CN109486916A

CN109486916A - 一种检测等位基因差异表达的方法

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Publication number: CN109486916A
Application number: CN201710809360.XA
Authority: CN
Inventors: 李新云; 赵书红; 赵长志; 吴慧; 刘华珍; 栾宇; 陈毅龙; 杨高娟; 胡素琴; 倪娟; 谢胜松; 赵云霞
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2017-09-10
Filing date: 2017-09-10
Publication date: 2019-03-19
Anticipated expiration: 2037-09-10
Also published as: CN109486916B

Abstract

本发明提供了一种检测等位基因差异表达的方法。具体地，本发明首次基于荧光基团标记引物策略扩增待测基因，利用限制性内切酶酶切的方法进行定量，并通过测定所述第二扩增产物LA的可检测标记的数量M_LA与所述第二扩增产物LG的可检测标记的数量M_LG，从而检测所述等位基因的差异表达。

Description

一种检测等位基因差异表达的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种检测等位基因差异表达的方法。

背景技术

最早研究等位基因差异表达是发现人类存在基因印记现象(genomicimprinting)和X染色体失活(X-chromosome inactivation)，后来逐渐证实等位基因差异表达现象是广泛存在于各种生物中。等位基因差异表达现象存在的主要原因是等位基因间存在多态性，这对基因的表达起了很重要的调控作用,并最终可能与生物的表型多态性联系起来。如今，随着测序技术的飞速发展,大量核甘酸序列信息被解码,通过分析这些碱基序列发现，即使在同一物种内,其等位基因的核苷酸序列也存在很大的差异。同一等位基因在不同个体，不同组织中均可存在差异表达，且差异表达类型也存在不同。

早在20世纪90年代开始，等位基因差异表达分析方法就已经逐渐发展起来，随着分子生物学技术的不断进步，使得对等位基因差异表达进行了深入的研究，从而促使验证差异表达基因方法不断得以丰富和改进，并在挖掘新的功能基因以及揭示基因的新功能方面表现出优势，使得寻找差异表达基因变得更加便捷。但由于等位基因差异表达的调控机制很复杂和检测技术的不完善，导致至今仍缺乏有效的技术解决这个问题。因此，在各种生物中等位基因差异表达所起的作用仍然有待探索。

目前检测等位基因差异表达的方法主要有差减杂交(subtractivehybridization,SH)、mRNA差异显示逆转录PCR(differential display of reversetranscriptional PCR,DDRT-PCR)、表达系列标签(serial analysis of geneexpression,SAGE)、cDNA限制性片段长度多态性分析(cDNA-AFLP)、基因芯片(DNA Chips)技术、半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术和转录组测序(RNA-seq)技术等。以上诸多技术都可检测等位基因差异表达，但都存在一定的不足，如操作繁琐、耗时耗力、价格昂贵、灵敏度低、重复性差和假阳性高等缺点。这些方法从某种层面上限制了等位基因差异表达的研究，也阻碍了其在生物体中的作用和机理的研究。

已有研究表明，拷贝数变异在生物体基因组中大量存在，是构成基因组结构变异的重要组成部分，属于重要的生物遗传变异资源，并且与表型的多样性相关，在物种的演化与发展中发挥着重要作用。基因组中拷贝数变异形式多种多样，如某个片段的重复，缺失，单个片段的多次重复，多个片段的多次重等。其检测方法主要分为两种，一种是在全基因组范围内对未知拷贝数变异进行检测，包括芯片技术和测序技术，此方法成本较高，目前使用比较少；另一种是对已知的拷贝数变异进行定点检测或验证，其中最常用的是实时定量PCR法，但准确度较低。

因此，本领域迫切需要开发一种能够快速检测等位基因差异表达和基因拷贝数的新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够快速检测等位基因差异表达和基因拷贝数的新方法，具体地，提供一种新的检测等位基因差异表达和基因相对拷贝数的方法，同时可弥补现有检测方法的不足。以便挖掘新的存在差异表达的功能基因，揭示基因的新功能。此发明中我们提供了非常简单的检测等位基因差异表达和基因拷贝数的方法，并应用此方法已经成功检测出存在差异表达的等位基因，且准确的检测出不同个体间的拷贝数差异。

本发明第一方面，提供了一种检测等位基因差异表达的方法，包括步骤：

(a)提供一待测样本，所述样本为等位基因cDNA样品；

(b)以所述cDNA样品为模板，用第一引物对对所述待测样本的所述等位基因序列进行PCR扩增，从而获得第一扩增产物；

(c)以所述第一扩增产物为模板，用带有可检测的标记的第二引物对，对步骤(b)获得的第一扩增产物进行PCR扩增，从而获得第二扩增产物，其中所述的第二扩增产物带有所述的可检测标记；

(d)在限制性内切酶的作用下，对步骤(c)获得的第二扩增产物进行酶切，其中，当所述第二扩增产物不含有所述限制性内切酶的酶切位点时，形成未经酶切且带有所述的可检测标记的第二扩增产物LA；当所述第二扩增产物含有所述限制性内切酶的酶切位点时，形成经酶切的且带有所述的可检测标记的第二扩增产物LG，其中所述的第二扩增产物LA的长度L1不同于所述第二扩增产物LG的长度L2；

(e)对所述第二扩增产物LA和所述第二扩增产物LG进行分离；和

(f)测定所述第二扩增产物LA的可检测标记的数量M_LA与所述第二扩增产物LG的可检测标记的数量M_LG，从而检测所述等位基因的差异表达。

在另一优选例中，在步骤(c)中，进行的PCR扩增的反应循环数为1。

在另一优选例中，所述的可检测标记选自下组：荧光基团、化学发光基团、生色团、或其组合。

在另一优选例中，所述的可检测标记为荧光基团。

在另一优选例中，在步骤(f)中，测量所述第二扩增产物LA与所述第二扩增产物LG的荧光强度，并进行比较从而确定所述等位基因的差异表达。

在另一优选例中，所述的等位基因包括野生型(或第一亚型)等位基因和突变型(或第二亚型)等位基因。

在另一优选例中，对应于所述野生型等位基因的扩增产物含有所述酶切位点，而对应于所述突变型等位基因的扩增产物不含有所述酶切位点。

在另一优选例中，对应于所述野生型等位基因的扩增产物不含有所述酶切位点，而对应于所述突变型等位基因的扩增产物含有所述酶切位点。

在另一优选例中，所述第一引物对与所述样本完全匹配。

在另一优选例中，所述第一引物对与所述样本不完全匹配。

在另一优选例中，所述第一引物对中至少一条引物带有酶切位点。

在另一优选例中，所述第二引物对带有一个、两个或多个荧光基团。

在另一优选例中，所述第二引物对标记的荧光基团与模板完全配对或者不完全配对。

在另一优选例中，所述第二引物对包括单引物荧光基团标记或双引物荧光基团标记。

在另一优选例中，PCR反应终点进行定量。

在另一优选例中，PCR扩增产物电泳包括琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。

在另一优选例中，需进行两步PCR反应进行定量。第一步PCR扩增引物为第一引物对；第二步PCR扩增引物为第二引物对。

在另一优选例中，所述荧光标记选自下组：异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)、甲基二氯羧基荧光素(JOE)、六氯甲基荧光素(HEX)、CY3、CY5、羧基四甲基若丹明(TAMRA)、ROX、Texas Red、LC RED640、LC RED705、或其组合。

