CN109540609A - 一种快速收集烟草挥发性气味物质的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是指一种快速收集烟草挥发性气味物质的方法及应用。包括以下几个步骤：用蒸馏水清洗烟草植株，用气味收集袋将烟草植株罩住，把气味收集箱出气口连入气味收集袋；将已活化的吸附管一端***气味收集袋内，另一端连接气味收集箱抽气口，连续吸附一定时间后，将挥发性气味物质从吸附管上洗脱下来并进行浓缩；随后用气相色谱‑质谱联用仪（GC‑MS）鉴定收集到的烟草挥发性物质是否纯净，用产卵选择试验鉴定收集到的烟草挥发性气味物质是否为烟夜蛾产卵引诱活性物质或产卵趋避活性物质。本发明可以快速、高效地收集纯净的活性植物气味物质，并可利用收集到的活性植物气味植物研发害虫绿色防控引诱剂。

Description

一种快速收集烟草挥发性气味物质的方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是指一种快速收集烟草挥发性气味物质的方法及应用。
背景技术
植物挥发性气味物质在植食性害虫取食、产卵等生命活动中发挥着不可替代的重要作用。因此研究植物挥发性气味物质中对害虫取食或产卵等具有显著引诱或趋避活性的气味物质，对于新型害虫引诱剂的开发以及害虫的绿色综合防控具有非常重要的意义。烟夜蛾作为烟草、辣椒等作物上的重要害虫，其成虫偏好在烟草植株上产卵，因此探索一种能够有效收集烟草挥发性气味物质的方法对于烟夜蛾引诱剂的研发以及绿色防控策略的制定具有十分重要的意义。
以前利用顶空法收集烟草挥发性气味物质，先用酒精或其他有机溶剂浸泡硅胶管，去除杂质。浸泡后的硅胶管晾干，用来连接大气采样仪、活性炭洗瓶、蒸馏水洗瓶、玻璃缸和吸附管，收集12 h后洗脱吸附管，浓缩后进行烟草挥发性气味物质的鉴定。虽然硅胶管用有机溶剂浸泡以去除杂质，但是由于本身材质原因，依然会有大量杂质残留。而且，使用硅胶管的连接处较多，不易保证其密封性，收集过程中会有大量空气杂质进入吸附管，致使最终检测得到的挥发性物含量少且含有大量杂质。周拥军等2012年发表了一种利用顶空固相微萃取法收集山核桃挥发性风味物质的方法（中国粮油学报，2012.27（6），115-119）。但这种方法存在固相微萃取的萃取头造价昂贵，且不同类型萃取头的使用范围较窄，若不能选择合适的萃取头，无法得到准确的植物挥发性物质。
发明内容
本发明提出一种快速收集烟草挥发性气味物质的方法及应用，解决了现有技术中植物挥发性气味物质无法准确得到的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种收集烟草挥发性气味物质的高效方法，包括如下步骤：
（1）在收集烟草挥发性气味物质2-3 h前，用蒸馏水将田间或实验室栽培的烟草植株清洗3-5次，保证每个叶片、花和茎上均无杂物；
（2）将Tenax TA吸附管（100mg，6×150mm）用活化仪在250°C 下持续活化15-30 min；
（3）用气味收集袋（宽25-48cm，长35-60cm）将烟草植株整株罩上，把气味收集箱（PYEVolatile Collection Kit）的出气管***收集袋底部10-20 cm，然后用棉线和脱脂棉将烟草根部茎连同气味收集袋底部扎紧；
（4）将气味收集袋上部剪一孔径大小为8-10 mm的小孔，把吸附管一端从小孔***收集袋内，用脱脂棉线缠绕几圈后将该口扎紧；
（5）把吸附管另一端连入气味收集箱抽气管，并在接口处用封口膜密封，打开气味收集箱电源，调节气流为500-800 mL/min，连续收集12-14 h；
（6）共用1-2 mL色谱纯重蒸正己烷将吸附管上的烟草气味物质洗脱至棕色样品瓶，洗脱过程应多次少量连续洗脱3-5次，之后用氮吹法将样品浓缩至50-100 uL，存放在-20 ℃冰箱中待用。
