CN109486942B - 一种用于类风湿性关节炎诊断的生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于类风湿性关节炎诊断的生物标志物及其应用，属于生物检测技术领域。本发明以基因RPN2的mRNA和蛋白质作为类风湿性关节炎诊断的生物标志物。本发明所提供的相应引物组和探针及蛋白质可用于制备试剂盒，且其在应用于外周血单个核细胞和血浆样本诊断类风湿性关节炎时，具有优异的灵敏度与特异性。本发明RPN2 mRNA的AUC值可以达到0.911，具有优异的诊断价值；以3.3为截点，灵敏度和特异性分别为82.1％和83.3％。本发明RPN2蛋白质的AUC值为0.672，以14.29ng/ml为截点，其灵敏度和特异性分别为65.0％和67.5％。因此，本发明所示的RPN2 mRNA和蛋白质可作为类风湿性关节炎的生物标志物，对于类风湿性关节炎的诊断和治疗，具有可应用价值。

Description

一种用于类风湿性关节炎诊断的生物标志物及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于类风湿性关节炎诊断的生物标志物及其应用，属于生物检测技术领域。

背景技术

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以侵蚀关节为主要表现的慢性自身免疫性疾病。该疾病通常通过侵蚀软骨和破坏骨骼关节导致肌肉与骨骼不健全、身体机能减退及诱发共生疾病，晚期致残率较高。如不治疗或对治疗无反应，炎症和关节破坏会导致身体功能丧失，严重影响患者的生活质量，并伴随沉重的社会经济负担。因此筛查RA的新型生物标志物，揭示其分子致病机制，建立早期疾病诊断模型和预防手段是控制RA免疫炎症、预防并减缓后期骨骼损伤或畸形的极为重要的战略措施。

RA是一种由环境因素和遗传因素共同调控的复杂疾病，其发病原理和机制尚未明确。遗传因素是RA发病的重要影响因素，在RA发病中所占比重约为50-60％。先前的全基因组关联研究已发现100多个与RA相关的易感基因，且其中多数与免疫相关。然而，已发现的遗传学易感位点联合起来解释RA遗传率很小(15％)，仍有大量的遗传因子有待发现。临床上传统的血清诊断指标包括自身抗体抗瓜氨酸蛋白抗体(ACPA)和类风湿因子(RF)。ACPA的灵敏度约67％，在早期RA患者中更低。RF的特异度为38％-85％。两个指标联合起来具有比单一指标更好的诊断效果。然而，有研究表明ACPA和RF组合的诊断模型仅能正确鉴定54％-57％的RA患者。因此，具有优越性能的生物标志物还有待开发。

外周血单个核细胞中含有一系列与免疫相关的细胞，如T细胞、B细胞、单核细胞等，因此目前多数针对RA的功能组学研究是以外周血单个核细胞为研究靶细胞。血浆内蕴含着丰富的蛋白质，通过血液循环到达全身各组织、参与生命过程。在外周血单个核细胞和血浆中筛选出在RA中异常表达的基因作为生物标志物，并研制相应的辅助诊断试剂盒，将有力推动我国RA的早期诊断、预测治疗、监测复发等，具有重要的临床应用价值。

发明内容

为解决上述技术问题，提供一种用于类风湿性关节炎诊断的外周血单个核细胞基因和血浆蛋白质生物标志物。同时提供一种能够用于早期检测且在检测时具有较高灵敏度和较高特异性的类风湿性关节炎检测试剂盒及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种用于类风湿性关节炎诊断的生物标志物，所述的生物标志物为基因RPN2(全称：ribophorinⅡ)编码的RPN2mRNA或RPN2蛋白质(蛋白质名称：dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit 2；别名：dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase 63kDasubunit；oligosaccharyltransferase complex subunit(non-catalytic)；ribophorin-2)。

在本发明的一种实施方式中，所述RPN2mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述RPN2蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述的RPN2mRNA和RPN2蛋白质分别来源于外周血单个核细胞和血浆。

本发明的第二个目的是提供一种用于类风湿性关节炎诊断的RPN2mRNA引物组和探针的组合。

本发明的第三个目的是提供一种用于类风湿性关节炎诊断的抗体，所述抗体可特异性识别并结合RPN2蛋白质。

本发明的第四个目的是提供一种用于类风湿性关节炎诊断的试剂盒，包含对外周血单个核细胞中RPN2mRNA表达量进行检测的mRNA引物组和mRNA探针的组合；或包含对血浆RPN2蛋白质含量进行测定的抗体。

在本发明的一种实施方式中，所述的mRNA引物组包括RPN2mRNA的定量PCR反转录正向引物和反向引物。

在本发明的一种实施方式中，所述RPN2mRNA的定量PCR反转录正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，或如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述的试剂盒还包括qPCR扩增检测的组件，所述qPCR扩增检测的组件包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl₂、dd H₂O、荧光染料、Taq酶、标准品和对照物。

