的SEM和TEM图像具有良好的一致性，证明TiO2纳米棒成功地固定在Ti3C2TX表面上。
通过在含有0.1M KCl的5.0mM[Fe(CN)6]4-/3-溶液中电化学阻抗谱(EIS)的电化学测试来表征制备的材料的性质。如图4所示，在奈奎斯特图中，EIS的半圆直径等于Ret。当在ITO上修饰Ag NPs时观察到小的半圆(图4，曲线a)，这意味着电极表面具有良好的导电性。当在ITO上修饰TiO2/Ti3C2TX时，半圆直径类似于M NPs的半径(图4，曲线b)，这归因于Ti3C2TX的优异导电性。当Ag NPs/TiO2/Ti3C2TX在ITO上改性时，半圆的直径减小(图4，曲线c)。原因是Ag NPs被修饰成TiO2/Ti3C2TX的孔隙，这有利于电子转移。
制造修饰电极
可通过常规技术手段获得ITO电极。通过在超声搅拌下将2.0mg的Ag NPs/TiO2/Ti3C2TX分散在1.0mL二次水中来制备2mg mL-1Ag NPs/TiO2/Ti3C2TX悬浮液。然后，将20μL所得悬浮液滴到具有0.5cm2固定面积的ITO切片上，并在红外灯下干燥。此后，为了更好地固定材料并防止材料在实验过程中脱落，将10μL壳聚糖溶液覆盖在其上并在环境空气中干燥以获得Ag NPs/TiO2/Ti3C2TX改性的ITO电极。
为了比较，通过与上述类似的方法获得Ag NPs/ITO和TiO2/Ti3C2TX改性的ITO电极。
凝血酶适体传感器的制备
将10μL的5μmolL-1凝血酶适体(TBA)溶液滴到用Ag NPs/TiO2/Ti3C2TX改性的ITO电极上。反应在4℃下进行12小时，以确保适体通过Ag与TBA的巯基之间形成的共价键成功固定在Ag NPs/TiO2/Ti3C2TX/ITO上，得到TBA/Ag NPs/TiO2/Ti3C2TX/ITO。在反应完成后，用PBS冲洗电极以除去物理吸收。随后，将电极用10μL的1％牛血清白蛋白(BSA)在4℃下覆盖1小时，以使电极表面上的未反应的活性位点失活，然后彻底洗涤。
为了比较，通过与上述类似的方法获得Ag NPs/ITO传感器和TiO2/Ti3C2TX改性的ITO传感器。
实验测量
将制备的TBA/Ag NPs/TiO2/Ti3C2TX/ITO电极在含有不同浓度凝血酶溶液的10μL0.1MPBS中于37℃温育40分钟。通过特异性识别亲和力将凝血酶固定在修饰电极的表面上TBA和凝血酶之间的反应，然后用PBS彻底洗涤。然后，成功开发了TB/TBA/Ag NPs/TiO2/Ti3C2TX/ITO电极并用于检测凝血酶。接下来，将获得的适体传感器浸入20μMMB溶液中5分钟以完成MB与凝血酶未识别的适体链的识别反应，然后用超纯水轻轻洗涤电极以获得MB/TB/TBA/Ag NPs/TiO2/Ti3C2TX/ITO。
为了比较，我们还制备了MB/TB/TBA/M NPs/ITO和MB/TB/TBA/TiO2/Ti3C2TX/ITO电极。
在具有常规三电极***的CHI660E电化学工作站上进行电化学实验和测量，并且由Princeton Applied Research(USA)进行电化学阻抗谱(EIS)测量。将修饰电极在0.1MPBS(pH7.4)中进行CV试验，并在含有5mM[Fe(CN)6]4-/3-的溶液中进行EIS试验。CV实验以0.1V s-1的扫描速率进行。EIS在0.1Hz至10kHz的频率窗口和5mV的替换电压下确定。DPV实验在0.1M PBS缓冲液(pH7.4)中在-0.6至0.0V(相对于SCE)的电位范围内进行。
采用循环伏安法(CV)或差分脉冲伏安法(DPV)进行控制变量实验，研究实验的机理可行性。实验结果如图5(A)所示。在不存在凝血酶的情况下，检测到显著的电流信号，因为在电极表面上没有形成凝血酶和适体的复合物，从而允许大量的MB与适体结合。当存在凝血酶时，凝血酶特异性结合凝血酶适体核酸序列，从而减少MB与适体的结合。与MB结合的适体的量响应于电流的变化。当没有凝血酶时，适体吸附更多的MB，传感器具有更大的电流响应(曲线a)，当存在凝血酶时，适体凝血酶结合降低MB的吸附并且传感器的电流响应降低(曲线b)。我们还使用差分脉冲伏安法(DPV)进行控制变量实验，以进一步研究该实验的机理可行性。如图5(B)所示，当没有凝血酶时，适体可以吸附更多的MB，并且传感器具有更大的电流响应(曲线a)。当存在凝血酶时，适体与凝血酶结合以减少MB的吸附，并且传感器的电流响应降低(曲线b)。结果与CV测试结果相同。实验结果表明，基于MB适体吸附检测凝血酶的生物传感器可作为检测凝血酶的新方法。
