CN103931581B - 一种利用薄荷挥发物诱杀假眼小绿叶蝉的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种诱杀茶园重要害虫假眼小绿叶蝉的方法。通过以假眼小绿叶蝉为试虫，以薄荷植株6种挥发物乙酸叶醇酯、3‑辛酮、石竹烯、α‑水芹烯、桉树脑和γ‑松油烯为味源，以正己烷为，溶剂按1:0.112:0.1‑12:0.1‑12:0.1‑12:0.1‑12比例组合配制成诱捕剂，载于橡皮头上制成诱芯，并附于芽绿色圆形粘板上，于假眼小绿叶蝉虫口高峰期时进行诱捕。本发明使用茶园常见杂草薄荷挥发物诱杀茶园中最重要的害虫假眼小绿叶蝉，减少化学农药的使用量，进而减少叶蝉抗药性、茶叶农残超标、次要害虫再增猖獗问题的发生。该叶蝉诱捕剂诱效高、安全无污染，与环境相容，诱捕速率快，使用便捷，成本低。
Description
技术领域
本发明属于植物保护领域。涉及茶园杂草薄荷挥发物中含有的信息物质，从中筛选出对假眼小绿叶蝉有显著引诱效应的组分，组成假眼小绿叶蝉引诱剂，加入适当剂量液体石蜡作为缓释剂，组成假眼小绿叶蝉高效引诱剂；将其附于芽绿色圆形粘板上，在该叶蝉虫口高峰期间、当成虫百分率超过一定数量时于茶园中施用，可以获得对该叶蝉的良好诱杀效果。
背景技术
假眼小绿叶蝉Empoasca vitis是茶树上主要害虫之一，以成虫和若虫刺吸芽叶汁液，受害芽叶叶缘泛黄，叶脉变红，进而叶尖叶缘萎缩焦枯，生长停滞，芽叶脱落，严重影响茶叶产量和品质。假眼小绿叶蝉在长江中下游流域茶园中1年发生10～14代，广东、广西15～19代，海南19～22代。在长江中下游地区以成虫在茶树、冬季豆类和绿肥等寄主植物上越冬，在两广、云南和海南无明显越冬现象，冬季也可见到卵和若虫。假眼小绿叶蝉一年的消长规律主要为双峰型，特殊地区、特殊年份有单峰型。双峰型是指一年中有两个发虫高峰，第1峰一般集中在5～6月份，主要为害夏茶，第2峰集中在9～10月份，主要为害夏、秋茶，如苏州洞庭山的假眼小绿叶蝉的消长规律为双峰型：第l峰为6月上旬～7月中下旬，其中6月中旬叶蝉数量最为密集；第2峰为9月上中旬～11月上旬，其中9月中旬叶蝉数量最为密集；第1峰虫量显著高于第2峰，是全年的主害峰。偶有单峰型报道，一般在7～8月份，如江西庐山、婺源鄣山、丰城罗山等海拔920m以上的茶园，由于冬季和春季气温低，叶蝉虫口数量积累缓慢，第一发虫高峰无法形成，在7月下旬～9月才出现虫口高峰，全年虫量呈现单峰型。
目前防治假眼小绿叶蝉的方法主要是化学防治，由于假眼小绿叶蝉世代重叠现象严重，多数茶区每年采取10多次化防，导致了假眼小绿叶蝉抗药性的显著增强，而且滥用化学农药对茶园群落中其它节肢动物(如中性昆虫、天敌等)有明显的杀伤力，破坏了茶园生物多样性的平衡，导致某些次要害虫的再增猖獗。因此寻找高效、无污染生物防治方法迫在眉睫。使用信息物质、色板等诱杀害虫可部分地替代农药。
利用诱虫作物(trapping plants)防治害虫是一种环境友好的生物防治方法，可大量减少农药的使用，既能维持茶园生态环境的稳定又使茶园生态***多元化，并且有利于增强寄生性天敌和捕食性天敌的控害潜能。在美国佛罗里达州，羽衣甘蓝(Brassicaoleracea var.acephala)能够诱集大量小菜蛾产卵，从而减少了主栽作物卷心菜上的幼虫发生量。将高的红车轴草(Trifolium pratense)与卷心菜(Brassica oleraceavar.capitata)间作可显著减少小菜蛾(Plutella xylostella)在甘蓝上的着卵量，等等。
