CN109517826B - 一种修饰的Bach1基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种修饰的Bach1基因及其在干细胞多能性、自我更新、增殖、重编程和分化中的应用。通过修饰转录因子Bach1基因，使得细胞的BACH1蛋白活性或表达被抑制或者细胞的BACH1蛋白活性或表达增加，进而与去泛素化蛋白酶Usp7，多能性因子Nanog，Sox2和/或Oct4、PRC2复合体、Wnt/β‑catenin信号通路、和/或Nodal/Smad2/3信号通路相互作用，从而调节干细胞自我更新、增殖和/或分化。

Description

一种修饰的Bach1基因及其应用

一、技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种修饰的Bach1基因及其在调节干细胞多能性、自我更新、增殖、重编程和/或分化中的应用。

二、背景技术

干细胞最重要的特征就是具有自我更新能力和多向分化的潜能性。目前，调控人胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cells,hESCs)的自我更新和分化的分子机制尚未完全阐明。在胚胎发育的早期阶段，组蛋白修饰、染色质重塑等表观遗传学的修饰作用与细胞内各种信号通路的协调活动，在胚胎发育和干细胞分化中具有重要作用。转录因子Bach1(BTB and CNC homology 1,BTB-CNC同源体1)属于碱性亮氨酸拉链蛋白家族成员，其广泛存在于哺乳动物各种组织中，参与调控基因的转录。但是Bach1在干细胞自我更新和分化中的作用尚不清楚。

另外，人胚胎干细胞的培养方法目前主要使用成分复杂且价格昂贵的培养基，如mTesR1等，其中添加的生长因子等物质不易获得，制作流程复杂。因此，急需一种更为简单、成本低的方法对其进行培养。

三、发明内容

本发明研究了Bach1对干细胞多能性、自我更新、增殖、重编程或分化的作用和分子机制，发现通过修饰Bach1基因，可以调控干细胞的多能性、自我更新、增殖、重编程和/或分化，因此，

本发明的第一方面，涉及一种修饰的转录因子Bach1基因，其中转录因子Bach1基因被修饰，使得细胞的BACH1蛋白活性或表达被抑制或者细胞的BACH1蛋白活性或表达增加。

本发明的第二方面，涉及一种修饰的转录因子Bach1基因在调节干细胞多能性、自我更新、增殖、重编程和/或分化中的应用。

本发明的第三方面，涉及一种转录因子Bach1的调节试剂在调节干细胞多能性、自我更新、增殖、重编程和/或分化中的应用。

进一步，所述的调节试剂在基因、mRNA、蛋白等水平上对转录因子Bach1进行调节。

本发明的第四方面，涉及一种调节干细胞多能性、自我更新、增殖、重编程和/或分化的方法，其中，所述干细胞的Bach1基因被修饰，使得干细胞的BACH1蛋白活性或表达被抑制或者干细胞的BACH1蛋白活性或表达增加。

本发明的第五方面，涉及一种干细胞系，其中，所述干细胞系的Bach1基因被修饰，使得干细胞的BACH1蛋白活性或表达被抑制或者干细胞的BACH1蛋白活性或表达增加。

上述发明中，优选的，所述转录因子BACH1蛋白与去泛素化蛋白酶USP7，多能性因子NANOG，SOX2和/或OCT4、PRC2复合体、Wnt/β-catenin信号通路、和/或Nodal/Smad2/3信号通路相互作用，从而调节干细胞多能性、自我更新、增殖、重编程和/或分化。

进一步，所述基因修饰使得干细胞的BACH1蛋白活性或表达被抑制，从而抑制干细胞多能性、自我更新、增殖和/或重编程。

进一步的，所述基因修饰使得干细胞的Bach1基因的mRNA水平下降，进而BACH1蛋白表达被抑制。

进一步，所述基因修饰使得干细胞的BACH1蛋白活性或表达被抑制，从而促进干细胞向中内胚层的分化，抑制神经外胚层的分化。

进一步，所述基因修饰使得干细胞的BACH1蛋白活性或表达被抑制，从而减少EZH2蛋白和H3K27me3蛋白在中内胚层分化基因的启动子区的富集，促进这些分化基因的表达。

进一步，所述基因修饰使得干细胞的BACH1蛋白活性或表达被抑制，从而激活Wnt/β-catenin和Nodal/Smad2/3信号通路，增加β-catenin和Smad2/3在中内胚层分化基因的启动子区的富集，促进中内胚层分化基因的表达。

进一步，所述基因修饰使得干细胞的BACH1蛋白活性或表达增加，从而维持干细胞多能性、维持干细胞自我更新能力、促进干细胞增殖、促进干细胞的重编程、抑制干细胞的分化。

进一步，所述基因修饰使得干细胞的BACH1蛋白活性或表达增加，从而增加去泛素化蛋白酶USP7蛋白表达，增加多能性因子NANOG，SOX2和/或OCT4蛋白与USP7蛋白的相互作用，从而增加多能性因子的蛋白稳定性。

进一步，所述基因修饰使得干细胞的BACH1蛋白活性或表达增加，从而增加体细胞重编程的效率。

优选的，对Bach1基因的第1外显子，第2外显子，第3外显子、第4外显子和/或第5外显子进行基因修饰。

优选的，所述使得BACH1蛋白活性或表达被抑制的基因修饰方式包括点突变、缺失、***、反义polynucleotides、siRNA、microRNA或基因编辑技术；进一步优选的，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶等基因编辑技术。

更优选的，所述基因修饰包括利用CRISPR/Cas9技术对Bach1基因的第2外显子进行敲除。

优选的，所述使得BACH1蛋白活性提高或者过表达的基因修饰方式包括点突变、连接强启动子、连接增强子、提高拷贝数，病毒载体、转座子基因***。

进一步优选的，所述基因修饰方式是利用Piggy Bac转座子***构建四环素Dox可诱导性Bach1过表达。

进一步，所述干细胞为胚胎干细胞、成体干细胞、诱导性多能干细胞；优选的，所述胚胎干细胞是鼠或人的胚胎干细胞。

本发明的第六方面，涉及一种sgRNA序列，所述sgRNA序列靶向细胞的转录因子Bach1基因，同时所述sgRNA在待改变的转录因子Bach1基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则。

更优选的，所述sgRNA在细胞中的转录因子Bach1基因的靶位点分别位于转录因子Bach1基因的第1、2、3外显子、第4外显子和/或第5外显子上。进一步优选的，所述的待改变的转换区为第2外显子部分或全部。

再进一步优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的第七方面，涉及一种干细胞系的培养方法，其中，所述方法中加入BACH1蛋白对干细胞系进行培养。

进一步，所述干细胞系为胚胎干细胞、成体干细胞、诱导性多能干细胞；优选的，所述胚胎干细胞是鼠或人的胚胎干细胞。

本发明的第八方面，涉及一种上述培养方法培养得到的干细胞系。

本发明的第九方面，涉及一种上述干细胞系在制备药物组合物中的用途。

本发明的第十方面，涉及一种药物组合物，其中，所述药物组合物包括上述干细胞系。

进一步，所述药物组合物用于治疗心血管疾病。

根据本发明提供的技术方案，1、我们首次发现了通过修饰的Bach1基因可以调控干细胞的多能性、自我更新、增殖、重编程和/或分化，Bach1基因与去泛素化蛋白酶Usp7，多能性因子Nanog，Sox2和/或Oct4、PRC2复合体、Wnt/β-catenin信号通路、和/或Nodal/Smad2/3信号通路相互作用，从而调控干细胞的多能性、自我更新、增殖、重编程和/或分化；2、Bach1通过多种机制抑制中内胚层细胞的分化，而心血管***的细胞是由中内胚层细胞进一步向下游分化得到的，心血管***疾病是危害人类健康的头号杀手，而基于干细胞来源的心血管***细胞是治疗心血管***疾病的一个重要方法。本发明发现，抑制Bach1可以促进干细胞向中内胚层的细胞分化，进而有利于得到用于治疗疾病的心血管***细胞，促进了再生医学的发展和临床应用；3、人胚胎干细胞的培养方法主要使用成分复杂且价格昂贵的培养基，如mTesR1，而转录因子BACH1蛋白可以维持干细胞的多能性、自我更新、增殖、重编程、抑制干细胞的分化，根据需要，将外源BACH1蛋白应用到干细胞的培养中，则可以更好得维持干细胞的多能性、自我更新、增殖、重编程、抑制干细胞的分化，同时，使干细胞的培养更加经济。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：

1、Molecular Cloning ALaboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，Fritschand Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；

2、L.Jiang et al.,Bach1represses Wnt/beta-Catenin signaling andangiogenesis.Circ Res 117,364-375(2015)；

3、L.Jiang et al.,The Transcription Factor Bach1Suppresses theDevelopmental Angiogenesis of Zebrafish.Oxid Med Cell Longev 2017,2143875(2017)；

4、Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；O.Shalem etal.,Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.Science 343,84-87(2014)；

5、S.Tu et al.,Co-repressor CBFA2T2regulates pluripotency and germlinedevelopment.Nature 534,387-390(2016).

