CN109486871A - 一种利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法，是以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)10‑1‑A为出发菌敲除其甘油脱氢酶gdh基因和2,3‑丁二醇脱氢酶基因budC并且以来自Thermococcus profundus DT5432中NADH氧化酶基因nox来替换乳酸脱氢酶基因ldh构建出能用于生产乙偶姻的地衣芽孢杆菌工程菌株，然后以葡萄糖为底物，生物发酵该菌，由发酵液得到乙偶姻。实验证实本发明的工程菌可生产82.14克/升的乙偶姻，生产效率达到2.28克/升/小时，且该生产过程成本低，产量高，具有很好的应用价值和可观的经济效益。

Description

一种利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法
技术领域
本发明涉及一种发酵生产乙偶姻的方法，尤其涉及一种利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法。
背景技术
乙偶姻(3-羟基-2-丁酮)是一种挥发性的化合物，它广泛应用于食品添加、植物生长促进及生物害虫防治等。另外，乙偶姻还可以作为一系列化合物的化学合成前体物质，如双乙酰及含烷基吡嗪，其中后者包括2,3,5,6-四甲基吡嗪。鉴于乙偶姻广泛的用途及实现工业化生产的潜力，其被美国能源部列为30种优先发展的平台化合物之一。
目前商业用乙偶姻主要来源是基于不可再生资源的化学合成方式，该工艺步骤复杂、反应条件苛刻、污染严重，且化学合成的乙偶姻在食品、医药、日化等领域的应用受到限制。也有众多研究者致力于利用微生物发酵实现乙偶姻的工业化生产，但相较于化学工艺方法，微生物发酵生产乙偶姻的成本依然较高。因此，降低乙偶姻产业对不可再生的石油资源的依赖，实现乙偶姻的绿色生产，提高微生物乙偶姻发酵工艺的经济竞争力，具有重要的经济效益和社会作用的意义。
检索发现：已有多种微生物被报道可用于乙偶姻发酵生产，美国专利(US0815840)报道了通过高耐糖筛选及NTG诱变，获得了一株短小芽孢杆菌，乙偶姻产量达到63g/L。孙建安等人通过在粘质沙雷氏菌中外源表达NADH氧化酶提高胞内NAD+浓度，以葡萄糖为碳源，最终乙偶姻产量达到75.2g/L，这是目前报道中乙偶姻产量的最高值。然而，利用敲除副产物2,3-丁二醇合成途径的关键酶基因(gdh和budC)，并利用来自Thermococcusprofundus DT5432菌株中的NADH氧化酶基因(nox)替换地衣芽孢杆菌乳酸脱氢酶基因(ldh)降低副产物乳酸的产量方式构建地衣芽孢杆菌工程菌株，以实现乙偶姻的高效生产的方法还未见报道。
发明内容
针对该现有技术的不足，本发明的目的是提供一种利用构建的地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法。
本发明所述利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法，步骤是：
(1)以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)10-1-A为出发菌，敲除地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)10-1-A甘油脱氢酶gdh基因和2,3-丁二醇脱氢酶基因budC并且以来自Thermococcus profundus DT5432中NADH氧化酶基因nox来替换乳酸脱氢酶基因ldh构建出能用于生产乙偶姻的地衣芽孢杆菌工程菌株，该工程菌株命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox；
其中，所述出发菌株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)10-1-A已于2011年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNO.5461；
(2)以葡萄糖为底物，生物发酵地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox，由发酵液得到乙偶姻；
其中，所述发酵条件是：培养温度为50±1℃，培养方式为搅拌培养，搅拌转速为500±50转/分钟，旋转半径为33±1毫米，通气量为1.0±0.1vvm，培养时间为18～36小时；
发酵培养基组成为：葡萄糖50～80克/升，酵母粉12克/升，无水乙酸钠6.5克/升，柠檬酸铵1克/升，磷酸氢二钾2克/升，七水硫酸镁0.25克/升，金属离子母液10毫升/升，余量为水；pH为7.0；其中的金属离子母液配方是：硫酸亚铁2.25克/升，硫酸锌0.75克/升，硫酸锰0.38克/升。
上述利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法中，步骤(1)所述工程菌株Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox的构建方法是：
以地衣芽孢杆菌10-1-A基因组为模板，PCR获得包含gdh基因上下游同源序列的重组片段，连接至pKVM1后经双亲杂交转入地衣芽孢杆菌10-1-A，经抗性筛选单交换转化子；温度诱导发生双交换后，PCR筛选获得gdh基因成功敲除菌株，命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdh；