本研究拟选用茶园常见杂草薄荷，检测其挥发物是否对假眼小绿叶蝉有引诱效应？若有显著的引诱效应，再挑选其中活性成分制成叶蝉引诱剂，加入缓释剂，再将其载于橡皮头制成诱芯附于诱虫色板上，在叶蝉虫口高峰期于茶园中实施诱杀。
发明内容
本发明目的是提供一种利用薄荷挥发物诱杀假眼小绿叶蝉的方法，是一种利用茶园杂草薄荷挥发物中的信息物质诱捕茶园最重要的害虫假眼小绿叶蝉的方法，通过以下步骤实现：
(1)以假眼小绿叶蝉为试虫，以薄荷植株中6种挥发物乙酸叶醇酯(cis-3-Hexenylacetate)、3-辛酮(3-Octanone)、石竹烯(Caryophyllene)、α-水芹烯((R)-(-)-α-Phellandrene)、桉树脑(Eucalyptol)和γ-松油烯(γ-Terpinene)为味源；
(2)以正己烷为溶剂，将薄荷植株6种挥发物分别配成浓度为10-10g/ml～10-2g/ml的味源物，并将乙酸叶醇酯、3-辛酮、石竹烯、α-水芹烯、桉树脑和γ-松油烯按1:0.1～12:0.1～12:0.1～12:0.1～12:0.1～12比例组合配制成假眼小绿叶蝉诱捕剂；
(3)将步骤(2)的诱捕剂，加入液体石蜡作为缓释剂，载于橡皮头上制成诱芯，诱芯附于芽绿色圆形粘板上(参照发明专利“一种诱捕防治假眼小绿叶蝉的方法”，专利号ZL201110134803.2的实施例1，但是本发明使用的色板形状是圆形，颜色是芽绿)，粘板直径20～30cm，于假眼小绿叶蝉虫口高峰期、当成虫百分率大于≥60％时进行诱捕。每诱芯加入10～30μl的液体石蜡作为缓释剂。
被引诱的叶蝉数与薄荷质量成抛物线关系，当薄荷质量增加时，引诱的叶蝉数也增加，薄荷质量超过1克时，引诱的叶蝉数减少；被引诱的叶蝉数(y)与薄荷质量(x)成抛物线关系y＝-0.6116x2+3.5241x+8.525,R 2＝0.8181(P<0.05)，薄荷挥发物显著地引诱该叶蝉。
使用空气夹带吸附法，从新鲜薄荷植株挥发物中分离鉴定出49种组分，再用其中含量较大的化合物21种组分作为味源，该叶蝉为试虫，进行行为测定，发现乙酸叶醇酯(cis-3-Hexenyl acetate)、3-辛酮(3-Octanone)、石竹烯(Caryophyllene)、α-水芹烯((R)-(-)-α-Phellandrene)、桉树脑(Eucalyptol)和γ-松油烯(γ-Terpinene)对该叶蝉有显著引诱活性。
本发明的另一个目的是提供所述的方法在利用薄荷挥发物诱杀假眼小绿叶蝉中的应用。
本发明使用茶园常见杂草薄荷挥发物中含有的信息物质诱杀茶园中最重要的害虫假眼小绿叶蝉，减少化学农药的使用量，进而减少叶蝉抗药性、茶叶农残超标、次要害虫再增猖獗问题的发生。本发明诱捕剂诱效高、安全无污染，与环境相容。将本发明叶蝉诱捕剂与芽绿粘板组合，诱捕速率快，使用便捷，成本低。
专利号ZL201110134803.2的假眼小绿叶蝉诱捕剂的成分来自于茶树挥发物，而本发明选用的信息物质源自于茶园杂草薄荷的挥发物，薄荷在茶园中的数量较多，便于取用。本发明将茶园杂草用于防治害虫，实现“变废为宝”，还可以将薄荷植株按一定种植方式间作于茶园中，吸引该叶蝉而减免茶树受该叶蝉为害。
附图说明
图1是趋向薄荷植株挥发物和CK(洁净空气)的假眼小绿叶蝉数量及差异，*差异达显著水平。
图2是薄荷植株挥发物的总离子流色谱图。
图3是诱捕器结构示意图。
图4是薄荷挥发物四组分诱芯诱杀的假眼小绿叶蝉数量。
