CN109536418A - 一种微生物菌剂及其在水产养殖上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微生物菌剂，具体是公开了由一株猪源地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis YHSH‑02制备的微生物菌剂及在水产养殖上的应用。本发明的该菌种已在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO．15454，保藏日期为2018年3月15日。本发明的地衣芽孢杆菌YHSH‑02是从野猪肠道中分离获得的，能产生丰富的小肽，脂肽类杆菌素，抗菌蛋白等，能抑制副溶血弧菌，迟缓爱德华氏菌，嗜水气单胞菌、假交替单胞菌、创伤弧菌等多种水产养殖病原菌的生长，可用于防治由副溶血弧菌，迟缓爱德华氏菌，嗜水气单胞菌、假交替单胞菌、创伤弧菌等多种细菌引起的水产养殖病害。本发明的微生物菌剂首次发现能有效防治对虾“黑脚病”，为防治对虾“黑脚病”的提供一种行之有效的方案，具有重要意义。本发明从野猪肠道获得的地衣芽孢杆菌YHSH‑02是一株防治效率高、防治范围广的显著促生长的生物防治潜力菌株，具有良好的应用开发前景。

Description

一种微生物菌剂及其在水产养殖上的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，公开了一种微生物菌剂及其在水产养殖上的应用，具体是公开了一种由地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis YHSH-02发酵制备而成微生物菌剂及在水产养殖上的应用。
背景技术
近几十年来，以抗生素、激素、防腐剂为主的饲料药物添加剂给鱼虾等水产养殖业生产带来了很大的效益。然而，随着它的广泛应用，也出现了一些弊端，比如耐药菌株的产生、抗生素在畜禽，鱼虾水产品中的残留及二重感染等，这些问题受到国际社会的普遍关注与担忧，越来越多的国家已纷纷禁止或限制多种抗生素、激素、防腐剂作为饲料添加剂。抗生素、激素、防腐剂等药物饲料添加剂的应用受到严重的挑战。因此，开发和推广一种既能有效替代抗生素、激素、防腐剂又能有效地保健、防疫、促生长的新型绿色饲料添加剂已成为当务之急。
鱼虾细菌病害（如弧菌）的病害问题始终是阻碍鱼虾养殖业可持续发展的瓶颈制约，特别是随着鱼虾养殖的快速发展和集约化养殖程度的提高，以及采用人工饲料喂常用的抗病化合药如抗生素、激素、防腐剂又存在着较易产生耐药性且副作用大的缺点。特别是近两年，闽南诏安、漳浦，粤东三甲，闽东长乐、霞浦一带高密度养殖的南美白对虾出现爆发性死亡。在病死虾泳足附近的甲壳出现明显的发黑症状，养殖户称为“黑脚病”。国家***第三海洋研究所徐长安等人通过荧光定量PCR方法进行了多种对虾的病原检测，检测结果表明：“黑脚病”的发生和一种新型的虾类虹彩病毒（CQIV）感染有关系；但是在实验室进行CQIV人工口服攻毒实验，发病死亡的对虾很少出现“黑脚”症状。因此推断，“黑脚病”虾的出现除了感染CQIV，很可能还存在环境或其它病原的因素。除了新型虹彩病毒外，有些研究也检测到偷死野田村病毒；也有认为是由于池底病原细菌过多，底质太差导致的。事实上，其具体原因还没有定论，因此，目前黑脚病一旦发生，尤其是当死虾数量增加时，并无有效的处理办法，建议及时出虾，不要拖延，尽可能降低损失。因此，如何找到一种防治“黑脚病”的有效药物，是对虾养殖的一个重要课题。