以地衣芽孢杆菌10-1-A基因组为模板，PCR获得包含budC基因上下游同源序列的重组片段，连接至pKVM1后经双亲杂交转入地衣芽孢杆菌licheniformisΔgdh，经抗性筛选单交换转化子；温度诱导发生双交换后，PCR筛选获得budC基因成功敲除菌株，命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudC。
以地衣芽孢杆菌10-1-A基因组为模板，PCR获得包含ldh基因上下游同源臂序列；以全基因合成的携带NADH氧化酶的质粒pUC57-nox为模板，PCR获得nox序列，将ldh基因上下游同源臂序列和nox序列重组PCR获得基因替换重组片段，连接至pKVM1后经双亲杂交转入地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudC，经抗性筛选单交换转化子；温度诱导发生双交换后，PCR筛选获得nox基因成功替换ldh基因的工程菌株，命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox。
上述地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox是革兰氏阳性菌，需氧或兼性厌氧生长，蛋白分泌能力强，生长速率快，是一种公认的生物安全菌。其形态为棒杆状，长1.5μm～3.0μm，直径0.6μm～0.7μm，菌落颜色为红色或白色，产芽孢，VP反应呈阳性，可利用葡萄糖、蔗糖、果糖产酸，可水解酪蛋白、明胶、吐温80，可利用柠檬酸盐，可在含100g/L NaCl的培养基中生长，可在42～60℃条件下生长。
上述利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法中，步骤(2)所述发酵条件优选是：培养温度为50℃，培养方式为搅拌培养，搅拌转速为500转/分钟，旋转半径为33毫米，通气量为1.0vvm，培养时间为25～36小时。
上述利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法中，底物葡萄糖的检测方法是：样品进行合适的稀释后，采用生物传感分析仪SBA-40D(山东省科学院生物研究所)测定。测定原理为利用固定化葡萄糖氧化酶膜专一性测定葡萄糖含量。
上述利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法中，发酵产物乙偶姻的检测方法是：
每500毫升乙酸乙酯中加入0.7毫升异戊醇，作为萃取剂；利用该萃取剂，对发酵液中发酵产物样品进行等体积萃取，利用涡旋振荡器对萃取的样品震荡30秒，然后静置，取上层样品进行气相检测。具体的气相检测条件如下：
所用气相色谱仪的型号为Agilent 6820，氮气作为载气，进样器和检测器的温度均设为280℃；毛细管柱为SupelcoBeta-DexTM120(内径0.25毫米，长度30米)；检测过程的柱温设定为：40℃保持3分钟，然后以每分钟1.5℃的速率升温到80℃，以每分钟0.5℃的速率升温到86℃，以每分钟30℃的速率升温到200℃。进样量1.0微升，进行气相检测。
本发明的特点和突出效果是：
(1)本发明提供的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox是高产乙偶姻的生物安全菌株，其敲除了副产物2,3-丁二醇合成途径的关键酶基因(gdh和budC)，从而阻断了乙偶姻转化为2,3-丁二醇的代谢流，此外利用来自Thermococcusprofundus DT5432菌株中的NADH氧化酶基因(nox)替换地衣芽孢杆菌乳酸脱氢酶基因(ldh)从而达到降低副产物乳酸的产量，并且降低NADH依赖型的副产物合成途径从而提高乙偶姻的产量。
(2)利用本发明提供的工程菌株以葡萄糖为底物，在本发明给出发酵条件下获得的乙偶姻最高浓度可达82.14克/升，生产效率可达2.28克/升/小时；
(3)本发明提供的生产乙偶姻的方法充分利用高温发酵过程的优势，污染杂菌的机率小，同时实现了产量高，生产强度大的目标。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
实施例1：构建生产乙偶姻的工程菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox
出发菌株为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis10-1-A，该菌已于2011年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.5461。
(1)甘油脱氢酶gdh基因的敲除
甘油脱氢酶基因gdh序列长度为1104个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
采用常规的方法制备B.licheniformis 10-1-A的基因组DNA，该过程参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备的方法，提取地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis10-1-A的基因组DNA；利用引物“gdh1-f和gdh1-r”与“gdh2-f和gdh2-r”PCR扩增gdh编码基因的上下游同源臂。然后利用“gdh1-f和gdh2-r”引物，以所获得的上、下游同源臂为模板进行重组PCR，获得gdh的截短片段，两端包含BglII和BamHI的酶切位点。
将gdh的截短片段和***质粒pKVM1分别使用BglII和BamHI进行双酶切，酶切产物经胶回收后，使用T4DNA连接酶连接，获得敲除质粒pKVM1-Δgdh。
