CN109485642A - 一种制备伊文氏蓝衍生物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种放射性配合物前体的制备方法。主要解决现有制备方法中存在的合成步骤繁琐，周期长，操作复杂，不适合工业化生产等技术问题。本发明技术方案为：一种制备伊文氏蓝衍生物的方法，包括如下步骤：（1）4,4'‑二氨基‑3,3'‑二甲基联苯与载体树脂反应，得到4,4'‑二氨基‑3,3'‑二甲基联苯‑树脂。（2）上一步的4,4'‑二氨基‑3,3'‑二甲基联苯‑树脂依次与带保护基的氨基酸及双功能螯合试剂在固相中进行偶联反应，得到多肽修饰的4,4'‑二氨基‑3,3'‑二甲基联苯‑树脂；（3）修饰的4,4'‑二氨基‑3,3'‑二甲基联苯‑树脂经切除后得到修饰的4,4'‑二氨基‑3,3'‑二甲基联苯化合物，再经重氮化与1‑氨基‑8‑萘酚‑2,4‑二磺酸一锅法反应，直接分离纯化得到修饰的伊文氏蓝衍生物。

Description

一种制备伊文氏蓝衍生物的方法
技术领域
本发明涉及一种放射性配合物前体的制备方法，特别涉及一种简便的制备伊文氏蓝衍生物的方法。
背景技术
伊文氏蓝又称为伊文思兰，英文名为Evans blue(EB)，分子量为960.8，化学分子式为C34H24N6Na4O14S4，它是带有金属光泽的蓝色结晶，极易溶于水，微溶于乙醇，几乎不溶于苯、氯仿、***。伊文氏蓝(EB)是一种重氮类荧光染料，在550nm激发光照射下成红色荧光。伊文氏蓝(EB)在体内和体外能够以10:1摩尔比与血浆蛋白不可逆结合，形成伊文氏蓝(EB)-白蛋白复合物。
利用伊文氏蓝(EB)与白蛋白特异结合这一性质，主要应用于以下几个方面：
1、伊文氏蓝衍生物可以作为血池显像剂应用于肿瘤治疗领域
人血清白蛋白（Human serum albumin, HSA）是人血浆中丰度最高的蛋白。由于其在人体内半衰期长，可以可逆的结合运载小分子等物质的性质，常被作为药物载体用于药物的递送平台，用于糖尿病、肿瘤、风湿性关节炎和感染性疾病等。HAS也可作为影像探针，标记荧光染料后用于光学成像。陈小元等(CN103242255A)利用伊文氏蓝(EB)与血清白蛋白的高亲和力，对伊文氏蓝(EB)进行改造，到多种伊文氏蓝(EB)衍生物，用于血池显像和***显像等医疗领域，具有广阔的应用的前景。
2、伊文氏蓝衍生物可以定位修饰GLP-1药物，在保留其生物活性的基础上，延长药物的半衰期。
例如：中国专利CN104650217A中阐述，经伊文氏蓝(EB)修饰的Exendin-4，不仅保留了Exendin-4的天然生物活性，同时延长了Exendin-4在体内留存的时间，具有良好的药代动力学和药理效应，有望在临床上得到推广和应用。
以上伊文氏蓝衍生物虽然在应用上有潜在的价值，但在制备过程中，无一例外，均采用了液相合成的方法，合成条件苛刻，繁琐，需多次分离纯化，不适用于工业化生产。因此，开发简便易操作的固相合成方法，具有实际意义和应用价值。
发明内容
本发明目的是开发一种制备伊文氏蓝衍生物的新方法，主要解决现有制备方法中存在的合成步骤繁琐，周期长，操作复杂，不适合工业化生产等技术问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种制备伊文氏蓝衍生物的方法：包括以下步骤：
（1）4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯与载体树脂反应，得到4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂；
（2）4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂依次与带保护基的氨基酸及双功能螯合试剂在固相中进行偶联反应，得到多肽修饰的4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂；
（3）多肽修饰的4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂经切除后得到多肽修饰的4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯，再经重氮化与1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸一锅法反应，直接分离纯化得到多肽修饰的伊文氏蓝衍生物纯品。
本发明所述的制备方法中，步骤1中的载体树脂为CTC树脂。
本发明所述的制备方法中，步骤（2）中所述的保护基选自Fmoc-；双功能螯合剂是指DOTA及其衍生物或NOTA及其衍生物，优选为DOTA-tris(tBu)ester或NOTA-bis(tBu)ester；偶联所用的活化试剂为：HOBt/DIC、HOBt/DCC、HBTU/HOBt或TBTU/HOBt、PyBOP、HATU、HBTU试剂中的一种或二种，优选为HATU或HBTU。本发明所述的制备方法中，步骤（3）中多肽修饰的4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯在酸性条件下以NaNO2重氮化与1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸一锅法反应后，直接分离纯化得到伊文氏蓝衍生物。
其合成路线如下：
本发明的有益效果是，解决了伊文氏蓝衍生物液相制备方法中步骤繁琐，分离纯化复杂的难题，提出了一种简便快速的固相合成方法，缩短了生产周期，降低了成本，减少了环境污染，是一种适合工业化生产的技术路线。