在本发明的一种实施方式中，所述抗体可特异性识别RPN2蛋白质。

在本发明的一种实施方式中，所述的试剂盒还包括ELISA检测的组件，所述组件包括检测板、缓冲液和RPN2蛋白质标样。

本发明的第五个目的是提供一种用于类风湿性关节炎诊断的芯片，包括用于对RPN2mRNA进行检测的mRNA探针。

在本发明的一种实施方式中，所述的mRNA探针的核苷酸序列与所述的mRNA探针的检测对象的全长成熟mRNA完全互补。

本发明的第六个目的是提供所述的mRNA生物标志物在制备检测类风湿性关节炎的产品中的应用。

本发明的mRNA生物标志物在类风湿性关节炎诊断中的应用包括：测定来源于受试者的外周血单个核细胞的生物标志物的表达水平以获得测定值，所述的生物标志物为RPN2mRNA；将所述的测定值与参考值比较，若RPN2mRNA测定值高于参考值，则确定受试者患有类风湿性关节炎。

在本发明的一种实施方式中，所述的应用具体包括：提取受试者的外周血单个核细胞中的生物标志物；提供与所述生物标志物对应的引物组和探针；以及，通过PCR检测方法测得所述测定值。其中，PCR检测的正/反向引物序列如SEQ ID NO.3(正向)/SEQ ID NO.4(反向)，或SEQ ID NO.5(正向)/SEQ ID NO.6(反向)所示。

在本发明的一种实施方式中，所述应用具体包括：提取受试者的外周血单个核细胞中的mRNA生物标志物；提供检测芯片，所述检测芯片上载有与所述生物标记物的全长成熟mRNA完全互补序列的mRNA探针；以及，以所述检测芯片测得所述检测值。

本发明的有益效果是：

本发明所提供的RPN2基因生物标志物及其相应引物组和探针可以用于制备诊断试剂盒，且其在应用于外周血单个核细胞和血浆样本的类风湿性关节炎诊断时，具有优异的灵敏度与特异性。本发明RPN2mRNA的AUC值可以达到0.911，以3.3为截点，灵敏度和特异性分别为82.1％和83.3％；本发明RPN2蛋白质的AUC值可以达到0.672，以14.29ng/ml为截点，其灵敏度和特异性分别为65.0％和67.5％。该基因可以作为人的类风湿性关节炎外周血单个核细胞和血浆样本诊断的生物标志物，有利于推动我国类风湿性关节炎的早期诊断、预测治疗、监测复发的发展。

附图说明

图1中，A为本发明RPN2mRNA在风湿性关节炎患者和正常对照中的表达水平(N＝43，FC＝2.09，P<0.05)；B为本发明RPN2mRNA用于区分类风湿性关节炎患者和正常对照的ROC曲线图；

图2为本发明RPN2mRNA在35例类风湿性关节炎和35例健康人外周血单个核细胞样本中的表达水平变化示意图(N＝70，FC＝1.14，P<0.05)；

图3为本发明RPN2mRNA在6例类风湿性关节炎和3例健康人T细胞样本中的表达水平示意图(N＝9，FC＝1.79，P<0.05)；

图4为本发明外周血单个核细胞中RPN2蛋白质在18例类风湿性关节炎和10例健康人中的表达水平示意图(N＝28，FC＝1.29，P<0.05)；

图5为本发明外周血单个核细胞中RPN2蛋白质的质谱鉴定图；其中，A为类风湿性关节炎患者；B为健康对照个体；

图6中，A为RPN2蛋白质在40例风湿性关节炎患者和40例正常对照血浆中的表达水平(N＝80，FC＝2.12，P<0.05)；B为发明RPN2蛋白质用于区分类风湿性关节炎患者和正常对照的ROC曲线图；

图7中，A为RPN2mRNA在PHA刺激后的Jurkat细胞和未刺激的对照细胞中的表达水平(P<0.05)；B为RPN2过表达对Jurkat细胞的细胞周期的影响(P<0.05)；C为RPN2过表达对Jurkat细胞的细胞凋亡的影响(P<0.05)；D为RPN2过表达对Jurkat细胞的细胞活化的影响(P<0.05)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例中未说明具体条件的实验，通常按照常规条件如厂商说明书、实验指南或教科书内容的条件。

在对实例描述前，有必要备注说明：采用不同厂家、不同批次的试剂会造成实验结果的差异，属于正常现象。

在进行小规模实验时，为保证平行实验间的重复性，建议配置试剂后，充分混匀并分装，以保证每次实验试剂的均一性。

实施例1：外周血单个核细胞中差异表达mRNA的芯片筛选

1、在取得患者知情同意后，收集了25例确诊为类风湿性关节炎患者的外周血样本及18例健康人作为正常对照的外周血样本于枸橼酸钠抗凝管。

2、通过密度梯度离心法获得类风湿性关节炎患者和正常人外周血单个核细胞，具体步骤如下：

(1)在leucosep分离管中加入15ml密度梯度分离液，离心100g，1分钟。

(2)将15ml外周血样本离心2000rpm,2分钟分层后的上清液集中到15ml离心管，离心2500g，15分钟。随后分装至2ml离心管，存于-80℃冰箱。

(3)用等量的PBS补充被提取的上清量，再将混合液集中至50ml的离心管中。随后加入等量混合液的PBS。

(4)将混合液移至(1)中的leucosep管内，离心500g，20分钟。

(5)吸弃上部分离管中的上清。提取中间层白细胞至新的50ml离心管，加入PBS至终体积为15ml，离心400g，10分钟。

(6)吸弃上部离心管中的上清。加入4ml PBS混匀，吸取10ul进行细胞计数，剩余细胞液平均分装至2ml冷冻管中，离心2000rpm，2分钟。

(7)沥干离心管后，取其中3支，分别加入1ml TRIzol以防止RNA降解。吹打混匀后保存于-80℃冰箱。

3、在发现实验中，从加有TRIzol的类风湿性关节炎患者及健康对照的外周血单个核细胞中提取Total RNA后，通过全基因组表达谱芯片(lncRNA+mRNA Human GeneExpression Microarray V4.0)检测mRNA的表达。

