CN110408617B - 抑制RKIP基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抑制RKIP基因表达的siRNA，其为双链RNA，其序列为：正义链5'GCUGCAUAGUUAUCAAUAUTT3'，反义链5'AUAUUGAUAACUAUGCAGCTT3'。本发明通过生物学方法挖掘一种能够抑制RKIP基因表达的小干扰RNA，其能够显著抑制微波辐射所致大鼠空间认知能力下降、海马组织形态结构改变，本发明为小干扰siRNA的临床应用提供了重要的理论基础，也为防治药物研发提供了新思路。

Description

抑制RKIP基因表达的siRNA及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和基因工程技术领域。更具体地说，本发明涉及一种抑制RKIP基因表达的siRNA及其应用。
背景技术
研究表明，脑是微波辐射损伤的重要敏感靶器官。流行病学调查显示，长期低剂量微波辐射引起受辐射人员脑电图异常、脑功能紊乱，重者可出现行为异常、神经衰弱、失眠多梦、记忆力减退等。另有报道指出，微波辐射可能增加老年痴呆的发病风险。动物实验研究表明，微波辐射导致动物空间参考记忆、短时记忆、长时记忆及运动性学习记忆能力下降，且伴有焦虑、兴奋等行为异常。进一步研究发现，微波辐射可引起海马脑区组织病理学改变。研究证实，海马是参与学习记忆功能的关键脑区，它不仅是长时程陈述性记忆形成的决定性结构，还参与短时记忆和空间记忆的形成，同时也参与情感行为的调节。上述研究提示，微波辐射可导致海马脑区认知功能障碍。
Raf激酶抑制蛋白(Raf-1kinase inhibition protein,RKIP)属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族，是高度保守的多功能调节性蛋白质，广泛存在于原核和真核生物中，在同一物种的多种组织和不同细胞类型中均有表达。近年来，RKIP的生物学功能研究日益受到瞩目。作为信号转导中的枢纽蛋白，RKIP主要参与调控ERK、NF-кB和GPCR信号通路，并介导它们之间的相互对话，可引起多种细胞行为，包括细胞凋亡、神经发育、***发生、细胞迁移、有丝***等。RKIP表达失调会导致阿尔茨海默病、肿瘤转移、染色体异常等病理过程。此外，RKIP是海马胆碱能神经刺激肽的前体蛋白，可促进乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)合成。众所周知，ACh是参与学习和记忆功能的重要神经递质。我们前期研究发现，微波辐射后大鼠海马RKIP表达失调，并且与微波辐射所致海马认知功能障碍密切相关。
基于上述可知RKIP在微波辐射脑损伤中发挥重要调节作用，由于目前微波辐射脑损伤机制尚未完全阐明，有关微波辐射脑损伤的防治仍以防护服等物理防护措施为主，尚缺乏特异有效的防治靶点和药物。因此，RKIP可能为微波辐射脑损伤的防治提供了一个有效靶点，从而为防治药物研发提供了新思路。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种抑制RKIP基因表达的siRNA及其应用，其通过生物学方法挖掘一种能够抑制RKIP基因表达的小干扰RNA，其能够显著抑制微波辐射所致大鼠空间认知能力下降、海马组织形态结构改变，本发明为小干扰siRNA的临床应用提供了重要的理论基础，也为防治药物研发提供了新思路。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种抑制RKIP基因表达的siRNA，所述siRNA为双链RNA，所述siRNA的序列为：
正义链5'GCUGCAUAGUUAUCAAUAUTT3'，
反义链5'AUAUUGAUAACUAUGCAGCTT3'。
优选的是，所述的抑制RKIP基因表达的siRNA，所述siRNA的序列的正义链和反义链的5'末端荧光标记修饰。
优选的是，所述的抑制RKIP基因表达的siRNA，所述siRNA的序列的正义链和反义链的3'末端胆固醇修饰。
优选的是，所述的抑制RKIP基因表达的siRNA，所述siRNA的序列的正义链经全程2’-OMe修饰。
优选的是，所述的抑制RKIP基因表达的siRNA，采用Real-time PCR检测RKIP的mRNA表达水平。