其中，扩增重组片段的引物设计如下：
gdh1-f:5’-ATTTAGATCTAACAAGCCGCGTCATTCAAG-3’(BglII)
gdh1-r:5’-ACTTGGCGCCATTCTTCTTCGACACATCGCAAATGATA-3’
gdh2-f:5’-TATCATTTGCGATGTGTCGAAGAAGAATGGCGCCAAGT-3’
gdh2-r:5’-TACCGTGGATCCGCTTTAAG-3’(BamHI)
1)接种携带敲除质粒的大肠杆菌S17-1λpir以及地衣芽孢杆菌10-1-A，在37℃下培养菌株至OD600＝1.2。将4～7毫升大肠杆菌菌液与1毫升地衣芽孢杆菌在6000转/分钟离心5分钟，用50mM pH 7.5的磷酸盐缓冲液洗两遍，将其混合后重悬并离心，然后用LB培养基重悬并滴在LB平板上，在30℃过夜培养。用30℃预热的LB液体培养基收集细胞后，稀释10-4和10-5涂布于添加红霉素和多粘菌素B的LB固体平板，30℃培养48～72小时。
2)挑转化子至加红霉素抗性的LB培养基，37℃培养6～12小时，然后用LB培养基洗一遍后转接至新鲜LB培养基中42℃培养6～12小时，然后梯度稀释至红霉素LB平板，42℃过夜培养，挑转化子42℃培养，挑取生长的单菌落，利用上下游引物进行PCR验证，得到可同时PCR出长片段和短片段的正确单交换目的菌。
3)挑转化子至LB培养基，30℃无抗性培养并转接两代，稀释10-5和10-6涂平板至LB，37℃培养12小时后，挑白色转化子至50℃培养并进行分子验证，利用上下游引物进行PCR验证，双交换的目的菌，能PCR出短片段(构建的上下游同源臂)，挑选正确的双交换菌，进行表型验证，得到正确的敲除地衣芽孢杆菌10-1-A甘油脱氢酶gdh基因的工程菌株Bacillus licheniformisΔgdh。
(2)2,3-丁二醇脱氢酶budC基因的敲除
2,3-丁二醇脱氢酶基因budC序列长度为783个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
基因budC的敲除步骤参照本实施例步骤(1)中gdh的敲除步骤，引物序列如下：
budC1-f:5’-AAACCATGGAATAAACGAGTTGACGGAAA-3’(NcoI)
budC1-r:5’-GCAAAGCAATTGCGGTTAAATTGCATTAAAACGCTTATCC-3’
budC2-f:5’-GGATAAGCGTTTTAATGCAATTTAACCGCAATTGCTTTGC-3’
budC2-r:5’-TTTGGATCCTATGCTCGCGGTGTTCTAT-3’(BamHI)
该正确的敲除地衣芽孢杆菌中甘油脱氢酶gdh基因和2,3-丁二醇脱氢酶budC基因的工程菌株命名为Bacillus licheniformisΔgdhΔbudC。
(3)以Thermococcus profundus DT5432中NADH氧化酶基因nox替换BacilluslicheniformisΔgdhΔbudC菌株中的乳酸脱氢酶基因ldh
NADH氧化酶基因nox序列长度为1320个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。乳酸脱氢酶ldh序列长度为960个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
采用常规的方法制备B.licheniformis 10-1-A的基因组DNA，该过程参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备的方法，提取地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis10-1-A的基因组DNA；以Bacillus licheniformis10-1-A的基因组DNA为模板利用引物“ldh::nox1-f和ldh::nox1-r”与“ldh::nox3-f和ldh::nox3-r”PCR扩增替换基因nox的上下游同源臂。以全基因合成的Thermococcus profundus DT5432中NADH氧化酶nox的基因为模板利用引物“ldh::nox2-f和ldh::nox2-r”扩增出中间段替换基因nox。然后利用“gdh1-f和gdh2-r”引物，以所获得的上游同源臂和中间段nox基因为模板进行重组PCR获得1-2片段。最后利用“gdh1-f和gdh3-r”引物，以获得的1-2片段和下游同源臂片段为模板进行重组PCR获得Δldh::nox的基因替换片段，两端包含BamHI和SmaI的酶切位点。
将Δldh::nox的基因替换片段和***质粒pKVM1分别使用BamHI和SmaI进行双酶切，酶切产物经胶回收后，使用T4DNA连接酶连接，获得基因替换质粒pKVM1-Δldh::nox。
其中，扩增重组片段的引物设计如下：
ldh::nox1-f:5’-AATGGATCCTAGCGTAGCAAGCAGTGTTCCGCTGTT-3’(BamHI)
ldh::nox1-r:5’-TGACGACTCTTTTGCGTTCCATGACTCATCATTCCTTTGCCG-3’
ldh::nox2-f:5’-CGGCAAAGGAATGATGAGTCATGGAACGCAAAAGAGTCGTCA-3’
ldh::nox2-r:5’-AGTATCTTCATGGTGTTCAGTTAAAATTTCAGGACGCGCG-3’
ldh::nox3-f:5’-CGCGCGTCCTGAAATTTTAACTGAACACCATGAAGATACT-3’
ldh::nox3-r:5’-AATCCCGGGCGGTGACCAAGCGTTCATAAT-3’(SmaI)