在另一优选例中，所述第二引物对的上游引物和/或下游引物的5'端带有一个或多个荧光标记基团。

在另一优选例中，所述第二引物对的上游引物和/或下游引物带有2个以上荧光标记。

在另一优选例中，所述的引物含有多个荧光标记，其中至少一个荧光标记在5'端。

在另一优选例中，当一个引物含有2个以上的荧光标记时，所述任何荧光标记之间的距离差为2-40bp,较佳地，3-20bp，更佳地，4-15bp。

在另一优选例中，所述第一引物对与所述第二引物对的序列可以相同，可以不同。

在另一优选例中，所述第一引物对的浓度为0.5-25μM，较佳地，1-20μM，更佳地，2-10μM。

在另一优选例中，所述第二引物对的浓度为0.5-25μM，较佳地，1-20μM，更佳地，2-10μM。

在另一优选例中，步骤(e)中，当LA的荧光强度Y_La与LG的荧光强度Y_LG存在显著差异(例如，两者中最大荧光强度与最小荧光强度之比(即Max(Y_La，Y_LG)/Min(Y_La，Y_LG))≥1.2，较佳地≥1.3，最佳地≥1.4)时，则表明可检测出等位基因存在显著的差异表达。

在另一优选例中，所能检测到的待测样本中等位基因之间表达差异的比例为64：1至1:64或更大，较佳地为32：1至1：32，更佳地16：1至1：16。

在另一优选例中，所述待测样本来自动物、植物、细菌、病毒或任一物种。

在另一优选例中，所述待测样本来自动物(如人或非人哺乳动物)、或植物(如农作物、花卉植物、林业植物)。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、牛、猪、羊、马、狗、猫、非人灵长动物(如猴)。

在另一优选例中，所述的等位基因包括结构基因、调控基因、或其组合。

在另一优选例中，所述的等位基因包括蛋白编码基因、miRNA基因、或其组合。

在另一优选例中，所述等位基因选自下组：KIT、PLAG1、RRM2B、CPE、IGF1R、PAPPA2、或其组合。

在另一优选例中，所述等位基因选自下组：KIT、PLAG1、或其组合。

本发明第二方面提供了一种检测等位基因差异表达的试剂盒，包括：

(i)第一引物对，所述第一引物对用于扩增待测对应于等位基因的cDNA，从而获得第一扩增产物；

(ii)第二引物对，所述第二引物对带有可检测标记，用于扩增所述第一扩增产物，从而获得第二扩增产物；和

(iii)限制性内切酶；

其中，所述的等位基因包括野生型(或第一亚型)等位基因和突变型(或第二亚型)等位基因；

并且对应于所述野生型等位基因的扩增产物含有对应于所述限制性内切酶的酶切位点，而对应于所述突变型等位基因的扩增产物不含有所述酶切位点；或者对应于所述野生型等位基因的扩增产物不含有对应于所述限制性内切酶的酶切位点，而对应于所述突变型等位基因的扩增产物含有所述酶切位点。

在另一优选例中，所述的组分位于不同的容器中。

本发明第三方面提供了一种检测个体的等位基因的相对拷贝数的方法，所述方法包括步骤：

(a)提供一待测样本，所述样本为基因组DNA样品，并且所述样品中含有外源添加的对应于所述野生型等位基因的参比型等位基因，所述的参比型等位基因含有与所述野生型等位基因的核苷酸序列相比的碱基突变；

(b)以所述样品为模板，用第一引物对对所述待测样本的所述等位基因序列进行PCR扩增，从而获得第一扩增产物；

(e)对所述第二扩增产物LA和所述第二扩增产物LG进行分离；和

(f)测定所述第二扩增产物LA的可检测标记的数量M_LA与所述第二扩增产物LG的可检测标记的数量M_LG，从而检测个体的等位基因相对拷贝数。

在另一优选例中，所述碱基突变为1－8个碱基或1-6个碱基或1-4个碱基的突变。

在另一优选例中，所述的外源添加的对应于所述野生型等位基因的参比型等位基因位于质粒上。

在另一优选例中，所述的参比型等位基因在所述碱基突变处形成所述限制性内切酶的酶切位点。

在另一优选例中，所述的可检测标记包括荧光基团、化学发光基因、生色团、或其组合。

在另一优选例中，所述的可检测标记为荧光基团。

在另一优选例中，在步骤(f)中，测量所述第二扩增产物LA与所述第二扩增产物LG的荧光强度，并进行比较从而确定个体的等位基因的相对拷贝数。

在另一优选例中，对应于所述野生型等位基因的扩增产物不含有对应于所述限制性内切酶的酶切位点，而对应于所述参比型等位基因的扩增产物含有所述酶切位点。

在另一优选例中，所述参比型等位基因的扩增产物含有的所述酶切位点是人工引入的。

在另一优选例中，PCR反应终点进行定量。

本发明第四方面提供了一种检测等位基因相对拷贝数的试剂盒，包括：

(ii)第二引物对，所述第二引物对带有可检测标记，用于扩增所述第一扩增产物，从而获得第二扩增产物；

(iii)限制性内切酶；和

(iv)一构建物，所述构建物含有对应于所述野生型等位基因的参比型等位基因；

其中，所述的等位基因为野生型等位基因，而所述的参比型等位基因含有与所述野生型等位基因的核苷酸序列相比的碱基突变；

并且对应于所述野生型等位基因的扩增产物不含有对应于所述限制性内切酶的酶切位点，而对应于所述参比型等位基因的扩增产物含有所述酶切位点。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是本方法的原理图；

图2是本方法中检测的FAM荧光信号极限值。A图是FAM引物电泳图；B图是1xFAM引物线性关系图；C图是2xFAM引物线性关系图；D图是FAM引物浓度及对应的荧光信号强度分别取2为底的对数值；

图3是本方法中8种不同类型FAM荧光基团标记引物示意图；

图4是本方法中构建的模拟等位基因载体示意图；

图5是本方法中检测的8种不同类型引物荧光信号值；

图6是本方法中利用FP2.2引物检测14个单克隆菌落等位基因比值结果；

图7是本方法中构建的PMD19-T:PAPPA2(A)和PMD19-T:PAPPA2(G)载体示意图；

图8是本方法中检测等位基因差异表达线性范围。A图是电泳结果；B图是线性关系结果；C图是质粒PAPPA2-(A)和PAPPA2-(G)不同比值及对应的荧光信号强度值分别取以2为底的对数统计结果；

图9是本方法中检测的基因组DNA结果；

图10是本方法中PAPPA2-DNA酶切分型结果；

图11是本方法中检测的等位基因组织表达谱电泳图；

图12是本方法中检测的等位基因KIT、PLAG1、PAPPA2、IGF1R、CPE、RRM2B酶切电泳图及FAM荧光强度统计结果，P2表示完全酶切；

图13是本方法中检测的KIT和PLAG1基因组DNA没切电泳图及FAM荧光统计结果，P2表示完全酶切；

图14是本方法中用质粒检测基因相对拷贝数的灵敏性和准确性。A图是PMD19-T:GAPDH(mt)-SRY(mt)载体示意图；B图是酶切电泳结果；C图和D图是荧光强度及相对拷贝数结果；E图是线性关系；