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

所有附图中，WT为野生型，Bach1-KO或KO为Bach1敲除的胚胎干细胞，Bach1-KO+Dox为DoxBach1转染的Bach1-KO加Dox处理，Bach1-KO-Dox为DoxBach1转染的Bach1-KO未加Dox处理，M为Marker

图1：

A：通过定量已发表质谱法分析的小鼠的六个胚胎期中Bach1和Oct4的蛋白质表达(左)；分析发表的RNA-SEQ数据E5.5(cavity stage,Cav)，E6.0(prestreak stage,PS)，E6.5(early-streak stage,ES),E7.0(late-middle streak stage,LMS),和E7.5(early-bud stage,EB)的小鼠胚胎中Bach1、T、Mesp1的表达(右)。P，后部；Epi，外胚层。

B：上图：E4.5囊胚中Oct4(左2)和Bach1(左1)表达的共聚焦免疫荧光分析。比例尺，20μm；

下图：E7.5小鼠胚胎中的T(左2)和Bach1(左1)表达。DAPI(细胞核标记，左3)。比例尺，100μm(上面)和50μm(下面)。

C：将WT hESC免疫荧光染色以表达Bach1(左1)，并用DAPI(左2)对细胞核进行复染色。比例尺，100μm。

D：通过CRISPR-Cas9基因组编辑产生Bach1敲除hESC策略图。

E：通过PiggyBac转座子***产生Dox诱导型Bach1 hESC示意图。

F：通过qRT-PCR测量WT和Bach1-KO hESC中的Nanog，Sox2，Oct4和Bach2 mRNA水平；将结果标准化为WT hESC中的测量值(n＝3)。

G：在DoxBach1转染的的WT hESC中，使用Dox(Dox+)或没有使用Dox(Dox-)处理，WB检测Nanog，Sox2，Oct4和BACH1蛋白水平(左图)和定量(右图)进行评价；β-actin用来评估等量的上样量(n＝3)。*P<0.05；**P<0.01与Dox-相比；t test。

H：WT和Bach1-KO hESC的细胞周期分布。细胞在指定的细胞周期阶段中的百分比(n＝3)。*P<0.05；**P<0.01与WT相比；t test。

I：通过流式细胞术(n＝3)鉴定annexin V标记的细胞来定量细胞凋亡。

从三个独立的重复中收集数据并显示为平均值±SD。

图2：

A：加或者不加DOX处理的WT hESC和DoxBach1转染的Bach1-KO hESC,免疫印迹分析克隆的Bach1蛋白水平(左)和碱性磷酸酶(AP)染色(右)，比例尺，500μm。

B：WT hESC和Bach1-KO hESC中分化的(Diff)，混合(一些细胞AP阳性，一些阴性)和未分化(Undiff)克隆平均百分比。(n＝3)。*P<0.05；**P<0.01与WT相比；t-test。

C：将WT，Bach1-KO-Dox和Bach1-KO+Dox hESC接种到包被有Matrigel的孔中(3×10 ⁴个细胞/孔)，并通过监测随后的4天培养期间的细胞计数来评估增殖情况。(n＝3)。*P<0.05；**P<0.01与WT相比；#P<0.05，##P<0.01，与Bach1-KO-Dox相比，单因素方差分析。

D：通过Western印迹(左图)评估WT，Bach1-KO-Dox和Bach1-KO+Dox hESC中的Nanog，Sox2，Oct4和Bach1蛋白水平并定量(右图)；β-actin的水平表示相同的上样量(n＝3)。**P<0.01，与WT相比；##P<0.01与Bach1-KO-Dox相比；单因素方差分析。

E：WT和Bach1-KO hESC进行Sox2或Oct4免疫荧光染色，DAPI染细胞核。比例尺，100μm。

F：用慢病毒对照shRNA(Lv-Con)或慢病毒Bach1-shRNA(Lv-shBach1)处理的hESC中的克隆的AP染色和分化的，混合的和未分化的细胞克隆的平均百分比。比例尺，500μm。*P<0.05；**P<0.01，与Lv-Con相比，；t test。

G-H：用Lv-Con或Lv-shBach1感染的hESC，4天后，Western Blot分析多能性基因的表达水平(左)和细胞数量的定量(右)(n＝3)。*P<0.05，**P<0.01与Lv-Con相比；t test。

I：Bach1的过表达增强了人真皮成纤维细胞的重编程效率。左图：重编程克隆的AP染色。右：AP阳性克隆的定量和统计分析(n＝4)。*P<0.05与AdGFP相比；t test。

从三个或四个独立的重复中收集数据，并显示为平均值±SD。

图3：

A：用10μg/ml环己酰亚胺(CHX)处理用或不用Dox处理的DoxBach1转染的WT hESC，在指定的时间通过免疫印迹测定Nanog，Sox2和Oct4蛋白的水平。定量免疫印迹的条带强度(n＝3)。*P<0.05；**P<0.01与Dox-相比，t test。

B：用(MG132)或不用(DMSO)蛋白酶体抑制剂MG132(10μM)处理WT和Bach1-KO hESC6小时，并通过WB和定量测定Nanog，Sox2和Oct4蛋白的水平(n＝3)。*P<0.05与WT，DMSO相比；#P<0.05##P<0.01与Bach1-KO，DMSO相比，；单因素方差分析。

C：用MG132(10μM)处理用或不用Dox处理的DoxBach1转染的WT hESC 6小时。使用ub抗体拉下泛素化的蛋白质，并使用抗Nanog抗体检测Nanog蛋白的泛素化。

D：Bach1从WT hESC免疫沉淀；然后，WB检测沉淀物中存在的Usp7，Nanog，Sox2，Oct4和c-Myc的量。

E-F：通过qRT-PCR或WB评估WT hESC和Bach1-KO hESC中的Usp7mRNA(E),和蛋白质(F)水平并定量；β-actin的水平表示相同的上样量(n＝3)。*P<0.05；**P<0.01，与WT相比，ttest。

G：发表的ChIP-seq数据的hESC中代表性基因座Usp7的Bach1信号转录，并且通过ChIP-qPCR在WT hESC中评估Usp7与Bach1的启动子序列的结合，并且IgG用作阴性对照(n＝3)。*P<0.05与IgG相比，t test。

H：在DoxBach1转染的WT hESC中，用(Dox+)或不用(Dox-)Dox处理并且用(Usp7si)或不用(Consi)Usp7siRNA(n＝3)转染，WB分析其中多能性蛋白的变化。*P<0.05；**，P<0.01与Dox-，Consi相比；##P<0.01与Dox+，Consi相比；单因素方差分析。

I:在存在和不存在Dox的情况下，转染非特异性或Usp7特异性siRNA后，在DoxBach1转染的WT hESC中检测Nanog的泛素化。使用ub抗体进行IP，并通过免疫印迹测定Nanog的水平。

从三个独立的重复中收集数据并显示为平均值±SD。

图4

A：用或不用Dox处理的DoxBach1转染的WT hESC，加入MG132(10μM)处理6小时。使用ub抗体拉下泛素化的蛋白，并使用抗Sox2抗体通过蛋白质印迹检测Sox2的泛素化蛋白。免疫沉淀Oct4，并使用ub抗体通过蛋白质印迹检查Oct4的泛素化蛋白。

B：HEK293T细胞中转染表达Flag-Bach1的质粒，用Flag抗体纯化进行MS，打出的肽段的计数。

C-D：DoxBach1转染的WT hESC，用(Dox+)或不用Dox(Dox-)处理，通过qRT-PCR或WB评估Usp7mRNA(C)和蛋白质(D)水平并定量；β-actin用来评估等量的上样量(n＝3)。*P<0.05；**P<0.01与Dox-相比；t test。