附图说明
图1为本发明实施例1产品的LCMS图a。
图2为本发明实施例1产品的LCMS图b。
图3为本发明实施例1产品的LCMS图c。
图4为本发明实施例1产品的HPLC图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步地阐释本发明，但本发明并不仅限于这些实施例，任何根据本发明做出的若干推演和替换，都应当视为本发明的权利保护范围。
本发明所用的英文缩写对应的中文含义，如下：
Fmoc： 9-芴甲氧羰基；
TIS：三异丙基硅烷；
DCM： 二氯甲烷；
TFA： 三氟乙酸；
Prep-HPLC： 制备高效液相色谱；
DMF： N,N-二甲基甲酰胺；
CTC树脂： 2-氯三苯甲基氯树脂
DIEA:N,N-二异丙基乙胺
HATU: 2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
o-Tolidine：4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯
Fmoc-Lys(Dde)-OH： N-Fmoc-N'-[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基]-赖氨酸
DOTA-tris(tBu)ester： 三叔丁基1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸。
实施例1：DOTA-MALEIMIDE-EB的制备
合成路线如下：
其中，Fmoc-赖氨酸可选用Fmoc-Lys(Dde)-OH, Fmoc-Lys(ivDde)-OH, Fmoc-Lys(Alloc)-OH, Fmoc-Lys(Z)-OH, Fmoc-Lys(Mtt)-OH等侧链保护，不同的是，脱保护时选用不同的脱保护试剂即可。
(1)化合物1： 4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-CTC树脂(Tolidine-CTC Resin)的制备
将5g (5 mmol, 1 eq) CTC树脂 (取代度: 1 mmol/g) 加入到多肽合成管中，加入DMF(20 mL)浸泡溶胀30min, 然后用质量百分浓度5% DIEA/ DMF溶液 (2×20 mL)洗2遍，最后，再用DMF(10 mL)洗一遍。依次加入DMF(10mL)，4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯(3.2 g,15 mmol, 3 eq) 和DIEA(5.3 mL, 30 mmol, 6 eq), 震荡反应5h。反应完毕后，滤去反应液，DMF (3×20 mL)洗三遍，然后加入甲醇(2 mL)和DIEA(0.5 mL)的DMF溶液(10 mL)，震荡反应30min，最后滤去反应液，DMF (2×20 mL)洗两遍，得到4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂，化合物1：4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-CTC树脂(Tolidine-CTC Resin)。
(2)化合物2：赖氨酸(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(Lys(Dde)-Tolidine-CTC Resin)的制备
Fmoc-Lys(Dde)-OH (8.0 g, 15 mmol, 3 eq)的DMF(15mL)溶液加入到上步产物的多肽合成管中，然后加入HATU (5.7 g, 15 mmol, 3.0 eq)和DIEA(5.3 mL, 30 mmol, 6eq)，室温震荡反应3h。最后滤去反应液，DMF (2×20 mL)洗两遍。然后加入质量百分浓度20%的哌啶/DMF(20mL)溶液，反应2次(第一次5min, 第二次25min)，反应完毕后，滤去反应液，DMF (3×20 mL)洗三遍，得到化合物2, 赖氨酸(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(Lys(Dde)-Tolidine-CTC Resin)。
(3)化合物3：DOTA(tBu)-赖氨酸(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys(Dde)-Tolidine-CTC Resin)的制备
取上步产物Lys(Dde)-Tolidine-CTC Resin (2.6mmol, 1 eq)，加入DOTA-tris(tBu)ester(4 g, 7 mmol, 2.7 eq)的DMF(10mL)溶液，然后加入HATU (3.0 g, 7.8 mmol, 2.9eq)和DIEA(2.1 mL , 13 mmol, 5 eq)，室温震荡反应7h。反应完毕后，滤去反应液，DMF (3×20 mL)洗三遍，得到化合物3，DOTA(tBu)-赖氨酸(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys(Dde)-Tolidine-CTCResin)。
(4)化合物4：DOTA(tBu)-赖氨酸-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys-Tolidine-CTC Resin)的制备