图15是本方法中检测的大白猪雌性个体与雄性个体X染色体AR基因的相对拷贝数。A图是PMD19-T:GAPDH(mt)-AR(mt)载体示意图；B图是酶切电泳结果；C图是是荧光强度及相对拷贝数结果。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，首次开发了一种能够快速检测等位基因差异表达和基因拷贝数的新方法。本发明首次基于荧光基团标记引物策略扩增待测基因，利用限制性内切酶酶切的方法进行定量，并通过测定所述第二扩增产物LA的可检测标记的数量M_LA与所述第二扩增产物LG的可检测标记的数量M_LG，从而检测所述等位基因的差异表达，并且具有非常高的灵敏性和准确性。在此基础上，本发明人完成了本发明。

限制性内切酶

在本发明中，所述限制性内切酶没有特别限制，可以根据等位基因的序列差异，选择相应的针对该靶序列的限制性内切酶。此外，也可以基于等位基因的序列差异，选用经人工改造的从而识别该靶序列的限制性内切酶。

内参基因

在本发明中，所述的内参基因没有特别限制，可以选用表达相对稳定，也可以选用存在表达差异(甚至表达差异很大)的内参基因。代表性的例子包括(但并不限于)：GAPDH、肌动蛋白等。本发明方法的一个显著优点就是可以选用存在表达差异(甚至表达差异很大)的基因作为内参基因，并且即使该内参基因的表达差异很大或存在表达波动，也不会对检测结果造成实质性的干扰。

检测等位基因差异表达的方法

本发明提供了一种检测等位基因差异表达的方法，包括：

(a)提供一待测样本，所述样本为等位基因cDNA样品；

(d)在限制性内切酶的作用下，对步骤(c)获得的第二扩增产物进行酶切，其中，当所述第二扩增产物不含有所述限制性内切酶的酶切位点时，形成未经酶切且带有所述的可检测标记的第二扩增产物LA；当所述第二扩增产物含有所述限制性内切酶的酶切位点时，形成经酶切的且带有所述的可检测标记的第二扩增产物LG，其中所述的第二扩增产物LA的长度L1不同于所述第二扩增产物LG的长度L2；和

(e)对所述第二扩增产物LA和所述第二扩增产物LG进行分离；和

具体地，在一优选实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(1)检测FAM荧光信号极限值

合成两条FAM荧光标记引物，其中一条引物做5’端FAM荧光标记，定义为1xFAM引物；另一条做5’端和中间FAM荧光标记，定义为2xFAM引物；将两条引物稀释至终浓度为10uM，按照1xFAM:(1/320～16)ul x10uM,2xFAM:(1/640～16)x10uM的量上样电泳检测,并读取每个条带的灰度值进行线性分析。结果表明1x FAM荧光信号极限值所对应的引物范围为(1/320～16)倍；2xFAM荧光信号极限值所对应的引物范围为(1/640～16)倍，均具有较好的线性关系，且未检测到最大荧光强度值。

(2)检测不同类型FAM荧光基团标记引物荧光信号强度

构建PMD19-T：GAPDH(wt)-GAPDH(mt)载体，使GAPDH(wt)和GAPDH(mt)具有相同的分子数。设计并合成不同类型FAM荧光标记引物，通过PCR扩增PMD19-T:GAPDH(wt)-GAPDH(mt)载体、酶切、电泳检测GAPDH(wt)和GAPDH(mt)的荧光强度，最后选择信号最强的FAM荧光标记引物。结果表明引物FP2.1，FP2.2，FP2.5荧光强度较强，优选信号最强引物FP2.1。

(3)检测等位基因差异表达线性范围

分别构建载体PMD19-T:PAPPA2(A)和PMD19-T:PAPPA2(G),按照(A):(G)＝32:1，16:1，8:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:8，1:16，1:32进行混合，用FAM荧光标记引物分别进行PCR扩增、酶切、电泳检测PAPPA2(A)和PAPPA2(G)的荧光强度，进行线性分析。结果表明本方法可准确检测出等位基因差异表达倍数为(A):(G)＝32:1～1:32。

(4)等位基因基因组DNA检测

FAM荧光标记引物扩增基因组DNA，检测等位基因PAPPA2(A/G)和miR-155(T/C)的荧光强度比值。结果表明PAPPA2和miR-155的等位基因荧光强度比值接近于1，表现为不差异，与理论值相符。

本发明的检测等位基因差异表达的应用

本发明的检测等位基因差异表达的方法可以应用到如下两个方面：

(1)等位基因差异表达验证

将成年猪(大白猪×恩施黑猪)以及95天胚胎(大白猪×梅山)肌肉、脂肪、脾脏、肝脏、脑等组织进行转录组测序，基于RNA-seq数据筛选出的一些可能存在差异表达的等位基因，分别设计各自FAM荧光标记引物，进行PCR扩增、酶切、电泳检测各自等位基因的荧光强度比值。最后本方法成功检测出等位基因KIT、PLAG1、RRM2B、CPE、IGF1R表达存在差异。

(2)检测基因相对拷贝数

选择X染色体基因AR为待测基因，常染色体基因GAPDH作为内参基因，检测AR基因在大白猪雌性个体中相对于雄性个体中的拷贝数。构建PMD19-T:GAPDH(mt)-AR(mt)载体，设计基因AR和GAPDH的FAM荧光标记引物，通过PCR扩增、酶切、电泳检测荧光强度。最终用本方法成功检测出X染色体上AR基因在雌性个体中的拷贝数相对于雄性个体为2倍，与理论值相符。

用于检测等位基因差异表达的试剂盒

在本发明中，还提供了一种用于检测等位基因差异表达的试剂盒，其包括：

(iii)限制性内切酶；

检测个体的等位基因的相对拷贝数的方法

本发明还提供了一种检测个体的等位基因的相对拷贝数的方法，所述方法包括步骤：

(e)对所述第二扩增产物LA和所述第二扩增产物LG进行分离；和

检测等位基因相对拷贝数的试剂盒

本发明还提供了一种检测等位基因相对拷贝数的试剂盒，包括：

(iii)限制性内切酶；和

并且对应于所述野生型等位基因的扩增产物含有对应于所述限制性内切酶的酶切位点，而对应于所述参比型等位基因的扩增产物不含有所述酶切位点；或者对应于所述野生型等位基因的扩增产物不含有对应于所述限制性内切酶的酶切位点，而对应于所述参比型等位基因的扩增产物含有所述酶切位点。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次公开了一种快速检测等位基因差异表达和基因相对拷贝数的新方法，该方法主要进行PCR、酶切和电泳三个步骤即可，操作非常简单。

(2)本发明提供的新方法所用到的荧光基团选择广泛，根据实验需求选择合适的荧光基团修饰引物即可，可塑性高。

(3)本发明公开了几种荧光信号强度较强的荧光基团标记引物设计方法，非常具有实用性。

(4)本发明提供了在用FAM荧光基团标记引物时，可检测到的等位基因差异表达最大倍数为32倍，且准确性较高。

(5)本发明提供的新方法中所用到的FAM荧光标记引物，其每管引物量可满足于检测一个小型群体的样本数，成本相对较低。

(6)本发明公开的新方法主要实验技术手段是基于PCR扩增，故没有物种限制，仅提供RNA样品即可，可检测任意物种、任意组织。

(7)本发明首次次基于荧光基团标记引物策略扩增待测基因，利用限制性内切酶酶切的方法进行定量，并通过比较未经酶切的第二扩增序列LA与经酶切的第二扩增序列LG的荧光强度比值，从而检测等位基因的差异表达。

