CN107447008B

CN107447008B - 用于诊断不明原因复发性流产的增强子rna组合、引物组及应用和试剂盒

Info

Publication number: CN107447008B
Application number: CN201710735738.6A
Authority: CN
Inventors: 陆春城; 黄振遥; 范赟; 韩秀梅; 黄晓敏; 韩莉; 夏彦恺; 王心如
Original assignee: Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing Medical University
Priority date: 2017-08-24
Filing date: 2017-08-24
Publication date: 2020-09-25
Anticipated expiration: 2037-08-24
Also published as: CN107447008A

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及用于诊断不明原因复发性流产的增强子RNA组合、引物组及应用和试剂盒。所述增强子RNA组合包括：与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第一增强子RNA、与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第二增强子RNA和与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第三增强子RNA。本发明利用筛选出的增强子RNA组作为新的标志物，制备用于不明原因复发性流产诊断或监测的试剂盒，具有灵敏度高、检出谱系广、成本低等优点。

Description

用于诊断不明原因复发性流产的增强子RNA组合、引物组及应用和试剂盒

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地，涉及用于诊断不明原因复发性流产的增强子RNA组合、引物组，以及增强子RNA组合与引物组的应用和试剂盒。

背景技术

复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指临床上连续2次或2次以上的孕20W前或胎儿体重不足500g的妊娠丢失，其发生率约占妊娠结局的1％～3％。RSA的病因极其复杂，目前已明确的病因有染色体异常、生殖解剖结构异常、内分泌失调、生殖***感染、自身免疫和环境因素等，但临床上仍有50％～60％的RSA找不到明确的病因，称为不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)。胚胎发育异常是发生URSA的主要原因。胚胎发育是有机体从其生命起始到成熟的复杂进程，受一系列环境因素、遗传因素和表观遗传修饰的调控。

近年来，长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)重要生物学功能的发现使其成为生命科学研究的一大焦点，它们可在表观遗传、转录以及转录后等多个层面上调控基因的表达。在整个基因组转录产物中，lncRNA所占的比例远远超过编码RNA所占的比例。不同于编码RNA，lncRNA的保守性要差得多，然而在其分子内部，却含有较为保守的局部区段，且其表达具有时空特异性，这些现象都提示了lncRNA具有重要的生物学功能。

当lncRNA与转录因子结合之后，lncRNA能与目的基因形成染色质环从而调控靶基因的时空表达。2010年Greenberg在小鼠神经细胞中发现，分布在整个基因组中、由神经细胞去极化作用所激活的增强子均被转录，且增强子转录产生的lncRNA与增强子邻近的基因所转录的mRNA相关联。Rosenfeld等研究发现，在乳腺癌细胞中，***与其受体结合会诱导lncRNA的转录，进而提高特定基因的表达，通过RNAi技术去除这些lncRNA，会减弱增强子上调基因表达的能力，同时减少增强子与启动子之间的成环现象。在胚胎发育方面，lncRNA的作用也正逐渐被证实。大量研究表明，lncRNA是胚胎发育和疾病发生过程中关键性的转录元件，可能是决定胚胎发育中基因时空表达的最早期分子之一，参与调控生长发育相关的基因。Samir等报道胚胎心脏发育受到lncRNA及其靶基因调控，lncRNA在胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中发挥了一定作用。

lncRNA大多转录自“基因沙漠区”，但有些可以转录自基因组上的增强子(enhancer)元件，这类lncRNA被称为增强子RNA(enhancer RNA,eRNA)。增强子是DNA上可与转录因子结合的区域，可以位于基因上游，也可位于基因下游，甚至远离受调控的基因，且常伴有组蛋白的不同修饰。当与转录因子结合之后，增强子能与目的基因形成染色质环从而调控靶基因的时空表达。

目前还没有将增强子RNA应用于不明原因复发性流产辅助诊断的报道，若能筛选出不明原因复发性流产相关的增强子RNA作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对不明原因复发性流产的诊断现状必将是一次有力的推动，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了一条新的途径。

发明内容

本发明的目的是提供用于诊断不明原因复发性流产的增强子RNA组合、引物组及应用和试剂盒。

本发明利用高通量测序技术检测绒毛组织中增强子RNA的表达情况，通过差异分析筛选到lnc-ERGIC1-4、lnc-PBK-2、lnc-SLC4A1-1在不明原因复发性流产绒毛组织样本中表达显著升高；荧光定量PCR实验进一步证实lnc-ERGIC1-4、lnc-PBK-2、lnc-SLC4A1-1在不明原因复发性流产患者绒毛组织和血清中的表达量显著高于正常对照。通过生物信息学分析和ChIP-qPCR确定lnc-ERGIC1-4、lnc-PBK-2、lnc-SLC4A1-1均为增强子RNA。通过独立人群验证和稳定性分析，这一组增强子RNA可作为不明原因复发性流产诊断标志物在不明原因复发性流产的诊断中应用。