目前我国针对细菌性水产病害的防治手段依然主要依赖抗生素等化学药物，抗生素治疗等措施能够达到部分控制疾病发生、促进养殖动物生长的目的，但由此带来的病原微生物耐药性、药物残留、水环境污染和水产品质量安全等问题越来越严重;同时，由于这些药物的长期使用，在杀灭病原生物的同时也损坏了养殖动物皮肤、肠道等所拥有的正常微生物屏障，使那些原来被正常菌群屏障所抑制的内源性病原菌或外源性病原菌得以大量繁殖，摧毁养殖动物表皮和肠道正常微生物群的微生态平衡，造成养殖动物疾病发生情况雪上加霜。利用自然环境中的拮抗微生物抑制病原菌，防治养殖动物的病原侵袭，控制病害发生，即生物防治一直是一个研究热点。从自然界分离、鉴定或通过生物工程人工组建有益微生物，开发经培养、发酵、干燥、加工等特殊工艺制成含有活菌并用于动物的生物制剂或活菌制剂有重要的理论意义和实际应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微生物菌剂，具体是提供一种由一株可拮抗多种水产病原菌的，能显著促生长的猪源地衣芽孢杆菌发酵而成的一种微生物菌剂；经过试验，该菌在0-7%的盐度中都能生长良好，可在海水与淡水都生长良好，并且对多种水产养殖病原菌如镘弧菌，副溶血弧菌，创伤弧菌，溶藻弧菌，哈维氏弧菌，链球菌，爱德华氏菌，河流弧菌，拟态弧菌，鲍曼不动杆菌，假交替单胞菌，嗜水气单胞菌具有显著抑制作用，能较好的防治对虾“黑脚病”。该菌种已在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO．15454，保藏日期为2018年3月15日。
另一方面，本发明目的是提供一种微生物菌剂（地衣芽孢杆菌制剂）在制备拮抗水产养殖病原菌的生物制品中的应用。
其中，所述的应用，其特征在于，所述的生物制品为发酵菌液或菌粉。其发酵菌液或菌粉可按现有发酵技术制备，本发明提供制备方法为:
一、取出地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis YHSH-02菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升LB培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至装液量为2LLB培养基的5L大三角瓶中， 37℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过20亿/毫升，即可作为地衣芽孢杆菌液体菌种；
二、将步骤一培养的地衣芽孢杆菌液体菌种作为种子，接种至600L发酵培养基，接种量为10%，开搅拌120r/min，每分钟通气量液气比1：0.8，37℃培养24-36小时，待芽孢含量不低于150亿CFU/ml，即可结束发酵，无菌灌装得到成品地衣芽孢杆菌菌剂；或得到发酵液后加上糊精进行喷雾干燥，得到地衣芽孢杆菌粉剂，其粉剂芽孢含量不低于100亿CFU/g；
其中所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
其中所述发酵培养基：豆粕粉50 g/L，鱼粉10 g/L，玉米浆粉10 g/L，葡萄糖5g/L，可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨5 g/L，硫酸镁0.3 g/L，硫酸锰0.05 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，碳酸钙5 g/L，pH7.2；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