主要实验步骤如下：

3.1提取RA和正常人外周血单个核细胞中的RNA后，进一步采用

RNA clean-up试剂盒对Total RNA进行纯化，再用分光光度计方法定量，用琼脂糖凝胶电泳方法检测其完整性。

3.2 Total RNA合成cDNA

(1)反转录合成First Strand cDNA。在0.2ml无核酸酶离心管中依次加入以下试剂：

a.5ul Total RNA(100-500ng)；

b.加入

基因表达谱外参(Cat.No.360030)1ul，同时根据表1加入相应体积的Agilent spike-in。

表1

c.在冰上配制反转录Master Mix，轻轻混匀，短暂离心放在冰浴上，Master Mix反应体系为：4ul的lncRNA+mRNA First Strand Buffer Mix，1ul的First Strand EnzymeMix。

d.取出c中5ul反转录Master Mix，加到含有Total RNA样品的离心管中，反转录最终反应体积为10ul。

e.轻柔吹吸混匀2-3次，瞬时离心，置于冰上。

f.将反转录离心管置于PCR仪上，25℃反应1h，42℃反应1h，4℃保持5min以上。取出反转录离心管，瞬时离心，置于冰上，准备进行Second Strand cDNA合成反应。

(2)合成Second Strand cDNA。

a.在冰上配制Second Strand Master Mix，轻轻混匀，短暂离心后冰浴。SecondStrand Master Mix反应体系为：32.5ul的Nuclease-free Water，12.5ul的Second StrandBuffer Mix，5ul的Second Strand Enzyme Mix。

b.取50μL Second Strand Master Mix加到上步合成的First Strand cDNA步骤中f的反应管中，混合体积为60μL；吹吸混匀2-3次，瞬时离心，置于冰上。

c.将第二链合成离心管置于PCR仪上，16℃反应1h(关闭PCR仪盖加热功能)，65℃反应10分钟，4℃保持5分钟以上。

d.反应结束后将反应管置于冰上继续合成反应，或者迅速冻存于-20℃。

3.3体外转录合成cRNA

(1)cRNA合成。

a.配制体外转录Master Mix，轻轻混匀，短暂离心将溶液收集于管底。Master Mix反应体系为：24ul的T7Buffer Mix；6ul的T7Enzyme Mix。

b.取30μL IVT Master Mix到上步骤合成的cDNA步骤中的反应管中，吹吸混匀，瞬时离心冰上放置。

c.将体外转录合成离心管置于PCR仪上，40℃反应16h，4℃保持。

d.反应结束后，瞬时离心，使用

RNA clean-up试剂盒(MN公司，740.948.250)对产物进行纯化，并使用紫外分光光度计对纯化后的cRNA产物进行定量。

3.4cRNA反转录生成cDNA

a.取cRNA纯化产物10μg，调整体积至22μL，加入到0.2mL无核酸酶离心管中，并加入2μL Random Primer混匀，置于PCR仪上，70℃5分钟，25℃5分钟，4℃,2分钟，瞬时离心收集液体至管底，冰上放置。

b.配制cRNA反转录Master Mix，轻轻混匀，短暂离心将溶液收集于管底。MasterMix反应体系为：8ul的2nd-Cycle Buffer Mix，8ul的2nd-Cycle Enzyme Mix。