图5是薄荷挥发物六组分诱芯诱杀的假眼小绿叶蝉数量。
图6是薄荷挥发物单组分诱芯诱杀的假眼小绿叶蝉数量。
图7是CK缓释诱芯诱杀的假眼小绿叶蝉数量。
图8A-E分别是一天中8个时间段茶园假眼小绿叶蝉飞向4种诱芯的数量呈显著的时间节律。每天标有不同字母的相同形状柱子代表的数量之间的差异达显著水平。
图9是六组分诱芯日累加诱捕假眼小绿叶蝉数。
图10是六组分缓释诱芯日累加诱捕假眼小绿叶蝉数。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
第1步薄荷植株挥发物引诱假眼小绿叶蝉的试验
1、味源
薄荷Mentha haplocalyx Briq.为自然生长于中国计量学院茶园中的杂草，试验时剪取幼嫩部分作为味源材料，释放挥发物引诱假眼小绿叶蝉。设0.5g、1g、3g、5g、7g和9g共6个剂量，每个剂量重复测试5次。对照为洁净空气。
2、供试昆虫
从中国计量学院茶园收集假眼小绿叶蝉雌、雄成虫，饲养于养虫笼内的盆栽茶树上，使其自由交尾产卵，待卵孵化成若虫、若虫羽化为成虫。试验开始前用指形管取出成虫，将其饥饿1小时再进行行为测定试验。
3、Y形嗅觉仪及生物测定程序
Y形管由无色透明玻璃制成，两臂与基部均为10cm，内径为1.0cm，两臂夹角为90°。两臂分别连接味源瓶(或对照瓶)、加湿瓶、空气过滤瓶(内装满已活化的活性炭)和流量计，各部件之间均用Teflon管连接。
测定时，调节两臂流量为110ml/min，每次测定前先抽气10min，使Y形管味源臂中充满气味。测试时用指形管将1头假眼小绿叶蝉成虫从Y形管基部引入，当假眼小绿叶蝉逆风进入Y形管一臂并爬行5cm，则计数。每种剂量重复测试5次，每次测试20头，每头只用一次；每测试10头，则用75％乙醇擦洗Y管内外壁，烘干，调换Y形管两臂与味源瓶和对照瓶的连接位置，以消除Y形管可能的不对称而造成的影响。每个剂量测试完后，将Y形管、味源瓶、对照瓶、加湿瓶用重铬酸钾洗液清洗，在100℃烘箱中烘干，活性炭置于100℃烘箱内烘4h，解吸附，消除吸附的气体，备用。
生物测定在暗室内执行，在Y管上方1.5米有1盏5W白炽灯提供照明。测试时间8:00至16:00，这期间该叶蝉比较活跃。室温26℃、相对湿度70％。
4、数据分析方法
假设薄荷挥发物对假眼小绿叶蝉行为没有影响，则趋向味源与对照的概率均为50％，则有假设实验H0：50:50，对两臂趋向率间的差异做χ2测验。分析薄荷剂量与其吸引的叶蝉数量之间的关系。
5、薄荷植株气味显著地引诱假眼小绿叶蝉
随着薄荷质量的增加，引诱的叶蝉数先增加后减少，当剂量达到9g时呈现驱避效应(图1)。当薄荷剂量(x)为0.5g、1g、3g、5g、7g、9g时，趋向味源的叶蝉平均数(y)相应地为10.5头、15头、13.25头、12头、10.75头、8头，二者呈抛物线关系y＝-0.6116x2+3.5241x+8.525,R 2＝0.8181(P<0.05)
χ2测验表明：当薄荷剂量为1g时，其引诱叶蝉的平均数与CK(洁净空气)引诱叶蝉的平均数之间的差异显著(P<0.05)(参见图1)。
第2步薄荷植株挥发性组分的分离鉴定
1、薄荷植株挥发物的提取
剪取25g薄荷枝叶放入玻璃质地圆柱体，该圆柱体由两部分组成，可以紧密磨合，也可打开，放入新鲜枝叶之后拧紧。圆柱体两端各有一个进气口和出气口，进气口依次连接一个空气过滤器(内装已活化的解吸附的活性炭)和流量计，出气口依次连接Super Q(100mg)吸附柱、吸水装置、气泵，各部分用Teflon管连接。抽气12h后，取下Super Q吸附柱，用600μl色谱纯正己烷淋洗，淋洗下的溶液接入棕色小瓶中，并加入10μl 10–4g/ml癸酸乙酯作为内标，摇匀后使用微量进样器吸取1μl注入气质联用仪。