本发明的效果：本发明的微生物菌剂中的地衣芽孢杆菌YHSH-02是从野猪肠道中分离获得的，能产生丰富的小肽，脂肽类杆菌素，抗菌蛋白等，能抑制副溶血弧菌，迟缓爱德华氏菌，嗜水气单胞菌、假交替单胞菌、创伤弧菌等多种水产养殖病原菌的生长，可用于防治由副溶血弧菌，迟缓爱德华氏菌，嗜水气单胞菌、假交替单胞菌、创伤弧菌等细菌引起的水产养殖病害。
本发明地衣芽孢杆菌液具有免疫增强作用，属实际无毒类物质，安全度大。
本发明地衣芽孢杆菌制剂可净化水质、降低水体与虾体内病原菌，提高养殖密度。本发明的地衣芽孢杆菌制剂首次发现能有效防治对虾“黑脚病”，为防治对虾“黑脚病”的提供一种行之有效的方案，具有重要意义。
本发明从野猪肠道获得的地衣芽孢杆菌YHSH-02是一株防治效率高、防治范围广的生物防治潜力菌株，具有良好的应用开发前景。
具体实施方式
实施例1地衣芽孢杆菌的分离
2014年12月，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株是在湖南省隆回县滩头镇野外的野生野猪的肠道内容物中分离得到的。具体方法是：取野生野猪的肠道内容物加入盛有10mL灭菌水的三角瓶中，震荡培养30min (200r/min)，然后取悬浮液1mL置于9mL无菌水中，制成10-2稀释悬浮液，依次类推，制成10-5，10-6稀释悬液；在其中各吸取100 u L，加到营养肉汤培养基平板，MRS培养基，PDA培养基上，用涂布棒涂布均匀，每个处理重复3次。将上述培养皿，置于37℃恒温培养箱中培养1-2d（PDA培养基置30℃下培养）。挑选单菌落转接到对应的培养基上培养，长出菌落后，用接种环进行划线分离纯化，纯化菌株于4℃保存。总共分离得到218个形态有差异单菌落。
其中的分离、纯化获得的YHSH-02菌株在营养肉汤培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为杏仁白色，湿润有光泽，略有放射状条纹，培养48小时后，培养基上有明显产棕色色素；细胞形状为杆状，细胞大小为0.6 um -0.8um×1.5 um -3.5 um；两端钝圆，形成芽孢，芽孢近椭圆形，中生，具有周生鞭毛，能运动。不形成伴孢晶体；好氧与厌氧都能生长；可液化明胶，水解淀粉，V-P反应、接触酶反应，酪素分解反应，牛奶胨化反应为阳性；卵黄反应，吲哚反应，苯丙氨酸脱氨反应，酪氨酸分解反应，牛奶凝固反应为阴性；能利用葡萄糖，木糖，L-***糖，甘露糖等。最适PH为5.5-8.7，最适生长温度为25-38℃，0-7%的盐度中都能生长良好，生长温度范围15-55℃通过16s rDNA鉴定为地衣芽孢杆菌。
实施例2地衣芽孢杆菌对常见致病菌的体外抑菌效果
具体实验方法如下:
1、YHSH-02菌悬液的制备:取斜面种子，接种至50m1灭菌TSB液体培养基中，恒温摇床震荡培养18h(培养温度30 ℃，转速200rpm)；将菌悬液8m1于l0ml灭菌离心管中，备用，均为现做现用。
2、鳗弧菌等致病性弧菌的菌悬液的制备
(1)挑取斜面菌苔一环接种至50m1 TSB液体培养基，摇床震荡培养18h(培养温度30℃，转速140rpm);
(2取上述菌悬液5m1重新接种至50m1新配TSB液体培养基，摇床震荡培养18h(培养温度30 ℃，转速140rpm);
( 3)离心(5000rpm,l0min)去掉上清，然后用生理盐水调整菌体浓度约1.0×108cfu/ml，取0.1 ml均匀涂板。
3、测定方法
(1)取上述制备好的鳗弧菌菌悬液108 cfu/ml（其他弧菌按同样的方法进行试验)0.1ml，均匀涂布于TSA平板表面(每个平板约30m1 TSA固体培养基);
(2)用打孔器在涂有病原弧菌的琼脂培养基上均匀的打五个孔，打孔器的直径约7mm。
