CN113390997A - 一种茶叶中苦参碱和氧化苦参碱同时定量检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种茶叶中苦参碱和氧化苦参碱同时定量检测的方法，其在茶叶样品加入氨水后，以三氯甲烷作为提取试剂，超声波提取，旋蒸至近干；再加入甲醇定容并通过逐级稀释的方法配置标准曲线溶液，最后采用Hypersil GOLD C18柱分离，以甲醇和乙酸铵甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为0.2 mL/min，柱温为30℃，柱温质谱采用电喷雾正离子源和多反应监测模式检测，外标法定量。本发明针对茶叶样品的前处理简单，准确度和精密度高，苦参碱和氧化苦参碱的检测低限均为0.01 mg/kg，实用性强，可以实现各类茶叶中苦参碱和氧化苦参碱项目检测，加强了生物碱类农药风险监控。
Description
技术领域
本发明涉及一种茶叶中苦参碱和氧化苦参碱同时定量检测的方法，属于分析化学技术技术领域。
背景技术
植物源农药，因其对人畜毒性低，而且在环境中易降解、少残留或无残留等特点，20世纪80年代以来成了各国植物保护工作者研究热点。植物源农药主要用于蔬菜、茶叶、中药材、园林绿化、棉花及水果上。特别是在有机茶的生产技术规程中禁止使用化学合成农药，植物源农药便成为了有机茶园理想的防治药剂。苦参碱是从苦参的根、茎等中经严格的工艺提取得到一种水溶性的生物碱，是天然的植物源广谱杀虫剂，具有胃毒和触杀作用，对蚜虫、自粉虱、菜青虫、茶毛虫、小菜蛾、茶尺蠖、小绿叶蝉等都有理想防效。可与常用的化学合成农药混用，表现出显著的增效作用，大大降低化学农药的用量，减少化学合成农药对环境的污染。
依据欧盟法规(EC)No 834/2007和(EC)No 889/2008关于有机产品生产和标签的规定，自2017年6月20日起，欧盟将不再接收有机农业投入物中使用苦参碱或使用含有苦参碱的产品。由于内销茶叶收益明显高于外销茶叶，且我国有关茶叶的标准从数量和限量要求上都要松于欧盟、日本等国家和地区的农残要求，茶农在种植过程中往往未严格按照进口国要求来使用农药。2019年9月9日，据欧盟食品饲料类快速预警***(RASFF)消息，西班牙拒绝我国出口红茶入境，理由为检出不得使用的苦参碱，含量0.029mg/kg。因此研究适宜的检测方法对于保障我国茶叶出口具有重要意义。
目前测定苦参碱的方法主要有薄层扫描法、毛细管电泳法、微流控芯片非接触电导检测法、高效液相色谱法、气相色谱法、色质联用法等。薄层扫描法、毛细管电泳法测定苦参碱分离步骤繁琐，分析时间较长，抗干扰能力差；而采用微流控芯片非接触电导技术检测苦参碱注射液中苦参碱含量，检出限为1.0μg/mL，不能满足低含量检测要求；高效液相色谱法、气相色谱法目前主要应用于药品中苦参碱含量的测定。因此，研究一种处理简单且适用于茶叶中苦参碱和氧化苦参碱残留量同时检测的方法是亟待解决的问题。
发明内容
鉴于此，本发明的目的是提供一种茶叶中苦参碱和氧化苦参碱同时定量检测的方法，可以克服现有技术的不足。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种茶叶中苦参碱和氧化苦参碱同时定量检测的方法，其包括以下步骤：
s1、样品的提取，
定量称取茶叶样品，在样品中加入氨水后，以三氯甲烷作为提取试剂，采用超声波提取，旋蒸至近干，即得标准品；
s2、配置标准曲线溶液，
在标准品中加入甲醇定容，并采用逐级稀释的方法配置标准曲线溶液；
s3、采用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱技术检测标准曲线溶液中苦参碱和氧化苦参碱的残留量。
前述步骤s1中，称取茶叶样品0.50g，加入0.5mL氨水静置30min，后加入20mL三氯甲烷超声30min，至少重复2次；再加入0.5g无水硫酸钠混匀，将全部溶液旋蒸至近干。
前述步骤s2中，
(1)分别称取定量标准品，用甲醇配置成1.0mg/mL的标准储备液，低温储存；
(2)取适量各标准储备液，用5％甲醇稀释成1.0mg/L的混合标准溶液；
(3)用样品空白基质溶液逐级稀释配制成浓度为2-100ng/mL范围内的标准曲线溶液；
(4)将每份标准曲线溶液通过粒径不大于0.22μm的滤膜过滤，上机检测。
前述步骤s2中，用空白基质溶液将各混合标准溶液逐级稀释配制成浓度为2、5、10、20、50、100ng/mL的标准曲线溶液。
