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一种羊肚菌菌丝体的培养方法及其培养基 Download PDF

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Abstract

一种羊肚菌菌丝体的培养方法及其培养基，该培养基为PDA培养基，添加了MgSO4；其中MgSO4的浓度为0.01‑1.0g/L，本发明中添加MgSO4可显著促进羊肚菌菌体的生长，并能显著提高羊肚菌多糖的产量，利用该培养基，将羊肚菌在22～28℃培养3～5天，能够促进羊肚菌菌丝的生长，促进羊肚菌产生胞外多糖，显著提高羊肚菌产量，适用于大规模工业化生产。

Description

一种羊肚菌菌丝体的培养方法及其培养基
技术领域
本发明属于食用菌栽培领域，具体涉及一种羊肚菌菌丝体的培养方法及其培养基。
背景技术
羊肚菌(Morchella esculenta)别名羊肚蘑、编笠菌、羊肚菜，其菌盖表面凹凸不平、形状似羊肚，因而得名。隶属子囊菌亚门(Ascomycotina)、盘菌纲(Discomycetes)、盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌属(Morchella)，其受欢迎程度在欧洲仅次于块菌(Tuber ssp.)。它不仅美味可口，还含有丰富的营养，它的氨基酸含量为所有食用菌之首，羊肚菌具有抗肿瘤，提高免疫能力，抗病毒，抑制肿瘤的功能，广为人所喜爱。
羊肚菌是一种野生名贵食药用真菌，具有多种保健和药理功效，最早收录于李时珍的《本草纲目》。传统中医认为其性平，味甘寒，无毒，具有益肠胃、消化助食、化痰理气、补肾、壮阳、补脑、提神之功效。最近又有研究发现，羊肚菌还能降血脂、调节免疫功能、抗疲劳、抗辐射、抗肿瘤等，它的水提物还可以一定程度保护化学性肝损伤，减轻放疗化疗对癌症患者造成的毒副作用。
由于羊肚菌本身具有的高经济价值和实用价值，其市场价格一直居高不下。面对巨大的市场需求，单纯靠人工采摘野生羊肚菌是相对不足的；同时，过度的采摘也造成了野生资源的破坏。人工栽培技术的发展无疑是解决这一问题的最佳途径。
国内学者于20世纪50年代就自然状态下羊肚菌的半人工栽培进行了详细的研究，获得了子实体。四川绵阳市食用菌研究所从1985年开始试种羊肚菌，1990年第1次获得子实体，室内栽培可收获子实体0.2～0.3kg/m2，现有技术中的羊肚菌培养中菌丝生长速度较慢，菌核的形成通常需要10-11天，且菌丝体中多糖含量在0.28-0.3％。
多糖的研究是当今科学研究的热点之一，随着近些年来国内外对食用菌多糖的研究，多种食用菌的多糖已经被提取纯化和分离鉴定，也进行了众多关于食用菌多糖功能性方面的研究。
羊肚菌多糖是羊肚菌的重要有效成分，它是从羊肚菌的子实体、菌丝体、发酵液中分离出来的活性多糖。羊肚菌多糖有抗肿瘤、降低血脂血糖、抗菌和抗病毒、抗衰老和抗氧化等众多作用，因而在食品工业、医药领域、化妆品工业等有极大的应用价值和广阔的开发前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种羊肚菌菌丝体的培养方法及其培养基，促进羊肚菌菌丝的生长，缩短羊肚菌菌丝体的培养时间，显著提高羊肚菌中的多糖含量，本发明的羊肚菌菌丝体多糖含量高达3.56g/100g，是常规培养的12.7倍，显著提高羊肚菌产量，适用于大规模工业化生产。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：
一种羊肚菌的培养方法，包括以下步骤：
1)将羊肚菌接种至凝固的PDA培养基中，于23～38℃下培养3～5天，菌丝长满平板；
2)步骤1)中的菌饼，接种至羊肚菌培养基中，封口后于22～28℃下培养时间4～5天，获得羊肚菌菌丝体；