NADH氧化酶基因nox替换Bacillus licheniformisΔgdhΔbudC菌株中的乳酸脱氢酶ldh的基因替换步骤参照本实施例步骤(1)中gdh的敲除步骤，最终获得重组地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox。
实验证实：上述Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox基因工程菌为革兰氏阳性菌，其最佳培养温度为
进一步的，上述地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox需氧或兼性厌氧生长，蛋白分泌能力强，生长速率快，是一种公认的生物安全菌。其形态为棒杆状，长1.5μm～3.0μm，直径0.6μm～0.7μm，菌落颜色为红色或白色，产芽孢，VP反应呈阳性，可利用葡萄糖、蔗糖、果糖产酸，可水解酪蛋白、明胶、吐温80，可利用柠檬酸盐，可在含100g/L NaCl的培养基中生长，可在42～60℃条件下生长。
实施例2：地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox菌株在1L发酵罐中发酵生产乙偶姻的转速优化
参照实施例1，以野生型地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis 10-1-A为出发菌株，敲除甘油脱氢酶gdh基因和2,3-丁二醇脱氢酶基因budC，表达Thermococcus profundusDT5432中NADH氧化酶基因nox来替换乳酸脱氢酶ldh，命名为地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox。
(1)将重组地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox划线到含有质量体积比为1.5～1.8％琼脂的LB培养基平板上，于50±1℃摇床振荡培养12±1小时；
(2)在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的单菌落，然后接种到5mL的LB培养基中，于50±1℃摇床振荡培养12±1小时，获得重组地衣芽孢杆菌一级种子；
(3)在无菌的条件下，取步骤(2)所得的一级种子菌液，以体积比为2～4％的接种量接种到两瓶100mL的LB培养基中，于50±1℃摇床振荡培养12±1小时，获得重组地衣芽孢杆菌二级种子菌液；
(4)在无菌的条件下，取步骤(3)所得的二级种子菌液，以体积比为5％的接种量接种到三个装有已经灭菌的0.8升发酵培养基的1升发酵罐中，在50℃条件下，通气量为1.0vvm，发酵罐搅拌转速分别为400转/分钟、500转/分钟和600转/分钟，发酵18～36小时。
发酵中每隔3小时取样，检测OD600nm。样品以8,000×g离心10分钟，检测上清中乙偶姻和葡萄糖的浓度，根据葡萄糖浓度补加葡萄糖干粉，使葡萄糖浓度维持在20～50克/升；对上清进行气相色谱分析测定发酵液中乙偶姻的浓度，当乙偶姻的浓度不再增加时，停止发酵。
36小时后检测结果显示地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox发酵生产乙偶姻的最佳转速条件为500转/分钟。
上述发酵培养基组成为：葡萄糖50～80克/升，酵母粉12克/升，无水乙酸钠6.5克/升，柠檬酸铵1克/升，磷酸氢二钾2克/升，七水硫酸镁0.25克/升，金属离子母液10毫升/升，余量为水；pH为6～7。
其中，上述金属离子母液配方是：硫酸亚铁2.25克/升，硫酸锌0.75克/升，硫酸锰0.38克/升。
实施例3：地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox菌株在1L发酵罐中发酵生产乙偶姻的通气量优化
参照实施例1，以野生型地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis 10-1-A为出发菌株，敲除甘油脱氢酶gdh基因和2,3-丁二醇脱氢酶基因budC，表达Thermococcus profundusDT5432中NADH氧化酶基因nox来替换乳酸脱氢酶ldh，命名为地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox。
(1)将重组地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox划线到含有质量体积比为1.5～1.8％琼脂的LB培养基平板上，于50±1℃摇床振荡培养12±1小时；
(2)在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的单菌落，然后接种到5mL的LB培养基中，于50±1℃摇床振荡培养12±1小时，获得重组地衣芽孢杆菌一级种子；
(3)在无菌的条件下，取步骤(2)所得的一级种子菌液，以体积比为2～4％的接种量接种到两瓶100mL的LB培养基中，于50±1℃摇床振荡培养12±1小时，获得重组地衣芽孢杆菌二级种子菌液；
(4)在无菌的条件下，取步骤(3)所得的二级种子菌液，以体积比为5％的接种量接种到三个装有已经灭菌的0.8升发酵培养基的1升发酵罐中，在50℃条件下，发酵罐搅拌转速为500转/分钟，通气量分别为0.5vvm、1.0vvm和1.5vvm，发酵36小时。
发酵中每隔3小时取样，检测OD600nm。样品以8,000×g离心10分钟，检测上清中乙偶姻和葡萄糖的浓度，根据葡萄糖浓度补加葡萄糖干粉，使葡萄糖浓度维持在20～50克/升；对上清进行气相色谱分析测定发酵液中乙偶姻的浓度，当乙偶姻的浓度不再增加时，停止发酵。