实施例2
MXenes-Ti3C2TX的合成
将3g Ti3AlC2缓慢加入30mL的5℃的9M HF溶液中，得到混合溶液。将混合溶液在5℃下搅拌20分钟，然后在45℃下搅拌24小时，得到Ti3C2TX薄片的悬浮液。然后将其离心直至悬浮液的pH达到6.5，通过超声处理11小时获得层状Ti3C2TX的胶体溶液，然后以3500rpm离心35分钟以除去沉淀物。
TiO2/Ti3C2TX水凝胶的合成
将20mL(4mg/mL)的Ti3C2TX溶液分散在5mL水中，超声处理1.2小时以获得均匀的悬浮液。然后，将悬浮液转移到Teflon密封的高压釜中并在180℃下加热14小时。冷却至室温后，使其静置14小时以形成TiO2纳米棒的生长。合成的三维复合纳米材料TiO2/Ti3C2TX用水洗涤，然后储存在纯水中。
得到TiO2/Ti3C2TX材料的SEM图像如图2所示，其显示了TiO2纳米棒紧密均匀地锚定在Ti3C2TX基底上。TiO2纳米棒的直径在5-30nm的范围内。此外，这些纳米棒均匀地覆盖Ti3C2TX基板的表面。还清楚地观察到许多TiO2纳米棒也很好地嵌入相邻Ti3C2TX纳米片层之间的空间中。TiO2纳米棒可以避免Ti3C2TX堆叠。该复合材料独特的纳米结构提供了大的接触界面和丰富的离子传输通道，确保了TiO2/Ti3C2TX纳米复合材料具有高导电性。
Au NPs/TiO2/Ti3C2TX水凝胶的合成
将15mL(4mg/mL)Ti3C2TX溶液分散在5mL水中，加入50mg六水合氯金酸，超声处理1小时以获得均匀的悬浮液。然后，将悬浮液转移到Teflon密封的高压釜中并在160℃下加热16小时。冷却至室温后，使其静置12小时以形成TiO2纳米棒的生长。合成的三维复合纳米材料Au NPs/TiO2/Ti3C2TX用水洗涤，然后储存在纯水中。
制造修饰电极
可通过常规技术手段获得ITO电极。通过在超声搅拌下将2.0mg的Au NPs/TiO2/Ti3C2TX分散在1.0mL二次水中来制备2mg mL-1M NPs/TiO2/Ti3C2TX悬浮液。然后，将20μL所得悬浮液滴到具有0.5cm2固定面积的ITO切片上，并在红外灯下干燥。此后，为了更好地固定材料并防止材料在实验过程中脱落，将10μL壳聚糖溶液覆盖在其上并在环境空气中干燥以获得Au NPs/TiO2/Ti3C2TX改性的ITO电极。
为了比较，通过与上述类似的方法获得Au NPs/ITO和TiO2/Ti3C2TX改性的ITO电极。
凝血酶适体传感器的制备
将10μL的5μmolL-1凝血酶适体(TBA)溶液滴到用Au NPs/TiO2/Ti3C2TX改性的ITO电极上。反应在4℃下进行12小时，以确保适体通过Au与TBA的巯基之间形成的共价键成功固定在M NPs/TiO2/Ti3C2TX/ITO上，得到TBA/Au NPs/TiO2/Ti3C2TX/ITO。在反应完成后，用PBS冲洗电极以除去物理吸收。随后，将电极用10μL的1％牛血清白蛋白(BSA)在4℃下覆盖1小时，以使电极表面上的未反应的活性位点失活，然后彻底洗涤。
为了比较，通过与上述类似的方法获得Au NPs/ITO传感器和TiO2/Ti3C2TX改性的ITO传感器。
实验测量
将制备的TBA/Au NPs/TiO2/Ti3C2TX/ITO电极在含有不同浓度凝血酶溶液的10μL0.1MPBS中于37℃温育40分钟。通过特异性识别亲和力将凝血酶固定在修饰电极的表面上TBA和凝血酶之间的反应，然后用PBS彻底洗涤。然后，成功开发了TB/TBA/Au NPs/TiO2/Ti3C2TX/ITO电极并用于检测凝血酶。接下来，将获得的适体传感器浸入20μM MB溶液中5分钟以完成MB与凝血酶未识别的适体链的识别反应，然后用超纯水轻轻洗涤电极以获得MB/TB/TBA/Au NPs/TiO2/Ti3C2TX/ITO。
为了比较，我们还制备了MB/TB/TBA/Au NPs/ITO和MB/TB/TBA/TiO2/Ti3C2TX/ITO电极。