取上步产物DOTA(tBu)-Lys(Dde)-Tolidine-CTC Resin，加入质量百分浓度2%水合肼的DMF(20mL)溶液，震荡反应2次，每次15min。反应完毕后，滤去反应液，DMF (3×15mL)洗三遍，得到化合物4，DOTA(tBu)-赖氨酸-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys-Tolidine-CTC Resin)。
(5)化合物5：DOTA(tBu)-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys(Mal)-Tolidine-CTC Resin)的制备
取上步产物DOTA(tBu)-Lys-Tolidine-CTC Resin，加入3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(2.0 g, 7.5 mmol, 3 eq)的DMF(20mL)溶液和DIEA(2.6 mL , 15 mmol, 6 eq)，室温震荡反应2h。反应完毕后，滤去反应液，DMF (2×20mL)洗两遍，甲醇(1×20 mL)洗一遍，放置干燥，得到化合物5，DOTA(tBu)-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys(Mal)-Tolidine-CTC Resin)。
(6)化合物6：DOTA-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯(DOTA-Lys(Mal)-Tolidine)的制备
取上步产物，加入TFA(20 mL)和TIS(1 mL)，室温震荡反应4h。反应完毕后，过滤除去CTC树脂，收集滤液蒸干，加入冷***沉降，白色固体析出，过滤干燥得到3.3 g粗品，化合物6：DOTA-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯 (DOTA-Lys(Mal)-Tolidine)，无需纯化，直接用于下一步反应。
(7)化合物7：DOTA-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-伊文氏蓝 (DOTA-Lys(Mal)-EB)的制备
取上步产物DOTA-Lys(Mal)-Tolidine (500 mg, 0.57 mmol)溶于乙腈(10 mL)中，0℃下，加入NaNO2 (118 mg, 1.7 mmol, 3eq)的水溶液10mL，然后缓慢滴加浓盐酸(118 µL,36%, 3 eq)，继续搅拌20min，备用。
另取一个圆底烧瓶，加入1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠盐(389 mg, 1.14mmol, 2 eq)和水(10mL)， 0℃下，分批加入NaHCO3(300 mg, 3.6 mmol, 6.3 eq)。然后，在冰浴条件下，加入上步的备用反应液，搅拌30 min，反应液变成紫色。反应完毕后，直接制备色谱纯化，得到470 mg化合物7，DOTA-Lys(Mal)-EB，纯度>95%。
纯化方法：
C-18色谱柱，检测波长：214 nm。
流动相A：0.1%TFA/H2O
流动相B：0.1%TFA /ACN。
梯度洗脱：首先以质量百分浓度7%的流动相B洗脱10 min，然后在70 min内逐步增加到10～20%的流动相B，流速为35 mL/min。收集目标峰组分，冷冻干燥，得到DOTA-Lys(Mal)-EB纯品，HPLC纯度：98%。产品的LCMS图见图1-3，产品的HPLC图见图4。
实施例2
(1)化合物1： 4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-CTC树脂(Tolidine-CTC Resin)的制备
将5g (5 mmol, 1 eq) CTC树脂 (取代度: 1 mmol/g) 加入到多肽合成管中，加入DMF(20 mL)浸泡溶胀30min, 然后用质量百分浓度5% DIEA/ DMF溶液 (2×20 mL)洗2遍，最后，再用DMF(10 mL)洗一遍。依次加入DMF(10mL)，4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯(3.2 g,15 mmol, 3 eq) 和DIEA(5.3 mL, 30 mmol, 6 eq), 震荡反应5h。反应完毕后，滤去反应液，DMF (3×20 mL)洗三遍，然后加入甲醇(2 mL)和DIEA(0.5 mL)的DMF溶液(10 mL)，震荡反应30min，最后滤去反应液，DMF (2×20 mL)洗两遍，得到4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂，化合物1：4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-CTC树脂(Tolidine-CTC Resin)。
(2)化合物2：赖氨酸(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己基亚甲基)-3-甲基丁基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(Lys(ivDde)-Tolidine-CTC Resin)的制备