其中，所述羊肚菌培养基由向PDA培养基中添加MgSO4 0.01-1.0g/L后，灭菌、凝固获得。
进一步，所述PDA培养基由向圆杨树叶的水提物中添加马铃薯150～250g/L、淀粉或葡萄糖15～30g/L、牛肉膏5～10g/L和琼脂15～20g/L获得。
又，所述圆杨树叶水提物的制备方法为：用水煎煮干圆杨树叶，开水煮沸20～30min，过滤，所得滤液即得圆杨树叶水提物，其中，水与干圆杨树叶的质量比为5～8：1。
一种羊肚菌培养基，包括含圆杨树叶水提物的PDA培养基和MgSO4，其中MgSO4的质量浓度为0.01-1.0g/L；其中，所述圆杨树叶水提物的制备方法为：用水煎煮干圆杨树叶，开水煮沸20～30min，过滤，所得滤液即得圆杨树叶水提物，其中，水与干圆杨树叶的质量比为5～8：1。
本发明的羊肚菌培养基中，加入牛肉膏和圆杨树叶提取物可以使该超群呈现良好的羊肚菌生长态势，表现出菌丝粗壮、生长速度快、菌核数量多的特点。
在羊肚菌的培养过程中，不同的矿质元素和植物激素对羊肚菌生长的作用效果不同，一些无机盐和微量元素是细胞的重要组成成分，一些在调节细胞膜透性和酶活性方面起重要的作用；本发明添加了外源镁元素，激活真核细胞中糖酵解、三羧酸循环、呼吸作用、硝酸盐还原等过程的酶；硝酸还原酶(NR)是N素代谢的限速酶，NR可直接调节NO3 -还原，从而调节N代谢，而Mg可提高NR的活性水平。另外，镁对谷酰胺合成酶、DNA和RNA聚合酶的活化，进而对核中RNA的合成也是必需的，缺镁时RNA的净合成立即停止，之后蛋白质合成迅速下降。
本发明中，MgSO4对羊肚菌菌丝的生长起到双重作用，即低质量浓度的MgSO4促进羊肚菌菌丝的生长，高质量浓度的MgSO4抑制羊肚菌菌丝的生长。
本发明中，在羊肚菌的生长初期，菌丝处于幼龄阶段，呈灰白色或浅黄色，有光泽，壁薄质少，分枝少，尖端分泌有针尖大的无色露珠，随之气生菌丝产生，并沿管壁上爬，菌丝尖端呈多指状或树枝状分枝，开始时分枝少，而后逐渐增多并交织成网状；生长中期菌丝渐呈深黄色至浅褐色，有光泽和露珠；成熟阶段的菌丝粗，呈褐色，壁厚质多，分枝较多，大多分枝呈锐角，少数呈直角，还可见有两两直角分枝相互吻合，相互沟通的菌丝；接种后第七天菌丝开始分泌针尖大的浅褐色色素，随着色素的产生，菌丝开始老化，颜色由褐色转为深褐色，光泽随之消失；转管成活率亦随菌龄的增长而下降，老龄阶段的菌丝无色，内无细胞质，毡绒型和颗粒型菌丝均是由短菌丝交织或聚集而成的，前者菌丝长宽比为3：1，有细胞质，分枝多，后者菌丝长宽比为2：1，近似椭圆型，有细胞质，多分枝；本发明中，菌丝粗壮且生长速度快，培养8-9天后，即可形成菌核，而利用常规培养基培养时，菌核的形成时间为10-11天。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的培养基中，在PDA培养基中添加MgSO4 0.01-1g/L，能促进羊肚菌菌丝的生长，显著提高羊肚菌产量，并能促使羊肚菌胞外多糖的产生，获得的羊肚菌中，多糖含量为0.6-3.56g/100g；多糖含量为3.56g/100g时，是常规的培养的菌丝体多糖含量的12.7倍，对羊肚菌胞内多糖的产生总量没有明显的影响，适用于大规模工业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例1羊肚菌菌丝随PDA培养基中添加不同浓度MgSO4的生长情况。
图2为本发明实施例1中羊肚菌培养3天时的情况。
图3为常规PDA培养基中羊肚菌培养3天时的生长情况。
图4为本发明实施例2羊肚菌多糖随PDA培养基中添加不同浓度MgSO4的产量变化情况。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。