E：转染非特异性或Usp7特异性siRNA后WT hESC中Nanog的泛素化。使用ub抗体进行免疫沉淀，并通过抗Nanog抗体检测。

F：在用不同浓度的(0,5,10μM)Usp7抑制剂P5091处理的WT hESC，WB检测Usp7和多能性基因的表达。

G：用或不用Usp7抑制剂P5091(10μM)处理的DoxBach1转染的WT hESC，WB检测多能性基因的表达。

H：用或不用Usp7质粒转染WT和Bach1-KO hESC，通过WB测定Nanog，Sox2和Oct4蛋白的水平(n＝3)，并定量。**P<0.01与WT，GFP相比；#P<0.05，##P<0.01与Bach1-KO，GFP相比；单因素方差分析。

图5

A：热图，分析WT和Bach1-KO hESC中不同胚层的指定基因的表达。

B：EB分化在指定的时间点通过qRT-PCR测量WT和Bach1-KO hESC中的中胚层，内胚层和神经外胚层标志物的mRNA水平，将结果标准化为WT，day0＝1(n＝3)。*P<0.05；**P<0.01与WT相比；t test。

C：EB分化Day3，对WT和KO hESC进行Gata6和T的免疫荧光染色，并用DAPI对细胞核进行复染色。比例尺，100μm。

D：通过WB在WT和Bach1-KO hESC中评估Gata6，T，Sox2，Oct4和Bach1蛋白水平。β-actin的水平表示相同的上样量。

E：在EB分化的第3天,在WT，Bach1-KO-Dox和Bach1-KO+Dox hESC中,通过qRT-PCR测量中内胚层和神经外胚层基因的mRNA水平；将结果标准化为WT细胞中的测量值(n＝3)。*P<0.05；**P<0.01与WT相比；#P<0.05，##P<0.01与Bach1-KO相比；单因素方差分析。

F：将WT或Bach1-KO hESC皮下注射到SCID小鼠中；8周后，收获畸胎瘤，切片并用苏木精和伊红染色用于组织学分析(左)。比例尺，100μm。通过qRT-PCR测量WT或Bach1-KOhESC的小鼠的畸胎瘤中谱系标志物基因的mRNA水平(右图，n＝3)。*P<0.05；**P<0.01与WT相比；t test。

从三个独立的重复中收集数据并显示为平均值±SD。

图6

A：用lentival control-shRNA(Lv-Con)或lentival Bach1-shRNA(Lv-shBach1)处理的hESC中，在EB分化的第3天，通过qRT-PCR测量中内胚层和神经外胚层基因的mRNA水平；将结果标准化为Lv-Con细胞中的测量值(n＝3)。*P<0.05；**P<0.01与Lv-Con相比；ttest。

B：细胞自发分化成胚状体，WT和Bach1-KO细胞中心脏祖细胞(Isl1)，软骨祖细胞(Sox9，Col2a1)，红细胞样细胞(β-珠蛋白)，胰腺样细胞(Pdx1)和肝细胞(Alb)的标志物的mRNA水平。在指定的时间点通过qRT-PCR测量，将结果标准化为WT，day0细胞的测量值(n＝3)。*P<0.05；**P<0.01，与WT相比，t test。

C-D：在WT和Bach1-KO hESC中,转染或不转染Usp7 siRNA(C)或Usp7质粒(D)，hESC在分化的第3天通过qRT-PCR，评估中内胚层基因的mRNA水平，并且将结果标准化为WT细胞中的测量值(n＝3)。*P<0.05，**P<0.01与WT，Consi或GFP相比；#P<0.05；##P<0.01与Bach1-KO，Consi或GFP相比；单因素方差分析。

图7

A：来自hESC中公布的ChIP-seq数据，围绕(±5kb)TSS(转录起始位点)的基因组区域的Bach1，EZH2和H3K27me3的热图。

B：来自hESC中公布的Bach1，EZH2和H3K27me3 ChIP-seq数据，代表性基因座T，Gata6，Wnt3和Nodal的信号轨迹。

C：在敲除Bach1上调的基因中，分析WT和Bach1-KO hESC±5Kb TSS内,H3K27me3和EZH2ChIP-seq信号。

D：WT和Bach1-KO hESC中代表性基因T和Gata6的H3K27me3和EZH2信号。

E：通过ChIP-qPCR(n＝3)在WT和Bach1-KO hESC中评估中内胚层基因。Nodal和Wnt3的启动子序列与H3K27me3，EZH2和H3K4me3的结合。*P<0.05；**P<0.01，与WT相比；ttest。

F：在用DoxBach1转染的WT hESC中通过qRT-PCR测量中内胚层基因mRNA水平，所述WT hESC已经用(Dox+)或不用(Dox-)Dox和用(+DZNep)或不用(-DZNep)EZH2抑制剂DZNep(20ng/mL)处理，EB分化后12小时(n＝3)。*P<0.05；**P<0.01与Dox-，DMSO相比，##P<0.01与Dox+，DMSO相比；单因素方差分析。

G-H：用含有T或Gata6启动子序列荧光素酶报告基因的质粒转染(DoxBach1转染的WT hESC，T或Gata6启动子序列(G)或T启动子的野生型和突变形(H)；然后，在用(Dox+)或不用Dox(Dox-)处理的细胞中测量荧光素酶活性，并将结果标准化为Dox-hESC(n＝3)中的测量值。*P<0.05；P<0.01**与Dox-相比；t test。

从三个独立的重复中收集数据并显示为平均值±SD。

图8

A：WT hESC针对Bach1和EZH2表达进行免疫荧光染色；细胞核用DAPI复染。比例尺，50μm。

B：Bach1从WT hESC免疫沉淀；然后，通过蛋白质印迹评估沉淀物中存在的EZH2，EED和SUZ12的量。

C：EZH2，EED和SUZ12从WT hESC免疫沉淀；然后，通过蛋白质印迹评估沉淀物中存在的EZH2，EED，SUZ12和Bach1的量。

D：存在和不存在DNA酶和RNA酶A的情况下，在WT hESC中进行Bach1和EZH2之间的Co-IP。

E：用编码Flag标记的Bach1和HA标记的EZH2质粒和空载转染HEK293细胞。然后，用抗Flag抗体免疫沉淀Bach1，用抗Flag抗体通过蛋白质印迹在免疫沉淀物和细胞裂解物中检测到Bach1，而用抗HA抗体通过蛋白质印迹在沉淀物中检测到EZH2。在裂解物中β-actin表示相同的上样量。

F：细菌表达的His标记的EZH2与GST标记的完整Bach1蛋白(Bach1-Full-GST)或缺乏C末端bzip结构域的Bach1突变形式(Bach1-N-GST)，或N末端BTB结构域(Bach1-C-GST)一起孵育。然后，用谷胱甘肽-Sepharose 4B珠子沉淀反应产物，并用抗-His抗体通过蛋白质印迹在沉淀物中检测EZH2。

图9

A：通过WB评估WT和Bach1-KO hESC中的H3K27me3，EZH2和Bach1蛋白水平，以及组蛋白3赖氨酸4-三甲基化(H3K4me3)，赖氨酸9-二甲基化(H3K9me2)，赖氨酸27-乙酰化(H3K27ac)，赖氨酸9-乙酰化(H3K9ac)，SUZ12和EED的蛋白质水平。

B-C：在WT和Bach1-KO hESC中，通过ChIP-qPCR评估H2AK119ub(B)和Ring1B(C)在中内胚层基因，Nodal和Wnt3的启动子区域的富集情况(n＝3)。

D：用或不用Usp7siRNA转染的WT hESC中，ChIP-qPCR评估H3K27me3富集在中内胚层基因，Nodal和Wnt3的启动子区域的情况(n＝3)。*P<0.05，**P<0.01与Consi相比，ttest。

E：用或不用Usp7质粒转染的WT和Bach1-KO hESC，ChIP-qPCR评估H3K27me3富集在中内胚层基因，Nodal和Wnt3的启动子区域的情况(n＝3)。*P<0.05；**P<0.01与WT，GFP相比；单因素方差分析