具体地，本发明的第一方面提供一组用于诊断不明原因复发性流产的增强子RNA组合，所述增强子RNA组合包括：与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第一增强子RNA、与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第二增强子RNA和与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列具有90％以上同源性的第三增强子RNA。

优选地，所述增强子RNA组合包括：与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有95％以上同源性的第一增强子RNA、与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有95％以上同源性的第二增强子RNA和与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列具有95％以上同源性的第三增强子RNA。

进一步优选地，所述增强子RNA组合包括：与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有96％、97％、98％、99％同源性的第一增强子RNA、与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有96％、97％、98％、99％同源性的第二增强子RNA和与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列具有96％、97％、98％、99％同源性的第三增强子RNA。

最优选地，所述增强子RNA组合包括：具有如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第一增强子RNA、具有如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的第二增强子RNA和具有如SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的第三增强子RNA。

本发明的增强子RNA组合可作为诊断不明原因复发性流产的生物分子标志物。

本发明的第二方面提供用于检测上述增强子RNA组合的引物组，所述引物组包括：

用于检测第一增强子RNA的上游引物和下游引物；

用于检测第二增强子RNA的上游引物和下游引物；

用于检测第三增强子RNA的上游引物和下游引物。

本领域技术人员可根据常规手段设计上述引物，优选地，用于检测第一增强子RNA的上游引物具有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，下游引物具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；

用于检测第二增强子RNA的上游引物具有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列，下游引物具有SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；

用于检测第三增强子RNA的上游引物具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列，下游引物具有SEQ ID NO：9所示核苷酸序列。

本发明还提供上述的增强子RNA组合和/或引物组在制备不明原因复发性流产诊断或监测试剂中的应用。

本发明的第三方面提供一种不明原因复发性流产诊断或监测试剂盒，该试剂盒包括上述的引物组。

所述试剂盒还可以包括内参，以及相关PCR技术常用的其他试剂。优选地，所述试剂盒还包括：

(1)检测GAPDH的正反向引物；和/或

(2)DNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、水和核酸染料中的至少一种。

根据本发明，可通过在不明原因复发性流产样本中检测上述增强子RNA组合来实现诊断或监测，具体方法包括但不限于杂交法、扩增法和测序法，所述杂交法为Northern杂交、基因芯片杂交及原位杂交法，所述扩增法为实时荧光定量聚合酶链式反应，所述不明原因复发性流产样本为不明原因复发性流产蜕膜、绒毛、血清、血浆、口腔黏液、尿液或体液。

本发明的有益效果包括：

(1)本发明筛选出一组新的增强子RNA，该组RNA可用于不明原因复发性流产诊断的特异性标志物。

(2)通过高通量测序技术筛选了一组在不明原因复发性流产和正常妊娠者绒毛组织中表达差异的增强子RNA。

(3)将筛选出的一组增强子RNA作为新的标志物，制备用于不明原因复发性流产诊断或监测的试剂盒，具有灵敏度高、检出谱系广、成本低等优点。

(4)采用一组增强子RNA作为不明原因复发性流产的标志物，将改进单一的标志物难以克服的个体差异所带来的低灵敏度。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述。

图1为不明原因复发性流产绒毛组织样本转录组测序增强子RNA表达差异程度的MA图。在Control组和Case组样本间差异表达的lncRNA分布(大于0的为上调的lncRNA，小于0的为下调的lncRNA)；

图2为Real-time PCR检测lnc-ERGIC1-4、lnc-PBK-2、lnc-SLC4A1-1在不明原因复发性流产绒毛组织样本中的表达示意图；

图3为Real-time PCR检测lnc-ERGIC1-4、lnc-PBK-2、lnc-SLC4A1-1在不明原因复发性流产血清样本中的表达示意图；

图4为正常妊娠对照组和不明原因复发性流产病例组ROC曲线。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为本领域常规方法，或按照试剂商所建议的条件与步骤进行。