Fmoc-Lys(ivDde)-OH (8.6 g, 15 mmol, 3 eq)的DMF(15mL)溶液加入到上步产物的多肽合成管中，然后加入HBTU (5.7 g, 15 mmol, 3.0 eq)和DIEA(5.3 mL, 30 mmol, 6eq)，室温震荡反应3h。最后滤去反应液，DMF (2×20 mL)洗两遍。然后加入质量百分浓度20%的哌啶/DMF(20mL)溶液，反应2次(第一次5min, 第二次25min)，反应完毕后，滤去反应液，DMF (3×20 mL)洗三遍，得到化合物2, 赖氨酸(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己基亚甲基)-3-甲基丁基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(Lys(ivDde)-Tolidine-CTCResin)。
(3)化合物3：DOTA(tBu)-赖氨酸(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己基亚甲基)-3-甲基丁基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys(ivDde)-Tolidine-CTCResin)的制备
取上步产物Lys(ivDde)-Tolidine-CTC Resin (2.6mmol, 1 eq)，加入DOTA-tris(tBu)ester(4 g, 7 mmol, 2.7 eq)的DMF(10mL)溶液，然后加入HBTU (3.0 g, 7.8 mmol,2.9 eq)和DIEA(2.1 mL , 13 mmol, 5 eq)，室温震荡反应7h。反应完毕后，滤去反应液，DMF (3×20 mL)洗三遍，得到化合物3，DOTA(tBu)-赖氨酸(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己基亚甲基)-3-甲基丁基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys(ivDde)-Tolidine-CTC Resin)。
(4)化合物4：DOTA(tBu)-赖氨酸-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys-Tolidine-CTC Resin)的制备
取上步产物DOTA(tBu)-Lys(ivDde)-Tolidine-CTC Resin，加入质量百分浓度2%水合肼的DMF(20mL)溶液，震荡反应2次，每次15min。反应完毕后，滤去反应液，DMF (3×15mL)洗三遍，得到化合物4，DOTA(tBu)-赖氨酸-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys-Tolidine-CTC Resin)。
(5)化合物5：DOTA(tBu)-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys(Mal)-Tolidine-CTC Resin)的制备
取上步产物DOTA(tBu)-Lys-Tolidine-CTC Resin，加入3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(2.0 g, 7.5 mmol, 3 eq)的DMF(20mL)溶液和DIEA(2.6 mL , 15 mmol, 6 eq)，室温震荡反应2h。反应完毕后，滤去反应液，DMF (2×20mL)洗两遍，甲醇(1×20 mL)洗一遍，放置干燥，得到化合物5，DOTA(tBu)-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys(Mal)-Tolidine-CTC Resin)。
(6)化合物6：DOTA-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯(DOTA-Lys(Mal)-Tolidine)的制备
取上步产物，加入TFA(20 mL)和TIS(1 mL)，室温震荡反应4h。反应完毕后，过滤除去CTC树脂，收集滤液蒸干，加入冷***沉降，白色固体析出，过滤干燥得到3.3 g粗品，化合物6：DOTA-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯 (DOTA-Lys(Mal)-Tolidine)，无需纯化，直接用于下一步反应。
(7)化合物7：DOTA-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-伊文氏蓝 (DOTA-Lys(Mal)-EB)的制备
取上步产物DOTA-Lys(Mal)-Tolidine (500 mg, 0.57 mmol)溶于乙腈(10 mL)中，0℃下，加入NaNO2 (118 mg, 1.7 mmol, 3eq)的水溶液10mL，然后缓慢滴加浓盐酸(118 µL,36%, 3 eq)，继续搅拌20min，备用。
另取一个圆底烧瓶，加入1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠盐(389 mg, 1.14mmol, 2 eq)和水(10mL)， 0℃下，分批加入NaHCO3(300 mg, 3.6 mmol, 6.3 eq)。然后，在冰浴条件下，加入上步的备用反应液，搅拌30 min，反应液变成紫色。反应完毕后，直接制备色谱纯化，得到470 mg化合物7，DOTA-Lys(Mal)-EB，纯度>95%。