2、GC-MS测定
本实验所采用的GC-MS仪器型号为Agilent GC(6890N)-MS(5975B)。色谱柱为30.0m×250um×0.25um id HP-5MS石英毛细管柱。不分流进样；恒定流量，流量为1.0ml/min。溶剂延迟3min。进样口温度250℃，GC-MS接口温度280℃。程序升温：柱温50～190℃，起始50℃并保持5min，以3.5℃·min-1速度升至141℃，再以2℃·min-1升至171℃，最后以3.5℃·min-1速度升至190℃，在190℃保持5min。EI离子源，电离能70eV，使用全扫描，扫描频率为2次/s。载气为99.999％的氦气。
定性方法：(1)依据同样的测试程序向GC-MS注入标准化合物，根据标准化合物在GC-MS上的保留时间等参数确定迷迭香气味中的组分；(2)根据迷迭香气味中组分的质谱图与GC-MS化学工作站中标准物图谱的匹配度。
定量方法：根据样品中各组分的峰面积对于内标(癸酸乙酯)峰面积的比例进行相对定量。
3、薄荷气味中各种组分及其含量
薄荷挥发物中共检测出49种挥发性挥发物(图2、表1)。薄荷挥发物成分主要包括酮、醇、烯烃、酯、烷烃、醛和其它化合物，其中醇类4种、酮类6种、酯类2种、烯烃类30种、烷烃类4种、醛类1种，其它化合物2种。酮类含量最大，占总含量的83.85％，其次分别是醇(9.82％)、烯烃(6.11％)、酯(0.13％)、烷烃(0.05％)、其他(0.04％)，最少的是醛(0.02％)。在这49种挥发物组分中薄荷酮的含量最大，占总含量的57.00％，其次是顺式胡薄荷酮，占总含量的23.25％，再次是薄荷醇(9.69％)。
表1薄荷挥发物中各组分及其相对于内标的量
第3步室内用Y管嗅觉仪检测薄荷挥发物中主要成分引诱叶蝉的活性
1、材料与方法
将薄荷挥发物中含量较大的21种组分(表2)作为味源：即薄荷酮、薄荷醇、1s-α-蒎烯、D-柠檬烯、β-月桂烯、β-蒎烯、石竹烯、桧烯、(+)-4-蒈烯、桉树脑、榄香烯、罗勒烯、α-水芹烯、莰烯、3-辛酮、乙酸叶醇酯、γ-松油烯、芳樟醇、青叶醇、乙酸已酯和反式十氢奈。
以正己烷为溶剂，分别将21种成分配成10–6g/ml、10–4g/ml和10–2g/ml三种剂量，吸取1ml作为味源，吸取正己烷1ml作为CK，进行行为测定；经测定发现活性较强的组分，再将其配成10–8g/ml和10–10g/ml两种剂量继续测定。试虫和测定程序同第1步“3Y形嗅觉仪及生物测定程序”。
2、结果
χ2测验结果表明：10-2g/ml乙酸叶醇酯、10-4g/ml 3-辛酮、10-4g/ml石竹烯、10-6g/ml和10-8g/ml(R)-(-)-α-水芹烯、10-10g/mlγ-松油烯、以及10-10g/ml和10-8g/ml桉树脑共8个剂量对叶蝉具有显著引诱效应(表2)。
表2显著引诱假眼小绿叶蝉的薄荷挥发物主要成分及其剂量
第4步茶园中薄荷挥发物的四组分和六组分混合物及单组分引诱叶蝉效应
1、诱芯
将表2中显著引诱叶蝉的10-2g/ml乙酸叶醇酯、10-4g/ml 3-辛酮、10-4g/ml石竹烯、10-6g/ml(R)-(-)-α-水芹烯、10-8g/ml桉树脑和10-10g/mlγ-松油烯。按1:1:1:1:1:1比例配成溶液，每吸取250μl载于1个橡皮头上制成1个诱芯，称为薄荷六组分诱芯。