实施例1：不明原因复发性流产增强子RNA甄别、筛选及确认

1、材料

1.1组织

本发明的临床组织标本均来自2015年3月至2016年7月于南京医科大学附属淮安第一人民医院诊断的不明原因复发性流产患者，对照组为同期正常妊娠后选择手术停止妊娠者并经过严格匹配。所有标本的使用均由患者或其委托人签署知情同意书，得到了南京医科大学医学伦理委员会标准。

1.2试剂

TRIzol^TM Reagent购自美国Invitrogen公司。反转录试剂盒(DRR036A)购自日本Takara公司。荧光实时(Real-time)定量PCT所用SYBR试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司。PCR引物由上海英骏生物技术有限公司设计并合成。转录组测序和数据分析工作由上海天昊生物科技有限公司完成。

2、方法和结果

2.1不明原因复发性流产绒毛组织样本转录组测序

以3例不明原因复发性流产患者绒毛组织和3例经过严格匹配的正常对照样本为对象，委托上海天昊生物科技有限公司进行转录组测序工作：按照RNA提取试剂TRIzol^TMReagent说明书推荐的步骤提取容貌组织总RNA。RNA样品质检合格后，采用去除rRNA，富集剩余mRNA，long noncoding RNA方法构建测序文库；采用Illumina Hiseq2500高通量测序平台完成转录本RNA测序；双向配对末端测序，即2×125bp，每条reads的两端各测100碱基；质控后平均数据量不低于10G/每样本；污染控制：rRNA比例低于rawdata的3％。

通过对原始数据进行整理，鉴定差异表达的潜在增强子RNA，发现lnc-ERGIC1-4、lnc-PBK-2、lnc-SLC4A1-1在不明原因复发性流产绒毛组织中显著高表达(如图1所示)。其中lnc-ERGIC1-4的转录区域位于5号染色体，全长344bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；lnc-PBK-2的转录区域位于8号染色体，全长267bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；lnc-SLC4A1-1的转录区域位于17号染色体，全长460bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.2增强子RNA确认

通过UCSC genome browser进行预测筛选增强子RNA，发现lnc-ERGIC1-4、lnc-PBK-2、lnc-SLC4A1-1均转录自具有H3K4me1及H3K27ac修饰的增强子区域。通过ChIP-qPCR确认lnc-ERGIC1-4、lnc-PBK-2、lnc-SLC4A1-1过表达时，H3K27ac表达均升高，因此确认lnc-ERGIC1-4、lnc-PBK-2、lnc-SLC4A1-1均为增强子RNA。

实施例2：qRT-PCR方法验证转录组测序结果

1、材料

1.1组织

本发明的临床组织标本同实施例1。

1.2试剂

qPCR所用试剂同实施例1。

2、方法

2.1制备cDNA样品

将组织在液氮中磨碎，每50～100mg组织加入1mL TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10％。将匀浆样品在室温(15～30℃)放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。每使用1mL TRIzol加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min。4℃，10 000g离心15min。样品分为3层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的50～60％，把水相转移到新管中。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mL TRIzol加入0.5mL异丙醇，充分振荡混匀，-20℃冰箱放置20min。4℃，10000g离心10min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。用新鲜的75％乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1mL TRIzol至少加1mL 75％乙醇。4℃不超过7500g离心5min，弃上清。室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾半小时即可。加入50μL DEPC水，用枪头吸打几次，37℃放置15min使RNA溶解。用Nanodrop2000测定浓度，提取的RNA置于-70℃保存。

提取的RNA使用036A试剂盒进行逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括1000μg的RNA样品，4μL 5×Primescript Buffer，1μL PrimerScript RT Enzyme MixI，1μLoligo dT primer，4μL Random 6mers，加入DEPC水将体系补足至20μL。逆转录反应步骤为37℃孵育15分钟，85℃孵育5秒钟，即可获得cDNA。该cDNA可用于增强子RNA Real-time PCR检测。

2.2引物设计

引物由上海英骏生物技术有限公司设计并合成：

序列为SEQ ID NO：1的标志物的上游引物为SEQ ID NO：4(5’-ATGTCCTCCACAATGTTAGCAA-3’)，下游引物为SEQ ID NO：5(5’-TCTCGAACTCCTGACCTATCTTT-3’)；

序列为SEQ ID NO：2的标志物的上游引物为SEQ ID NO：6(5’-TCATTCATTGATCTTCCCACAC-3’)，下游引物为SEQ ID NO：7(5’-CCGTAGACAACTGGACACTCAG-3’)；