(3)然后在琼脂孔中分别加入下述液体(约0.2 ml /孔)菌悬液、生理盐水阴性对照;
( 4)将上述平板置恒温培养箱培养24h-48h，然后观察结果测量抑菌圈直径。实验结果见表1。结果表明，地衣芽孢杆菌YHSH-02对水产养殖中的病原菌镘弧菌，副溶血弧菌，创伤弧菌，溶藻弧菌，哈维氏弧菌，链球菌，爱德华氏菌，河流弧菌，拟态弧菌，鲍曼不动杆菌，假交替单胞菌，嗜水气单胞菌等都具有明显的抑制效果。
表1.地衣芽孢杆菌对病原菌的体外抑菌效果
病原菌 菌悬液 阴性对照（无菌生理盐水
镘弧菌 32±2 7
副溶血弧菌 29±2 7
创伤弧菌 22±1 7
溶藻弧菌 28±1 7
哈维氏弧菌 22±1 7
链球菌 28±1 7
爱德华氏菌 33±2 7
河流弧菌 27±1 7
拟态弧菌 24±1 7
鲍曼不动杆菌 20±1 7
假交替单胞菌 18±1 7
嗜水气单胞菌 28±2 7
实施例3本发明微生物菌剂（地衣芽孢杆菌制剂）的制备
一、取出菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，37℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升LB培养基中，在培养箱中37℃震荡培养24小时。种子采用5%的接种量，接种至装液量为2LLB培养基的5L大三角瓶中， 37℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过20亿/毫升，即可作为地衣芽孢杆菌液体菌种；
二、将步骤一培养的地衣芽孢杆菌液体菌种作为种子，接种至600L发酵培养基，接种量为10%，开搅拌120r/min，每分钟通气量液气比1：0.8，37℃培养24-36小时，待芽孢含量不低于150亿CFU/ml，即可结束发酵，无菌灌装得到成品地衣芽孢杆菌菌剂；或得到发酵液后加上糊精进行喷雾干燥，得到地衣芽孢杆菌粉剂，其粉剂芽孢含量不低于100亿CFU/g；
其中所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
其中，所述发酵培养基：豆粕粉50 g/L，鱼粉10 g/L，玉米浆粉10 g/L，葡萄糖5g/L，可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨5 g/L，硫酸镁0.3 g/L，硫酸锰0.05 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，碳酸钙5 g/L，pH7.2；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
实施例4本发明微生物菌剂（地衣芽孢杆菌制剂）的安全性试验
本发明实施例2生产的地衣芽孢杆菌液在邵阳学院经大鼠急性毒性试验，结论结果表明地衣芽孢杆菌液对大鼠（按0.6ml/10g体重饲喂本发明地衣芽孢杆菌液14天）效果：大鼠全部存活,活动自如,毛发光滑,饮食正常,呼吸道、眼及口腔等处无分泌物外，未发现任何中毒症状，体重均有增加。与空白组对照组，比较，饲喂本地衣芽孢杆菌液的大鼠体重明显增加（P＜0.001）。14天观察期结束，将大鼠脱臼处死解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、脑、肠、小肠等脏器均未见明显异常表现。另外，大鼠胸腺系数和脾脏系数结果表明，与空白对照组比较，地衣芽孢杆菌液试验组大鼠脾脏系数明显增加（P＜0.01），提示本地衣芽孢杆菌液具有免疫增强作用，属实际无毒类物质，安全度大。