36小时后检测结果显示地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox发酵生产乙偶姻的最佳通气量条件为1.0vvm。
上述发酵培养基组成为：葡萄糖50～80克/升，酵母粉12克/升，无水乙酸钠6.5克/升，柠檬酸铵1克/升，磷酸氢二钾2克/升，七水硫酸镁0.25克/升，金属离子母液10毫升/升，余量为水；pH为6～7。
其中，上述金属离子母液配方是：硫酸亚铁2.25克/升，硫酸锌0.75克/升，硫酸锰0.38克/升。
实施例4：利用地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox菌株以发酵培养基在5L发酵罐中发酵生产乙偶姻
参照实施例1，以野生型地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis 10-1-A为出发菌株，敲除甘油脱氢酶gdh基因和2,3-丁二醇脱氢酶基因budC，表达Thermococcus profundusDT5432中NADH氧化酶基因nox来替换乳酸脱氢酶ldh，命名为地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox。
(1)将重组地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox划线到含有质量体积比为1.5～1.8％琼脂的LB培养基平板上，于50±1℃摇床振荡培养12±1小时；
(2)在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的单菌落，然后接种到5mL的LB培养基中，于50±1℃摇床振荡培养12±1小时，获得重组地衣芽孢杆菌一级种子；
(3)在无菌的条件下，取步骤(2)所得的一级种子菌液，以体积比为2～4％的接种量接种到两瓶100mL的LB培养基中，于50±1℃摇床振荡培养12±1小时，获得重组地衣芽孢杆菌二级种子菌液；
(4)在无菌的条件下，取步骤(3)所得的二级种子菌液，以体积百分比5％的接种量接种在装有已经灭菌的4升发酵培养基的5升发酵罐中，在50℃条件下，发酵罐搅拌转速500转/分钟，通气量为1.0vvm，发酵36小时。
发酵中每隔3小时取样，检测OD600nm。样品以8,000×g离心10分钟，检测上清中乙偶姻和葡萄糖的浓度，根据葡萄糖浓度补加葡萄糖干粉，使葡萄糖浓度维持在20～50克/升；对上清进行气相色谱分析测定发酵液中乙偶姻的浓度，当乙偶姻的浓度不再增加时，停止发酵。
36小时后检测结果显示：乙偶姻的浓度达到57.98克/升，生产效率为1.61克/升/小时。
上述发酵培养基组成为：葡萄糖50～80克/升，酵母粉12克/升，无水乙酸钠6.5克/升，柠檬酸铵1克/升，磷酸氢二钾2克/升，七水硫酸镁0.25克/升，金属离子母液10毫升/升，余量为水；pH为6～7。
其中，上述金属离子母液配方是：硫酸亚铁2.25克/升，硫酸锌0.75克/升，硫酸锰0.38克/升。
实施例5：利用地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox菌株以发酵培养基在50L发酵罐中发酵生产乙偶姻
参照实施例1，以野生型地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis 10-1-A为出发菌株，敲除甘油脱氢酶gdh基因和2,3-丁二醇脱氢酶基因budC，表达嗜热球菌Thermococcusprofundus DT5432中NADH氧化酶基因nox来替换乳酸脱氢酶ldh，命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox。
(1)将重组地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisΔgdhΔbudCΔldh::nox划线到含有质量体积比为1.5～1.8％琼脂的LB培养基平板上，于50±1℃摇床振荡培养12±1小时；
(2)在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的单菌落，然后接种到5mL的LB培养基中，于50±1℃摇床振荡培养12±1小时，获得重组地衣芽孢杆菌一级种子；
(3)在无菌的条件下，取步骤(2)所得的一级种子菌液，以体积比为2～4％的接种量接种到50mL的LB培养基中，于50±1℃摇床振荡培养12±1小时，获得重组地衣芽孢杆菌二级种子菌液；
(4)在无菌的条件下，取步骤(3)所得的二级种子菌液，以体积比为2～4％的接种量接种到两瓶1L的LB培养基中，于50±1℃摇床振荡培养12±1小时，获得重组地衣芽孢杆菌三级种子菌液；
(5)在无菌的条件下，取步骤(4)所得的三级种子菌液，以体积百分比5％的接种量接种在装有已经灭菌的40升发酵培养基的50升发酵罐中，在50℃条件下，发酵罐搅拌转速500转/分钟，通气量为1.0vvm，发酵36小时。
发酵中每隔3小时取样，检测OD600nm。样品以8,000×g离心10分钟，检测上清中乙偶姻和葡萄糖的浓度，根据葡萄糖浓度补加葡萄糖干粉，使葡萄糖浓度维持在20～50克/升；对上清进行气相色谱分析测定发酵液中乙偶姻的浓度，当乙偶姻的浓度不再增加时，停止发酵。
36小时后检测结果显示：乙偶姻的浓度达到82.14克/升，生产效率为2.28克/升/小时。
上述发酵培养基组成为：葡萄糖50～80克/升，酵母粉12克/升，无水乙酸钠6.5克/升，柠檬酸铵1克/升，磷酸氢二钾2克/升，七水硫酸镁0.25克/升，金属离子母液10毫升/升，余量为水；pH为6～7。