序列为SEQ ID NO：3的标志物的上游引物为SEQ ID NO：8(5’-CCGTAGACAACTGGACACTCAG-3’)，下游引物为SEQ ID NO：9(5’-TCATATTCCTCCTGCTCCAGAT-3’)。

2.3qRT-PCR

染料法：取1μl cDNA，将cDNA倍比稀释，加入0.3μl Taq酶，1μl 20×EVA GREEN，0.25μl 10μM上游引物，0.25μl 10μM下游引物，1.2μl 25mM MgCl₂，1.6μl 2.5mM dNTP混合液，2μl 10×PCR缓冲液，12.4μl纯水，20μl体系进行荧光定量PCR。仪器使用ABI Prism7900荧光定量PCR仪，PCR的反应条件为：95℃5分钟预变性→95℃15秒退火，60℃1分钟延伸进行40个循环，获得ct值。可用方程2^–△ct计算增强子RNA相对表达量，其中△ct＝ct_eRNA–ct_GAPDH。

3结果

为验证转录组测序结果，本发明对临床采集的不明原因复发性流产绒毛组织样本进行qRT-PCR检测(30:30)，证实lnc-ERGIC1-4、lnc-PBK-2、lnc-SLC4A1-1在复发性患者绒毛组织中均高表达(如图2所示)，提示lnc-ERGIC1-4、lnc-PBK-2、lnc-SLC4A1-1可能参与调控不明原因复发性流产的发生过程，具有应用于不明原因复发性流产诊疗的可能。

实施例3：qRT-PCR方法检测血清中增强子RNA lnc-ERGIC1-4、lnc-PBK-2、lnc-SLC4A1-1表达情况

1、材料

1.1血清

本发明的临床血清标本采集同实施例1。

1.2试剂

qPCR所用试剂同实施例1。

2、方法

在200μl血清样本中加入1mL TRIzol，进行充分混匀，于4℃静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。后续方法同实施例1 2.2。

3、结果

与正常妊娠者相比，lnc-ERGIC1-4、lnc-PBK-2、lnc-SLC4A1-1在复发性患者血清中均高表达(如图3所示)，提示这一组增强子RNA与不明原因复发性流产相关，可用于该疾病的诊断。

实施例4：增强子RNA lnc-ERGIC1-4、lnc-PBK-2、lnc-SLC4A1-1组合对不明原因复发性流产的判断

根据实施例2、实施例3的材料和方法，通过对病例和对照组血清样品的增强子RNA表达水平的分析，以正常人妊娠对照增强子RNA表达量的五分位数为阈值，对lnc-ERGIC1-4、lnc-PBK-2、lnc-SLC4A1-1进行评分，进一步求得总得分，以此绘制ROC曲线来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这三个增强子RNA表达对不明原因复发性流产的评估能力。ROC分析结果显示，lnc-ERGIC1-4、lnc-PBK-2、lnc-SLC4A1-1以77.1％的AUC(ROC曲线下面积)将正常妊娠对照组和不明原因复发性流产病例组分开(如图4所示)，最佳临界点的敏感度＝0.781，特异度＝0.756。

在上述一系列研究结果的基础上，证明了采用lnc-ERGIC1-4、lnc-PBK-2、lnc-SLC4A1-1能够很好地将正常妊娠对照组和不明原因复发性流产病例组分开。

实施例5：用于不明原因复发性流产监测和风险评估的相关增强子RNA诊断试剂盒的制作

该增强子RNA试剂盒的制作工艺和操作流程主要基于qRT-PCR技术。

首先通过测序和qRT-PCR方法确定不明原因复发性流产患者和正常妊娠对照者血清中有一个拷贝以上的增强子RNA。然后通过定量PCR等技术筛选与不明原因复发性流产相关的一类血清增强子RNA，作为不明原因复发性流产监测和风险评估的指标。最后筛选出对应的血清增强子RNA的数量控制在3-4条，这是在预实验的基础上做出的最优化的精简。此试剂盒包括一批血清增强子RNA引物，其中增强子RNA的引物包括lnc-ERGIC1-4、lnc-PBK-2、lnc-SLC4A1-1和GAPDH的正反向引物(见表1)。还包括相关PCR技术常用的试剂，如Taq酶、PCR缓冲液、MgCl₂、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液、染料等试剂，这些试剂可采用相应的市售产品。此试剂盒的价值在于只需要一次提供少量(2ml)血液，即可检测血清增强子RNA标志物的变化趋势，再通过该变化趋势预测不明原因复发性流产发生的可能性，并易于进行动态监测。