实施例5本发明微生物菌剂（地衣芽孢杆菌制剂）抑菌物质分析
1小肽含量的测定
准确称取取发酵液6g于100ml烧杯中，准确加入15%三氯乙酸溶液50ml，混合均匀，静置5min，以中速定性滤纸过滤，弃去少许初始滤液，将滤液转移至离心管，在4000r/min下离心10min,准确移取其上清液10于消化管中，按粗蛋白测定方法测定其粗蛋白含量，同时做空白试验，测定未接种发酵液（培养基）的粗蛋白含量。
2抗菌蛋白的粗提取--硫酸铵不同饱和度盐析
分别取100 ml发酵液静置于冰浴中，分别加入硫酸铵固体至20%, 30%, 40%,50%,60%, 70%, 80%，90%饱和度，静置过夜，次日离心收集沉淀，将分别将沉淀溶于l0ml磷酸缓冲液((PB)(0.01mol/L, pH6.8)中，透析浓缩后，杯碟法测定其抗菌（副溶血弧菌）活性。
3其他抑菌活性物质的粗提取
取120m1发酵液调pH值至2-3，加入等量乙酸乙酯萃取三次，并将萃取液用滤纸过滤后，40℃下旋转蒸干，得到淡黄色粗提物，用少量乙酸乙酯溶解，有机系微孔滤膜(孔径0.45μm)过滤去残渣，将上清定容至5ml，即抑菌活性物质粗提物，4℃密封保存。
4抑菌活性物质化学结构分析
(1) 薄层层析(TLC)
毛细管取少量粗提物点样在硅胶G板上(20 cm×5cm×0.25cm)边缘1.0- 1.5cm处，室温晾干，氯仿:甲醇:冰醋酸:水二6:3:1:1作为展开剂，首先将在展开剂里浸泡过的滤纸条粘贴在层析缸四壁上，向层析缸内加入展开剂，挥发10-30min，待层析缸被展开剂完全饱和后，将点好样的硅胶G板60℃倾斜放入在层析缸中，溶剂前沿低于样点，上行法展层，在展开剂前沿距硅胶G板顶部 1.0-2.0 cm时取出薄板，记好溶剂前沿，干燥后碘显色。将每个斑点对应组分刮下，用lml甲醇浸提，杯碟法测其抑菌活性，并计算各组分的Rf值。同时做硅胶G空白对照。
(2) 官能团显色反应
将抗菌活性物质粗提物薄板展层后干燥，分别用茚三酮试剂、苯酚-硫酸试剂、钼酸铵-高氯酸显色试剂、2，4-二硝基苯肼试剂、三氯化铁试剂、磷钼酸试剂、对氨基苯磺酸试剂喷雾显色，测其组分。
3结果：
地衣芽孢杆菌YHSH-02 菌株的发酵液经过检测，其小肽含量（30.89g/L）占总初始蛋白（36.5g/L）的84.5%，说明本地衣芽孢杆菌产生丰富的蛋白酶，能基本上将豆粕中的蛋白基本上转变为小肽物质，
我们试验发现，硫酸铵饱和度低于30%，高于80%时，盐析得到的粗蛋白很少，稍微有一点也是无抑菌性的杂蛋白。从表2可以看出，硫酸铵饱和度在30%-80%范围内有大量抗菌蛋白析出；采取直接加硫酸铵达到终点饱和度的方法，硫酸铵饱和度达到60%时粗提蛋白的抑菌活性最强，抑菌圈直径高达35.8mm。硫酸铵饱和度50%时，抑菌性次之，抑菌圈直径为32.7mm。
表2不同硫酸铵饱和度沉淀蛋白抑菌效果
硫酸铵浓度（%） 20 30 40 50 60 70 80 90
抑菌圈直径（mm） 0 24.5 18.6 32.7 35.8 28.2 13.4 0
地衣芽孢杆菌YHSH-02菌株的发酵液经过盐处理后，离心取上清进行抑菌效果测定，试验结果显示上清液仍具有抑菌活性。发酵液经过80%饱和度的硫酸铵沉淀后，同时其发酵液离心取上清进行抑菌效果测定，试验结果显示上清液仍具有抑菌活性。发酵液经过80%饱和度的硫酸铵沉淀后，上清测得具有抑菌活性，说明地衣芽孢杆菌YHSH-02菌株的胞外代谢物中除了抗菌蛋白外还存在其他抑菌活性物质，如细菌素、多肽类等中的一种或几种。本试验初步确定地衣芽孢杆菌YHSH-02菌株胞外代谢物中除抗菌蛋白之外还有其它抑菌活性物质。