c.取16μL反转录Master Mix加入4.1.1步骤反应后的离心管中，总体积为40μL，吹吸混匀2-3次，瞬时离心。

d.将cRNA反转录离心管置于PCR仪上，25℃反应10分钟，40℃反应1.5h，70℃反应10分钟，4℃反应5分钟，离心管冰上放置。

e.冰上操作，在cRNA反转录离心管中加入2μL RNase H混匀，瞬时离心，置于PCR仪上，37℃反应45分钟，95℃反应5分钟，4℃维持5分钟。

f.反应结束后，可在-20℃冻存过夜，或立即进行纯化操作。使用

Extract II(MN公司，Cat.No.740609.250)试剂盒进行cDNA纯化，并使用紫外分光光度计对纯化后的cRNA产物进行定量。

3.5荧光标记

(1)荧光染料标记反应

a.将反转录并纯化后得到的cDNA产物体积浓缩至14μL，加入4μL Random Primer混匀，短暂离心后置于PCR仪上，95℃变性3分钟，冰浴5分钟。

b.依次加入5ul的5×Klenow Buffer，1ul的Cy5-dCTP(或Cy3-dCTP)，1.2ul的Klenow Fragmen。

c.短暂离心后，置于PCR仪上，37℃反应1.5小时，70℃反应5分钟。4℃保持。

d.荧光染料标记反应结束后，使用

Extract II(MN公司，Cat.No.740609.250)试剂盒进行cDNA纯化，并使用紫外分光光度计对纯化后的荧光标记产物进行荧光掺入量和核酸定量。

3.6芯片杂交

(1)标记产物杂交准备

a.经

Extract II试剂盒纯化后的标记产物，洗脱体积在30μL左右。

b.如果进行单通道芯片杂交，将单管标记(cy3-dCTP或cy5-dCTP)纯化洗脱产物抽真空浓缩或补水体积至27.5μL备用。

c.如果进行双通道芯片杂交，将1管cy3-dCTP标记纯化产物与另外1管cy3-dCTP标记纯化产物混合后，共计60μL左右抽真空浓缩至27.5μL备用。

(2)杂交体系配制、杂交反应

a.将上步步骤中准备好的标记产物，与55ul的2×GEx Hyb Buffer，27.5ul的Formamide，27.5ul的Sample混合。

b.取100μL杂交液加样至杂交盖片围栏中，“Agilent”标签面朝下轻轻盖上围栏，安装好Agilent杂交盒并旋紧后，可轻轻水平转动杂交盒，检查各个亚阵的杂交腔体内液体是否流动。

c.将杂交盒安装在杂交炉的转子上，注意对称安装，同时在托盘中加入适量超纯水后，45℃杂交过夜。

3.7芯片清洗及扫描

a.结束后，取出芯片在博奥Slide Washer 8芯片洗干仪进行清洗，清洗程序如下：

洗液I：0.2％SDS，2×SSC,42℃120S清洗2遍。

洗液II：0.2％SDS，2×SSC,42℃80S清洗3遍。

清洗程序完成后，离心甩干，待扫描

b.使用Agilent芯片扫描仪(G2565CA)对清洗后的芯片进行扫描，得到杂交图片。

3.8芯片数据分析

芯片的荧光扫描图像经AGCC软件(

Command

Software)将图像信号转化为数字信号，得到每个探针的荧光信号强度。随后运用Affimetrix Expression Console软件的Robust Multi-array Average(RMA)模块进行数据的预处理，包括原始数据的归一化、探针信号是否显著高于背景信号的判别、将探针信号整合为探针组信号。再使用Agilent GeneSpring软件对数据进行归一化和差异分析。

mRNA差异表达分析。分析主要包括：通过fold-change值(FC)方法比较病例组与对照组的mRNA表达差异；利用t检验计算病例组与对照组间的差异p值。筛选条件为p<0.05。

4、对25例类风湿性关节炎患者和18例正常对照的外周血单个核细胞基因表达进行差异表达分析，与正常对照相比，RPN2mRNA表达上调。RPN2mRNA的差异表达具有显著性(图1A，p<0.05，Fold Change(FC)＝2.09)，且mRNA的ROC曲线下面积(AUC)为0.91(p<0.05；95％置信区间：0.83-0.99)，具有诊断价值。当截点值为3.3，灵敏度和特异性分别为82.1％和83.3％(图1B)。

实施例2：外周血单个核细胞中mRNA的qRT-PCR实验

1、根据芯片结果，对RPN2mRNA进行qRT-PCR验证。对类风湿性关节炎患者和正常对照的外周血单个核细胞进行RPN2mRNA的qRT-PCR检测，在整个研究中实施严格质控，每个样本连续检测至少三次。所用正向和反向引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

2、在取得患者知情同意后，收集35例确诊为类风湿性关节炎患者的外周血样本及35例健康人作为正常对照的外周血样本于枸橼酸钠抗凝管。

3、采用与实施例1中相同的密度梯度离心法获得类风湿性关节炎患者和正常人外周血单个核细胞。

4、对加有TRIzol外周血单个核细胞进行样本总RNA的提取、mRNA的反转录与cDNA的定量PCR。具体实验步骤如下：

4.1样本RNA的提取

(1)将浸泡在TRIzol中的单个核细胞从冰箱中取出，室温解冻，混匀；

(2)按200ul氯仿/1mL TRIzol的比例加入氯仿，迅速混匀15秒钟(不用涡旋仪混匀以防基因组DNA断裂)，室温放置2-3分钟；

(3)4℃下12000g离心15分钟，提取上层水相；

(4)加入与水相等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟后，4℃下12000rpm离心10分钟，使RNA沉淀于管底。

(5)吸出上清液，向有沉淀的管中加入-20℃预冷的75％酒精悬浮沉淀(酒精用去RNA酶水配置)；

(6)4℃下7500rpm离心5分钟，弃去上层废液，空气中干燥5-10分钟，用30ul去RNA酶的水溶解RNA沉淀。

4.2RNA中残留基因组DNA的消化

取上述步骤提取得到的RNA原液30ul进行DNA消化反应。反应程序为37℃，30分钟。反应体系如下(50ul)：30ul RNA原液；0.5ul Recombinant Rnase Inhibitor；5ul DNaseIbuffer；13.5ul Rnase Free H₂O；1ul Dnase I(Rnase free)。