同法，将10-4g/ml石竹烯、10-6g/ml(R)-(-)-α-水芹烯、10-8g/ml桉树脑和10-10g/mlγ-松油烯这4种组分制成薄荷四组分诱芯；10-2g/ml乙酸叶醇酯制成单组分诱芯；正己烷载于橡皮头上作为CK诱芯。
2、试验和分析方法
在假眼小绿叶蝉虫口高峰期，分别将每种诱芯附于芽绿色圆形粘板上，直径25cm(图3)(图3参照发明专利“一种诱捕防治假眼小绿叶蝉的方法”，专利号ZL201110134803.2的实施例1，但是本发明使用的色板形状是圆形，颜色是芽绿)。
1块粘板附1个诱芯，再把粘板挂于小木棍上，木棍插于茶行中，粘板的最下面边邻接茶梢，粘板之间距离7～8米。每种诱芯重复30次。2013年10月18日挂板，19～23日连续调查5天，每次调查之后调整色板的方位以便均匀地诱捕来自各个方向的叶蝉。第3天更换1次粘板，共更换1次。
分析每种诱芯每日诱捕的叶蝉数量(y)与天数(x)之间的相关关系，计算出回归模型。
3、薄荷挥发物的六组分诱芯有显著引诱效果
如图4、图5、图6和图7分别代表薄荷挥发物四组分诱芯、六组分诱芯、单组分诱芯和芽绿色圆形粘板(CK)每日诱捕的叶蝉数量。每天平均每块板上诱捕叶蝉数量如下：四组分诱芯3.4头，六组分诱芯3.9头，单组分缓释3.1头，CK 2.4头。由于长时间持续高温，旱情十分严重，部分茶树已经干死，茶园中叶蝉数量很少，但是仍然可见六组分诱芯诱杀效果很强。
实施例2茶园中叶蝉飞向诱芯的时间节律
1、材料与方法
选用实施例1第4步中的六组分诱芯、四组分诱芯、10-2g/ml乙酸叶醇酯单组分诱芯，再将10-2g/ml乙酸叶醇酯和10-2g/ml芳樟醇配成二组分诱芯。4种诱芯分别附于白色圆形粘板上，粘板直径25cm。参照例1第4步程序于茶园中进行试验，每种诱芯重复30次。将一天的调查时间分为以下8个时间段：19:30-05:30、05:30-07:30、07:30-09:30、09:30-11:30、11:30-13:30、13:30-15:30、15:30-17:30和17:30-19:30。在每段时间最后的30分钟内调查色板上的叶蝉数。从10月24日～10月28日进行了为期5天的时间节律调查。
对于每天每种诱芯8个时间段诱捕的叶蝉数量之间的差异作方差分析，并以Duncan’s新复极差比较差异。
2、结果和分析
在15:30～17:30、17:30～19:30、19:30-05:30、05:30～07:30四个时间段诱捕的数量最多(图8A-E，每天标有不同字母的相同形状柱子代表的数量之间的差异达显著水平)。由于使用的是白色粘板而不是芽绿色板，白板的引诱效果显著小于芽绿色板。但是仍可以看出由薄荷挥发物六组分、四组分、二组分制成的诱芯对于该叶蝉有诱杀作用，尤其是六组分诱芯(叶蝉诱捕剂诱芯)有显著诱杀效应。但是，2013年夏秋季持续高温干旱，部分茶树凋萎，茶园中假眼小绿叶蝉基数很小，被诱杀的叶蝉数也很小，叶蝉诱捕剂未能充分发挥作用。
实施例3薄荷挥发物六组分及其加入缓释剂的混合物引诱叶蝉的效应
1、材料与方法按照实例1第4步茶园中试验程序，选择第4步中六组分信息物质：10-2g/ml乙酸叶醇酯、10-4g/ml 3-辛酮、10-4g/ml石竹烯、10-6g/ml(R)-(-)-α-水芹烯、10- 8g/ml桉树脑和10-10g/mlγ-松油烯配制2组诱芯，一组将这6种组分按1:1:1:1:1:1比例吸取、制成混合物，上载于橡皮头制成诱芯称为六组分诱芯，每个橡皮头上载250μl混合物；另一组则在这250μl六组分混合物中再加入10μl的液体石蜡作为缓释剂，称为六组分缓释诱芯。两组的诱芯都附于白色圆形粘板上，直径25cm，1板1个诱芯。