其中，上述金属离子母液配方是：硫酸亚铁2.25克/升，硫酸锌0.75克/升，硫酸锰0.38克/升。
序列表
<110> 山东大学深圳研究院 山东大学
<120> 一种利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法
<141> 2018-12-05
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1104
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) 10-1-A
<221> 甘油脱氢酶基因gdh序列
<400> 1
ggaagcgtcc gtttgttgag catcgtctcg gcggagacca tgaccccttc atcaacaagc 60
gtccggctgt tttcgatcat tttttcgaaa tagcgcgccc gctgtgcaaa cgtcggcttt 120
ttatccatca tagcgaagcc gatttctgca aagtcttcga ccgttcccca gttgtgggaa 180
atatgaagca catccaggta ggggatgatc agctcgtagc ggccgatatc gagcgtcaag 240
tttgagttga tctgcgtccg cacgccgcgt tcatgagcgt attttaataa aggaacgaca 300
tattccttta cagattttaa tgagagcatc ggctcgccgc ccgtaatgct taaagaacga 360
aggcggggaa tctcatcaag ccgtttcaac agaaggctga ctggcagcgc gtccgggtcc 420
ttcgtctgga gcgtataccc gacggcgcag tgctcgcagc gcatattgca aagagtcgtc 480
gtcgtaaatt caacgttcgt cagctgtata tctccaaatt ggtcaacgtc catgtaggct 540
tcccacggat catattccgg ggtgatcgga cgagcctgca ttttttctgt catgacatat 600
ctaactcctt tatgatagga catactaata tagcccaact attcatttta gacctgatcc 660
ttgaggcatg caagtcatgg atgattgaaa aaaggccgtt tataggctac gataaaggaa 720
caaaaggagg agaatcatgg gtaacgcagt acatgacaaa gaacagcaag tcaattattt 780
gaaaaacaga ttggatatgt ttatgtcagt catcgattct ttagacccgg aatcgaccga 840
ccttgaagat attgacagac tgatcagcat gctcgacgat ttggaagcca aatacgagcg 900
ctttaaaaaa gactggaaat aaaaccgcgc attctctgcc gcggtttttt ttgttttcca 960
agtgttgctt ggtatgaaat gctcagccct tctgcacaat aagaaaaaat aaaactggga 1020
gcgagaagat gatgaaacga atctgtgcca tatgctgcgg attcctgctg acgctggcgt 1080
tcagcggcaa tgctgaagcg attt 1104
<210> 2
<211> 783
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)10-1-A
<221> 2,3-丁二醇脱氢酶基因budC序列
<400> 2
atgagtaaag tatctggaaa aattgctttt gttactggcg gcggtcaagg aattggagaa 60
gcaatctgca aacgattggc agaggacgga ttcgcagttg cagttgccga ttataatgta 120
gaaactgcaa cacaagttgc tgaggacatc aataagctta acggcaaagc aattgcggtt 180
aaagtggatg ttgctgatcg cgatgatgtt tttaaagctg tcgatgaaac agtaaaacgt 240
cttggcggtc ttgatgtggt gattaataat gcgggtcttg gaccaaccac ccctattgaa 300
agcattacat atgaagatta tcggaaagtc tatgatgtta acgttggcgg tacttattgg 360
ggaatacaag cagctgtaaa agcctttaaa gaacttggac acggcgggaa aatcattaat 420
gcatcttctc aagccggcca agtcggcaac ccgggcttag cggtttacgg aggaacaaag 480
ttcgctgttc gcgggattac ccaaactgcg gcaaaagatc tagctgaatt aggtattact 540
gtaaacgcct tttgtccggg tatcgttaaa actcctatga tgatggggat tgcacagcaa 600
accgctgatg aagcaggcaa gccgtttgaa tggggcatgg aacaattcgc taaaaatatt 660