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非有特别说明，否则实施例所用的材料均为市售产品。

实施例1设计检测等位基因差异表达新方法的流程图

为了更加详细的呈现本发明的原理，设计并绘制出一个简易流程图，以供参考和理解。主要包括四个步骤：第一步，用基因特异引物进行PCR扩增，扩增循环数根据基因表达高低设定；第二步，用FAM荧光基团标记引物扩增第一步的PCR产物，扩增循环数设定为1；第三步，用相应的限制性内切酶酶切第二步的PCR产物；第四步，琼脂糖凝胶电泳检测及灰度值分析。其流程图如图1所示。

实施例2检测FAM荧光信号极限值

为了考察该方法的灵敏度，需检测FAM荧光信号强度所能达到的最大值和最小值，且在最大值和最小值间存在较好的线性关系。因此，设计两条FAM荧光标记引物，并送至Invitrogen公司合成。其中一条引物只做5’端FAM荧光标记，定义为1xFAM引物；另一条做5’端和中间FAM荧光标记，定义为2xFAM引物,引物序列分别为1xFAM:A_FAMCTCGTCCTTCTTTCCCAGGTGT(SEQ ID NO.:1),2xFAM:A_FAMTCTAGT_FAMACACTCGTCCTTCTTTCCCAGGTGT(SEQ ID NO.:2)；将引物稀释至终浓度为10uM，按照

1x FAM:(1/320，1/160，1/80，1/40，1/20，1/10，1/5，1，2，4，8，16)ul x10uM,

2x FAM:(1/640，1/320，1/160，1/80，1/40，1/20，1/10，1/5，1，2，4，8，16)ul x10uM的量上样电泳,其上样缓冲液6xloading buffer(Takara，9156)不需要加任何荧光染料，电泳缓冲液1xTAE需及时更换，保持干净。然后用荧光影像扫描分析仪(FUJIFILM,FLA-5100)检测电泳条带，电压设定为500v，最后用图像处理软件MultiGauge软件读取每个条带的灰度值进行线性分析。结果表明1x FAM的荧光信号极限值所对应的引物量范围为(1/320～16)倍，2x FAM的荧光信号极限值所对应的引物量范围为(1/640～16)倍，且均具有较好线性关系，并未检测到最大荧光信号值。如图2所示。

实施例3检测不同类型FAM荧光基团标记引物荧光信号强度

1)设计8种不同类型FAM荧光标记引物，并送至Invitrogen公司合成。8种类型引物分别命名为FP1.1、FP1.2、FP2.1、FP2.2、FP2.3、FP2.4、FP2.5、FP2.6，如图3所示。

a.FP1.1(G_FAMGAGCCTTCCTCTTCACCTGCCGCAGATACACAGC(SEQ ID NO.:3)):只做5’端FAM荧光标记，且引物序列与目标基因序列完全互补配对；

b.FP1.2(A_FAMTCTAGTACGGAGCCTTCCTCTTCACCTGCCGCAGATACACAGC(SEQ ID NO.:4)):引物序列除了与目标基因完全互补配对外，在5’端另加一段游离序列,并在游离序列的5’端做FAM荧光标记；

c.FP2.1(G_FAMGAGCCT_FAMTCCTCTTCACCTGCCGCAGATACACAGC(SEQ ID NO.:5)):做5’端和中间FAM荧光标记，两个FAM荧光标记的碱基间隔5个核苷酸，且引物序列与目标基因序列完全互补配对；

d.FP2.2(A_FAMTCTAGT_FAMACGGAGCCTTCCTCTTCACCTGCCGCAGATACACAGC(SEQ ID NO.:4)):引物序列除了与目标基因完全互补配对外，在5’端另加一段游离序列，并在游离序列做5’端和中间FAM荧光标记，两个FAM荧光标记的碱基间隔5个核苷酸；

e.FP2.3(G_FAMGAGCCT_FAMGTTCCTCTTCACCTGCCGCAGATACACAGC(SEQ ID NO.:6)):做5’端和中间FAM荧光标记，两个FAM荧光标记的碱基间隔5个核苷酸，其中间FAM修饰碱基及相邻一个碱基为另外***，不与目标基因序列互补配对，使其中间FAM修饰碱基在引物退火时形成凸起状，其余引物序列与目标基因序列完全互补配对；

f.FP2.4(G_FAMGAGCCTTCCTCT_FAMTCACCTGCCGCAGATACACAGC(SEQ ID NO.:7)):做5’端和中间FAM荧光标记，两个FAM荧光标记的碱基间隔11个核苷酸，且引物序列与目标基因序列完全互补配对；

g.FP2.5(A_FAMTCTAGCTACATT_FAMACGGAGCCTTCCTCTTCACCTGCCGCAGATACACAGC(SEQ IDNO.:8)):引物序列除了与目标基因完全互补配对外，在5’端另加一段游离序列，并在游离序列做5’端和中间FAM荧光标记，两个FAM荧光标记的碱基间隔11个核苷酸；

h.FP2.6(G_FAMGAGCCTTCCTGT_FAMGCTTCACCTGCCGCAGATACACAGC(SEQ ID NO.:9)):做5’端和中间FAM荧光标记，两个FAM荧光标记的碱基间隔11个核苷酸，其中间FAM修饰碱基及相邻两个碱基为另外***，不与目标基因序列互补配对，使其中间FAM修饰碱基在引物退火时形成凸起状，其余引物序列与目标基因序列完全互补配对。

2)构建PMD19-T:GAPDH(wt)-GAPDH(mt)载体，使等位基因串联在同一个载体上，即具有相同的拷贝数，如图4所示。并利用上述不同类型FAM荧光标记引物进行PCR扩增、酶切、电泳，最后检测GAPDH(wt)和GAPDH(mt)荧光强度及比值。主要步骤为：

a.构建PMD19-T:GAPDH(wt)载体。设计GAPDH基因特异扩增引物，送至武汉奥科鼎盛生物科技有限公司合成，引物序列为：GAPDH-DNA-2139-F:CCACAAGGGTTCGAGGACTG(SEQID NO.:10)，

GAPDH-DNA-2139-R:TGATGGCGACAATGTCCACT(SEQ ID NO.:11)。

用猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增。具体体系及反应条件如下：

PCR反应体系(总体积)为50μL：

PCR反应条件：

95℃5min；(95℃30s，65℃30s，72℃2min)*35循环；72℃5min；15℃2min。

制备2％琼脂糖凝胶电泳，然后用DNA凝胶回收试剂盒(Takara，9762)纯化目的片段，最后连接到PMD19-T载体，连接体系如下：

然后转化、涂板和挑取单克隆菌落扩大培养，最后进行PCR和测序鉴定。

b.构建PMD19-T:GAPDH(wt)-GAPDH(mt)载体设计GAPDH点突变引物用来引入酶切位点KpnI，引物序列为：

GAPDH-Fusion-5’-F:GTGAATTCGAGCTCGCCACAAGGGTTCGAGGAC(SEQ ID NO.:12),

GAPDH-Fusion-5’-R:GGAAAATTTCTAGGTACCCATGACTCAGCTCC(SEQ ID NO.:13),

GAPDH-Fusion-3’-F:ACCTAGAAATTTTCCACAAAATGGCTCCCGGAGC(SEQ ID NO.:14),

GAPDH-Fusion-3’-R:GATCTCTAGAGGATCTGATGGCGACAATGTCCAC(SEQ ID NO.:15)；

用点突变引物扩增PMD19-T:GAPDH(WT)以制备GAPDH(mt)序列，GAPDH(mt)序列中含有引入的酶切位点KpnI，通过In-Fusion克隆(Takara，638909)制备PMD19-T:GAPDH(wt)-GAPDH(mt)载体。具体体系及反应条件如下：