材料：超群羊肚菌；PDA培养基；玻璃纸；葡萄糖(105℃恒温烘干至恒重)；乙醇(95％食用级，分析纯)；苯酚(重蒸馏)；硫酸(分析纯)等。
仪器：MV-1601型紫外及可见光分光光度计(日本岛津公司)；MICROCL17RCentrifuge离心机(Thermo)；电炉；恒温水浴锅等。
菌株：供试菌株为超群羊肚菌。
PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，圆杨树叶水提物1000mL。
圆杨树叶水提物的制备方法为：用水煎煮干圆杨树叶，开水煮沸20～30min，过滤，所得滤液即得圆杨树叶水提物，其中，水与干圆杨树叶的质量比为5～8：1。
菌种的活化：
将配置好的PDA培养基于高压蒸汽灭菌锅灭菌，无菌环境下将灭完菌的培养基倒入灭过菌且干燥的培养皿制成平板培养基。待培养基凝固后，在平板中央接入菌种，最后将平板于25℃培养箱中培养，待菌丝长满平板后4℃保存备用。
实施例1矿质元素MgSO4对羊肚菌生长的影响
将矿质元素MgSO4按0、0.005、0.01、0.1、1、5、10、15、20g/L分别加入到PDA培养基中，以0g/L的培养基作为对照，配置成含有不同浓度MgSO4的培养基，于高压蒸汽灭菌锅进行灭菌。
准备灭菌后干燥的直径为90mm的培养皿若干，在无菌环境下向爱那个培养皿中分别倒入适量的培养基，待培养基冷却凝固；培养基冷却凝固之后，在每个培养基中央定量接种1块直径8mm的菌饼(使用内径为8mm的打孔器)，每种培养基接三皿，用封口膜将培养基封口，于25摄氏度的培养箱中培养；以培养皿正中央为原点，在培养皿上画“十”字，沿着“十”字每一天测量一次羊肚菌菌丝在四个方向上的生长长度，并做好记录，以常规PDA培养基作为对比例，结果参见图1。
由图1可以看出，低质量浓度的MgSO4(≤0.05g/L)对羊肚菌菌丝的生长起到促进作用，且当MgSO4质量浓度为0.01g/L时促进作用最强，促进作用也从这个质量浓度开始向两边递减；而当MgSO4的质量浓度大于0.05g/L时，MgSO4对羊肚菌的生长的作用开始变为抑制，并且随着MgSO4质量浓度的继续升高抑制作用变得越来越强。方差分析的结果表明，不同质量浓度的MgSO4对羊肚菌菌丝的生长的影响极显著(P＜0.01)。
由此可以得出MgSO4对羊肚菌菌丝的生长起到双重作用，即低质量浓度的MgSO4促进羊肚菌菌丝的生长，高质量浓度的MgSO4抑制羊肚菌菌丝的生长。
本实施例和对比例培养3天后的生长情况参见图2-3，可见，羊肚菌菌丝体在添加0.01g/L MgSO4和圆杨树叶水提物的PDA培养基图2的生长速度比普通PDA图3的生长速度要快。
实施例2矿质元素MgSO4对羊肚菌中多糖含量的影响
1.配制培养基：
PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，圆杨树叶水提物1000mL。
MgSO4：质量浓度分别为0.005g/L、0.01g/L、0.1g/L、1.0g/L、10g/L。
2.培养并收集菌丝
配置具有不用MgSO4质量浓度的PDA培养基，其中，MgSO4质量浓度分别为0.005g/L、0.01g/L、0.1g/L、1.0g/L，10g/L对羊肚菌进行培养，待其长满平板再收集菌丝待测。
具体步骤为：配置培养基，于高压蒸汽灭菌锅进行灭菌；无菌环境下将灭好菌的培养基倒入灭过菌且干燥的培养皿，待其凝固；将凝固后的培养基表明贴上一层裁剪好且灭过菌的玻璃纸，玻璃纸大小以略小于培养皿为宜；
接种，每种培养基接5皿以保证之后收集到足够的菌丝，于25℃培养箱中培养；待其完全长满培养皿时取出，刮取菌丝并收集于5mL离心管中，同样也收集足量的培养基于5mL离心管中，存放于-70℃冷冻以备用。
3.测定多糖总量
用蒽酮比色法测定羊肚菌中的多糖：