实施例3
(1)化合物1： 4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-CTC树脂(Tolidine-CTC Resin)的制备
将5g (5 mmol, 1 eq) CTC树脂 (取代度: 1 mmol/g) 加入到多肽合成管中，加入DMF(20 mL)浸泡溶胀30min, 然后用质量百分浓度5% DIEA/ DMF溶液 (2×20 mL)洗2遍，最后，再用DMF(10 mL)洗一遍。依次加入DMF(10mL)，4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯(3.2 g,15 mmol, 3 eq) 和DIEA(5.3 mL, 30 mmol, 6 eq), 震荡反应5h。反应完毕后，滤去反应液，DMF (3×20 mL)洗三遍，然后加入甲醇(2 mL)和DIEA(0.5 mL)的DMF溶液(10 mL)，震荡反应30min，最后滤去反应液，DMF (2×20 mL)洗两遍，得到4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂，化合物1：4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-CTC树脂(Tolidine-CTC Resin)。
(2)化合物2：赖氨酸(-N’-甲基三苯甲基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(Lys(Mtt)-Tolidine-CTC Resin)的制备
Fmoc-Lys(Mtt)-OH (9.4 g, 15 mmol, 3 eq)的DMF(15mL)溶液加入到上步产物的多肽合成管中，然后加入HATU (5.7 g, 15 mmol, 3.0 eq)和DIEA(5.3 mL, 30 mmol, 6eq)，室温震荡反应3h。最后滤去反应液，DMF (2×20 mL)洗两遍。然后加入质量百分浓度20%的哌啶/DMF(20mL)溶液，反应2次(第一次5min, 第二次25min)，反应完毕后，滤去反应液，DMF (3×20 mL)洗三遍，得到化合物2, 赖氨酸(N’-甲基三苯甲基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(Lys(Mtt)-Tolidine-CTC Resin)。
(3)化合物3：DOTA(tBu)-赖氨酸(-N’-甲基三苯甲基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys(Mtt)-Tolidine-CTC Resin)的制备
取上步产物Lys(Mtt))-Tolidine-CTC Resin (2.5mmol, 1 eq)，加入DOTA-tris(tBu)ester(3.9 g, 6.7 mmol, 2.7 eq)的DMF(10mL)溶液，然后加入HATU (2.7 g, 7.2 mmol,2.9 eq)和DIEA(2.0 mL , 12.5 mmol, 5 eq)，室温震荡反应7h。反应完毕后，滤去反应液，DMF (3×20 mL)洗三遍，得到化合物3，DOTA(tBu)-赖氨酸(N’-甲基三苯甲基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys(Mtt))-Tolidine-CTC Resin)。
(4)化合物4：DOTA(tBu)-赖氨酸-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys-Tolidine-CTC Resin)的制备
取上步产物DOTA(tBu)-Lys(Mtt)-Tolidine-CTC Resin，加入质量百分浓度1%TFA/DCM的DMF(20mL)溶液，震荡反应2次，每次15min。反应完毕后，滤去反应液，DMF (3×15mL)洗三遍，得到化合物4，DOTA(tBu)-赖氨酸-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys-Tolidine-CTC Resin)。
(5)化合物5：DOTA(tBu)-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys(Mal)-Tolidine-CTC Resin)的制备
取上步产物DOTA(tBu)-Lys-Tolidine-CTC Resin，加入3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(2.0 g, 7.5 mmol, 3 eq)的DMF(20mL)溶液和DIEA(2.6 mL , 15 mmol, 6 eq)，室温震荡反应2h。反应完毕后，滤去反应液，DMF (2×20mL)洗两遍，甲醇(1×20 mL)洗一遍，放置干燥，得到化合物5，DOTA(tBu)-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys(Mal)-Tolidine-CTC Resin)。
(6)化合物6：DOTA-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯(DOTA-Lys(Mal)-Tolidine)的制备