前述步骤s2中，称取适量的空白茶叶样品，按照步骤s1中样品提取的方法处理，再用5％甲醇定容，即得空白基质溶液。
前述步骤s2中，标准储备液存储在-20℃环境中。
前述步骤s3中，采用Hypersil GOLD C18柱分离，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，再采用柱温质谱，以电喷雾正离子源和多反应监测模式检测，外标法定量；
其中流动相A为甲醇，流动相B为乙酸铵甲酸溶液。
前述乙酸铵甲酸溶液为5mmol/L乙酸铵水溶液，并且在5mmol/L乙酸铵水溶液中含有0.1％甲酸。
前述步骤s3中，高效液相色谱-串联三重四极杆质谱的测定条件为：
(1)高效液相色谱为Hypersil GOLD C18，规格为柱长100mm，柱内径2.1mm,粒径1.9μm；
柱温30℃，
流速：0.2mL/min；
进样量：10μL；
流动相条件见表1：
表1 HPLC梯度洗脱
运行时间：8min；
(2)质谱条件为：
采用电喷雾正离子模式；
扫描方式：多反应监测；
干燥气温度：300℃；
干燥气流量：3L/min；
鞘气流量：15L/min；
毛细管温度350℃；
喷雾电压：3200V；
多反应监测模式下的质谱参数见表2
表2 多反应监测模式下的质谱参数
与现有技术比较，本发明公开的一种茶叶中苦参碱和氧化苦参碱同时定量检测的方法，其在茶叶样品加入氨水后，以三氯甲烷作为提取试剂，超声波提取，旋蒸至近干；再加入甲醇定容并通过逐级稀释的方法配置标准曲线溶液，最后采用Hypersil GOLD C18柱分离，以甲醇和乙酸铵甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为0.2mL/min，柱温为30℃，柱温质谱采用电喷雾正离子源和多反应监测模式检测，外标法定量。结果表明，苦参碱和氧化苦参碱在2～100ng/mL质量浓度范围内线性关系良好，相关系数(r2)不低于0.995，高、中、低3个添加水平下平均回收率为90.6％～116.2％，相对标准偏差(n＝6)为2.7％～5.4％，检测底限均为0.01mg/kg，适用于茶叶中苦参碱和氧化苦参碱残留量的同时检测。
本发明的有益效果是：
(1)本发明针对茶叶样品的前处理简单，只需加入提取液用超声提取，操作省时省力，便捷、高效；
(2)采用空白基质逐级稀释标准溶液、外标法定量的方法确定检测低限，准确度和精密度高，苦参碱和氧化苦参碱的检测低限均为0.01mg/kg；
(3)应用高效液相色谱串联三重四极杆质谱技术检测茶叶中苦参碱和氧化苦参碱的残留量，优化了前处理和色谱、质谱条件，并进行添加回收实验，方法可行，结果可靠，检测低限可以达到0.01mg/kg的要求；
(4)实用性强，可以实现各类茶叶中苦参碱和氧化苦参碱项目检测，加强了生物碱类农药风险监控。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：
图1为氨化后三氯甲烷直接提取的总离子流图；
图2为水直接提取的总离子流图。
图3为氨化后水提取的总离子流图。
图4为苦参碱提取离子色谱图和离子碎片图。
图5为氧化苦参碱提取离子色谱图和离子碎片图。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。
一种茶叶中苦参碱和氧化苦参碱同时定量检测的方法，其包括以下步骤：
s1、样品的提取，
定量称取茶叶样品，在样品中加入氨水后，以三氯甲烷作为提取试剂，采用超声波提取，旋蒸至近干，即得标准品；
s2、配置标准曲线溶液，
在标准品中加入甲醇的定容，并采用逐级稀释的方法配置标准曲线溶液；
s3、采用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱技术检测标准曲线溶液中苦参碱和氧化苦参碱的残留量。
步骤s1中，称取茶叶样品0.50g，加入0.5mL氨水静置30min，后加入20mL三氯甲烷超声30min，至少重复2次；再加入0.5g无水硫酸钠混匀，将全部溶液旋蒸至近干。
优选地，茶叶样品旋蒸使用的旋蒸设备为瑞士布琦公司的R300旋转蒸发仪。
步骤s2中，
(1)分别称取定量标准品，用甲醇配置成1.0mg/mL的标准储备液，低温储存；
(2)取适量各标准储备液，用5％甲醇稀释成1.0mg/L的混合标准溶液；
(3)用样品空白基质溶液逐级稀释配制成浓度为2-100ng/mL范围内的标准曲线溶液；