具体试剂盒组成如下：

试剂盒含有以下3对引物：SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6和SEQ IDNO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9，各10μM 0.25μl。

试剂盒中还可以含有0.3μl Taq酶，1μl 20×EVA GREEN，1.2μl 25mM MgCl₂，1.6μl 2.5mM dNTP混合液，2μl 10×PCR缓冲液，12.4μl纯水。

试剂盒中还可以含有内参GAPDH的正反向引物一对(表1)。试剂盒中的组分除引物外的试剂可以采用现有技术中用于增强子RNA含量检测的相应试剂。

表1实施例5相关增强子RNA的引物序列

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

序列表

<110> 南京医科大学

<120> 用于诊断不明原因复发性流产的增强子RNA组合、引物组及应用和试剂盒

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 344

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

tccagcctag cggcagagca agcgtccatc tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa gagtttaatt 60

gcttatctca acaaaactat gaaatcagag cagcaggtga catgaaggag gcaactacca 120

aaaatgccat gtctatatgc agaaatgcca gcgtgaatgt cctccacaat gttagcaatg 180

gtcaggttgg ggatgggctg ttgcgggtga tttctttaca tggtatttgc ttatagtgct 240

tggatttttt ttctttcttt tttttttttt ttgccaatgt atttaaattt tcacaaaaac 300

aaaagccttt ttaaaagcaa aaagataggt caggagttcg agac 344

<210> 2

<211> 267

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atggccaaga cctgcaaaac acacccgcta ataaaaatta ttaattactc attcattgat 60

cttcccacac catctaacat ttctatatga tgaaactttg gctcacttct tggtgcctgc 120

ctaatcctcc agatcattac acgattactc ttggccatgc agtacacatc agacacttca 180

actgccttct cttcagttgc tcatatcagc tgagatgtaa actacagctg aatggtctgc 240

tattttcatg cttccttggt ctcacta 267

<210> 3

<211> 460

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

gctgtcagaa cgagtgggaa cgtagctggt cgcagagggc accagcggct gcaggacttc 60

accaagggac cctgaggctc gtgagcaggg acccgcggtg cgggttatgc tgggggctca 120

gatcaccgta gacaactgga cactcaggac cacgccatgg aggagctgca ggtgggtgtt 180

ccctggcatc agcagtgctc ccacctggag gctctgggga cctggtccta gactcctatc 240

ttcgttgggg gtggaagagc ccctcacagc ccagcctcag cggccacttc ccacaggatg 300

attatgaaga catgatggag gagaatctgg agcaggagga atatgaagac ccagacatcc 360

ccgagtccca gatggaggag ccggcagctc acgacaccga ggcaacagcc acagactacc 420

acaccacatc acacccgggt acccacaagg tctatgtgga 460

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

atgtcctcca caatgttagc aa 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tctcgaactc ctgacctatc ttt 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tcattcattg atcttcccac ac 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

agcaactgaa gagaaggcag tt 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ccgtagacaa ctggacactc ag 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

catattcctc ctgctccaga t 21

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

cggagtcaac ggatttggtc gtat 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

agccttctcc atggtggtga agac 24

Claims

1.一组用于诊断不明原因复发性流产的增强子RNA组合产品，其特征在于，所述增强子RNA组合产品包括：如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第一增强子RNA、如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的第二增强子RNA和如SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的第三增强子RNA。

2.用于检测权利要求1中所述的增强子RNA组合的引物组，其特征在于，所述引物组包括：

用于检测第一增强子RNA的上游引物和下游引物；

用于检测第二增强子RNA的上游引物和下游引物；和

用于检测第三增强子RNA的上游引物和下游引物。

3.根据权利要求2所述的引物组，其中，

用于检测第一增强子RNA的上游引物如SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，下游引物如SEQID NO：5所示核苷酸序列；

用于检测第二增强子RNA的上游引物如SEQ ID NO：6所示核苷酸序列，下游引物如SEQID NO：7所示核苷酸序列；

用于检测第三增强子RNA的上游引物如SEQ ID NO：8所示核苷酸序列，下游引物如SEQID NO：9所示核苷酸序列。

4.权利要求1所述的增强子RNA组合产品和/或权利要求2或3所述的引物组在制备不明原因复发性流产诊断或监测试剂中的应用。

5.一种不明原因复发性流产诊断或监测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求2或3所述的引物组。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括：

（1）检测GAPDH的正反向引物；和/或

（2）DNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、水和核酸染料中的至少一种。