优选的是，所述的抑制RKIP基因表达的siRNA，在Real-time PCR的检测中以β-actin为内参照。
本发明还提供了一种所述的抑制RKIP基因表达的siRNA在调控ACh受体表达中的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明通过生物学方法挖掘一种能够抑制RKIP基因表达的小干扰RNA，其能够显著抑制微波辐射所致大鼠空间认知能力下降、海马组织形态结构改变，本发明为小干扰siRNA的临床应用提供了重要的理论基础，也为防治药物研发提供了新思路。本发明的小干扰siRNA的作用机制与RKIP对M1、β2型ACh受体基因表达具有正向调控的功能有关。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明采用GP-siRNA-Mate Plus转染试剂，不同剂量CY3标记抑制RKIP基因表达的siRNA转染效率示意图，Scale bar:100μm；
图2为本发明阴性对照siRNA(NC siRNA)和抑制RKIP基因表达的siRNA(RKIPsiRNA)转染大鼠C6细胞后24h细胞收样图片；
图3为本发明大鼠C6细胞转染后24h和48h各组RKIP mRNA表达水平；
图4为本发明海马定位注射RKIP siRNA对微波辐射致大鼠平均逃避潜伏期改变的影响示意图；
图5为本发明微波辐射后4d大鼠Morris水迷宫空间探索实验游泳轨迹图；
图6为本发明海马定位注射RKIP siRNA对微波辐射致大鼠平台象限游泳时间百分比和平台象限游泳路程百分比改变的影响的示意图；
图7为本发明海马定位注射RKIP siRNA对微波辐射后6h和7d大鼠海马组织结构的影响的示意图；
图8为本发明海马定位注射RKIP siRNA对微波辐射后6h和7d大鼠海马神经元超微结构的影响的示意图；
图9为本发明海马定位注射RKIP siRNA对微波辐射后6h和7d大鼠海马组织ACh受体亚型mRNA表达的影响的示意图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
一、抑制RKIP基因表达的siRNA的合成与验证：
1.1合成
抑制RKIP基因表达的小分子干扰RNA(siRNA)及其阴性对照由苏州吉玛基因股份有限公司合成，siRNA序列如下：
抑制RKIP基因表达的siRNA：正义链5'GCUGCAUAGUUAUCAAUAUTT3'，
反义链5'AUAUUGAUAACUAUGCAGCTT3'；
阴性对照siRNA：正义链5'UUCUCCGAACGUGUCACGUTT'3'，
反义链5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3'。
其中，上述单链中的5'末端均荧光标记修饰，3'末端均胆固醇修饰，正义链经全程2’-OMe修饰，反义链无甲氧修饰；
A、G、C、U、T分别表示腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸。
1.2验证
体外传代培养大鼠神经胶质瘤C6细胞，利用GP-siRNA-Mate Plus转染试剂分别将抑制RKIP基因表达的siRNA和阴性对照siRNA(NC siRNA)转染C6细胞，并观察转染效率。分别于转染后24h和48h收集细胞，提取总RNA用于Real time PCR检测，以β-actin为内参照。PCR引物序列如下：
RKIP上游引物5'GACTACGGCGGAGTAACGG3'，
下游引物5'ATGAAATGCTGCTTGGTC TATT3'，扩增片段长度82bp；
β-actin上游引物5'CGTAAAGACCTCTATGCCAACA3'，
下游引物5'GGAGGAGCAATGATCTTGATCT3'，扩增片段长度131bp。
如图1所示采用转染试剂GP-siRNA-Mate Plus，1μl oligo的转染效率可达到70％以上，随着oligo剂量的增加，转染效率随之增加。抑制RKIP基因表达的siRNA转染后细胞收样图片如图2所示。实时荧光PCR定量分析结果表明，抑制RKIP基因表达的siRNA转染后24h和48h均见大鼠C6细胞RKIP的mRNA表达水平显著下调(p<0.05或p<0.01)，如图3所示，图3中Blank-空白对照组，Mock-转染试剂组，Negative siRNA-NC siRNA组；vs Blank，*示p<0.05，**示p<0.01。
二试验