测定结果(见表3)表明，由乙酸乙酯提取的抑菌物质，有机粗提物经过纸层析和生物显影显示有抑菌圈，茚三酮试剂反应呈阳性，在硅胶薄板上Rf0.84处出现红色斑点，推断该物质为多肽类或氨基酸类物质;苯酚-硫酸试剂显棕色，在硅胶薄板上Rf0.47处出现棕色斑点，说明有糖脂类物质，具有抑菌活性;钼酸铵一高氯酸显色剂呈阳性反应，在硅胶薄板Rf0.47处出现蓝黑色斑点，Rf0.58处出现蓝色斑点，说明存在糖脂、磷脂类物质，具有抑菌活性;磷钼酸试剂在薄板Rf0.84处出现斑点，说明抑菌活性物质为还原性物质;三氯化铁试剂反应呈阳性，在硅胶薄板Rf0.84处出现绿色斑点，显示该物质含有酚环;2, 4一二硝基苯肼试剂反应呈阳性，显示该物质含活泼羰基，但没有抑菌活性；对氨基苯磺酸试剂反应呈阳性，显示该物质存有胺类及能偶合的杂环化合物。根据层析板显色反应初步分析该抑菌活性物质可能为肽类物质，糖脂类，磷脂类物质。
表3通过不同试剂定性检验其抑菌物质及抑菌效果
显色剂 存在物质 结果 抑菌性
茚三酮试剂 肽类、氨基酸类物质 + ++
苯酚-硫酸试剂 糖脂类 + +
钼酸铵-高氯酸显色剂 磷脂类 + +
磷钼酸试剂 还原性物质、类脂等 + +
三氯化铁试剂 酚类物质 + -
2，4-二硝苯肼试剂 醛类物质 + -
对氨基苯磺酸试剂 酚类、胺类和能偶合的杂环化合物 + +
实施例5 下面结合试验说明本发明微生物菌剂（也称：地衣芽孢杆菌制剂）的效果
1、试验地点：广州市番禺区海鸥岛；养殖品种：南美白对虾；面积：12亩；养殖类型：土塘混养；放养天数： 30天；水体盐度为千分之三。
2、问题描述：虾吃料慢，有偷死，肝胰脏色泽不深，虾体弧菌为5×105CFU/ml PH8-8.5，溶氧6.5mg/L,氨氮0.3mg/L,水体检测弧菌3×104CFU/ml；
3、问题分析：对虾转肝期生长不良，肝胰脏发育不太好，水体弧菌较高，严重影响对虾的生存，易引起应激，但全池增氧机都已经打开，施入增氧剂效果也不明显。
4、解决方法：将地衣芽孢杆菌制剂添加在日常饲料中搅拌均匀，添加比例控制在0.1%；同时将地衣芽孢杆菌制剂直接全池泼水，添加量为1L/亩。
5、结果：本发明地衣芽孢杆菌制剂使用后，24小时后，偷死明显减少，水质指标为：PH8-8.5，溶氧5.5mg/L,氨氮0mg/L，虾体弧菌为8×103CFU/ml，水体检测弧菌5×102CFU/ml；48小时后，虾体色变好，水质指标为：PH8-8.4，溶氧4.8mg/L,氨氮0mg/L；虾体弧菌为500CFU/ml，水体检测弧菌20CFU/ml第三天后，虾体色恢复，无偷死,水色呈黄绿色；从试验结果可以看出，本地衣芽孢杆菌制剂具有明显治疗弧菌引起的偷死症。可净化水质、降低水体与虾体内弧菌，提高养殖密度。
实施例6 本发明的微生物菌剂--地衣芽孢杆菌制剂对虾弧菌感染的防治试验结果
1、试验地点：湛江市雷州市纪家镇；养殖品种：南美白对虾；面积：十亩；养殖类型：土塘混养；放养天数： 20天；水体盐度为千分之十。
2、问题描述：对虾处在转肝期，偷死严重，虾体内溶血弧菌超过2×106CFU/g，水体弧菌超过5×104CFU/ml，PH8.0-8.5，溶氧5-6.6mg/L,氨氮0.3mg/L,亚硝酸盐0mg/L，硫化氢0mg/L；
3、问题分析：应该是对虾弧菌引起的对虾早期偷死综合症；
4、解决方法：将地衣芽孢杆菌制剂添加在日常饲料中搅拌均匀，添加比例控制在0.2%；同时将地衣芽孢杆菌制剂直接全池泼水，添加量为2L/亩。
5、结果：本发明地衣芽孢杆菌制剂使用后，24小时后，偷死明显减少，对虾体弧菌检测含量已经降低了两个数量级达到3×104CFU/g水体弧菌降至2×102CFU/ml；48小时后，虾体色变好，只有少量偷死；第三天后，虾体色恢复，无偷死，对虾体弧菌检测含量已经降低了至100CFU/g，水体弧菌含量也降低至10 CFU/ml。