gcattaaaac gcttatccga gccggaagat gtagcagcat gcgtttctta ccttgcaggg 720
ccagattcag attatatgac tggtcaagct cttatcattg atggcggaat ggtatttaat 780
taa 783
<210> 3
<211> 1320
<212> DNA
<213> Thermococcus profundus DT5432
<221> NADH氧化酶基因nox序列
<400> 3
caagtccgtg gagagaaacg aacccttcca cgtccggttt gagtccaaac tcctccggcg 60
agtgcctcag gatataggcc atcagcttgc ttaccctcgt cctctttgat cccatagtaa 120
aaagttgggg agaaaagcta aaaacctcac ggaagctcca ccagagccca caccggcctg 180
tggtctgaaa cctccacgtc acaaaggcag ccgtagtctt taatttcagc cggccagttc 240
ttcttaagca ggatgtagtc tatgttctct ttgtccctga cgccgttcct ctcccagagg 300
aaggtgtaag gcggcctctg ctcaaatgca tccctgtact cgcgggtgag tatctctatc 360
gctttctcgt ccggctcggc gttcgtgtcg ccgagtatta tctccgctat gggtccgctc 420
tccgcgaact tgaggagctc ctcggcctgc atcgccctct cctcttcgct caaacccata 480
tggacgttca cgagggtgag acccaactcc tcgaagctaa ccttctgggc tggcctggcc 540
tgaccgacgc tcttgaggtt gagctcgccc tccgtcttca tgtgccagtg ggagaagacc 600
gctattccgt aggtgccctc cactgcaggc ttgtactcgt aaacgtagcc gaggtaggcc 660
gagagcatga gcgggacgtc ctggtagccg ttgcctatca tcccaccgac gacctcctgg 720
gacgcccaga tgtcaggttt ctgttctttt aggagattaa caagctcgta gccgttgaac 780
ttcccgtcgt aaggcccgaa accctggtgg acgttgtagg tccagatgag aacctctttt 840
ttggccggtt cgtagaccgg agaggcgttg aagatggcta ggacgattat agaggccagg 900
aggaggcccc cgagggaagc cgctatctcc cttacgcttg gaaccctgat ctccaccgac 960
tttccatagg cgctcatggc gtagactacg gatgccgcaa ggatgagggc ctcaagcctg 1020
tcctccatga aagctaaacc gatgtccctg cccacatagg ccccgagggc aagggtcgcg 1080
accaggaaga gatagaccgc tccgatgact cctcccctgc tgcccttgga gctttcgacg 1140
agagctattg aagatgccag cgcaagcggg aggccgatta aagcggccgg ccttacgaag 1200
agcgccgcag agccaaggat cagcaggagt gcggctatgc caggcttttt gcccagatat 1260
gggccgagga ggatagccag tgcgacgacg aacgagaagc cgacgaactg tgggaggtag 1320
<210> 4
<211> 960
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) Δgdh ΔbudC
<221> 乳酸脱氢酶基因ldh序列
<400> 4
gtgacgcacg gttatttcta tcaaagggcg cgggaaagcg aaaggcgttt ggcacgcagg 60
gcggtcaacg gggagcggct ttggccggca aagttcagtt tgtggtattt cagaccggcg 120
ggggcgtgtc ccgcacagtg gtacaatcag ccgcatgtcg gccgctttaa atcgcattgt 180
ttttacgagc cgacagcgga agagtgtgag aatgtctata atacgttcta acaaaaacat 240
cccttttcaa cggtttttga aaagggatgt ttttcgttca aaataattct gccagtcttt 300
cgtaagactg cttcttatct tcaaaccggt agacgttagt taaaatcata aactcatctg 360
tttgatatcg ttcagaaagc tcgagcagtt ttcttttgac tgtttgagga gacccgatca 420
ccatacggct gcggttttgg gcaagcttct ttttatcggc agctgtgtaa gcggccgatt 480