(1)样品的提取、净化
利用多糖可经热水提取又不溶于乙醇的特性，用热水提取多糖后，用乙醇沉淀、精化。取2g样品，加入100ml水，煮沸提取30min，冷却后2500r/min离心5min。取上清液于一烧杯中，残渣再加入100mL水，煮沸提取30min，收集上清液于同一烧杯中，残渣再重复提取一次，将三次收集的有提取液的烧杯在电炉上加热、浓缩至30mL左右冷却，再加入100mL乙醇使多糖析出，沉淀30min后2500r/min离心3min，弃去上清液，残渣再加入50mL乙醇搅拌清洗后同样离心弃上清液，残渣再清洗一次后，用约80℃热水70mL溶解残渣，转移至一200mL容量瓶中，冷却后定容备用。
(2)显色剂配制：
取1g蒽酮，用浓硫酸500mL溶解，临用时配制，所用试剂均为分析纯。
(3)配制葡萄糖标准溶液：
精确称取干燥至恒重的葡萄糖0～1000g，加水溶解定容至1000mL，浓度为0.1mg/mL。
(4)制备标准曲线：
取0.1mg/mL的葡萄糖标准液0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mL于10mL试管中，用水补足至1mL，将全部试管浸人冰水中，各加人蒽酮显色剂3mL后同时摇匀，再将试管放人沸水浴中煮沸15min取出，立即放人冰水中，冷却5min后在室温中平衡10min，使用0.5cm的比色杯，在620nm波长下进行比色，测得OD值，进行回归计算，得出回归方程为Y＝5.68X-0.005，r＝0.9996。
(5)测定样品：
将⑴中准备好的备用液稀释10倍，取稀释液1mL加入10mL试管中，各加人蒽酮显色剂3mL后同时摇匀，再将试管放人沸水浴中煮沸15min取出，立即放人冰水中，冷却5min后在室温中平衡10min，用0.5cm的比色杯，在620nm波长下进行比色，测得OD值，以水作空白对照，从标准曲线中查糖含量计算多糖，具体结果参见图4。
从图4可以看出，MgSO4对于胞外多糖的产生总量却有很明显的影响，由图4可以观察到，适量浓度的MgSO4可以促使羊肚菌产生胞外多糖，其中MgSO4添加浓度为1g/L时羊肚菌多糖的含量最高，而浓度过大(10g/L)则会抑制羊肚菌胞外多糖的产生。
本发明控制PDA培养几种MgSO4浓度为0.01-1g/L，可显著促进羊肚菌产生胞外多糖产生。

Claims (5)

1.一种羊肚菌菌丝体的培养方法，包括以下步骤：
1)将羊肚菌接种至凝固的PDA培养基中，于23～38℃下培养3～5天，菌丝长满平板；
2)取步骤1)中的菌饼，接种至羊肚菌培养基中，封口后于22～28℃下培养时间4～5天，获得羊肚菌菌丝体；
其中，所述羊肚菌培养基由向PDA培养基中添加MgSO40.01-1g/L后，灭菌、凝固获得。
2.根据权利要求1所述羊肚菌的培养方法，其特征在于，所述PDA培养基由向圆杨树叶的水提物中添加马铃薯150～250g/L、淀粉或葡萄糖15～30g/L、牛肉膏5～10g/L和琼脂15～20g/L获得。
3.根据权利要求2所述羊肚菌的培养方法，其特征在于，所述圆杨树叶水提物的制备方法为：用水煎煮干圆杨树叶，开水煮沸20～30min，过滤，所得滤液即得圆杨树叶水提物，其中，水与干圆杨树叶的质量比为5～8：1。
4.根据权利要求1所述羊肚菌的培养方法，其特征在于，获得的羊肚菌中，多糖含量为0.6-3.56g/100g。
5.一种羊肚菌培养基，包括含圆杨树叶水提物的PDA培养基和MgSO4，其中MgSO4的质量浓度为0.01-1.0g/L；其中，所述圆杨树叶水提物的制备方法为：用水煎煮干圆杨树叶，开水煮沸20～30min，过滤，所得滤液即得圆杨树叶水提物，其中，水与干圆杨树叶的质量比为5～8：1。
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