实施例7本发明的微生物菌剂--地衣芽孢杆菌制剂，在黄颡鱼爆头病上的防治效果
1、试验地点：湖南省澧县某养殖户，黄颡鱼养殖面积达到80亩，发病池塘为18亩，体重在2-4两。
2、问题描述：7月5日，开始有鱼出现爆头病即“一点红”病，使用其他杀虫，抗生素药物作用不明显，7月8日，死鱼量增加明显，水色较浑浊，氨氮0.4mg/L,亚硝酸盐0.2mg/L，硫化氢0mg/L。
3、问题分析：该病多由车轮虫等寄生虫寄生引起的细菌性并发病。是“爱德华氏菌”慢性感染造成的。其感染途径是经鼻腔感染嗅觉细胞，再进入大脑，经脑膜感染头骨。该病多伴随其他疾病发生，最常见的是败血症发生后易出现裂头病。因为“一点红”病的感染是从鱼脑内向脑外，所以一旦发病，外用消毒、内服抗生素效果均不是太好。
4、解决方法：将本发明地衣芽孢杆菌制剂添加在日常饲料中搅拌均匀，添加比例控制在0.2%；同时将地衣芽孢杆菌制剂直接全池泼水，添加量为1L/亩，将池塘中所有的增氧机全开48小时。
5、结果：本发明地衣芽孢杆菌制剂使用后，24小时后，死鱼己不见增多，水色也有明显改观， 48小时后，死鱼明显减少；第三天后，鱼体色恢复，已无死鱼，水色黄绿，氨氮0.1mg/L,亚硝酸盐0mg/L，硫化氢0mg/L，效果非常显著。
实施例8本发明的微生物菌剂--地衣芽孢杆菌制剂，在对虾“黑脚病”的防治效果
1、试验地点：湛江市建新镇；养殖品种：南美白对虾；面积：每口池塘三亩，总共8口，每口池塘放苗70万；养殖类型：高位池；水体盐度为千分之十二；试验组：四口塘，每周有三天连续将本发明地衣芽孢杆菌制剂添加在日常饲料中搅拌均匀，添加比例控制在0.1%；同时每周将地衣芽孢杆菌制剂直接全池泼水一次，添加量为1L/亩，将池塘中所有的增氧机全开48小时。对照组：：四口塘，每周有三天连续将市场上常规菌剂（多酶益菌素等）添加在日常饲料中搅拌均匀，添加比例控制在0.2%；同时每周将EM原露或光合细菌(市场上常规菌剂)直接全池泼水一次，添加量为5L/亩，将池塘中所有的增氧机全开48小时；其他操作相同。
试验结果：前65天养殖正常，对照组每口塘平均每餐吃料65斤左右，规格平均是60-70头。试验组每口塘平均每餐吃料75斤左右，规格平均是50-55头。由于冷空气来后，水温降速较快，对照组中有两口塘（对照组1与对照组3），在养殖至70天时，开始有蜕壳偷死，但表现不明显。蜕壳也不是2-3天就蜕完了，而是慢慢蜕，先是有少量偷死，每天2-3斤，第74天开始死亡量开始多起来，每天50-100斤，吸出来的虾主要症状就是游泳足发黑，而池塘里3-4成的虾也有“黑脚”的症状。活的病虾会游到池中心离水面20公分左右的水层飘着，活力很差，捞起来看都是空肠空胃的虾。对照组的另外两口塘，在养殖至78天时，也开始出现一样的有几只偷死与黑脚。
通过检测，我们发现水体的弧菌含量较高，达到2×105CFU/ml；，由于有报道说黑脚病是虹彩病毒病或野田村病毒引起的（但用虹彩病毒病或野田村病毒攻毒试验并不能导致对虾出现黑脚病，因此黑脚病具体原因还不是很清楚），同时送样至广东海洋大学做检测，从病死虾中有一部分虾中能检测出虹彩病毒显阳性，但不是所有死虾都有；采取措施：停料，通过降低水位（从原来的1.8－2米降到1－1.2米）和定期消毒（以前很少消毒），同时提高水体的氧化还原电位来进行处理，但是收效甚微。前两口发病的池塘，死虾太多，在78天时卖虾，清塘，最后对照组1平均规格为62.4头/斤，成活率仅仅54.96%，产值仅仅86312.8元；对照组3平均规格为60.6头/斤，成活率仅仅57.89%，产值仅仅96962.9元。