2.1辐射处理：采用军事医学研究院自建高功率微波辐射模拟源，中心频率2.856GHz，平均功率密度30mW/cm2，脉宽500ns，重复频率1000Hz，峰值功率密度200W/cm2，辐射时间15min。具体辐射方法为：大鼠置于透明带孔有机玻璃辐射盒中，将辐射盒置于微波暗室内可旋转的辐射台，微波源自上而下均匀辐射；对大鼠行与上述辐射方法中的同等条件的伪辐射定义为假辐射。
2.2大鼠脑立体定位注射小分子干扰RNA
抑制RKIP基因表达的siRNA和阴性对照siRNA(NC siRNA)均以无菌水稀释为60μM。采用微量注射泵、脑立体定位仪在两只体征相同的大鼠双侧海马CA3区(前囟后4.0mm，旁开3.0mm，颅骨表面下4.0mm)分别微量注射抑制RKIP基因表达的siRNA和阴性对照siRNA (NCsiRNA)(60μM，5μl/侧)。具体步骤如下：
微波辐射前4d，大鼠以1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剔去头颈部被毛并固定于大鼠脑立体定位仪；两耳正中皮肤75％酒精消毒，纵向剪开1.5cm；无菌棉球蘸H2O2擦拭颅骨，充分暴露前囟；以前囟为基点，向后4.0mm、双侧旁开3.0mm处定位标志点；以牙科钻在标志点处小心钻通颅骨；调整微量注射器进针至硬脑膜表面下4.0mm，到达海马CA3区；启动微量注射泵，微量注射抑制RKIP基因表达的siRNA或阴性对照siRNA (NC siRNA)，注射速度0.5μl/min，每侧注射5μl，注射给药一次完成，注射后留针5min。75％酒精棉签擦拭钻孔周围消毒后，常规被皮缝合，缝合处以碘伏棉签擦拭消毒。术后恢复3d，每天肌注青霉素20万单位。
2.3动物选择：采用二级雄性Wistar大鼠，体重200±20g,由军事医学研究院实验动物中心提供。
2.4动物分组：将健康大鼠均分为4组：假辐射组(大鼠不经过注射，直接进行伪辐射，计为A组)、单纯微波辐射组(大鼠不经过注射，直接进行微波辐射，计为B组)、注射阴性对照siRNA+微波辐射组(大鼠先经注射后进行微波辐射，计为C组)和注射抑制RKIP基因表达的siRNA+微波辐射组(大鼠先经注射后进行微波辐射，计为D组)；行为学检测的分组标准为10只动物/组/时间点，病理、生化及分子生物学分析的分组标准为6只动物/组/时间点。
2.5数据分析(统计学分析)
实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS 22.0统计学软件进行两因素方差分析(定量PCR、Morris空间探索)或具有一个重复测量的两因素方差分析(Morris定位航行)，以p<0.05示为有统计学意义。
2.6Morris水迷宫实验检测大鼠学习和记忆能力
将上述四组大鼠均进行Morris水迷宫实验，Morris水迷宫实验是评价动物学***均分成I、II、III、IV四个象限。水池中有一可移动平台，平台直径为8cm，低于液面2cm，实验中保持平台位置固定。水池正上方悬挂摄像机，实时记录大鼠活动轨迹，水池周围用布帘遮挡，室内保持安静。实验分为寻找平台训练、定位航行实验和空间探索实验三部分。
①寻找平台训练：将大鼠紧贴I象限槽壁内侧，面向槽壁轻轻放入水中，同时开始记录大鼠60s内游泳轨迹。若60s内大鼠找到并停留在平台，轨迹追踪即刻停止，若大鼠60s内未能找到平台，指引其上台，并保持其在平台停留20s以巩固记忆，随后依次完成II～IV象限，取出擦干后放回鼠笼。每天训练1次，连续3d。
②定位航行实验：于微波辐射后第1，2，3d进行定位航行实验，将大鼠依次从四个象限放入水中，记录60s内找到平台的时间，即为该象限的平均逃避潜伏期(Averageescape latency,AEL)，若大鼠60s内未能找到平台，AEL将记录为60s，大鼠不需在平台停留，进入下一象限测试。四个象限AEL的平均值即为本次测试该动物的AEL。测试期间，每日更换水，保持水池干净无异味。
四组大鼠的每个时间点对应平均逃避潜伏期结果如图4所示，图4中的Control为A组，Microwave为B组，siRNA control为C组，RKIP siRNA为D组；vs Control，*示p<0.05，vsRKIP siRNA，#示p<0.05，Morris水迷宫定位航行实验结果表明，B组(单纯微波辐射组)和C组(注射阴性对照siRNA+微波辐射组)的大鼠平均逃避潜伏期(AEL)均较A组(假微波辐射组)和D组(注射抑制RKIP基因表达的siRNA+微波辐射组)显著延长(p<0.05)，且A组和D组大鼠的AEL未见统计学差异(p>0.05)，由此可知抑制RKIP基因表达的siRNA的海马注射可显著抑制微波辐射所致大鼠空间学习记忆能力的下降。