(4)将每份标准曲线溶液通过粒径不大于0.22μm的滤膜过滤，上机检测。
具体地，所述的标准储备液可储存于-20℃冰箱中。
具体地，用空白基质溶液将各混合标准溶液逐级稀释配制成浓度为2、5、10、20、50、100ng/mL的标准曲线溶液。
称取适量的空白茶叶样品，按照步骤s1中样品提取的方法处理，再用5％甲醇定容，即得空白基质溶液。
步骤s3中，采用Hypersil GOLD C18柱分离，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，在采用柱温质谱，以电喷雾正离子源和多反应监测模式检测，外标法定量；其中流动相A为甲醇，流动相B为乙酸铵甲酸溶液。
所述乙酸铵甲酸溶液为5mmol/L乙酸铵水溶液，并且5mmol/L乙酸铵水溶液含有0.1％甲酸。
优选地，高效液相色谱制备为美国赛默飞公司的U3000高效液相色谱仪；质谱设备为美国赛默飞公司的Access MAX三重四极杆质谱仪。
步骤s3中高效液相色谱-串联三重四极杆质谱的测定条件为：
(1)高效液相色谱为Hypersil GOLD C18，规格为柱长100mm，柱内径2.1mm,粒径1.9μm；
柱温30℃，
流速：0.2mL/min；
进样量：10μL；
流动相条件见表1：
表1 HPLC梯度洗脱
运行时间：8min；
(2)质谱条件为：
采用电喷雾正离子模式；
扫描方式：多反应监测；
干燥气温度：300℃；
干燥气流量：3L/min；
鞘气流量：15L/min；
毛细管温度350℃；
喷雾电压：3200V；
多反应监测模式下的质谱参数见表2
表2 多反应监测模式下的质谱参数
结果与分析
见图1-图3，分别采用三种方式提取茶叶中的苦参碱和氧化苦参碱
提取方式1：纯水提取；
提取方式2：氨化后纯水提取；
提取方式3：氨化后三氯甲烷提取；
经过对比，发现纯水直接提取效果差，加入氨水后得到改善，用氨化后三氯甲烷提取时效果最佳。
色谱柱的填料和粒径会影响待测组分的分离度，其中对三种不同型号的色谱柱进行了比较，结果表明：
采用ACQUITY UPLC HSS T3，规格为100×2.1mm，1.8μm的色谱柱，目标组分峰顶端分叉，分离度不佳；
采用ACQUITY UPLC BEH HILIC，规格为100×2.1mm,1.7μm的色谱柱分离，目标组分峰较宽，峰形不好；
而采用所述的Hypersil GOLD C18色谱柱，其规格为100×2.1mm，1.9μm，对目标组分的保留能力较好，峰形较好，分离度高。
见图4-图5，对有机相采用甲醇和乙腈进行比较，结果表明甲醇作流动相时响应值较乙腈更高；水相采用0.1％甲酸水溶液和5mmol/L的乙酸铵水溶液(含0.1％甲酸)进行比较，结果表明选择甲醇-5mmol/L的乙酸铵(含0.1％甲酸)作为流动相，苦参碱、氧化苦参碱提取离子色谱和离子碎片峰型和分离度都较好。
将同浓度的阴性基质标准溶液目标物响应值与纯溶剂标准溶液目标物响应值进行比较，当比值＝1时，表明不存在基质效应；比值>于1时，表明存在基质增强作用；比值<1时，表明存在基质抑制作用；比值介于0.8～1.2时，通常认为基质效应较弱，可以忽略。选取阴性茶叶样品，经上述相应步骤处理后得到的基质样液配制浓度为10μg/L的基质混合标准溶液，与纯甲醇配制的相同浓度混合标准溶液进行检测。经计算苦参碱的比值为20，氧化苦参碱的比值为3.7，结果表明目标物响应值受基质干扰影响较大。因此采用空白基质稀释标准溶液进行外标法定量，以减少基质效应的影响。
本实验采用空白基质逐级加标至仪器所能检出的最低浓度，并保证该浓度在一段时间内平行测定值的相对标准偏差较低，以此来确定方法的检测低限。结果显示苦参碱和氧化苦参碱的检测低限均为0.01mg/kg。苦参碱和氧化苦参碱的线性范围、相关系数、检测底限和回归方程见表3：
表3 苦参碱和氧化苦参碱的线性范围、相关系数、检测底限和回归方程
以10、20、100μg/kg三个水平添加到空白样品中，测定回收率和精密度，结果见表4：
表4 苦参碱和氧化苦参碱加标回收率与相对标准偏差〔n＝6)
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式保密的限制，任何未脱离本发明技术方案内容、依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种茶叶中苦参碱和氧化苦参碱同时定量检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1、样品的提取，