取上步产物，加入TFA(20 mL)和TIS(1 mL)，室温震荡反应4h。反应完毕后，过滤除去CTC树脂，收集滤液蒸干，加入冷***沉降，白色固体析出，过滤干燥得到3.3 g粗品，化合物6：DOTA-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯 (DOTA-Lys(Mal)-Tolidine)，无需纯化，直接用于下一步反应。
(7)化合物7：DOTA-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-伊文氏蓝 (DOTA-Lys(Mal)-EB)的制备
取上步产物DOTA-Lys(Mal)-Tolidine (400 mg, 0.45 mmol)溶于乙腈(10 mL)中，0℃下，加入NaNO2 (94 mg, 1.3 mmol, 3eq)的水溶液10mL，然后缓慢滴加浓盐酸(94 µL,36%, 3 eq)，继续搅拌20min，备用。
另取一个圆底烧瓶，加入1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠盐(311 mg, 0.9 mmol,2 eq)和水(10mL)， 0℃下，分批加入NaHCO3(240 mg, 2.8 mmol, 6.0 eq)。然后，在冰浴条件下，加入上步的备用反应液，搅拌30 min，反应液变成紫色。反应完毕后，直接制备色谱纯化，得到300 mg化合物7，DOTA-Lys(Mal)-EB，纯度>95%。
实施例4
(1)化合物1： 4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-CTC树脂(Tolidine-CTC Resin)的制备
将5g (5 mmol, 1 eq) CTC树脂 (取代度: 1 mmol/g) 加入到多肽合成管中，加入DMF(20 mL)浸泡溶胀30min, 然后用质量百分浓度5% DIEA/ DMF溶液 (2×20 mL)洗2遍，最后，再用DMF(10 mL)洗一遍。依次加入DMF(10mL)，4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯(3.2 g,15 mmol, 3 eq) 和DIEA(5.3 mL, 30 mmol, 6 eq), 震荡反应5h。反应完毕后，滤去反应液，DMF (3×20 mL)洗三遍，然后加入甲醇(2 mL)和DIEA(0.5 mL)的DMF溶液(10 mL)，震荡反应30min，最后滤去反应液，DMF (2×20 mL)洗两遍，得到4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂，化合物1：4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-CTC树脂(Tolidine-CTC Resin)。
(2)化合物2：赖氨酸((2-丙烯氧基)羰基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(Lys(Alloc)-Tolidine-CTC Resin)的制备
Fmoc-Lys(Alloc)-OH (6.8 g, 15 mmol, 3.0 eq)的DMF(15mL)溶液加入到上步产物的多肽合成管中，然后加入HBTU (5.7 g, 15 mmol, 3.0 eq)和DIEA(5.3 mL, 30 mmol,6.0 eq)，室温震荡反应3h。最后滤去反应液，DMF (2×20 mL)洗两遍。然后加入质量百分浓度20%的哌啶/DMF(20mL)溶液，反应2次(第一次5min, 第二次25min)，反应完毕后，滤去反应液，DMF (3×20 mL)洗三遍，得到化合物2, 赖氨酸(2-丙烯氧基)羰基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(Lys(Alloc)-Tolidine-CTC Resin)。
(3)化合物3：DOTA(tBu)-赖氨酸((2-丙烯氧基)羰基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys(Alloc)-Tolidine-CTC Resin)的制备
取上步产物Lys(Alloc)-Tolidine-CTC Resin (2.0mmol, 1 eq)，加入DOTA-tris(tBu)ester(3.0 g, 5.4 mmol, 2.7 eq)的DMF(10mL)溶液，然后加入HBTU (2.2 g, 5.8mmol, 2.9 eq)和DIEA(1.6 mL , 9.7 mmol, 5 eq)，室温震荡反应7h。反应完毕后，滤去反应液，DMF (3×20 mL)洗三遍，得到化合物3，DOTA(tBu)-赖氨酸((2-丙烯氧基)羰基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys(Alloc)-Tolidine-CTC Resin)。
(4)化合物4：DOTA(tBu)-赖氨酸-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys-Tolidine-CTC Resin)的制备
取上步产物DOTA(tBu)-Lys(Alloc)-Tolidine-CTC Resin，加入Pd(PPh3)4(3eq)和DMF(20mL)和乙酸（1mL），震荡反应2次，每次15min。反应完毕后，滤去反应液，DMF (3×15mL)洗三遍，得到化合物4，DOTA(tBu)-赖氨酸-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys-Tolidine-CTC Resin)。