PCR反应体系(总体积)为100μL：

10×LA PCR Buffer II(Mg<sup>2+</sup>Plus)	10ul	10×LA PCR Buffer II(Mg<sup>2+</sup>Plus)	10ul
				dNTP Mixture(各2.5mM)	8ul	dNTP Mixture(各2.5mM)	8ul
GAPDH-Fusion-5’-F(10μM)	2ul	GAPDH-Fusion-3’-F(10μM)	2ul
				GAPDH-Fusion-5’-R(10μM)	2ul	GAPDH-Fusion-3’-R(10μM)	2ul
LATaq酶(5U/μL)	1ul	LATaq酶(5U/μL)	1ul
				PMD19-T:GAPDH(wt)质粒	10ng	PMD19-T:GAPDH(wt)质粒	10ng
补水至100ul		补水至100ul

PCR反应条件：

95℃5min；(95℃30s，60℃30s，72℃1min)*35循环；72℃5min；15℃2min。

制备2％琼脂糖凝胶电泳，然后用DNA凝胶回收试剂盒(Takara，9762)纯化目的片段。通过In-Fusion克隆到线性化的PMD19-T:GAPDH(wt)。体系如下：

50℃反应15min后，将上述10ul产物全部用于转化、涂板和挑取单克隆菌落扩大培养，最后进行PCR鉴定。

3)检测不同FAM荧光标记引物信号强度及GAPDH(wt)与GAPDH(mt)的荧光强度比值。用上述合成的8种不同类型的FAM荧光标记引物扩增PMD19-T:GAPDH(wt)-GAPDH(mt)质粒，然后酶切、电泳，检测GAPDH(wt)与GAPDH(mt)荧光强度。步骤如下：

a.设计和合成扩增PMD19-T:GAPDH(wt)-GAPDH(mt)载体的非荧光标记引物

GAPDH-plasmid-t-769-F:tGGAGCCTTCCTCTTCACCTG(SEQ ID NO.:16),

GAPDH-plasmid-769-R:GCCTTTAGGGTGGGGTCAAC(SEQ ID NO.:17),

GAPDH-plasmid-732-R:GGAAGCAGCTTCAAGGAGCACTG(SEQ ID NO.:18)，

进行第一步PCR扩增。具体体系及反应条件如下：

PCR反应体系(总体积)为50μL(8个重复)：

PCR反应条件：

95℃5min；(95℃30s，60℃30s，72℃40s)*35循环；72℃5min；15℃2min。

b.用8种不同FAM荧光标记引物进行第二步PCR扩增，模板为第一步8个重复PCR扩增产物的混合物。具体体系及反应条件如下：

PCR反应体系(总体积)为50μL(避光)：

2xPremix Taq 50ul

8种不同FAM修饰引物(10μM) 2ul

第一步PCR扩增产物 23ul

PCR反应条件：

95℃5min；(95℃30s，60℃30s，72℃40s)*1循环；72℃5min；15℃2min。

c.将第二步PCR扩增产物进行酶切。体系如下：

酶切体系(总体积)为30ul：

制备2％普通琼脂糖凝胶，更换新鲜的1xTAE电泳缓冲液，每个酶切体系中加入7ul未加核酸染料的6xloading buffer，总体积共37ul，全部上样电泳。用荧光影像扫描分析仪(FUJIFILM，FLA-5100)检测电泳条带，电压设定为500v，并用图像处理软件MultiGauge读取每个条带的灰度值进行线性分析。结果显示引物FP2.1，FP2.2，FP2.5荧光信号强度相对较强，且GAPDH(wt)和GAPDH(mt)荧光强度比值都将近为1，与理论值相符。最后，本发明选择引物FP2.2用于后续实验。如图5所示。

然后将下游特异扩增引物GAPDH-plasmid-769-R更换为GAPDH-plasmid-732-R，FAM荧光标记引物不变，重复上述实验步骤，得到相同的试验结果，即FP2.1，FP2.2，FP2.5荧光信号强度相对较强，且GAPDH(wt)和GAPDH(mt)灰度值的比值都将近为1。如图5所示。

4)与PMD19-T:GAPDH(wt)-GAPDH(mt)载体类似，构建PMD19-T:SRY(wt)-SRY(mt)载体，所用的基因特异扩增引物为SRY-DNA-1610-F:CTATAACATCCGCCGCCTGG(SEQ IDNO.:19),SRY-DNA-1610-R:CATGCTCCCCAGCACTACA(SEQ ID NO.:20)。点突变引物为

SRY-Fusion-5’-F:GTGAATTCGAGCTCGCTATAACATCCGCCGCCT(SEQ ID NO.:21),

SRY-Fusion-5’-R:TTCCACTTGGATCCCAGCCACTTGCTGATCTCTG(SEQ ID NO.:22)；

SRY-Fusion-3’-F:GGGATCCAAGTGGAAAATGCTTACAGAAGCCGAA(SEQ ID NO.:23),

SRY-Fusion-3’-R:GATCTCTAGAGGATCCATGCTCCCCAGCACTAC(SEQ ID NO.:24)，

扩增PMD19-T:SRY(wt)-SRY(mt)载体的非荧光标记引物为

SRY-plasmid-t-691-F:AGCAGAGCCTTCAGCAACTC(SEQ ID NO.:25)

SRY-plasmid-691-R:CTTGCGACGAGGTCGGTATT(SEQ ID NO.:26)，引入的酶切位点为BamHI。同样体外模拟等位基因，使其具有相同的拷贝数，具体方法与构建PMD19-T:GAPDH(wt)-GAPDH(mt)载体一致。将上述两种等位基因GAPDH(wt)/(mt)和SRY(wt)/(mt)分别挑取7个单克隆菌落，扩大培养，提取质粒(Takara，9760)，并用FAM荧光标记引物GAPDH-FP2.2-F:A_FAMTCTAGT_FAMACGGAGCCTTCCTCTTCACCTGCCGCAGATACACAGC(SEQ ID NO.:4)和SRY-FP2.2-F:A_FAMTCT_FAMAGTACAGCAGAGCCTTCAGCAACTCGGATTA(SEQ ID NO.:27)

GACCTAG分别进行PCR扩增，检测等位基因荧光强度比值。结果显示，扩增的14个单克隆菌落，其等位基因荧光强度比值都将近为1，并与理论值相符。如图6所示。

实施例4检测等位基因差异表达线性范围

为了考察本发明能检测到的等位基因差异表达最大倍数，我们将等位基因PAPPA2(A)和PAPPA2(G)分别连接到PMD19-T载体，如图7所示。分别抽提质粒，并按照(A):(G)＝32:1，16:1，8:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:8，1:16，1:32进行混合，并用FP2.2荧光标记引物分别进行PCR扩增、酶切、电泳，然后检测PAPPA2(A)和PAPPA2(G)的灰度值，进行线性分析。具体步骤如下：