定量称取茶叶样品，在样品中加入氨水后，以三氯甲烷作为提取试剂，采用超声波提取，旋蒸至近干，即得标准品；
s2、配置标准曲线溶液，
在标准品中加入甲醇定容，并采用逐级稀释的方法配置标准曲线溶液；
s3、采用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱技术检测标准曲线溶液中苦参碱和氧化苦参碱的残留量。
2.根据权利要求1所述的茶叶中苦参碱和氧化苦参碱同时定量检测的方法，其特征在于：步骤s1中，称取茶叶样品0.50g，加入0.5mL氨水静置30min，后加入20mL三氯甲烷超声30min，至少重复2次；再加入0.5g无水硫酸钠混匀，将全部溶液旋蒸至近干。
3.根据权利要求1所述的茶叶中苦参碱和氧化苦参碱同时定量检测的方法，其特征在于：步骤s2中，
(1)分别称取定量标准品，用甲醇配置成1.0mg/mL的标准储备液，低温储存；
(2)取适量各标准储备液，用5％甲醇稀释成1.0mg/L的混合标准溶液；
(3)用样品空白基质溶液逐级稀释配制成浓度为2-100ng/mL范围内的标准曲线溶液；
(4)将每份标准曲线溶液通过粒径不大于0.22μm的滤膜过滤，上机检测。
4.根据权利要求3所述的茶叶中苦参碱和氧化苦参碱同时定量检测的方法，其特征在于：用空白基质溶液将各混合标准溶液逐级稀释配制成浓度为2、5、10、20、50、100ng/mL的标准曲线溶液。
5.根据权利要求4所述的茶叶中苦参碱和氧化苦参碱同时定量检测的方法，其特征在于：称取适量的空白茶叶样品，按照步骤s1中样品提取的方法处理，再用5％甲醇定容，即得空白基质溶液。
6.根据权利要求5所述的茶叶中苦参碱和氧化苦参碱同时定量检测的方法，其特征在于：标准储备液存储在-20℃环境中。
7.根据权利要求1所述的茶叶中苦参碱和氧化苦参碱同时定量检测的方法，其特征在于：步骤s3中，采用Hypersil GOLD C18柱分离，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，再采用柱温质谱，以电喷雾正离子源和多反应监测模式检测，外标法定量；
其中流动相A为甲醇，流动相B为乙酸铵甲酸溶液。
8.根据权利要求6所述的茶叶中苦参碱和氧化苦参碱同时定量检测的方法，其特征在于：所述乙酸铵甲酸溶液为5mmol/L乙酸铵水溶液，并且在5mmol/L乙酸铵水溶液中含有0.1％甲酸。
9.根据权利要求6所述的茶叶中苦参碱和氧化苦参碱同时定量检测的方法，其特征在于：步骤s3中，高效液相色谱-串联三重四极杆质谱的测定条件为：
(1)高效液相色谱为Hypersil GOLD C18，规格为柱长100mm，柱内径2.1mm,粒径1.9μm；
柱温30℃，
流速：0.2mL/min；
进样量：10μL；
流动相条件见表1：
表1 HPLC梯度洗脱
运行时间：8min；
(2)质谱条件为：
采用电喷雾正离子模式；
扫描方式：多反应监测；
干燥气温度：300℃；
干燥气流量：3L/min；
鞘气流量：15L/min；
毛细管温度350℃；
喷雾电压：3200V；
多反应监测模式下的质谱参数见表2
表2 多反应监测模式下的质谱参数
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| CN114324629A (zh) * | 2021-12-01 | 2022-04-12 | 安徽蜜之源食品集团有限公司 | 一种蜂蜜中总苦参碱残留量的检测方法 |
| CN114924015A (zh) * | 2022-06-16 | 2022-08-19 | 中南大学 | 一种苦参碱和氧化苦参碱的快速检测方法 |
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| CN102636585A (zh) * | 2012-03-29 | 2012-08-15 | 武汉华大药业有限公司 | 检测苦参绿茶复方制剂的方法 |
| CN111189941A (zh) * | 2020-02-07 | 2020-05-22 | 通标标准技术服务(上海)有限公司 | 一种快速检测茶叶中苦参碱残留量的方法 |
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2021
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