③空间探索实验：于微波辐射后第4d进行空间探索实验以检测大鼠的空间记忆能力，将平台撤掉，以放置有平台象限的对侧象限为落水点，将大鼠放入水中，观察大鼠在60s内跨越平台所在位置的次数，记录并采集微波辐射后4d每组大鼠的游泳的轨迹图，如图5所示，图5中的A为A组，B为B组，C为C组，D为D组。记录大鼠的平台象限游泳时间、平台象限游泳路程，并计算平台象限游泳时间百分比(T/％)和平台象限游泳路程百分比(D/％)，结果如图6所示，图6中注：T1为游泳时间百分比，D1为游泳路程百分比；Control为A组，Microwave为B组，siRNA control为C组，RKIP siRNA为D组；vs Control，*示p<0.05，vs RKIP siRNA，#示p<0.05。
由图5～6可知，Morris水迷宫空间探索实验结果显示，微波辐射后4d，B组(单纯微波辐射组)和C组(注射阴性对照siRNA+微波辐射组)的大鼠平台象限游泳时间百分比(T1％)和平台象限游泳路程百分比(D1％)均较A组(假微波辐射组)和D组(注射抑制RKIP基因表达的siRNA+微波辐射组)显著降低(p<0.05)，且A组和D组的大鼠T1％和D1％均未见统计学差异(p>0.05)，这进一步说明抑制RKIP基因表达的siRNA的海马注射可显著抑制微波辐射所致大鼠空间认知能力下降。
2.7大鼠海马组织病理学分析
①海马组织光镜观察：将每组大鼠分别于微波辐射后6h和7d，以1％戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠后断头取脑，脑组织先后经4％多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋和切片，切片厚度5μm，经苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色后，利用光学显微镜观察海马组织形态结构，并进行显微摄像，结果如图7所示，图7中注：C为C组，R为B组，SC为C组，S为D组。
由图7可知，光学显微镜观察显示，与A组(假辐射组)相比，B组(单纯微波辐射组)和C组(注射阴性对照siRNA+微波辐射组)均可见部分海马神经元变性、坏死，主要表现为核固缩，锥体细胞胞体皱缩，血管周间隙略增宽，偶见毛细血管充血，且病变以海马CA3和CA4区为主，辐射后7d较6h病变加重。而D组(注射抑制RKIP基因表达的siRNA+微波辐射组)上述病变均明显减轻。
②海马组织超微结构观察：对每组大鼠分别于微波辐射后6h和7d，大鼠经麻醉断头取脑后，取大鼠海马CA3区1mm3组织经2.5％戊二醛固定2h，1％锇酸固定2h，乙醇和丙酮脱水，Epon812树脂包埋，半薄切片定位，行超薄切片，切片厚度70nm，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后，采用透射电子显微镜(HITACHI H7650,Japan)观察并照相，结果如图8所示，图8中注：C为A组，R为B组，SC为C组，S为D组。
由图8所示，透射电子显微镜观察显示，与A组(假辐射组)相比，B组(单纯微波辐射组)和C组(注射阴性对照siRNA+微波辐射组)均见部分海马神经元核染色质凝聚、边集，核型不整，核膜边界不清，凋亡发生；线粒体肿胀、空化、嵴消失，粗面内质网扩张、脱颗粒，突触间隙模糊，突触内囊泡减少；胶质细胞水肿，血管周间隙增宽，偶见血管充血，辐射后7d较6h病变加重。而D组(注射抑制RKIP基因表达的siRNA+微波辐射组)上述超微结构病变明显减轻。
据图7～8分析可知，抑制RKIP基因表达的siRNA的海马注射可显著减轻微波辐射所致大鼠海马形态结构改变。
2.8实时荧光定量PCR检测海马组织ACh受体表达
将每组大鼠分别于微波辐射后6h和7d，大鼠经麻醉断头取脑后，冰上剥离双侧海马组织，液氮冻存备用。利用TRIZOL试剂提取海马组织总RNA并纯化，RNA逆转录后通过实时荧光定量PCR扩增检测ACh受体M1、M2、M3、M4、M5、α4、α7、β2亚型mRNA表达水平，以β-actin为内参照，PCR的检测结果如图9所示，图9中注：C为A组，R为B组，SC为C组，S为D组；vs C，*p<0.05；vs R，#示p<0.05。