图10

A：WT和Bach1-KO hESC中,EB分化第3天的热图，说明中胚层，内胚层，Wnt和TGF-β信号通路的基因表达情况。

B：EB分化第3天，用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes分析WT和Bach1-KO hESC的RNA-seq数据，以鉴定在Bach1-KO hESC中上调的信号通路。

C：用TOPflash荧光素酶报告基因转染WT和Bach1-KO hESC；然后，用或不用Wnt/β-catenin抑制剂IWR1-e(10μM)或Wnt3a(10ng/mL)处理细胞，并在分化的第3天评估荧光素酶活性并将其标准化为WT细胞中的测量值(n＝3)。*P<0.05；**P<0.01与WT，IWR1-e-或Wnt3a-相比；##P<0.01与Bach1-KO，IWR1-e-或Wnt3a-相比；单因素方差分析。

D：在分化的第3天用或不用Wnt3a(10ng/mL)处理的WT和Bach1-KO hESC，qRT-PCR评估中内胚层基因的mRNA水平，并将结果标准化为WT细胞中的测量值(n＝3)。*P<0.05；**P<0.01与WT，Wnt3a-相比，##P<0.01与Bach1-KO，Wnt3a-相比；单因素方差分析。

图11

A：在分化成胚胎体的第3天，在WT和Bach1-KO hESC中，通过qRT-PCR测量Wnt信号传导途径的组分的mRNA水平，并标准化至WT细胞中的测量值(n＝3)。*P<0.05，P<0.01；**与WT相比；t test。

B：在分化的第3天,通过WB在WT和Bach1-KO hESC中评估Wnt3，Fzd1，激活形式的β-catenin和总的β-catenin的蛋白质水平。

C：在分化的第3天,在WT和Bach1-KO hESC中，通过WB测定细胞核和细胞质中激活形式的β-catenin和总的β-catenin的蛋白质水平。

D：用TOPflash荧光素酶报告基因转染WT和Bach1-KO hESC，然后，用或不用Wnt抑制剂IWP2(10μM)处理细胞，并在分化的第3天评估荧光素酶活性，并将其标准化为WT细胞中的测量值(n＝3)。**P<0.01，与WT(IWP2-)相比；##P<0.01与Bach1-KO(IWP2-)相比；单因素方差分析。

E：在分化第3天(n＝3)用或不用IWP2(10μM)处理的WT和Bach1-KO hESC中，评估中内胚层基因的mRNA水平。**P<0.01与WT，DMSO相比；#P<0.05；##P<0.01与Bach1-KO，DMSO相比；单因素方差分析。

F：在分化的第3天通过ChIP-qPCR，在WT和Bach1-KO hESC(左)和加(Dox+)或不加(Dox+)的DoxBach1转染的WT hESC中评估中内胚层基因和信号分子Wnt3和Nodal与活化的β-catenin的启动子序列的结合。将结果标准化为WT(左)或Dox-(右)细胞(n＝3)。*P<0.05；**P<0.01与WT或Dox-相比；t test。

G：分化的第3天，在编码β-catenin shRNA(Ad-shβ-catenin)或对照shRNA序列(Ad)的腺病毒感染的WT和Bach1-KO hESC中，评估中内胚层基因的mRNA水平和β-catenin的蛋白水平(n＝3)。**P<0.01与WT，Ad-shCtrl相比；##P<0.01与KO，Ad-shCtrl相比；单因素方差分析。

H：在分化的第3天，在DoxBach1转染的WT hESC中用Dox(Dox+)或没有(Dox-)处理，通过qPCR评估Wnt3，Nodal和Bach1的mRNA水平(n＝3)。*P<0.05与Dox-相比；t test。

I：用含有荧光素酶报告基因的质粒转染DoxBach1转染的WT hESC，所述构建体含有野生型或突变形式的Wnt3启动子，然后，在分化第3天用(Dox+)或不用Dox(Dox-)处理的细胞中测量荧光素酶活性，并将结果标准化为在Dox-细胞中测量(n＝3)。*P<0.05与Dox-相比，；ttest。从三个独立的重复中收集数据并显示为平均值±SD

图12

A：在分化的第3天，在WT和Bach1-KO hESC中，通过qRT-PCR评估Nodal和受体ALK4和ACVRIIB的mRNA水平，并将结果标准化为WT细胞中的测量。(n＝3)。**P<0.01与WT相比，ttest。

B：在WT和Bach1-KO hESC中，在分化的第3天通过WB评估Nodal，ACVRIIB，磷酸化Smad2和Smad3(分别为p-Smad2和p-Smad3)和总Smad2/3的蛋白质水平。

C：用含有由野生型或突变形式的Nodal启动子控制的荧光素酶报告基因质粒转染DoxBach1转染的WT hESC；然后，在分化第3天用Dox(Dox+)或不用Dox(Dox-)处理的细胞中测量荧光素酶活性，并将结果标准化为在Dox-细胞中的测量值(n＝3)。*P<0.05与Dox-相比；ttest。

D：通过WB在分化的第3天检测WT和Bach1-KO hESC的细胞核和细胞质中评估p-Smad2，总Smad2/3和组蛋白3蛋白水平。

E：分化的第3天，在WT和Bach1-KO hESC(左),和在DoxBach1转染的WT hESC，加(Dox+)或不加(Dox-)处理(右)，进行ChIP-qPCR，评估了中内胚层基因和信号分子Wnt3和Nodal的启动子序列的结合，将结果标准化为WT或Dox-细胞中的测量值(n＝3)。*P<0.05；**P<0.01与WT或Dox-相比；ttest。

F-G：在WT和Bach1-KO hESCs以及用SB-431542(20μM)处理的WT和Bach1-KO hESC中评估中内胚层基因的mRNA水平，SB-431542为TGF-β受体抑制(F)或感染用腺病毒编码β-catenin的shRNA并用SB-431542(G)处理，并通过qRT-PCR在分化的第3天进行评估；将结果标准化为WT细胞中的测量值(n＝3)。**P<0.01与WT，DMSO(F)或WT，DMSO，Ad-shCtrl(G)相比；##P<0.01与KO，DMSO(F)或KO，DMSO，Ad-shCtrl(G)相比；单因素方差分析。

从三个独立的重复中收集数据并显示为平均值±SD。

H：模式图表示Bach1在维持hESC自我更新和抑制中内胚层分化中起重要作用。Bach1与Nanog，Sox2和Oct4相互作用，通过募集去泛素化酶Usp7促进这些多能性因子的去泛素化，从而稳定多能性因子并维持干细胞的自我更新。Bach1还通过募集PRC2阻止中内胚层分化，这导致H3K27me3的沉积和基因沉默，进而抑制Wnt/β-catenin和Nodal/Smad2/3信号通路。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，主要的设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

1.实验材料

1.1实验细胞：本实验中的人胚胎干细胞为H7(Wicell Research Institute)。

1.2实验仪器：、

普通PCR仪器(Thermo公司)；Infinite TM 200系列多功能酶标仪(Tecan公司)；实时定量PCR仪(BIO-RAD公司)；显影仪(Tanon公司)；Leica IM50图像采集***、Leica Dmi8荧光显微镜(Leica公司)。

1.3抗体

Bach1(RND公司/Santa Cruz公司)；EZH2、SUZ12、Non-p-β-catenin、smad2/3、Histone 3(CST公司)；EED、GST抗体、(Proteintech公司)；T、Msx2、Gata6、Gata4(RND公司)；Sox2、Oct4、Nanog、Totalβ-catenin、ACVRIIB(Santa Cruz公司)；Wnt3、Nodal、H3k9me2、H3k27AC、H3k9AC(Abcam公司)；β-actin(Affinay公司)；p-smad2、p-smad 3(Abway公司)；H3k27me3、H3k4me3(Millipore公司)；Flag、HA(Sigma公司)。

2.统计分析

实验数据用均值±标准差(Mean±SD)表示。两组数据用非配对t检验(Non-pairedt test)，多组数据用单因素方差分析(One way ANOVA)。以P<0.05为有显著性统计学意义。采用GraphPad Prism 5绘图软件作图。

实施例1：制备Bach1敲除的hESC

1、构建sgRNA

Bach1-KO hESC通过CRISPR/Cas9基因编辑技术产生。使用CRISPR设计工具设计靶向感兴趣的基因组区域的sgRNA(http://crispr.mit.edu/)，针对Bach1第2号外显子进行基因打靶，进行筛选，并由上海桑尼公司进行引物合成。sgRNA-1靶位点序列(SEQ ID NO：1)：5’-GAC AGC GGT TCC GCG CTC AC-3’和其反向互补序列为(SEQ ID NO：2)：5’-GTG AGCGCG GAA CCG CTG TC-3’。