1)设计和合成扩增PAPPA2基因的非荧光标记引物，序列为PAPPA2-cDNA-t-654-F:tGACAGAACAGCCCAGCCATC(SEQ ID NO.:28),PAPPA2-cDNA-654-R:CCCGTTGTACTGGGAGATCA(SEQ ID NO.:29)。

以猪的cDNA为模板进行PCR扩增，然后切胶纯化、连接、转化，最终得到PMD19-T:PAPPA2(A)和PMD19-T:PAPPA2(G)质粒。

2)合成FAM荧光标记引物

FAM荧光标记引物序列为PAPPA2-FP2.2-F:A_FAMTCTAGT_FAMACGACAGAACAGCCCAGCCATCATTGCAGGTGTGTT(SEQ ID NO.:30)。将质粒PMD19-T:PAPPA2(A)和PMD19-T:PAPPA2(G)浓度稀释到1ng/ul，按照(A):(G)＝32:1，16:1，8:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:8，1:16，1:32进行混合，用PAPPA2-FP2.2-F进行PCR扩增，具体操作步骤同实施例3。结果显示本发明可准确检测到的等位基因差异表达最大倍数为32倍，且(A):(G)在(32:1～1:32)范围内具有较好的线性关系，R²＝0.9961。如图8所示。

实施例5等位基因基因组DNA检测

为了考察本发明在检测等位基因基因组DNA时，其等位基因的荧光强度比值是否为理论值1。选择等位基因PAPPA2和miR-155进行验证。具体步骤为：

1)设计和合成非荧光标记引物，引物序列为

PAPPA2-DNA-t-622-F:tACTCGTCCTTCTTTCCCAGG(SEQ ID NO.:31),PAPPA2-DNA-622-R:CCACATTGTCACAAGCCGTT(SEQ ID NO.:32)；Mir-155-DNA-t-478-F:tGGTCTCCCCTCTGCGTTTTA(SEQ ID NO.:33),

Mir-155-DNA-478-R:ATGTAGGAGTCAGACGGAGGT(SEQ ID NO.:34)。

分别扩增恩施黑猪x大白猪杂交后代F1群体基因组DNA，酶切检测杂合子个体。

2)用FAM荧光标记引物扩增上述检测到的杂合子个体，方法同实施例3。序列分别为PAPPA2-FP2.2-F:A_FAMTCTAGT_FAMACACTCGTCCTTCTTTCCCA(SEQ ID NO.:35)

GGTGT；Mir-FP-F:A_FAMTCTAGT_FAMACGGTCTCCCCTCTGCGTTTTAGCATTTGG(SEQ ID NO.:36)。结果显示PAPPA2和miR-155的等位基因灰度值比值都将近1，即扩增等位基因基因组DNA时，表现为不差异，与理论值相符。如图9所示。

3)为了进一步证实步骤2)中结果的可靠性，将PAPPA2杂合个体cDNA重新扩增PCR，与FAM荧光标记引物扩增PCR步骤相同，第二步PCR时将FAM荧光标记引物换成非荧光标记引物。然后纯化回收、连接PMD19-T、转化、涂板、最终挑取96个单克隆菌落扩大培养，然后进行PCR检测、酶切分型，统计等位基因克隆数。统计结果显示AA基因型有39个克隆，GG基因型有37个克隆，其余克隆无法确定基因型，AA:GG＝1.05。如图10所示。

4)将PAPPA2基因特异扩增引物PAPPA2-DNA-622-R换成PAPPA2-DNA-629-R，其他条件不变，重复步骤2)和3)，得到了相似的结果。如图10所示。

实施例6等位基因差异表达验证

将成年猪(恩施黑猪x大白猪)肌肉组织和脂肪组织进行转录组测序，基于RNA-seq数据筛选出的一些可能存在差异表达的等位基因，有PLAG1,KIT,RRM2B、CPE、IGF1R、PAPPA2分别设计各自FAM荧光标记引物，检测各自等位基因的荧光强度比值。基因非荧光标记引物、限制性内切酶及退火温度为：

PLAG1(HpyCH4V):60℃

PLAG1-466-2F:AGCGCATTCTTCCGTGTCTC(SEQ ID NO.:37)

PLAG1-466-t-2R:tAAGGAAGCTGAACACCGACT(SEQ ID NO.:38)

KIT(TaiI):58℃

KIT-396-t-F:tGGAGAAAGCAGAGGCCATGA(SEQ ID NO.:39)

KIT-396-R:ACAGCCACAACAGGTACAGC(SEQ ID NO.:40)

RRM2B(AflII):60℃

RRM2B-794-F:TCCTAGTTCGAGGTGGCTTG(SEQ ID NO.:58)

RRM2B-794-t-R:tCCAGGTACTGAAACATGAGGCA(SEQ ID NO.:59)

CPE(NlaIII):60℃

CPE-207-F:CTGCCGCAAGAACGACGAT(SEQ ID NO.:60)

CPE-207-t-R:tCTGCCTCATTTTAATGGATGAGC(SEQ ID NO.:61)

IGF1R(AluI):60℃

IGF1R-189-F:GCCTGGCATTCTACTGCATGGGCTGAAGCCCTGGACACAGTAAGC(SEQ ID NO.:62)

IGF1R-189-t-R:tTGAGAAGAGGAGTTTGATGCTGAGA(SEQ ID NO.:63)

PAPPA2(MscI):60℃

PAPPA2-227-F:CTTCGTGAGCCCCCTTTTGCCAGTGGCTGGCC(SEQ ID NO.:64)

PAPPA2-227-t-R:tCCATCATCACACTCTTCTCCAAGGC(SEQ ID NO.:65)

荧光标记引物为：

PLAG1-FP2.2-R:A_FAMTCTAGT_FAMACAAGGAAGCTGAACACCGACTCTGTAAGACT(SEQ ID NO.:41)

KIT-FP2.2-F:A_FAMTCTAGT_FAMACGGAGAAAGCAGAGGCCATGAATACAGG(SEQ ID NO.:42)

IGF1R-FP2.2-R:A_FAMTCTAGT_FAMACTGAGAAGAGGAGTTTGATGCTGAGAGGACATCCAGG(SEQID NO.:66)

PAPPA2-FP2.2-R:A_FAMTCTAGT_FAMACCCATCATCACACTCTTCTCCAAGGCTCCTTGCAACC(SEQID NO.:67)

RRM2B-FP2.2-R:A_FAMTCTAGT_FAMACCCAGGTACTGAAACATGAGGCAAGCAAAGTCACAG(SEQ IDNO.:68)

CPE-FP2.2-F:A_FAMTCTAGT_FAMACCTGCCTCATTTTAATGGATGAGCTATAGGTTCAGAC(SEQ IDNO.:69)

具体过程如下：

1)RNA提取。Trizol裂解法提取成年猪(恩施黑猪x大白猪)组织RNA，包括心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪、大脑、下丘脑、垂体，共10个组织。提取方法见TransZolUp(TransGen，ET111)说明书。

2)反转录。将上述提取的RNA按照PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNAEraser(Takara，RR047A)试剂盒进行反转录，并用GAPDH引物检测cDNA质量。