(5)化合物5：DOTA(tBu)-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys(Mal)-Tolidine-CTC Resin)的制备
取上步产物DOTA(tBu)-Lys-Tolidine-CTC Resin，加入3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(1.5 g, 5.6 mmol, 3 eq)的DMF(20mL)溶液和DIEA(1.9 mL , 11.2 mmol, 6eq)，室温震荡反应2h。反应完毕后，滤去反应液，DMF (2×20mL)洗两遍，甲醇(1×20 mL)洗一遍，放置干燥，得到化合物5，DOTA(tBu)-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(DOTA(tBu)-Lys(Mal)-Tolidine-CTC Resin)。
(6)化合物6：DOTA-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯(DOTA-Lys(Mal)-Tolidine)的制备
取上步产物，加入TFA(20 mL)和TIS(1 mL)，室温震荡反应4h。反应完毕后，过滤除去CTC树脂，收集滤液蒸干，加入冷***沉降，白色固体析出，过滤干燥得到3.3 g粗品，化合物6：DOTA-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯 (DOTA-Lys(Mal)-Tolidine)，无需纯化，直接用于下一步反应。
(7)化合物7：DOTA-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-伊文氏蓝 (DOTA-Lys(Mal)-EB)的制备
取上步产物DOTA-Lys(Mal)-Tolidine (375 mg, 0.42 mmol)溶于乙腈(10 mL)中，0℃下，加入NaNO2 (88.5 mg, 1.3 mmol, 3eq)的水溶液10mL，然后缓慢滴加浓盐酸(88.5 µL,36%, 3 eq)，继续搅拌20min，备用。
另取一个圆底烧瓶，加入1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠盐(291 mg, 0.85mmol, 2 eq)和水(10mL)， 0℃下，分批加入NaHCO3(225 mg, 2.7 mmol, 6.0 eq)。然后，在冰浴条件下，加入上步的备用反应液，搅拌30 min，反应液变成紫色。反应完毕后，直接制备色谱纯化，得到300 mg化合物7，DOTA-Lys(Mal)-EB，纯度>95%。
实施例5：NOTA-MALEIMIDE-EB的制备
(1)化合物1： 4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-CTC树脂(Tolidine-CTC Resin)的制备
将5g (5 mmol, 1 eq) CTC树脂 (取代度: 1 mmol/g) 加入到多肽合成管中，加入DMF(20 mL)浸泡溶胀30min, 然后用质量百分浓度5% DIEA/ DMF溶液 (2×20 mL)洗2遍，最后，再用DMF(10 mL)洗一遍。依次加入DMF(10mL)，4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯(3.2 g,15 mmol, 3 eq) 和DIEA(5.3 mL, 30 mmol, 6 eq), 震荡反应5h。反应完毕后，滤去反应液，DMF (3×20 mL)洗三遍，然后加入甲醇(2 mL)和DIEA(0.5 mL)的DMF溶液(10 mL)，震荡反应30min，最后滤去反应液，DMF (2×20 mL)洗两遍，得到4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂，化合物1：4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-CTC树脂(Tolidine-CTC Resin)。
(2)化合物2：赖氨酸(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(Lys(Dde)-Tolidine-CTC Resin)的制备
Fmoc-Lys(Dde)-OH (8.0 g, 15 mmol, 3 eq)的DMF(15mL)溶液加入到上步产物的多肽合成管中，然后加入HBTU (5.7 g, 15 mmol, 3.0 eq)和DIEA(5.3 mL, 30 mmol, 6eq)，室温震荡反应3h。最后滤去反应液，DMF (2×20 mL)洗两遍。然后加入质量百分浓度20%的哌啶/DMF(20mL)溶液，反应2次(第一次5min, 第二次25min)，反应完毕后，滤去反应液，DMF (3×20 mL)洗三遍，得到化合物2, 赖氨酸(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(Lys(Dde)-Tolidine-CTC Resin)。
(3)NOTA(tBu)-赖氨酸(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(NOTA(tBu)-Lys(Dde)-Tolidine-CTC Resin)的制备