其打靶策略如图1D所示。

2、克隆Guide RNA至Lenti crispr V2(Addgene，Watertown，MA，#52961)的载体中

2.1酶切消化Lenti crispr V2载体

按照如下体系酶切Lenti crispr V2载体，37℃，2h

表1.1 20μl酶切体系

2.2纯化回收酶切后的Lenti crispr V2载体

利用天根通用性DNA纯化回收试剂盒，纯化回收酶切后的Lenti crispr V2载体，纯化回收步骤见试剂盒说明书。

2.3磷酸化和退火Guide RNA序列的上下游Oligo

按照如下表中的体系将上下游的Oligo，在PCR仪中退火，

程序为：37℃30min

95℃5min然后按照5℃/min的降温速度，降至25℃

表1.2 oligo信息

表1.3 20μl酶切体系

2.4连接反应过夜

将步骤2.1中纯化回收的酶切后载体和步骤2.3中的退火后的Oligo进行连接反应，体系如下表：

表1.4 20μl酶切体系

2.5转化铺板

将以上连接体系按照如下操作转化与铺板

1)准备好选择培养基：氨苄120ng/μl，卡那霉素60ng/μl；

2)使DH5α冰上融化；

3)轻微混匀；

4)加入连接后的DNA样品全部；

5)冰中放置30min；

6)42℃激活菌体60sec；

7)冰中放置1-2min；

8)添加无抗生素的LB液体500ul；

9)37℃振荡培养45min(160-225rpm)；

10)涂于含抗生素的选择培养板。100mm大皿涂500μl：

11)37℃过夜培养。

2.6挑克隆测序鉴定

板子挑选3～5个克隆测序，阳性克隆抽质粒备用。

3、转染hESC

通过电穿孔(Life technologies，Carlsbad，CA，#MPK5000)瞬时转染到hESC中，并用嘌呤霉素(Invivogen，San Diego，CA，#ant-pr-5b)筛选。

电穿孔法转染

1)消化H7细胞：

使用六孔板培养待转染的H7细胞，至细胞基本长满培养皿。弃去培养液，使用1×PBS濯洗细胞，每孔加入1ml消化酶Accutase将细胞从贴壁状态消化至悬浮。迅速中和，取20μl细胞悬液在4℃下640g离心5分钟，收集细胞沉淀并加入20μl R buffer将细胞重悬；

2)向细胞沉淀中加入3μg质粒，混匀；

3)使用10μl电转枪头吸取上述混合液体；

4)电转：向电转杯中加入3ml E buffer；

5)电转条件：

1100V Voltage

10ms Width

1pulses Pulses

按下Start键，等待2秒；

6)将电转枪头里的细胞移至10cm培养皿培养；

7)若细胞量较少，可以重复3～5步骤；

8)使用PBS清洗电转枪头和电转杯；

9)细胞培养48h后，加入Puromycin抗生素进行筛选获得Bach1敲除的hESC(Bach1-KO hESC)。选择培养一周后，挑取细胞单克隆。

如图2A所示，经West-Blot检测Bach1-KO hESC细胞中未能检测到BACHI蛋白条带，而在WT细胞中可以检测到BACHI蛋白条带。

实施例2：用PiggyBac转座子***产生Dox诱导型Bach1hESC

1、构建hBach1过表达质粒至Piggy Bac转座子***

1.1扩增hBach1目的片断

1)将按照表2.1设计好的扩增hBach1目的片段的引物，KOD高效保真酶按照表2.2中的PCR体系扩增，扩增PCR程序如表2.3。

表2.1扩增详细信息

表2.2 50μl PCR体系

表2.3PCR扩增条件

2)将所有PCR产物与6×Loading Buffer混匀，全部上样，120V电泳45min，根据目的条带的大小，从琼脂糖凝胶中切下目的条带，放入新的1.5ml EP管中称重。

3)后按照天根通用型DNA纯化回收试剂盒步骤纯化回收hBach1目的片段。

2、酶切PB-TRE3G-eGFP-PGK-Neo质粒

将Piggy Bac还转座子***中的PB-TRE3G-eGFP-PGK-Neo质粒按照如下表2.4中的体系进行酶切反应，37℃过夜，后纯化回收。

表2.4酶切反应50μl体系

3、将目的基因片段与载体的连接

将以上纯化回收酶切后的载体和目的片段按表2.5的连接体系，37℃连接3小时。

表2.5连接反应10μl体系

4、转化与铺板

转化铺板的步骤同实施例1。

5、挑选克隆与测序鉴定

将过夜培养的菌板，挑选3～5个单克隆，摇菌，送测序，挑选出测序阳性的克隆，大抽质粒备用。

6、电转染胚胎干细胞

通过电穿孔(Life technologies，Carlsbad，CA，#MPK5000)瞬时转染到hESC和实施例1中获得的Bach1敲除的hESC(Bach1-KO hESC)中，并用嘌呤霉素(Invivogen，SanDiego，CA，#ant-pr-5b)筛选。(具体方法参见实施例1)，最终获得诱导型Bach1hESC系(DoxBach1)和DoxBach1转染的Bach1-KO hESC(Bach1-KO+Dox)。

图1E为Dox诱导Bach1表达***示意图。DOX诱导WT hESC过表达Bach1如图1G所示，经DOX诱导后BACH1蛋白表达增加。DOX诱导Bach1-KO hESC结果如图2A所示，经Dox诱导后WT和Bach1-KO+Dox都检测到BACH1蛋白条带，而未经Dox诱导的Bach1-KO(Bach1-KO-Dox)未能检测到BACH1蛋白。

实施例3：Bach1在hESC中维持其干细胞的特性

利用Western Blot、碱性磷酸酶(AP)活性测定、慢病毒感染、RT-PCR、细胞计数、流式、免疫荧光法，测定细胞的生长情况，碱性磷酸酶(AP)活性、多能性因子Sox2，Oct4和/或Nanog的蛋白质水平。

结果显示：Bach1在内细胞团(ICM)和滋养外胚层细胞中都有表达，并提示Bach1与Oct4共定位于小鼠囊胚的ICM细胞中(图1B，上图)。Bach1也在E7.5胚胎的内胚层，中胚层和外胚层中广泛表达，而T主要在原条区域中表达(图1B，下图)。

在未分化的hESC的细胞核和细胞质中均观察到Bach1表达(图1C)。通过CRISPR-Cas9基因组编辑产生Bach1敲除的hESC(Bach1-KO hESC)(图1D)，并用PiggyBac转座子***产生多西环素诱导型Bach1hESC系(DoxBach1)示意图(图1E)；WB验证Bach1-KO hESC中Bach1无表达，Bach1敲除不影响Bach2表达图(图1F)，并且用Dox处理后在DoxBach1转染的Bach1-KO hESC中恢复Bach1表达(图2A)。

Bach1KO-hESCs的克隆比野生型hESC(WT hESCs)的克隆更平坦，并且Bach1-KOhESC中的碱性磷酸酶(AP)活性低于WT hESC，在DoxBach1转染的Bach1-KO hESC中加入Dox，使其恢复至接近WT水平(图2A)。与WT hESC克隆相比，Bach1-KO hESC中含有更大比例的分化的或混合型的克隆(其中WT hESC中混合和分化状态克隆所占比例分别为6％和2％，而Bach1-KO hESC中混合和分化状态的克隆所占比例分别为25％和15％)(图2B)，Bach1-KOhESC增殖较慢(图2C，最下面那条线为Bach1-KO-Dox，最上面那条线为Bach1-KO+Dox，中间那条线为WT)，多能性因子Sox2，Oct4和/或Nanog的蛋白质水平表达降低(图2D-2E)(其中图2D右边图中，每个蛋白对应的左边条形柱为WT，中间条形柱为Bach1-KO-Dox，右边条形柱为Bach1-KO+Dox)；值得注意的是，Bach1敲除不影响Nanog，Sox2和Oct4的mRNA表达水平(图1F)，表明Bach1促进多能性因子的蛋白质水平发生在转录后。