PCR引物序列如下：
Chrm1上游引物(5’-3’)GCCTTCATCCTCACCTGGACA，
下游引物(5’-3’)TCCCACAGGGTTTCAGGAACA，扩增片段86bp；
Chrm2上游引物(5’-3’)CCTCGAACAATGGCTTGGCTA，
下游引物(5’-3’)CCAGAATGTTCCCAATGATGGTC，扩增片段111bp；
Chrm3上游引物(5’-3’)CATCATGATAGACAACGCAAAGG，
下游引物(5’-3’)CAAAGGCGAGGTTGTACTGTTACTG，扩增片段197bp；
Chrm4上游引物(5’-3’)CGGCACCAGCAGAGAAAGAC，
下游引物(5’-3’)CATTGACAGGCGTGAAGTTGG，扩增片段88bp；
Chrm5上游引物(5’-3’)ACGGGATTACCGTGCCTCA，
下游引物(5’-3’)AAGGTTTGGAGCTGCTCTATGTTTG，扩增片段183bp；
Chrnα4上游引物(5’-3’)GGGACCCTGGTGACTACGAGAA，
下游引物(5’-3’)GGTCAGGTGGGTGACTGCAA，扩增片段119bp；
Chrnα7上游引物(5’-3’)TGGTGACAGTGATTGTGCTGAGA，
下游引物(5’-3’)ACCATGCACACCAGTTCAGGAG，扩增片段99bp；
Chrnβ2上游引物(5’-3’)GTACGCTTCATTGCGGACCAC，
下游引物(5’-3’)CACCATGGCAACGTATTTCCAG，扩增片段81bp；
β-actin上游引物(5’-3’)GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA，
下游引物(5’-3’)GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG，扩增片段82bp。
由图9可知，实时荧光定量PCR结果显示，微波辐射后7d，B组(单纯微波辐射)海马M1、β2型ACh受体mRNA均较A组(伪辐射)显著下调(p<0.05)，而D组(注射抑制RKIP基因表达的siRNA+微波辐射组)海马M1、β2型ACh受体mRNA表达均较B组显著上调(p<0.05)，表明抑制RKIP基因表达的siRNA海马注射可显著抑制微波辐射所致M1、β2型ACh受体基因表达下调，提示RKIP通过对M1、β2型ACh受体基因表达的正向调控而参与微波辐射所致海马损伤。此外，我们还发现，微波辐射可导致辐射后7d海马M3型ACh受体基因表达下调(p<0.05)，海马α4、α7型ACh受体基因表达分别于辐射后6h和7d呈上调趋势，然C组(注射阴性对照siRNA+微波辐射组)与B组间均未见显著性差异，表明RKIP对微波辐射后M3、α4、α7型ACh受体基因表达无明显影响。
三、结论
抑制RKIP基因表达的siRNA海马注射可显著抑制微波辐射所致大鼠空间认知能力下降、海马组织形态结构改变，以及M1、β2型ACh受体基因表达下调；RKIP在微波辐射致海马认知功能损伤中发挥重要调节作用，其作用机制与RKIP对M1、β2型ACh受体基因表达的正向调控有关；RKIP及其调控的ACh受体可能成为微波辐射脑损伤防治的新靶点，从而为相关药物研发提供了新的线索。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (1)

1.抑制RKIP基因表达的siRNA在制备治疗微波辐射所致脑损伤药物中的应用，其特征在于，抑制RKIP基因表达的siRNA表现为调控ACh受体表达；
所述siRNA为双链RNA，所述siRNA的序列为：
正义链5'GCUGCAUAGUUAUCAAUAUTT3'，
反义链5'AUAUUGAUAACUAUGCAGCTT3'；
所述siRNA的序列的正义链和反义链的5'末端荧光标记修饰；
所述siRNA的序列的正义链和反义链的3'末端胆固醇修饰；
所述siRNA的序列的正义链经全程2’-OMe修饰；
采用Real-time PCR检测RKIP的mRNA表达水平；
在Real-time PCR的检测中以β-actin为内参照。
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