向反应得到的RNA中加入500ul TRIzol，按照实施例1中3.1的步骤进行RNA提取，最后加入30ul去RNA酶的水溶解RNA。

4.3使用1st-Strand cDNA Synthesis kit(境象生物)按操作手册进行逆转录反应。

4.4使用SYBR Green qPCR Master Mix Kit(境象生物)进行qPCR反应，仪器使用罗氏实时荧光定量PCR仪Roche light cycler 480II(Roche公司)。

5、数据分析

PCR扩增结果用Ct值表示，即PCR反应中荧光信号达到所设定阈值时的循环数。计算差异表达的mRNA的△Ct值，采用B2M作为内参进行标化，运用相对定量

法计算病例与对照组间mRNA的表达差异。组间比较运用t-test比较差异，P<0.05认为具有统计学差异。

6、数据分析结果显示，RPN2mRNA的差异表达具有显著性(图2，FC＝1.14,p<0.05)。

实施例3：人T细胞中mRNA的qRT-PCR实验

1、对类风湿性关节炎患者和正常对照的T细胞进行RPN2mRNA的qRT-PCR检测，在整个研究中实施严格质控，每个样本连续检测至少三次。所用正向和反向引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

2、在取得患者知情同意后，收集6例确诊为类风湿性关节炎患者的外周血样本及3例健康人作为正常对照的外周血样本于枸橼酸钠抗凝管。

3、人T细胞提取

(1)按照实例1中所述提取外周血单个核细胞。

(2)使用EasySep Human Whole Blood CD3 Positive Selection Kit(STEMCELLTechnologies,加拿大)试剂盒提取外周血单个核细胞中的T细胞。

a.加入1ml PBS重悬外周血单个核细胞，转移至新的圆形透明管中。

b.加入60ul的EasySep Human CD3 Positive Selection Cocktail和EasySepmagnetic nanoparticles两种试剂标记CD3+细胞，静置3分钟。

c.震荡透明管30秒，加入45ul的Rapidsphere于透明管中，静置3分钟。

d.将上述溶液放置在磁铁中，静置3分钟。

f.同时倒置起磁铁和透明管，将悬浮液倒出。将透明管移出磁铁，此时CD3+细胞贴在管壁上。

g.加入PBS重悬细胞，离心，300g，5分钟。弃上清液。管底沉淀团块即为目标细胞。

4、在提取的T细胞中加入适量TRIzol，进行样本总RNA的提取。具体实验步骤同实例3中RNA的提取。

5、取2ug的RNA，使用

First-Strand cDNA Synthesis kit(Promega,美国)按操作手册进行逆转录反应。

6、使用

qPCR Master Mix Kit(Promega,美国)进行qPCR反应，仪器使用QuantStudioTM 6 Flex(Life Technologies,美国)。

7、数据分析

PCR扩增结果用Ct值表示，即PCR反应中荧光信号达到所设定阈值时的循环数。计算差异表达的mRNA的△Ct值，采用GAPDH作为内参进行标化，运用相对定量

法计算病例与对照组间mRNA的表达差异。组间比较运用t-test比较差异，P<0.05认为具有统计学差异。

8、数据分析结果显示，RPN2mRNA的差异表达具有显著性(图3，FC＝1.79,p<0.05)。

实施例4：外周血单个核细胞中差异表达蛋白的筛选

1、在取得患者知情同意后，收集18例确诊为类风湿性关节炎患者的外周血样本及10例健康人作为正常对照的外周血样本于枸橼酸钠抗凝管。

2、采用与实施例1中相同的密度梯度离心法获得类风湿性关节炎患者和正常人外周血单个核细胞。

3、外周血单个核细胞总蛋白的提取、预处理和定量

(1)每管外周血单个核细胞样本中加入300μl SDT缓冲液(4％SDS,1.0mM DTT,100mM Tris-HCl,PH＝7.6)裂解细胞，沸水浴中孵育15分钟。

(2)高速离心，14000g,40分钟,收集上清，获得外周血单个核细胞总蛋白。沸水浴5分钟,超声裂解。

(3)将蛋白样本进行离心，13400rpm/min,30分钟，取上清。

(6)BCA法进行蛋白定量。

4、蛋白质的SDS-PAGE实验

每个样品各取20μg蛋白质样品5:1(v/v)加入5倍浓缩上样缓冲液，沸水浴5分钟，14000g离心10分钟取上清，进行12.5％SDS-PAGE电泳。电泳条件：恒流：15mA，电泳时间60分钟。考马斯亮蓝染色。

5、每份样品分别取200μg，分别加入DTT至终浓度为100mM，沸水浴5分钟，冷却至室温。加入200μL UA buffer(8M Urea，150mM Tris-HCl pH8.0)混匀，转入30kd超滤离心管，离心14000g 15分钟。加入200μL UA buffer离心14000g 15分钟，弃滤液。加入100μL IAA(50mM IAA in UA)，600rpm振荡1分钟，避光室温30分钟，离心14000g 10分钟。加入100μLUA buffer，离心14000g 10分钟重复2次。加入100μL NH4HCO3buffer，离心14000g 10分钟重复2次。加入40μL Trypsin buffer(2μg Trypsin in 40μL NH4HCO3buffer)，600rpm振荡1分钟，37℃16-18h。换新收集管，离心14000g 10分钟，收集滤液，滤液C18-SD ExtractionDisk Cartridge脱盐处理，OD280定量。