在DoxBach1转染的Bach1-KO hESC中，Dox处理恢复了WT样集落形态并增加了多能性因子的增殖和表达(图2A和图2C-2D)。用Dox处理后，DoxBach1转染的WT hESCs中多能性因子的表达也增加(图1G)(其中Nanog增加1.7倍，Sox2增加1.8倍，Oct4增加2.3倍)，并且细胞周期分析表明Bach1-KO比WT hESC更大比例处于G1期(图1H)(WT为26.09％，Bach1-KO为51.24％)，这与Bach1-KO细胞中观察到的较低增殖速率一致，而敲除Bach1对细胞凋亡的影响没有显著差异(图1I)(WT为2.01％，Bach1-KO为1.88％)。此外，用慢病毒Bach1-shRNA感染hESCs，发现与在Bach1-KO hESCs中观察到的相似(图2F-2H)，用转录因子Oct4，Klf4，Sox2和c-Myc重编程人成纤维细胞，发现过表达Bach1可以促进重编程的效率，增加hESC样(即AP阳性)克隆的数量(图2I)(WT为19.75，Bach1-KO为34每5万个细胞)。总之，这些结果表明Bach1有助于维持干细胞多能性和自我更新，促进细胞的重编程。

实施例4：Bach1与Nanog，Sox2和Oct4相互作用，并通过募集去泛素化酶Usp7促进其稳定性。

利用Western Blot、免疫沉淀(IP)和质谱(MS)、Chip-qPCR方法，测定多能性因子Sox2，Oct4和/或Nanog的蛋白质水平和去泛素化酶Usp7的作用。

因为hESCs中敲除Bach1导致Nanog，Sox2和Oct4蛋白水平的下降，而不影响其mRNA水平，我们通过阻止多能性因子降解的速率，来研究Bach1是否有助于维持干细胞的多能性因子的蛋白稳定性。当用环己酰亚胺(CHX)处理DoxBach1转染的WT hESC以阻断新蛋白质的合成时，Dox诱导的Bach1过表达显著延长其半衰期，并延迟Nanog，Sox2和Oct4蛋白质的降解(图3A)(在加CHX 9h后，DOX-组Nanog，Sox2和Oct4分别降解到7.9％，12.2％和32.0％，而Bach1过表达组(Dox+)Nanog，Sox2和Oct4分别降解到29.2％，86.0％和74.1％)，同时用蛋白酶体抑制剂MG132可以恢复Bach1-KO hESC中的Nanog，Sox2和Oct4蛋白水平(图3B)(其中图3B下图中，每个蛋白对应的左边第一条形柱为WT+DMSO，第二条形柱为Bach1-KO+DMSO，第三条形柱为WT+MG132,第四条形柱为Bach1-KO+MG132)。Bach1过表达还显着降低了Nanog，Sox2和Oct4的泛素化(图3C和图4A)，这表明Bach1通过破坏泛素依赖性蛋白酶体降解来促进这些多能性因子的稳定性。另外，293HEK中转染Flag-Bach1质粒，通过免疫沉淀(IP)和质谱(MS)可以检测出Usp7,在hESC中做内源性的IP，WB验证Bach1和Usp7有结合，在hESC中，Bach1也与Nanog，Sox2和Oct4相互作用，但不与c-Myc相互作用(图3D)。而Bach1-KO hESCs中Usp7的mRNA和蛋白水平显着低于WT hESCs(图3E-3F)(其中Usp7的mRNA降低到34.2％，蛋白水平降低到49.0％)，而过表达Bach1的hESCs中Usp7表达增加(图4C-4D)(其中Usp7的mRNA升高了2.6倍，蛋白水平升高了1.5倍)。Chip-qPCR测定证实了Bach1占据了Usp7启动子区(图3G)，表明Usp7是受Bach1的直接调控的靶标，当通过siRNA转染和/或用Usp7抑制剂P5091处理使Usp7活性下调时，WT hESC中Nanog泛素化增加(图4E)，多能性基因蛋白水平表达下降(图4F)，并且可以逆转Bach1过表达引起的多能性基因蛋白水平的升高(图3H和图4G)(其中图3H下图中，每个蛋白对应的左边第一条形柱为Dox-(Bach1off)+Consi，第二条形柱为Dox-(Bach1off)+Usp7si，第三条形柱为Dox-(Bach1on)+Consi,第四条形柱为Dox-(Bach1on)+Usp7si)。此外，在Bach1-KO hESC中过表达Usp7可以部分的逆转其多能性基因蛋白水平的下降(图4H)(其中图4H右图中，每个蛋白对应的左边第一条形柱为WT+GFP，第二条形柱为Bach1-KO+GFP，第三条形柱为WT+Usp7,第四条形柱为Bach1-KO+Usp7)，并且抑制Usp7可以逆转Bach1过表达的引起的Nanog泛素化的下降(图3I)。总之，这些结果表明Bach1诱导的多能性蛋白质的稳定性是通过Usp7的去泛素化活性介导的。

实施例5：Bach1敲除促进hESC的中内胚层的分化。

我们研究了hESC自发分化为胚状体(EBs)中，Bach1的丢失或过表达是否改变了其中的胚层标记物表达。其检测方法包括：免疫荧光、Western Blot、慢病毒转染、qRT-PCR、畸胎瘤形成实验等方法，对中胚层，内胚层和外胚层的细胞标志物进行检测。

在EB分化的过程中，多数中胚层，内胚层和外胚层的细胞标志物在Day4或者Day6表达达到峰值，这与先前的报道一致；因此，由于这些实验的目的是研究Bach1在hESC分化早期阶段的作用，我们的分析是在hESC-EB分化的第0天至第6天进行的。在WT hESC中，中胚层标志物(T和Msx2)，内胚层标志物(Gata4和Gata6)和神经外胚层标志物(Otx2和Pax6)的mRNA水平在自发性EB分化的前四天逐渐增加(图5B)，尽管WT-和Bach1-KO hESC中标志物表达的时间依赖性大致相似，在Bach1-KO hESC中，中内胚层标志物表达始终较高，而神经外胚层标志物表达始终低于WT hESC(图5B)。当通过免疫荧光(图5C)和/或Western Blot(图5D)评估时，Bata1-KO hESC中的Gata6和T表达也显着高得多，并且Sox2和Oct4表达低于WThESC，而Bach1表达在hESC分化的第2天和第4天上调，并在第6天下降(图5D)。当通过用慢病毒的Bach1-shRNA感染敲低Bach1时，在hESC分化的第3天，检测到胚层标记物表达的类似变化(图6A)，并且qRT-PCR测量表明这些变化在用Dox诱导Bach1过表达可以逆转Bach1敲除引起的内中外胚层标志基因的改变(图5E)。

EB分化12天，Bach1-KO hESCs中心脏祖细胞(Isl1)，软骨细胞(Sox9，Col2a1)，红细胞样细胞(β-珠蛋白)和胰腺样细胞(Pdx1)的标志物的表达在比WT hESC中更高。而肝标记基因(Alb)的表达没有变化(图6B)，然WT和Bach1-KO hESCs在注射到成年SCID小鼠中时形成含有所有三个胚层(内胚层，中胚层，外胚层)的畸胎瘤，在由Bach1-KO hESC形成的畸胎瘤中，中内胚层标志物表达较高，并且神经外胚层标志物表达较低(图5F)(中胚层基因T升高6.8倍，Msx2升高2.6倍，Gata6升高1.9倍，Gata4升高8.2倍，外胚层基因Pax6降低到0.53倍，Otx2降低到0.44倍)。当用Usp7siRNA转染细胞时，WT和Bach1-KO hESC中的中内胚层基因mRNA水平也显着增加(图6C)(对应于每个蛋白柱形图由左至右依次为WT+Consi、KO+Consi、WT+Usp7si、KO+Usp7si)，而Usp7的过表达部分地消除了Bach-KO hESC中大多数中内胚层基因的上调(图6D)(对应于每个蛋白柱形图由左至右依次为WT+GFP、KO+GFP、WT+Usp7、KO+Usp7)。

实施例6：Bach1在中内胚层基因启动子中通过EZH2催化的H3K27三甲基化抑制hESCs中的中内胚层基因表达。

利用ChIP-seq、ChIP-qPCR、免疫共沉淀、蛋白质印迹、RT-PCR、萤光素酶报告基因等方法，检测Bach1，EZH2和H3K27me3在中内胚层分化基因启动子区富集的变化，我们研究了Bach1，EZH2和H3K27me3之间的相互作用是否参与调节hESC分化基因的表达。

