CN109490429A - 一种d-核糖发酵液中葡萄糖的检测方法 - Google Patents

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叶婷
贾伟
任祥万
郑雄敏
王水淋
余赛娇
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Abstract

本发明涉及一种d‑核糖发酵液中葡萄糖的检测方法，属于微生物发酵领域。采用高效液相色谱进行分析检测，将d‑核糖发酵液经预处理后按以下色谱条件进行检测：色谱柱：Shodex SUGAR KS‑801或其他等效的色谱柱；流动相：水；流速：0.5ml/min‑1.2ml/min；检测器：示差检测器；色谱柱温度：70℃‑85℃；检测器温度：40℃；进样量：10μl。本发明快速、准确，为d‑核糖发酵液中葡萄糖的测定提供了一种可靠的分析方法。本发明操作简单、方便实用、安全环保、对发酵法生产d‑核糖具有现实的指导意义，本发明的检测方法精密度好、重复性高，能够快速、准确地测定d‑核糖发酵液中葡萄糖的含量，有助于提高食品添加剂d‑核糖的质量和安全可控性。

Description

一种d-核糖发酵液中葡萄糖的检测方法
技术领域
本发明涉及一种d-核糖发酵液中葡萄糖的检测方法，属于微生物发酵领域。
背景技术
d-核糖作为遗传物质核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)的重要组成部分广泛地存在于所有生物细胞之中，在生理上起着重要作用。
d-核糖是食品添加剂和工业上合成抗癌药物卡培他滨关键中间体和抗病毒药物、核黄素等的原料，在制药工业和食品工业上的需求逐步增大。d-核糖在医疗保健方面的作用逐步显现。d-核糖具有治疗心肌局部缺血，提高心脏对局部缺血的耐性，从而改善心脏功能的作用。同时，d-核糖具有治疗运动引起的肌肉酸痛、胞内磷酸化缺乏造成的肌肉酸痛、腺苷酸脱氢酶缺陷造成的僵硬、增强机体耐缺氧能力的作用。
目前，d-核糖的生产制备方法有3种：一种是通过化学法和酶水解法水解酵母核酸、核苷酸的方法提取d-核糖；一种是通过化学方法合成d-核糖；一种是利用枯草芽孢杆菌的转酮酶缺陷突变株，以葡萄糖为原料发酵生产d-核糖。但由于化学合成法生产d-核糖工艺复杂，生产条件要求高，产品收率低、生产成本高等一系列缺陷逐步被微生物发酵法所取代。微生物发酵法生产d-核糖关键参数就是葡萄糖的残留量，根据葡萄糖残留量从高到低的变化来判断发酵转化率情况，另一个方面也可以反应本次发酵产酸率。d-核糖发酵液中含葡萄糖残留量控制在不得超过0.05％，优选不得超过0.02％，就可以提高d-核糖产品收率和更好地控制产品质量。
现有文献中一般应用葡萄糖测定仪测定葡萄糖含量，测定原理是利用固定化葡萄糖脱氢酶与葡萄糖进行专一性反应，不受其它化合物的干扰。但是该方法与固定化葡萄糖脱氢酶的活性有关，同一样品在新旧酶膜条件下检测，旧酶膜活性会下降，导致结果偏差比较大，精密度有待提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题，在于提供一种d-核糖发酵液中葡萄糖的检测方法，快速、准确，为d-核糖发酵液中葡萄糖的测定提供了一种可靠的分析方法。
本发明是这样实现的：
一种d-核糖发酵液中葡萄糖的检测方法，采用高效液相色谱进行分析检测，将d-核糖发酵液经预处理后按以下色谱条件进行检测：
色谱柱：Shodex SUGAR KS-801或其他等效的色谱柱；
流动相：水；
流速：0.5ml/min-1.2ml/min；
检测器：示差检测器；
色谱柱温度：70℃-85℃；
检测器温度：40℃；
进样量：10μl。
更具体地，所述检测方法，具体包括如下步骤：
(1)样品制备：取d-核糖发酵液50ml，18000r/min离心10分钟，取上清液，量取Xml置于容量瓶中，加水溶解并稀释至100倍体积，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，得待测液，若d-核糖发酵液的发酵培养时间小于40小时，则再取上述微孔滤膜过滤后的过滤液Yml移至量瓶中，加水稀释至10倍体积，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，得待测液。
(2)采用高效液相色谱进行分析检测，同时设置空白对照，标准工作液设有不包含零点的五个浓度梯度，以葡萄糖量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，按外标法计算待测液中葡萄糖的含量，即得发酵液中葡萄糖的含量。
本发明具有如下优点：本发明操作简单、方便实用、安全环保、对发酵法生产d-核糖具有现实的指导意义，本发明的检测方法精密度好、重复性高，能够快速、准确地测定d-核糖发酵液中葡萄糖的含量(本发明的检测时长为半个小时左右)，有助于提高食品添加剂d-核糖的质量和安全可控性。
具体实施方式
实施例1
一.仪器与试剂
1.高效液相色谱仪：安捷伦高效液相色谱仪1260，示差检测器。