在具有常规三电极***的CHI660E电化学工作站上进行电化学实验和测量，并且由Princeton Applied Research(USA)进行电化学阻抗谱(EIS)测量。将修饰电极在0.1MPBS(pH7.4)中进行CV试验，并在含有5mM[Fe(CN)6]4-/3-的溶液中进行EIS试验。CV实验以0.1V s-1的扫描速率进行。EIS在0.1Hz至10kHz的频率窗口和5mV的替换电压下确定。DPV实验在0.1M PBS缓冲液(pH7.4)中在-0.6至0.0V(相对于SCE)的电位范围内进行。
采用循环伏安法(CV)或差分脉冲伏安法(DPV)进行控制变量实验，研究实验的机理可行性。
实施例3
MXenes-Ti3C2TX的合成
将3g Ti3AlC2缓慢加入30mL的5℃的9M HF溶液中，得到混合溶液。将混合溶液在5℃下搅拌20分钟，然后在45℃下搅拌24小时，得到Ti3C2TX薄片的悬浮液。然后将其离心直至悬浮液的pH达到6.5，通过超声处理11小时获得层状Ti3C2TX的胶体溶液，然后以3500rpm离心35分钟以除去沉淀物。
TiO2/Ti3C2TX水凝胶的合成
将20mL(4mg/mL)Ti3C2TX溶液分散在5mL水中，超声处理1.2小时以获得均匀的悬浮液。然后，将悬浮液转移到Teflon密封的高压釜中并在180℃下加热14小时。冷却至室温后，使其静置14小时以形成TiO2纳米棒的生长。合成的三维复合纳米材料TiO2/Ti3C2TX用水洗涤，然后储存在纯水中。
得到TiO2/Ti3C2TX材料的SEM图像如图2所示，其显示了TiO2纳米棒紧密均匀地锚定在Ti3C2TX基底上。TiO2纳米棒的直径在5-30nm的范围内。此外，这些纳米棒均匀地覆盖Ti3C2TX基板的表面。还清楚地观察到许多TiO2纳米棒也很好地嵌入相邻Ti3C2TX纳米片层之间的空间中。TiO2纳米棒可以避免Ti3C2TX堆叠。该复合材料独特的纳米结构提供了大的接触界面和丰富的离子传输通道，确保了TiO2/Ti3C2TX纳米复合材料具有高导电性。
Pt NPs/TiO2/Ti3C2TX水凝胶的合成
将15mL(4mg/mL)的Ti3C2TX溶液分散在5mL水中，加入50mg六水合氯铂酸，超声处理1小时以获得均匀的悬浮液。然后，将悬浮液转移到Teflon密封的高压釜中并在160℃下加热16小时。冷却至室温后，使其静置12小时以形成TiO2纳米棒的生长。合成的三维复合纳米材料Pt NPs/TiO2/Ti3C2TX用水洗涤，然后储存在纯水中。
制造修饰电极
可通过常规技术手段获得ITO电极。通过在超声搅拌下将2.0mg Pt NPs/TiO2/Ti3C2TX分散在1.0mL二次水中来制备2mg mL-1M NPs/TiO2/Ti3C2TX悬浮液。然后，将20μL所得悬浮液滴到具有0.5cm2固定面积的ITO切片上，并在红外灯下干燥。此后，为了更好地固定材料并防止材料在实验过程中脱落，将10μL壳聚糖溶液覆盖在其上并在环境空气中干燥以获得Pt NPs/TiO2/Ti3C2TX改性的ITO电极。
为了比较，通过与上述类似的方法获得Pt NPs/ITO和TiO2/Ti3C2TX改性的ITO电极。
凝血酶适体传感器的制备
将10μL的5μmolL-1凝血酶适体(TBA)溶液滴到用Pt NPs/TiO2/Ti3C2TX改性的ITO电极上。反应在4℃下进行12小时，以确保适体通过Pt与TBA的巯基之间形成的共价键成功固定在M NPs/TiO2/Ti3C2TX/ITO上，得到TBA/Pt NPs/TiO2/Ti3C2TX/ITO。在反应完成后，用PBS冲洗电极以除去物理吸收。随后，将电极用10μL的1％牛血清白蛋白(BSA)在4℃下覆盖1小时，以使电极表面上的未反应的活性位点失活，然后彻底洗涤。
为了比较，通过与上述类似的方法获得Pt NPs/ITO传感器和TiO2/Ti3C2TX改性的ITO传感器。
实验测量
将制备的TBA/Pt NPs/TiO2/Ti3C2TX/ITO电极在含有不同浓度凝血酶溶液的10μL0.1MPBS中于37℃温育40分钟。通过特异性识别亲和力将凝血酶固定在修饰电极的表面上TBA和凝血酶之间的反应，然后用PBS彻底洗涤。然后，成功开发了TB/TBA/Pt NPs/TiO2/Ti3C2TX/ITO电极并用于检测凝血酶。接下来，将获得的适体传感器浸入20μMMB溶液中5分钟以完成MB与凝血酶未识别的适体链的识别反应，然后用超纯水轻轻洗涤电极以获得MB/TB/TBA/Pt NPs/TiO2/Ti3C2TX/ITO。