分析Bach1敲除引起上调的分化基因，发现Bach1-KO hESCs中H3K27me3和EZH2在TSS的±5kb的富集降低(图7C)，并且在中内胚层发育调节因子(T，Gata6，Wnt3，Nodal，Mesp1，Msx2和Gata4)的启动子区域中的富集也降低(图7D)，ChIP-qPCR进一步证实，Bach1-KO hESC中H3K27me3和EZH2在T，Gata6以及许多其他中内胚层分化基因的启动子区域的富集降低(图7E)(Bach1-KO hESC中H3K27me3和EZH2的富集降低50％左右)。值得注意的是，H3K4me3与这些启动子的结合在Bach1-KO hESCs中升高(图7E)。而在WT和Bach1-KO hESC中，H3K27me3，EZH2，H3K4me3，H3K9me2，H3K9ac和H3K27ac蛋白的水平相似(图9A)。

用Dox处理后，DoxBach1转染的WT hESC中的中内胚层基因mRNA水平下降，但EZH2抑制剂DZNep部分消除了这种下降(图7F)，表明EZH2参与Bach1对中内胚层基因表达的抑制。在T和Gata6启动子区有Bach1的结合位点(图7B)，因此我们构建了含有Bach1的结合位点的T和Gata6启动子的萤光素酶报告基因，Dox诱导的Bach1过表达显着降低了T或Gata6萤光素酶报告基因的转录活性(图7G)(Gata6降低到21.2％，T降低到44.1％)，而对Bach1的结合位点进行突变后，Bach1过表达则不影响其转录活性(图7H)。Bach1还与EZH2在细胞核中存在共定位(图8A)，免疫共沉淀实验证实，Bach1与EZH2，以及PRC2复合体中的另外两个亚基EED和SUZ12有结合(图8B和8C)。值得注意的是，Bach1和EZH2之间的结合在DNase或RNaseA的存在下持续存在(图8D)，这表明Bach1和EZH2之间的相互作用不需要DNA或RNA分子。在293FT中转染Flag标记的Bach1和HA标记的EZH2，证实Bach1与EZH2有外源性的结合(图8E)，GST-pull down实验中，构建带有GST标签的Bach1全长(Bach1-Full-GST)，GST-Bach1缺失C端(Bach1-N-GST)，GST-Bach1缺失N端(Bach1-C-GST),以及带His标签的EZH2(EZH2-His)共同孵育并通过谷胱甘肽-琼脂糖珠，结果证实，EZH2与全长序列共沉淀最强(图8F)。总之，这些观察结果表明Bach1的N-和C-末端区域与EZH2直接相互作用，并且Bach1将EZH2募集到几个中内胚层基因的启动子区域中的Bach1结合位点，这促进了H3K27的三甲基化并抑制了中内胚层基因表达。

Usp7siRNA转染WT hESC时，虽然H3K27me3在一些中内胚层基因的富集略有下降(图9D)，但是Bach1-KO hESC中，H3K27me3的降低不能被过表达Usp7所逆转(图9E)。此外，尽管有证据表明PRC1被招募到中胚层基因，Bach1敲除不影响E3连接酶Ring1B和H2AK119ub对中内胚层基因富集(图9B和9C)，其中Ring1B是PRC1的一个组成部分。

实施例7：Bach1敲除通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进中内胚层的分化。

利用ChIP-qPCR、蛋白质印迹、RT-PCR、萤光素酶报告基因等方法方法，检测Bach1敲除后，Wnt/β-catenin信号通路配体、受体和下游效应分子的表达变化，我们研究了Bach1与Wnt/β-catenin信号通路之间的相互作用是否参与促进中内胚层的分化。

hESCs的中内胚层分化至少部分是通过激活Wnt/β-catenin信号通路介导的，EB分化第3天的RNA-seq分析表明，在Bach1-KO hESC中内胚层基因和Wnt信号传导基因的表达更高(图10A-10B)。敲除Bach1使得：

1)几种wnt的配体(包括Wnt3,Wnt2b,Wnt5b)，受体(Frizzled-1,-2,-10)，以及下游的靶基因(LEF1)(图11A-11B)表达升高(其中Wnt3升高51.0倍，Wnt2b升高5.0倍，Wnt5b升高55.2倍，Fzd1升高4.1倍，Fad2升高5.4倍，Fzd10升高6.6倍，LEF1升高47.3倍)；

2)促进激活形式的β-catenin和总的β-catenin的蛋白表达(图11B-11C)；

3)促进TOPflash荧光素酶报告基因的转录活性(图11D)(Bach1-KO hESC中升高3.4倍)，其中TOPflash报告基因包含8个Tcf/lef结合位点的拷贝。然而，当用IWP2(Wnt产生的抑制剂(图11D))或抑制β-catenin的IWR1-e(图10C)处理细胞时(WT-和Bach1-KO hESC加入IWP2后分别降低到0.39和0.43倍；加入IWR1-e分别抑制到0.45和0.53倍)，WT-和Bach1-KO hESC中的TOPflash活性是相似的，当在培养的细胞中加入Wnt3a中刺激Wnt信号传导时，Bach1-KO细胞中的TOPflash活性和中内胚层基因表达显着高于WT细胞(图10C-10D)。

ChIP-qPCR分析表明，在Bach1-KO hESC中，激活形式的β-catenin在中内胚层基因启动子的结合比在WT hESC中更高，而当用Dox处理DoxBach1转染的WT hESC时，则抑制其结合(图11F)(Bach1-KO hESC中β-catenin在不同启动子区域的富集升高10～30倍，过表达Bach1则抑制β-catenin在这些位点的富集到0.5倍左右)。在Bach1-KO hESCs的EB分化的第3天，中内胚层分化基因表达增加，并且当用Ad-β-catenin shRNA感染WT或Bach1-KO hESC时或用IWP2处理，可以显着降低中内胚层分化基因的表达(图11G和11E)，而对hESC中Bach1ChIP-seq数据的分析鉴定了Wnt3启动子中的Bach1结合位点(图7B)。ChIP-qPCR测定证实Bach1富集在Wnt3启动子区，Dox诱导的Bach1过表达可以抑制Wnt3mRNA水平(图11H)(过表达Bach1抑制其到0.33倍)和Wnt3-荧光素酶报告基因的转录活性，但当Bach1的结合位点发生突变时，过表达Bach1则不影响其报告基因的转录活性(图11I)(过表达Bach1抑制Wnt3的转录活性到0.77倍，突变时为0.96倍)。因此Bach1敲除促进中内胚层基因的表达至少部分是通过激活Wnt/β-catenin信号通路引起的。

实施例8：Bach1敲除通过激活Nodal信号通路促进中内胚层分化。

利用ChIP-qPCR、免疫共沉淀、蛋白质印迹、RT-PCR、萤光素酶报告基因等方法方法，检测Bach1敲除后，Nodal/Smad2/3信号通路配体、受体和下游效应分子的表达变化，我们研究了Bach1和Nodal信号通路之间的相互作用是否参与促进中内胚层分化调节。