2.离心机：湖南湘仪实验室仪器TG16-WS台式高速离心机(18000r/min)。
3.水为双蒸水。
二.***适应性：分离度≥1.5、相对标准偏差≤2.0％、对称因子≤1.3、理论塔板数均≥2000。
三.色谱条件
色谱柱：Shodex SUGAR KS-801或其他等效的色谱柱；
流动相：水；
流速：0.5ml/min---1.2ml/min；
示差检测器；
色谱柱温度：70℃--85℃；
检测器温度：40℃；
进样量：10μl。
四.供试品溶液的制备
取d-核糖发酵液50ml，用离心机(18000r/min)离心10分钟，取上清液，精密量取1ml，置100ml容量瓶中，精密称定，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。再取上述溶液10ml移至100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。(发酵培养40小时后的d-核糖发酵液只要稀释第一步可以不进行第二步稀释)
五.方法学考察
1.空白试验
制备不含有d-核糖发酵液的样品，按上述葡萄糖含量测定方法试验，结果在葡萄糖峰处未见干扰(葡萄糖出峰时间7.388min、d-核糖出峰时间9.196min)。
2.色谱条件考察
色谱柱：Shodex KS-801或其他等效的色谱柱；
流动相：水；
流速：0.5ml/min---1.2ml/min；
示差检测器；
色谱柱温度：70℃--85℃；
检测器温度：40℃；
3.线性关系的考察
精密称取葡萄糖适量，加双蒸馏水溶液制成每1ml含9.175mg的溶液。精密吸取上述溶液10ml置于100ml量瓶中，加双蒸馏水稀释至刻度，摇匀，得到每1ml含0.9175mg的溶液，备用。吸取上述不同浓度的对照品溶液，分别进样10、20、30、50、60μl，以葡萄糖量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：Y＝9587.5X+200.53，r＝1结果表明葡萄糖的进样量在9.175ˉ55.05μg范围内峰面积积分值与质量呈良好的线性关系(见表1)。
表1葡萄糖标准曲线测定数据
4.精密度试验
分别取同一对照品溶液与同一供试品溶液，各分别连续进样6次，测定峰面积值，对照品溶液与供试品溶液的RSD分别为0.04％和1.31％(见表2)。结果表明，该方法精密度良好。
表2精密度试验结果
5.稳定性试验
取供试品溶液，配制后放置0、1、2、4、6、8、10、12h分别测定，结果表明在12h内稳定，见表3。
表3稳定性试验结果
6.重复性试验
取同一批号(20180603)46小时发酵液样品，按d-核糖发酵液中葡萄糖残留含量测定方法重复测定6次得其平均含量为1.646g/100ml。结果表明，该方法重复性良好(见表4)。
表4重复性试验结果
7.回收率试验
按起始发酵投料配方浓度约20％葡萄糖，分别配置成投料浓度的50％、80％、100％三个浓度的样品各3份，按照葡萄糖残留含量的检测方法检测，计算平均回收率为98.60％(n＝9)，RSD为0.57％(见表5)。结果表明，该法方法回收率良好。
表5回收率试验
8.耐用性考察
本实验考察了三个品牌的高效液相色谱仪、三种流速的耐用性，结果见表6。
表6d-核糖发酵液中葡萄糖的含量
三台仪器同一色谱柱检测出的结果RSD为2.13％，同一仪器，同一色谱柱不同流速检测出的结果RSD为3.16％。结果表明，该方法耐用性良好。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims (2)

1.一种d-核糖发酵液中葡萄糖的检测方法，其特征在于：采用高效液相色谱进行分析检测，将d-核糖发酵液经预处理后按以下色谱条件进行检测：
色谱柱：Shodex SUGAR KS-801或其他等效的色谱柱；
流动相：水；
流速：0.5ml/min-1.2ml/min；
检测器：示差检测器；
色谱柱温度：70℃-85℃；
检测器温度：40℃；
进样量：10μl。
2.根据权利要求1所述的d-核糖发酵液中葡萄糖的检测方法，其特征在于：所述检测方法，具体包括如下步骤：
(1)样品制备：取d-核糖发酵液50ml，18000r/min离心10分钟，取上清液，量取Xml置于容量瓶中，加水溶解并稀释至100倍体积，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，得待测液，若d-核糖发酵液的发酵培养时间小于40小时，则再取上述微孔滤膜过滤后的过滤液Yml移至量瓶中，加水稀释至10倍体积，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，得待测液；
(2)采用高效液相色谱进行分析检测，标准工作液设有不包含零点的五个浓度梯度，以葡萄糖量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，按外标法计算待测液中葡萄糖的含量，即得d-核糖发酵液中葡萄糖的含量。
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