tcgcctcttc aatgcttggg acaaggctgt ccagcccttt ttcaacccgg agaagccata 540
aatcttggct caagcagagc tcctcggctt tttcatcgga ctccgcacaa acgacgaaaa 600
cggcggccaa tgattggggg cgtttaaaga aaggggaagg ccgaaagctt tcacggtatg 660
attgaaaggc gttctttcct ctcgcgggag agatgaaatg gccgaatacg tatcccgctc 720
ccatgctacc ggccaatttt gcgctgtttt ctcccaggcc taaaagccac acctccgggg 780
gcgaatccgt caaaggggag gctttaattc cgaagtaatc atgtccggaa ggcacggaat 840
cagtcagaaa gctaaccaag tcttgtaact gtctcgggaa ttcgtgcagg cttttatgaa 900
ccccgtctgt cagcgccagc ctcgttttag ttgtgcctcc cggagagcgg ccgatcccca 960

Claims (3)

1.一种利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法，步骤是：
(1)以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)10-1-A为出发菌，敲除地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)10-1-A甘油脱氢酶gdh基因和2,3-丁二醇脱氢酶基因budC并且以来自Thermococcus profundus DT5432中NADH氧化酶基因nox来替换乳酸脱氢酶基因ldh构建出能用于生产乙偶姻的地衣芽孢杆菌工程菌株，该工程菌株命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ΔgdhΔbudCΔldh::nox；
其中，所述出发菌株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)10-1-A已于2011年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.5461；
(2)以葡萄糖为底物，生物发酵地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ΔgdhΔbudCΔldh::nox，由发酵液得到乙偶姻；
其中，所述发酵条件是：培养温度为50±1℃，培养方式为搅拌培养，搅拌转速为500±50转/分钟，旋转半径为33±1毫米，通气量为1.0±0.1vvm，培养时间为18～36小时；
发酵培养基组成为：葡萄糖50～80克/升，酵母粉12克/升，无水乙酸钠6.5克/升，柠檬酸铵1克/升，磷酸氢二钾2克/升，七水硫酸镁0.25克/升，金属离子母液10毫升/升，余量为水；pH为7.0；其中的金属离子母液配方是：硫酸亚铁2.25克/升，硫酸锌0.75克/升，硫酸锰0.38克/升。
2.根据权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法，其特征在于，步骤(1)所述工程菌株Bacillus licheniformis ΔgdhΔbudCΔldh::nox的构建方法是：
以地衣芽孢杆菌10-1-A基因组为模板，PCR获得包含gdh基因上下游同源序列的重组片段，连接至pKVM1后经双亲杂交转入地衣芽孢杆菌10-1-A，经抗性筛选单交换转化子；温度诱导发生双交换后，PCR筛选获得gdh基因成功敲除菌株，命名为地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis Δgdh；
以地衣芽孢杆菌10-1-A基因组为模板，PCR获得包含budC基因上下游同源序列的重组片段，连接至pKVM1后经双亲杂交转入地衣芽孢杆菌licheniformis Δgdh，经抗性筛选单交换转化子；温度诱导发生双交换后，PCR筛选获得budC基因成功敲除菌株，命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ΔgdhΔbudC。
以地衣芽孢杆菌10-1-A基因组为模板，PCR获得包含ldh基因上下游同源臂序列；以全基因合成的携带NADH氧化酶的质粒pUC57-nox为模板，PCR获得nox序列，将ldh基因上下游同源臂序列和nox序列重组PCR获得基因替换重组片段，连接至pKVM1后经双亲杂交转入地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ΔgdhΔbudC，经抗性筛选单交换转化子；温度诱导发生双交换后，PCR筛选获得nox基因成功替换ldh基因的工程菌株，命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ΔgdhΔbudCΔldh::nox。
3.根据权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌工程菌株发酵生产乙偶姻的方法，其特征在于，步骤(2)所述发酵条件是：培养温度为50℃，培养方式为搅拌培养，搅拌转速为500转/分钟，旋转半径为33毫米，通气量为1.0vvm，培养时间为25～36小时。
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