在中内胚层分化的过程中，Wnt与TGF-β超家族成员Nodal通常具有协同作用，对EBs分化第3天的RNA-seq结果分析表明，Bach1-KO hESCs中Nodal和TGF-β信号转导基因的表达高于WT hESCs(图10A-10B)；因此，我们研究了Bach1在抑制中内胚层分化中的作用是否部分通过Nodal信号传导的调节来介导。对Bach1 ChIP数据的分析鉴定了hESC中Nodal的TSS附近的区域有Bach1结合位点，并且在EB分化的第3天，Bach1-KO hESC中，Nodal mRNA(图12A)(升高2.78倍)和蛋白质(图12B)水平表达增高，但Nodal受体ACVRIIB和ALK4的表达水平没有变化。Dox诱导的Bach1过表达显着降低了Nodal萤光素酶报告基因的转录活性，而对Bach1的结合位点进行突变后，Bach1过表达则不影响其转录活性(图12C)。而Bach1敲除与两个Nodal下游靶标Smad2和Smad3以及活化的Smad2和Smad3(即磷酸化)的表达增加有关(图12B和12D)。ChIP-qPCR分析表明，在Bach1-KO hESC中，Smad2/3在中内胚层基因启动子的结合比在WT hESC中更高，而当用Dox处理DoxBach1转染的WT hESC时，则抑制其结合(图12E)(Bach1-KO hESC中Smad2/3在不同启动子区域的富集升高2～6倍，过表达Bach1则抑制Smad2/3在这些位点的富集到0.5倍左右)。EB分化第3天，在Bach1-KO hESC中，中内胚层基因表达的mRNA也显着高于WT hESC，但是在Bach1-KO hESC加入Nodal受体的抑制剂SB-431542，其中内胚层分化基因的表达则显著下降(图12F)(其中图12F图中，每个蛋白对应的左边第一条形柱为WT+DMSO，第二条形柱为Bach1-KO+DMSO，第三条形柱为WT+SB,第四条形柱为Bach1-KO+SB)。同时加入Ad-β-catenin shRNA和SB-431542，抑制wnt/β-catenin和Nodal/Smad2/3信号通路，则进一步降低中内胚层分化基因的表达(图12G)(其中图12G图中，每个蛋白对应的左边第一条形柱为WT+DMSO+Ad-shCtrl，第二条形柱为KO+DMSO+Ad-shCtrl，第三条形柱为WT+SB+Ad-shCtrl,第四条形柱为KO+SB+Ad-shCtrl)。因此Bach1敲除促进中内胚层分化基因的表达依赖于wnt/β-catenin和Nodal/Smad2/3信号通路。

Bach1在小鼠发育的囊胚期高度表达，并且具有所有Bach1全外显子敲除的小鼠是亚致死性的，但其潜在性的分子机制尚未完全阐明。我们的数据表明，Bach1通过稳定多能性因子和抑制谱系特异性基因的表达来维持hESC的干性(图12H)。我们还表明，hESCs中Bach1的缺失导致了中内胚层基因表达和分化的激活；因此，Bach1活性似乎是hESCs中细胞命运和谱系规范的关键决定因素。

在胚胎干细胞中多能性因子部分通过泛素化和去泛素化进行调节，例如，Oct4和Sox2蛋白水平受E3连接酶WWP2调节，去泛素化蛋白酶Usp21稳定Nanog，维持多能性，而FBXW8，一种E3连接酶，泛素化Nanog，并使其不稳定，从而促进ESC分化然而，虽然Usp7通过去泛素化和稳定REST和c-Myc来维持神经祖细胞/干细胞的多能性，Usp7活性是否有助于Bach1在hESC干中的作用，这在很大程度上是未知的。在这项研究中，我们证明了Bach1直接靶向并增加了Usp7在hESCs中的表达，并且Bach1与Nanog，Sox2和Oct4相互作用并将Usp7募集到它们的启动子中，这有利于多能性因子去泛素化并维持hESC干细胞。我们还发现，通过上调Usp7表达可以部分地消除与Bach1敲除引起的中内胚层基因表达的增加，这表明Usp7可能是Bach1缺失促进hESC分化的机制的一个组成部分，其作用可能是由于多能性蛋白水平下降，而引起的继发后果。

以前的报道显示Bach1调节许多参与细胞周期和凋亡的基因的表达，并且在抑制人脐静脉内皮细胞增殖的同时，促进细胞凋亡；然而，hESCs中Bach1敲除不会改变细胞凋亡，Bach1-KO hESCs的增殖率低于WT hESCs。总的来说，这些观察结果表明，Bach1对细胞凋亡和细胞增殖的影响在不同的细胞类型中可能存在很大差异。

在hESCs和hESC衍生细胞中差异表达的大多数基因富含CG并且通过H3K27me3的富集进行转录抑制。值得注意的是，尽管已知Bach1可调节癌症转移，以及氧化应激，血红素氧化和血管生成，以及敲低Bach1可降低乳腺癌细胞中特定基因启动子的H3K27me3富集水平，Bach1-KO hESCs中H3K27me3在中内胚层分化基因的启动子区富集降低，并不仅仅是由于Usp7表达下降引起。Usp7过表达不能恢复上述降低。PRC2对于抑制性H3K27甲基化也是必需的，并且在发育过程中与干细胞多能性和细胞谱系分化密切相关。PRC2的EZH2亚基催化H3K27的二甲基化和三甲基化，并且EZH2的缺陷降低多能性并促进hESC向中内胚层命运的自发分化；然而，EZH2转录抑制中内胚层基因的机制尚不清楚。在这里，我们证实了EZH2直接与Bach1相互作用，并在许多中内胚层分化基因的启动子区域，与Bach1和H3K27me3存在共定位。此外，Bach1敲除降低了EZH2和H3K27me3启动子富集，上调了中内胚层基因表达，并诱导了hESCs的中内胚层细胞分化，Bach1过表达显著抑制中内胚层基因mRNA水平，但是当使用EZH2抑制剂DZNep处理细胞时，则能部分逆转Bach1过表达引起的中内胚层基因的表达降低。Bach1还与EZH2合作抑制Raf激酶抑制蛋白(RKIP)的转录。总的来说，我们的研究证明Bach1通过至少2个独立途径抑制hESC中的分化：1)通过募集Usp7，和2)通过作为PRC2募集的支架起作用。我们的结果还表明，Bach1敲除型的hESCs，中胚层和内胚层基因表达增加伴随着Wnt/β-catenin和Nodal/Smad2/3信号通路的激活，并且在加入Wnt配体产生抑制剂或Nodal受体抑制剂而受到抑制。这一观察结果与之前的报道一致，即activin/Nodal和Wnt信号通路，可以促进内胚层和中胚层谱系分化，同时抑制外胚层的分化。并且β-catenin和Smad2/Smad3之间的直接相互作用，是激活中内胚层基因转录所必需的。此外，必须去除抑制性H3K27me3的富集，以激活Activin/Nodal和Wnt信号通路，并且两者协同作用以促进中内胚层分化。因此，Bach1敲除hESCs中Wnt/β-catenin和Nodal/Smad2/3信号通路活性增加，使细胞更有效地向内胚层和中胚层的谱系分化。总之，本发明结果表明，Bach1通过在多种不同机制的顶点起作用维持hESC的干细胞特性，包括通过募集去泛素化因子Usp7来稳定多能性因子，通过PRC2沉默中内胚层基因表达，诱导H3K27me3在中内胚层基因启动子上的沉积，以及抑制Wnt3和Nodal信号通路。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 一种修饰的Bach1基因及其应用

<130> 1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacagcggtt ccgcgctcac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgagcgcgg aaccgctgtc 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caccgacagc ggttccgcgc tcac 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaacgtgagc gcggaaccgc tgtc 24

<210> 5

<211> 48

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accctcgtaa aggcgggatc cataccatgt ctctgagtga gaactcgg 48

<210> 6

<211> 48

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtcggaattc ttacttgtac attactcatc agtagtacat ttatcagt 48

Claims (5)

1.一种修饰的转录因子Bach1基因在体外调节胚胎干细胞分化中的应用，其中，所述修饰使得胚胎干细胞的BACH1蛋白活性或表达被抑制，从而促进胚胎干细胞向中、内胚层的分化，抑制神经外胚层的分化。

2.一种转录因子Bach1的调节试剂在体外调节胚胎干细胞分化中的应用，其中，所述调节试剂使得胚胎干细胞的BACH1蛋白活性或表达被抑制，从而促进胚胎干细胞向中、内胚层的分化，抑制神经外胚层的分化。

3.如权利要求1-2任一所述的应用，其特征在于，所述转录因子Bach1与去泛素化蛋白酶Usp7，多能性因子Nanog，Sox2和/或Oct4、PRC2复合体、Wnt/β-catenin信号通路、和/或Nodal/Smad2/3信号通路相互作用，从而调节胚胎干细胞分化。

4.一种体外调节胚胎干细胞分化的方法，其特征在于，所述胚胎干细胞的Bach1基因被修饰，使得胚胎干细胞的BACH1蛋白活性或表达被抑制，从而促进胚胎干细胞向中、内胚层的分化，抑制神经外胚层的分化。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述转录因子Bach1与去泛素化蛋白酶Usp7，多能性因子Nanog，Sox2和/或Oct4、PRC2复合体、Wnt/β-catenin信号通路、和/或Nodal/Smad2/3信号通路相互作用，从而调节胚胎干细胞分化。