3)组织表达谱，酶切分型。用上面所述的基因非荧光标记引物和限制性内切酶进行组织表达谱验证和酶切分型。结果如图11所示。

4)FAM荧光标记引物检测等位基因差异表达。具体步骤与实施例3一致。检测结果显示KIT、PLAG1、RRM2B、IGF1R、CPE、PAPPA2等位基因存在差异表达现象。这与RNA-seq结果一致，说明本发明具有一定的准确性。如图12所示。

5)扩增基因组DNA，检测KIT和PLAG1等位基因荧光强度比值是否为1。

6)设计和合成非荧光标记引物，序列为：

KIT-DNA-746-F:TCGTCGACCCTCCCTTGTAT(SEQ ID NO.:43)

KIT-DNA-746-t-R:tTGCTGCGTGAATAACGAGGT；(SEQ ID NO.:44)

PLAG1-DNA-466-2F:AGCGCATTCTTCCGTGTCTC(SEQ ID NO.:37)

PLAG1-DNA-466-t-2R:tAAGGAAGCTGAACACCGACT；(SEQ ID NO.:38)

以DNA为模板进行PCR扩增、酶切分型，挑选出杂合个体。再用FAM荧光标记引物

KIT-DNA-FP2.2-R:A_FAMTCTAGT_FAMACTGCTGCGTGAATAACGAGGTTCACTGTCAGCTGGT；(SEQID NO.:45)

PLAG1-FP2.2-R:A_FAMTCTAGT_FAMACAAGGAAGCTGAACACCGACTCTGTAAGACT(SEQ ID NO.:46)扩增酶切分型检测出的杂合子个体，具体步骤与实施例3一致。结果显示两个等位基因的比值接近于1，故用该方法检测的KIT和PLAG1存在等位基因差异表达现象不是由于基因组DNA变异导致。如图13所示。

实施例7基因相对拷贝数检测

为了验证本发明是否适用于检测基因相对拷贝数，选择X染色体基因AR为待测基因，常染色体基因GAPDH作为内参基因，检测大白猪雌性个体与雄性个体的相对拷贝数。

1)用质粒验证检测基因相对拷贝数的灵敏性和准确性

准备PMD19-T:GAPDH(mt)-SRY(mt)、PMD19-T:GAPDH(wt)和PMD19-T:SRY(wt)载体，为了体外模拟等位基因以检测相对拷贝数，将三个载体按照不同比例混合，形成等比体系。

a.构建载体。其中PMD19-T:GAPDH(wt)和PMD19-T:SRY(wt)载体构建见实施例3。

只需构建PMD19-T:GAPDH(mt)-SRY(mt)载体。将PMD19-T:SRY(mt)载体用限制性内切酶KpnI(Takara，1618)和BamHI(Takara，1605)双酶切，体系如下：

37℃水浴3h，电泳切胶纯化目的条带。

用引物GAPDH(mt)-KpnI-F:ATGGGTACCGGAGCCTTCCTCTTCACCT，(SEQ ID NO.:47)

GAPDH(mt)-BamHI-R:ATGGGATCCTGATGGCGACAATGTCCACT，(SEQ ID NO.:48)

扩增PMD19-T:GAPDH(mt)质粒，得到GAPDH(mt)片段。纯化回收后同样用限制性内切酶KpnI和BamHI进行双酶切，体系如下：

37℃水浴3h，电泳切胶回收目的条带。最后将两个纯化回收的酶切片段进行连接，体系如下：

16℃连接2h，转化、涂板、挑克隆、PCR验证、测序确定，最终得到PMD19-T:GAPDH(mt)-SRY(mt)载体。如图14所示。

b.将PMD19-T:GAPDH(mt)-SRY(mt)载体(简称G(mt)-S(mt))、PMD19-T:GAPDH(wt)

载体(简称G(wt))和PMD19-T:SRY(wt)载体(简称S(wt))浓度均稀释至1ng/ul，并按照如下两种方式进行混合，一种是G(wt):S(wt):G(mt)-S(mt)＝1:1:1，2:2:2，4:4:4，8:8:8；另一种是G(wt):S(wt):G(mt)-S(mt)＝2:1:(1,2,4,8,16)，4:1:(1,2,4,8,16)，8:1:(1,2,4,8,16)，16:1:(1,2,4,8,16)，32:1:(1,2,4,8,16)。用实施例3中的引物GAPDH-plasmid-t-769-F/769-R和SRY-plasmid-t-691-F/691-R分别扩增上述混合体系，进行第一步PCR扩增，然后用实施例3中的FAM荧光标记引物GAPDH-FP2.2-F和SRY-FP2.2-F分别扩增第一步PCR产物，得到FAM荧光标记的产物，再分别用限制性内切酶KpnI和BamHI酶切各自等位基因，电泳检测荧光强度比值，最后选择等位基因比值接近于1的体系进行相对拷贝数的计算。如图15所示。结果显示G(wt):S(wt)为1，2，4，8，16，32(G/S,2G/S,4G/S,8G/S,16G/S,32G/S)时，其对应的数值分别为1.19，2.22，5.50，11.06，23.01，46.10。将上述数值进行标准化后，分别取以2为底的对数进行线性分析，分析结果呈现较好的线性关系，且R²＝0.9989，如图14所示。说明本发明可准确检测出基因的相对拷贝数，且具有较高的灵敏性和准确性。

2)检测大白猪雌性个体与雄性个体X染色体AR基因的相对拷贝数，以常染色体GAPDH基因做内参。

a.构建PMD19-T:AR(mt)-GAPDH(mt)载体。用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切PMD19-T:GAPDH(mt)载体，体系如下：

37℃水浴3h，电泳切胶回收目的条带。用引物AR-2247-F:AGCAGGTATGTGTGTGTGGAG(SEQ ID NO.:49)，AR-2247-R:TGCACGATCAGTTTGGGCTA(SEQ ID NO.:50)扩增大白猪基因组DNA，得到AR基因片段，克隆到PMD19-T载体上，获得PMD19-T:AR(wt)载体，***片段长度为2247bp。设计AR点突变引物用来引入酶切位点MluI(Takra，1619)，引物序列为：

AR-Fusion-5’-F:AAAACGACGGCCAGTGAATTAGCAGGTATGTGTGTGTGGAGG(SEQ ID NO.:51)

AR-Fusion-5’-R:TAGACAGTGCCAACGCGTAATGAGCTCACC(SEQ ID NO.:52)

AR-Fusion-3’-F:TTACGCGTTGGCACTGTCTATTATAGTTCACAGAT(SEQ ID NO.:53)

AR-Fusion-3’-F:TTGTGGATCTCTAGAGGATCCCATTCTCTGCCCAATCTTGC(SEQ ID NO.:54)

用AR点突变引物扩增PMD19-T:AR(wt)以制备AR(mt)序列，AR(mt)序列中含有引入的酶切位点MluI，通过In-Fusion克隆(Takara,638909)制备PMD19-T:GAPDH(mt)-AR(mt)载体。具体体系及反应条件与实施例3相同。

b.选择大白猪雌雄个体各4只，提取基因组DNA，测定浓度，并将每个个体DNA浓度稀释至50ng/ul左右。将PMD19-T:AR(mt)-GAPDH(mt)质粒浓度稀释至1ng/ul，再逐渐稀释至(10^-2,10^-3,10^-4)x1ng/ul，并分别与雌性个体DNA(50ng/ul)等体积混匀作为PCR扩增模板。第一步PCR扩增所用引物为非荧光标记引物GAPDH-plasmid-t-769-F/769-R(见实施例3)和AR-562-t-F:GCCATGAGATCCTGCTGTG(SEQ ID NO.:55),