养殖78天时，由于试验组，对虾采食，体色，肝胰脏都正常，而在对照组的第2口与第4口塘开始发病时，养殖场技术厂长，则私自向对照组的两口塘直接泼洒5L/亩本发明地衣芽孢杆菌液体，增氧机全开，由于已经停料，因此，没有拌料。第二天，其中一口塘，死虾达到50多斤，另外一口塘，死虾15斤左右；但打样，水体虾体色明显有改善；第三天后，死虾明显减少，只有几斤，水体弧菌已经低至200CFU/ml；第四天，只有几只死虾，开始拌减半投料，并拌0.2%的地衣芽孢杆菌液体菌剂，以后操作与试验组相同。最终试验结果见表4，从表4可以看出，全程使用地衣芽孢杆菌菌液的试验组的成活率没有低于74%的，而对照组最高的成活率也只有64.05%（这个还是后期也使用了地衣芽孢杆菌菌液的），从规格上，对照组养最大规格是40.8尾/斤，而试验组最低的规格可达到28.4尾/斤；明显试验组长得更快，虾成活率高很多；从产值上比，对照组四口池塘总共产值不到67万元，而试验组池塘3一口塘的产值就达到了76.9万元，四口实验塘总产值达到了258万元，是对照组产值的3.85倍；经济效益巨大。更为重要的是，由于对虾黑脚病排塘率超过80%，对对虾产业的破坏巨大，而且在没有使用本发明地衣芽孢杆菌制剂时，基本上是无法治疗的。因此，本发明的地衣芽孢杆菌菌液为防治对虾黑脚病的提供一种行之有效的方案，具有重要意义。
表4地衣芽孢杆菌在防治黑脚病试验效果
组别 是否发病 养殖天数 出虾规格（尾/斤） 产量（斤） 成活率 塘口价（元/斤） 产值（元）
对照组1 是 78 62.4 6165.2 54.96% 14 86312.8
对照组2 是 95 42.1 10506.5 63.19% 22 231143
对照组3 是 78 60.6 6687.1 57.89% 14.5 96962.9
对照组4 是 96 40.8 10988.4 64.05% 22.5 247239
试验组1 否 100 28.4 18892.6 76.65% 28 528992.8
试验组2 否 100 26.3 21564.3 81.02% 28.5 614582.6
试验组3 否 102 22.1 25231.7 79.66% 30.5 769566.9
试验组4 否 102 23.5 22289.8 74.83% 30 668694
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (4)

1.一种微生物菌剂，其特征在于，此微生物菌剂是由地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis YHSH-02发酵制备而成，其中，该菌种已在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO．15454，保藏日期为2018年3月15日。
2.根据权利要求1所述的一种微生物菌剂，其特征在于，该微生物菌剂在制备拮抗水产养殖病原菌并促进生长的生物制品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的水产养殖病原菌为镘弧菌，副溶血弧菌，创伤弧菌，溶藻弧菌，哈维氏弧菌，链球菌，爱德华氏菌，河流弧菌，拟态弧菌，鲍曼不动杆菌，假交替单胞菌，嗜水气单胞菌。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的生物制品为发酵菌液或菌粉。
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