6、酶解产物的LC-MS/MS分析

按照定量结果，每个样品各取2μg酶解产物进行LC-MS/MS分析。采用纳升流速HPLC液相***EASY-nLC1000进行分离。液相A液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为2％)，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱Thermo EASY column SC200 150μm*100mm(RP-C18)以100％的A液平衡。样品由自动进样器上样到Thermo EASY column SC001traps150μm*20mm(RP-C18)(Thermo)，再经色谱柱分离，流速为400nL/min。相关液相梯度如下：0分钟---100分钟，B液线性梯度从0％到45％；100分钟---108分钟，B液线性梯度从45％到100％；108分钟---120分钟，B液维持在100％。酶解产物经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪(Thermo Finnigan)进行质谱分析。分析时长：120min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300-1800m/z，多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后采集20个碎片图谱(MS2scan，HCD)。MS1在M/Z 200时分辨率为70,000，MS2在M/Z200时分辨率为17,500。

7、Maxquant的非标记定量分析

6个样品的LC-MS/MS原始文件导入Maxquant软件(版本号1.3.0.5)进行查库，进行LFQ非标定量分析。数据库为uniprot_human_151619_20160229.fasta(收录序列151619条，下载于2016-02-29)。主要参数如下：

Main search ppm：6 Missed cleavage：2

MS/MS tolerance ppm：20 De-Isotopic：TRUE

enzyme：Trypsin

database：uniprot_human_151619_20160229.fasta

Fixed modification：Carbamidomethyl(C)

Variable modification:Oxidation(M)，Acetyl(Protein N-term)

Decoy database pattern:reverse

LFQ：TRUE

LFQ min.ratio count：1

Match between runs：2min

Peptide FDR：0.01

Protein FDR：0.01

(9)Perseus的统计学分析

Maxquant处理后的数据使用Perseus 1.3.0.4软件进行统计分析，通过比较类风湿性关节炎患者组和正常对照组外周血单个核细胞中的蛋白质组表达谱，筛选出在患者组表达失调的蛋白质。组间差异分析结果表明：患者组和正常组之间RPN2蛋白质表达水平存在显著差异(P<0.05)。

图4显示，与正常对照组相比，类风湿性关节炎外周血单个核细胞中RPN2蛋白质表达水平显著上调(FC＝1.29；P<0.05)。

图5为外周血单核细胞中RPN2蛋白质的二级质谱鉴定图。其中，A为类风湿性关节炎患者；B为健康对照个体。

实施例5：血浆蛋白质标志物的鉴定

在取得患者知情同意后，收集40例确诊为类风湿性关节炎患者的外周血样本及40例健康人作为正常对照的外周血样本于枸橼酸钠抗凝管。血浆RPN2蛋白质检测步骤如下：

1、血样采集、血浆分离

(1)约10ml静脉血在500g的转速下，高速离心10min，将上层血浆小心吸出备用。

2、用RPN2蛋白的ELISA试剂盒(MyBioSource,Cat.No:MBS9312546)定量血浆RPN2蛋白浓度。按操作手册进行实验。

图6显示RPN2蛋白质在40例类风湿性关节炎患者和40例对照个体血浆中的浓度差异(图6A，N＝80；FC＝2.12；P<0.05)。ROC曲线下面积(AUC)为0.672(图6B，p<0.05；95％置信区间:0.55-0.79)。以14.29ng/ml为截点，其灵敏度和特异性分别为65.0％和67.5％。

实施例6：特定RPN2基因在Jurkat免疫细胞中对细胞生长和激活的作用

上述实施例表明：RPN2mRNA对类风湿性关节炎外周血单个核细胞检测具有较高的诊断价值(高灵敏度和特异性)。本实施例围绕RPN2基因开展其与类风湿性关节炎之间的关联机制研究。Jurkat细胞为常见的CD4+T淋巴细胞系。首先研究炎性因子刺激对Jurkat细胞中RPN2mRNA表达水平的影响，如图7A所示，Jurkat细胞在PHA刺激下RPN2mRNA表达水平显著上调。利用PGMLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-Puro载体在Jurkat细胞中构建RPN2过表达稳定转染细胞系(OE)和对照细胞(NC)，RPN2过表达可以影响Jurkat细胞周期(图7B)、促进细胞增殖(图7C)及PHA诱导的细胞激活(图7D)。

综上所述，藉由上述技术方案，本发明所提供的RPN2基因生物标志物及其相应引物组和探针可以用于制备诊断试剂盒，且其在应用于外周血单个核细胞样本的类风湿性关节炎诊断时，具有优异的灵敏度与特异性。进一步地，本案发明人通过研究证实，RPN2mRNA的AUC值可以达到0.911，当截点值为3.3时，灵敏度和特异性分别为82.1％和83.3％。RPN2蛋白质的AUC值可以达到0.672，以14.29ng/ml为截点，其灵敏度和特异性分别为65.0％和67.5％。该基因可以作为人类风湿性关节炎外周血单个核细胞样本诊断的生物标志物，有利于推动我国类风湿性关节炎的早期诊断、预测治疗、监测复发的发展。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 一种用于类风湿性关节炎诊断的生物标志物及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2227