所述的烟草挥发性气味物质的应用，烟草挥发性气味物质作为引诱或趋避烟夜蛾产卵的活性物质或研发害虫绿色防控引诱剂的应用。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明直接将气流只通过一个装有活性炭的钢瓶吹至气味收集袋，减少中间连接口，可有效保证密封性，避免了空气杂质的进入，通过本发明可以快速、高效地收集烟草挥发性气味物质。此外，本发明也适用于番茄、茄子、辣椒、黄瓜、苦瓜等植物挥发性气味物质的收集。
（2）本发明为了验证鉴定得到的烟草挥发性气味物质成分是否是烟草中存在的对烟夜蛾产卵具有引诱或趋避作用的活性物质，我们进行烟夜蛾成虫对这些气味物质的产卵选择反应。产卵选择试验结果表明（表2）：0.01mol/L壬醛对烟夜蛾具有显著的产卵引诱活性，而0.01mol/L的苯甲醛、苯甲醇和芳樟醇则对烟夜蛾具有显著的产卵趋避活性。
（3）用本发明提供的方法收集到的烟草挥发性气味物质纯净且杂质少，能够很好地收集到烟草中存在的对烟草害虫-烟夜蛾产卵具有显著引诱或趋避作用的活性气味物质。而且，本发明是直接收集活体植株挥发性气味物质，排除了离体植物受伤后植物防御气味物质的干扰。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
烟草上主要害虫如烟夜蛾为夜出性昆虫，其成虫羽化、交尾、选择寄主植物产卵等活动均在夜间进行。烟草作为烟夜蛾的主要寄主植物，其夜间释放的挥发性气味物质对于烟夜蛾的产卵等活动具有十分重要的作用。因此，收集烟草挥发性活性气味物质也于夜间进行。
在下午18:00时，用蒸馏水将田间栽培的烟草植株仔细清洗3次，保证每个叶片、花和茎上均无杂物。
用气味收集袋（48cm×60cm）将烟草植株整株罩上。将Tenax TA 吸附管（100mg，6×150mm）用活化仪（HH-10）在250°C 下持续活化20 min，之后将气味收集箱（PYE VolatileCollection Kit）的出气管***收集袋底部15 cm，然后用棉线和脱脂棉将烟草根部茎连同气味收集袋底部扎紧。
将气味收集袋上部剪一孔径大小为8 mm的小孔，把吸附管一端从小孔***收集袋内，用脱脂棉线缠绕几圈后将该口扎紧；吸附管另一端连入气味收集箱抽气管，并将接口处用封口膜密封。打开气味收集箱电源，调节气流为600 mL/min，从晚上20:00到次日早上8:00连续收集烟草挥发性气味物质12 h。
共用2 mL色谱纯重蒸正己烷洗脱吸附管，将吸附管上吸附的烟草挥发性气味物质洗脱至棕色样品瓶，连续洗脱3次，之后用氮吹法将样品浓缩至100 uL，存放在-20 ℃冰箱中待用。
为了鉴定收集到的烟草挥发性气味物质是否纯净，使用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术对收集到的烟草挥发性成分进行鉴定。具体试验条件如下：GC-MS型号为：AgilentTechnologies5977BMS×7890BGC，色谱柱型号为Agilent 19091S-433:93.92873，温度范围0°C -325°C，色谱柱规格: 30 m×250 um×0.25 um，载气为氦气。程序升温：起始温度40°C，保持1min后以5°C/min的速度升到150°C，保持1min后以10°C/min的速度上升至250°C，保持5min结束，总时间为39min。进样量为1uL，溶剂延迟1.5min。进样口温度250°C，离子源温度230°C ，MS四极杆150°C，模式为不分流。
为了验证鉴定得到的烟草挥发性气味物质成分是否是烟草中存在的对烟夜蛾产卵具有引诱或趋避作用的活性物质，我们进行烟夜蛾成虫对这些气味物质的产卵选择反应。具体试验操作如下：将得到的烟草挥发物单体溶解在3%的琼脂中，浓度为0.01 mol/L；在烟夜蛾进入蛹期时按雌雄分开，将羽化后3 d的成虫放置在一个圆柱形的养虫笼（直径:30cm；高:28cm）中，每笼放3头雌蛾和5头雄蛾，笼底部放置蘸有10%蔗糖溶液的脱脂棉供成虫取食，笼顶部用纱布覆盖作为产卵介质，在纱布上面靠近养虫笼边缘等距离各处放置含单体气味物质（处理）和不含单体气味物质（空白对照）的琼脂块，每种琼脂块各2个，呈十字交叉放置。第二天记录纱布上4个产卵区域的落卵量。每种气味物质重复10次，计算每次两种产卵区域的平均落卵量，对试验结果使用配对t测验进行统计。