2013年10月27日挂板，24小时之后调查白色粘板上假眼小绿叶蝉的数量，从10月28日～11月7日连续调查11天，每次调查在09:30～10:00完成。第六天更换1次粘板，共更换1次。每种诱芯重复30次。
2、结果和分析
由图9、图10分别算出六组分诱芯的半衰期为5.06天、六组分缓释诱芯的半衰期为7.42天，延迟2.36天；平均每种诱芯每天每板诱杀的叶蝉数分别为2.9头和3.3头。
Claims (4)
1.一种利用薄荷挥发物诱杀假眼小绿叶蝉的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
（1）以假眼小绿叶蝉为试虫，以薄荷植株6种挥发物乙酸叶醇酯（cis-3-Hexenylacetate）、3-辛酮（3-Octanone）、石竹烯（Caryophyllene）、α-水芹烯（(R)-(-)-α-Phellandrene）、桉树脑（Eucalyptol）和γ-松油烯（γ-Terpinene）为味源；
（2）以正己烷为溶剂，将6种挥发物分别配成浓度为10 -10g / ml - 10 -2 g / ml 的味源物，并将乙酸叶醇酯、3-辛酮、石竹烯、α-水芹烯、桉树脑和γ-松油烯按1 : 0.112: 0.1-12 : 0.1-12: 0.1-12: 0.1-12比例组合配制成假眼小绿叶蝉诱捕剂；
（3）将步骤（2）的诱捕剂，加入液体石蜡作为缓释剂，载于橡皮头上制成诱芯，诱芯附于芽绿色圆形粘板上，粘板直径20 - 30 cm，于假眼小绿叶蝉虫口高峰期、当成虫百分率≥60%时进行诱捕。
2.根据权利要求1所述的一种利用薄荷挥发物诱杀假眼小绿叶蝉的方法，其特征在于，步骤（3）中每诱芯加入10 - 30μl的液体石蜡作为缓释剂。
3.根据权利要求1所述的一种利用薄荷挥发物诱杀假眼小绿叶蝉的方法，其特征在于，被引诱的叶蝉数与薄荷质量成抛物线关系，当薄荷质量增加时，引诱的叶蝉数也增加，薄荷质量味源剂量超过1克时，引诱的叶蝉数减少；被引诱的叶蝉数y与供试薄荷质量x成抛物线关系y = - 0.6116 x2 + 3.5241 x+8.525, R 2 = 0.8181 ，P < 0.05，薄荷挥发物显著地引诱该叶蝉。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法在利用薄荷挥发物诱杀假眼小绿叶蝉中的应用。
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| 3 种植物精油防治茶假眼小绿叶蝉药效研究;白先丽 等;《现代农业科技》;20120920(第584期);第117、119页 * |
| 7种寄主和非寄主植物气味对茶尺蠖成虫行为的调控效应;江丽容 等;《生态学报》;第4993-5000页;20100930;第30卷(第18期);第4993-5000页 * |
| 薄荷属植物的杀虫活性;孙永艳 等;《世界农药》;20110825;第33卷(第4期);第25-56页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103931581A (zh) | 2014-07-23 |
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