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 1

ggactccggc gggacctgct cggaggaatg gcgccgccgg gttcaagcac tgtcttcctg 60

ttggccctga caatcatagc cagcacctgg gctctgacgc ccactcacta cctcaccaag 120

catgacgtgg agagactaaa agcctcgctg gatcgccctt tcacaaattt ggaatctgcc 180

ttctactcca tcgtgggact cagcagcctt ggtgctcagg tgccagatgc aaagaaagca 240

tgtacctaca tcagatctaa ccttgatccc agcaatgtgg attccctctt ctacgctgcc 300

caggccagcc aggccctctc aggatgtgag atctctattt caaatgagac caaagatctg 360

cttctggcag ctgtcagtga ggactcatct gttacccaga tctaccatgc agttgcagct 420

ctaagtggct ttggccttcc cttggcatcc caagaagcac tcagtgccct tactgctcgt 480

ctcagcaagg aggagactgt gctggcaaca gtccaggctc tgcagacagc atcccacctg 540

tcccagcagg ctgacctgag gagcatcgtg gaggagattg aggaccttgt tgctcgcctg 600

gatgaactcg ggggcgtgta tctccagttt gaagaaggac tggaaacaac agcgttattt 660

gtggctgcca cctacaagct catggatcat gtggggactg agccatccat taaggaggat 720

caggtcatcc agctgatgaa cgcgatcttc agcaagaaga actttgagtc cctctccgaa 780

gccttcagcg tggcctctgc agctgctgtg ctctcgcata atcgctacca cgtgccagtt 840

gtggttgtgc ctgagggctc tgcttccgac actcatgaac aggctatctt gcggttgcaa 900

gtcaccaatg ttctgtctca gcctctgact caggccactg ttaaactaga acatgctaaa 960

tctgttgctt ccagagccac tgtcctccag aagacatcct tcacccctgt aggggatgtt 1020

tttgaactaa atttcatgaa cgtcaaattt tccagtggtt attatgactt ccttgtcgaa 1080

gttgaaggtg acaaccggta tattgcaaat accgtagagc tcagagtcaa gatctccact 1140

gaagttggca tcacaaatgt tgatctttcc accgtggata aggatcagag cattgcaccc 1200

aaaactaccc gggtgacata cccagccaaa gccaagggca cattcatcgc agacagccac 1260

cagaacttcg ccttgttctt ccagctggta gatgtgaaca ctggtgctga actcactcct 1320

caccagacat ttgtccgact ccataaccag aagactggcc aggaagtggt gtttgttgcc 1380

gagccagaca acaagaacgt gtacaagttt gaactggata cctctgaaag aaagattgaa 1440

tttgactctg cctctggcac ctacactctc tacttaatca ttggagatgc cactttgaag 1500

aacccaatcc tctggaatgt ggctgatgtg gtcatcaagt tccctgagga agaagctccc 1560

tcgactgtct tgtcccagaa ccttttcact ccaaaacagg aaattcagca cctgttccgc 1620

gagcctgaga agaggccccc caccgtggtg tccaatacat tcactgccct gatcctctcg 1680

ccgttgcttc tgctcttcgc tctgtggatc cggattggtg ccaatgtctc caacttcact 1740

tttgctccta gcacgattat atttcacctg ggacatgctg ctatgctggg actcatgtat 1800

gtctactgga ctcagctcaa catgttccag accttgaagt acctggccat cctgggcagt 1860

gtgacgtttc tggctggcaa tcggatgctg gcccagcagg cagtcaagag aacagcacat 1920

tagttccaga agaaagatgg aaattctgaa aactgaatgt caagaaaagg agtcaagaac 1980

aattcacagt atgagaagaa aaatggaaaa aaaaaacttt atttaaaaaa gaaaaaagtc 2040

cagattgtag ttatactttt gcttgttttt cagtttcccc aacacacagc agatacctgg 2100

tgagctcaga tagtctcttt ctctgacact gtgtaagaag ctgtgaatat tcctaactta 2160

cccagatgtt gcttttgaaa agttgaaatg tgtaattgtt ttggaataaa gagggtaaca 2220

ataggaa 2227

<210> 2

<211> 631

<212> PRT

<213> （人工合成）

<400> 2

Met Ala Pro Pro Gly Ser Ser Thr Val Phe Leu Leu Ala Leu Thr Ile

1 5 10 15

Ile Ala Ser Thr Trp Ala Leu Thr Pro Thr His Tyr Leu Thr Lys His

20 25 30

Asp Val Glu Arg Leu Lys Ala Ser Leu Asp Arg Pro Phe Thr Asn Leu

35 40 45

Glu Ser Ala Phe Tyr Ser Ile Val Gly Leu Ser Ser Leu Gly Ala Gln

50 55 60

Val Pro Asp Ala Lys Lys Ala Cys Thr Tyr Ile Arg Ser Asn Leu Asp

65 70 75 80

Pro Ser Asn Val Asp Ser Leu Phe Tyr Ala Ala Gln Ala Ser Gln Ala

85 90 95

Leu Ser Gly Cys Glu Ile Ser Ile Ser Asn Glu Thr Lys Asp Leu Leu