为了比较，我们还制备了MB/TB/TBA/Pt NPs/ITO和MB/TB/TBA/TiO2/Ti3C2TX/ITO电极。
在具有常规三电极***的CHI660E电化学工作站上进行电化学实验和测量，并且由Princeton Applied Research(USA)进行电化学阻抗谱(EIS)测量。将修饰电极在0.1MPBS(pH7.4)中进行CV试验，并在含有5mM[Fe(CN)6]4-/3-的溶液中进行EIS试验。CV实验以0.1V s-1的扫描速率进行。EIS在0.1Hz至10kHz的频率窗口和5mV的替换电压下确定。DPV实验在0.1M PBS缓冲液(pH7.4)中在-0.6至0.0V(相对于SCE)的电位范围内进行。
采用循环伏安法(CV)或差分脉冲伏安法(DPV)进行控制变量实验，研究实验的机理可行性。
上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种凝血酶适体传感器，其特征是，该传感器包括：
基体电极；
M NPs/TiO2/Ti3C2TX复合材料，所述M NPs/TiO2/Ti3C2TX 复合材料附着在基体电极上，形成M NPs/TiO2/Ti3C2TX 改性的基体电极；
以及，凝血酶适体，所述凝血酶适体通过共价键与所述M NPs/TiO2/Ti3C2TX改性的基体电极中的M NPs 相连；
所述M NPs/TiO2/Ti3C2TX复合材料的制备方法包括：
将层状Ti3C2TX、贵金属盐和水混合均匀，然后在160~200℃下水热反应12~16 小时，冷却后静置12~15h，即可制备得到M NPs/TiO2/Ti3C2TX 复合材料；
其中，层状Ti3C2TX、贵金属盐和水的比例为30~120mg：15~30mL：50~80mg；
其中M为贵金属；
所述M NPs/TiO2/Ti3C2TX 复合材料的微观形貌为：TiO2纳米棒紧密均匀的附着或穿插在层状Ti3C2TX 上，M NPs 均匀的附着在TiO2纳米棒和层状Ti3C2TX上，其中TiO2纳米棒的直径为5~30 nm，直径与长度的比例为1：3~8，M NPs 大小为12~18 nm。
2.如权利要求1 所述的凝血酶适体传感器，其特征是，层状Ti3C2TX的制备方法，该方法具体包括：将2 g 至4 g Ti3AlC2加入20 mL 至40 mL 的 4℃至6℃的9M HF 溶液中，得到混合溶液；将混合溶液在4℃至6℃下搅拌10~30 分钟，然后在42~47℃下搅拌22~26 小时，得到Ti3C2TX 薄片的悬浮液；然后将其离心直至悬浮液的pH 达到6~7；通过超声处理10~12 小时获得层状Ti3C2TX的胶体溶液，然后离心除去沉淀物。
3.如权利要求1所述的凝血酶适体传感器，其特征是，所述贵金属盐包括硝酸银、六水合氯金酸或六水合氯铂酸。
4.如权利要求1所述的凝血酶适体传感器，其特征是，所述基体电极为铟锡氧化物电极。
5.如权利要求1所述的凝血酶适体传感器，其特征是，所述凝血酶适体的序列为5'-SH-（CH2）6-GGT TGGTGTGGT TGG-3'。
6.权利要求1-5任一权利要求所述的凝血酶适体传感器的制备方法，其特征是，该方法包括以下步骤：
将M NPs/TiO2/Ti3C2TX复合材料的悬浮液滴涂至基体电极上，制备得到M NPs/TiO2/Ti3C2TX 改性的基体电极；
将凝血酶适体滴到M NPs/TiO2/Ti3C2TX 改性的基体电极上进行连接反应，反应结束后，洗涤，然后采用牛血清白蛋白封闭未反应的活性位点，得到凝血酶适体传感器。
7.权利要求1-5任一权利要求所述的凝血酶适体传感器在检测凝血酶中的应用。
8.一种检测凝血酶的方法，其特征是，该方法包括：采用权利要求1-5任一权利要求所述的凝血酶适体传感器选择性识别凝血酶，识别之后，将凝血酶适体传感器浸入亚甲基蓝溶液中，没有与凝血酶识别的适体吸附亚甲基蓝，利用亚甲基蓝的电化学信号来检测凝血酶。
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