收集的烟草挥发性气味物质鉴定结果见表1。结果显示：开花期的烟草咸丰小兰花夜间释放的挥发性气味物质主要有：3-己醇、顺-3-己烯醇、缬草酸、α-蒎烯、苯甲醛、P-伞花烃、(+)-柠檬烯、苯甲醇、苯乙醛、芳樟醇、壬醛、乙酸苄酯、萘、癸醛、乙酸反-2-癸烯酯、烟碱、β-榄香烯、十二醛、β-石竹烯等19种含量较高的成分。
产卵选择试验结果表明（表2）：0.01mol/L壬醛对烟夜蛾具有显著的产卵引诱活性，而0.01mol/L的苯甲醛、苯甲醇和芳樟醇则对烟夜蛾具有显著的产卵趋避活性。
试验结果表明，用本发明提供的方法收集到的烟草挥发性气味物质纯净且杂质少，能够很好地收集到烟草中存在的对烟草害虫-烟夜蛾产卵具有显著引诱或趋避作用的活性气味物质。而且，本发明是直接收集活体植株挥发性气味物质，排除了离体植物受伤后植物防御气味物质的干扰。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或者改进，均属于本发明要求保护的范围。
表1 开花期咸丰小兰花成分表
表2 烟夜蛾对0.01mol/L的烟草挥发性单一成分的产卵选择反应
注：“±” 前后数字分别表示落卵量的平均值与平均值的标准误，“*”：表示0.01 ＜ P ＜ 0.05，达到显著性水平；“**”：表示P ＜ 0.01，达到极显著性差异。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种快速收集烟草挥发性气味物质的方法，其特征在于步骤如下：
（1）用蒸馏水将田间或实验室栽培的烟草植株清洗3-5次，保证每个叶片、花和茎上均无杂物；
（2）将Tenax TA 吸附管用活化仪进行活化；
（3）用气味收集袋将烟草植株整株罩上，把气味收集箱的出气管从收集袋底部***，然后用棉线和脱脂棉将烟草根部茎连同气味收集袋底部扎紧；
（4）将气味收集袋上部剪开一角，把吸附管一端***袋内，用脱脂棉线缠绕几圈后扎紧；
（5）把吸附管另一端连入气味收集箱抽气管，并在接口处用封口膜密封；打开气味收集箱电源，调节气流，收集烟草挥发性气味物质；
（6）利用色谱纯重蒸正己烷洗脱吸附管上吸附的烟草挥发性气味物质，并用氮吹法进行浓缩，得到的即为收集到的烟草挥发性气味物质。
2.如权利要求1所述的快速收集烟草挥发性气味物质的方法，其特征在于步骤（1）进行步骤（2）前2-3h进行。
3. 如权利要求1所述的快速收集烟草挥发性气味物质的方法，其特征在于：所述步骤（2）中活化时间为15-30 min，活化温度为250°C。
4. 如权利要求1所述的快速收集烟草挥发性气味物质的方法，其特征在于：所述步骤（3）中气味收集箱出气管***气味收集袋的长度为10-20 cm，剪开气味收集袋的孔径大小为8-10 mm，所述气味收集袋宽25-48cm，长35-60cm。
5. 如权利要求1所述的快速收集烟草挥发性气味物质的方法，其特征在于：所述步骤（5）中气流流量为500-800 mL/min，收集时间为12-14 h。
6. 如权利要求1所述的快速收集烟草挥发性气味物质的方法，其特征在于：所述步骤（6）中洗脱次数为3-5次，整个洗脱过程用色谱纯重蒸正己烷的量为1-2 ml，浓缩后的植物挥发性气味物质体积为50-100uL。
7.权利要求1-6任一项所述的烟草挥发性气味物质的应用，其特征在于：烟草挥发性气味物质作为引诱或趋避烟夜蛾产卵的活性物质或研发害虫绿色防控引诱剂的应用。
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