100 105 110

Leu Ala Ala Val Ser Glu Asp Ser Ser Val Thr Gln Ile Tyr His Ala

115 120 125

Val Ala Ala Leu Ser Gly Phe Gly Leu Pro Leu Ala Ser Gln Glu Ala

130 135 140

Leu Ser Ala Leu Thr Ala Arg Leu Ser Lys Glu Glu Thr Val Leu Ala

145 150 155 160

Thr Val Gln Ala Leu Gln Thr Ala Ser His Leu Ser Gln Gln Ala Asp

165 170 175

Leu Arg Ser Ile Val Glu Glu Ile Glu Asp Leu Val Ala Arg Leu Asp

180 185 190

Glu Leu Gly Gly Val Tyr Leu Gln Phe Glu Glu Gly Leu Glu Thr Thr

195 200 205

Ala Leu Phe Val Ala Ala Thr Tyr Lys Leu Met Asp His Val Gly Thr

210 215 220

Glu Pro Ser Ile Lys Glu Asp Gln Val Ile Gln Leu Met Asn Ala Ile

225 230 235 240

Phe Ser Lys Lys Asn Phe Glu Ser Leu Ser Glu Ala Phe Ser Val Ala

245 250 255

Ser Ala Ala Ala Val Leu Ser His Asn Arg Tyr His Val Pro Val Val

260 265 270

Val Val Pro Glu Gly Ser Ala Ser Asp Thr His Glu Gln Ala Ile Leu

275 280 285

Arg Leu Gln Val Thr Asn Val Leu Ser Gln Pro Leu Thr Gln Ala Thr

290 295 300

Val Lys Leu Glu His Ala Lys Ser Val Ala Ser Arg Ala Thr Val Leu

305 310 315 320

Gln Lys Thr Ser Phe Thr Pro Val Gly Asp Val Phe Glu Leu Asn Phe

325 330 335

Met Asn Val Lys Phe Ser Ser Gly Tyr Tyr Asp Phe Leu Val Glu Val

340 345 350

Glu Gly Asp Asn Arg Tyr Ile Ala Asn Thr Val Glu Leu Arg Val Lys

355 360 365

Ile Ser Thr Glu Val Gly Ile Thr Asn Val Asp Leu Ser Thr Val Asp

370 375 380

Lys Asp Gln Ser Ile Ala Pro Lys Thr Thr Arg Val Thr Tyr Pro Ala

385 390 395 400

Lys Ala Lys Gly Thr Phe Ile Ala Asp Ser His Gln Asn Phe Ala Leu

405 410 415

Phe Phe Gln Leu Val Asp Val Asn Thr Gly Ala Glu Leu Thr Pro His

420 425 430

Gln Thr Phe Val Arg Leu His Asn Gln Lys Thr Gly Gln Glu Val Val

435 440 445

Phe Val Ala Glu Pro Asp Asn Lys Asn Val Tyr Lys Phe Glu Leu Asp

450 455 460

Thr Ser Glu Arg Lys Ile Glu Phe Asp Ser Ala Ser Gly Thr Tyr Thr

465 470 475 480

Leu Tyr Leu Ile Ile Gly Asp Ala Thr Leu Lys Asn Pro Ile Leu Trp

485 490 495

Asn Val Ala Asp Val Val Ile Lys Phe Pro Glu Glu Glu Ala Pro Ser

500 505 510

Thr Val Leu Ser Gln Asn Leu Phe Thr Pro Lys Gln Glu Ile Gln His

515 520 525

Leu Phe Arg Glu Pro Glu Lys Arg Pro Pro Thr Val Val Ser Asn Thr

530 535 540

Phe Thr Ala Leu Ile Leu Ser Pro Leu Leu Leu Leu Phe Ala Leu Trp

545 550 555 560

Ile Arg Ile Gly Ala Asn Val Ser Asn Phe Thr Phe Ala Pro Ser Thr

565 570 575

Ile Ile Phe His Leu Gly His Ala Ala Met Leu Gly Leu Met Tyr Val

580 585 590

Tyr Trp Thr Gln Leu Asn Met Phe Gln Thr Leu Lys Tyr Leu Ala Ile

595 600 605

Leu Gly Ser Val Thr Phe Leu Ala Gly Asn Arg Met Leu Ala Gln Gln

610 615 620

Ala Val Lys Arg Thr Ala His

625 630

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 3

tgacttcctt gtcgaagttg aa 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 4

gtgatgccaa cttcagtgga 20

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 5

ccggaattca cctgctcgga ggaatggc 28

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 6

ccgctcgagc taatgtgctg ttctcttgac tgcctg 36

Claims (3)

1.一种生物标志物在制备检测类风湿性关节炎的产品中的应用，其特征在于，所述的生物标志物为基因RPN2编码的RPN2 mRNA或RPN2蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述RPN2 mRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述RPN2蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

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