AR-562-R:CGATCCCTGATCCC(SEQ ID NO.:56)

TATTGC；第二步PCR引物为GAPDH-FP2.2-F和AR-FP2.2-F:A_FAMTCTAGT_FAMACGCCATGAGATCCTGCTGTGTAGCACTGAG(SEQ ID NO.:57)。具体操作过程与前面所述一致。检测结果显示AR基因在雌性个体相对于雄性个体拷贝数分别为1.86，2.10，1.80，2.02，四组数值均非常接近于理论值2，故该方法可成功检测个体基因间的相对拷贝数。如图15所示。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种检测等位基因差异表达的方法

<130> P2017-1403

<160> 69

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

actcgtcctt ctttcccagg tgt 23

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

atctagtaca ctcgtccttc tttcccaggt gt 32

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

ggagccttcc tcttcacctg ccgcagatac acagc 35

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

atctagtacg gagccttcct cttcacctgc cgcagataca cagc 44

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

ggagccttcc tcttcacctg ccgcagatac acagc 35

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

ggagcctgtt cctcttcacc tgccgcagat acacagc 37

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

ggagccttcc tcttcacctg ccgcagatac acagc 35

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

atctagctac attacggagc cttcctcttc acctgccgca gatacacagc 50

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

ggagccttcc tgtgcttcac ctgccgcaga tacacagc 38

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

ccacaagggt tcgaggactg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

tgatggcgac aatgtccact 20

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

gtgaattcga gctcgccaca agggttcgag gac 33

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

ggaaaatttc taggtaccca tgactcagct cc 32

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

acctagaaat tttccacaaa atggctcccg gagc 34

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

gatctctaga ggatctgatg gcgacaatgt ccac 34

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

tggagccttc ctcttcacct g 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

gcctttaggg tggggtcaac 20

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

ggaagcagct tcaaggagca ctg 23

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

ctataacatc cgccgcctgg 20

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 20

catgctcccc agcactaca 19

<210> 21

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 21

gtgaattcga gctcgctata acatccgccg cct 33

<210> 22

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 22

ttccacttgg atcccagcca cttgctgatc tctg 34

<210> 23

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 23

gggatccaag tggaaaatgc ttacagaagc cgaa 34

<210> 24

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 24

gatctctaga ggatccatgc tccccagcac tac 33

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 25

agcagagcct tcagcaactc 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 26

cttgcgacga ggtcggtatt 20

<210> 27

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 27

atctagtaca gcagagcctt cagcaactcg gatta 35

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 28

tgacagaaca gcccagccat c 21

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 29

cccgttgtac tgggagatca 20

<210> 30

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 30

atctagtacg acagaacagc ccagccatca ttgcaggtgt gtt 43

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 31

tactcgtcct tctttcccag g 21

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 32

ccacattgtc acaagccgtt 20

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 33

tggtctcccc tctgcgtttt a 21

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 34

atgtaggagt cagacggagg t 21

<210> 35

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 35

atctagtaca ctcgtccttc tttccca 27

<210> 36

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 36

atctagtacg gtctcccctc tgcgttttag catttgg 37

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 37

agcgcattct tccgtgtctc 20

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 38

taaggaagct gaacaccgac t 21

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 39

tggagaaagc agaggccatg a 21

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 40

acagccacaa caggtacagc 20

<210> 41

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 41

atctagtaca aggaagctga acaccgactc tgtaagact 39

<210> 42

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 42

atctagtacg gagaaagcag aggccatgaa tacagg 36

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 43

tcgtcgaccc tcccttgtat 20

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 44

ttgctgcgtg aataacgagg t 21

<210> 45

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 45

atctagtact gctgcgtgaa taacgaggtt cactgtcagc tggt 44

<210> 46

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 46

atctagtaca aggaagctga acaccgactc tgtaagact 39

<210> 47

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 47

atgggtaccg gagccttcct cttcacct 28

<210> 48

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 48

atgggatcct gatggcgaca atgtccact 29

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 49

agcaggtatg tgtgtgtgga g 21

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 50

tgcacgatca gtttgggcta 20

<210> 51

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 51

aaaacgacgg ccagtgaatt agcaggtatg tgtgtgtgga gg 42

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 52

tagacagtgc caacgcgtaa tgagctcacc 30

<210> 53

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 53

ttacgcgttg gcactgtcta ttatagttca cagat 35

<210> 54

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 54

ttgtggatct ctagaggatc ccattctctg cccaatcttg c 41

<210> 55

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 55

gccatgagat cctgctgtg 19

<210> 56

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 56

cgatccctga tccc 14

<210> 57

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 57

atctagtacg ccatgagatc ctgctgtgta gcactgag 38

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 58

tcctagttcg aggtggcttg 20

<210> 59

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 59

tccaggtact gaaacatgag gca 23

<210> 60

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 60

ctgccgcaag aacgacgat 19

<210> 61

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 61

tctgcctcat tttaatggat gagc 24

<210> 62

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 62

gcctggcatt ctactgcatg ggctgaagcc ctggacacag taagc 45

<210> 63

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 63

ttgagaagag gagtttgatg ctgaga 26

<210> 64

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 64

cttcgtgagc ccccttttgc cagtggctgg cc 32

<210> 65

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 65

tccatcatca cactcttctc caaggc 26

<210> 66

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 66

atctagtact gagaagagga gtttgatgct gagaggacat ccagg 45

<210> 67

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 67

atctagtacc catcatcaca ctcttctcca aggctccttg caacc 45

<210> 68

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 68

atctagtacc caggtactga aacatgaggc aagcaaagtc acag 44

<210> 69

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 69

atctagtacc tgcctcattt taatggatga gctataggtt cagac 45

Claims

1.一种检测等位基因差异表达的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供一待测样本，所述样本为等位基因cDNA样品；

(e)对所述第二扩增产物LA和所述第二扩增产物LG进行分离；和

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可检测标记选自下组：荧光基团、化学发光基团、生色团、或其组合。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(f)中，测量所述第二扩增产物LA与所述第二扩增产物LG的荧光强度，并进行比较从而确定所述等位基因的差异表达。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(e)中，当LA的荧光强度Y_La与LG的荧光强度Y_LG存在显著差异(例如，两者中最大荧光强度与最小荧光强度之比(即Max(Y_La，Y_LG)/Min(Y_La，Y_LG))≥1.2，较佳地≥1.3，最佳地≥1.4)时，则表明可检测出等位基因存在显著的差异表达。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所能检测到的待测样本中等位基因之间表达差异的比例为64：1至1:64或更大，较佳地为32：1至1：32，更佳地16：1至1：16。

6.一种检测等位基因差异表达的试剂盒，其特征在于，包括：

(iii)限制性内切酶；

7.一种检测个体的等位基因的相对拷贝数的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(e)对所述第二扩增产物LA和所述第二扩增产物LG进行分离；和

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述碱基突变为1-8个碱基或1-6个碱基或1-4个碱基的突变。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(f)中，测量所述第二扩增产物LA与所述第二扩增产物LG的荧光强度，并进行比较从而确定个体的等位基因的相对拷贝数。

10.一种检测等位基因相对拷贝数的试剂盒，其特征在于，包括：

(iii)限制性内切酶；和