取上步产物Lys(Dde)-Tolidine-CTC Resin (2.6mmol, 1 eq)，加入NOTA-bis(tBu)ester(2.9 g, 7 mmol, 2.7 eq)的DMF(10mL)溶液，然后加入HBTU (3.0 g, 7.8 mmol,2.9 eq)和DIEA(2.1 mL , 13 mmol, 5 eq)，室温震荡反应7h。反应完毕后，滤去反应液，DMF (3×20 mL)洗三遍，得到：NOTA(tBu)-赖氨酸(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(NOTA(tBu)-Lys(Dde)-Tolidine-CTCResin)。
(4) NOTA(tBu)-赖氨酸-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(NOTA (tBu)-Lys-Tolidine-CTC Resin)的制备
取上步产物NOTA(tBu)-Lys(Dde)-Tolidine-CTC Resin，加入质量百分浓度2%水合肼的DMF(20mL)溶液，震荡反应2次，每次15min。反应完毕后，滤去反应液，DMF (3×15mL)洗三遍，得到：NOTA(tBu)-赖氨酸-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(NOTA(tBu)-Lys-Tolidine-CTC Resin)。
(5) NOTA(tBu)-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(NOTA(tBu)-Lys(Mal)-Tolidine-CTC Resin)的制备
取上步产物NOTA(tBu)-Lys-Tolidine-CTC Resin，加入3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(2.0 g, 7.5 mmol, 3 eq)的DMF(20mL)溶液和DIEA(2.6 mL , 15 mmol, 6 eq)，室温震荡反应2h。反应完毕后，滤去反应液，DMF (2×20mL)洗两遍，甲醇(1×20 mL)洗一遍，放置干燥，得到：NOTA(tBu)-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂(NOTA(tBu)-Lys(Mal)-Tolidine-CTC Resin)。
(6)NOTA-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯 (NOTA-Lys(Mal)-Tolidine)的制备
取上步产物，加入TFA(20 mL)和TIS(1 mL)，室温震荡反应4h。反应完毕后，过滤除去CTC树脂，收集滤液蒸干，加入冷***沉降，白色固体析出，过滤干燥得到2.5 g粗品：NOTA-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯 (NOTA-Lys(Mal)-Tolidine)，无需纯化，直接用于下一步反应。
(7)NOTA-赖氨酸(3-马来酰亚胺基)-伊文氏蓝 (NOTA-Lys(Mal)-EB)的制备
取上步产物NOTA-Lys(Mal)-Tolidine (440 mg, 0.57 mmol)溶于乙腈(10 mL)中，0℃下，加入NaNO2 (118 mg, 1.7 mmol, 3eq)的水溶液10mL，然后缓慢滴加浓盐酸(118 µL,36%, 3 eq)，继续搅拌20min，备用。
另取一个圆底烧瓶，加入1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸单钠盐(389 mg, 1.14mmol, 2 eq)和水(10mL)， 0℃下，分批加入NaHCO3(300 mg, 3.6 mmol, 6.3 eq)。然后，在冰浴条件下，加入上步的备用反应液，搅拌30 min，反应液变成紫色。反应完毕后，直接制备色谱纯化，得到目标物：NOTA-Lys(Mal)-EB(320 mg)，纯度>95%。

Claims (7)

1.一种制备伊文氏蓝衍生物的方法，其特征是：包括以下步骤：（1）4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯与载体树脂反应，得到4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂；（2）4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂依次与带保护基的氨基酸及双功能螯合试剂在固相中进行偶联反应，得到多肽修饰的4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂；（3）修饰的4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯-树脂经切除得到修饰的4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯化合物，再经重氮化与1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸一锅法反应，直接分离纯化后得到修饰的伊文氏蓝衍生物。
2.根据权利要求1所述的一种制备伊文氏蓝衍生物的方法，其特征是：步骤（1）中载体树脂为CTC树脂。
3.根据权利要求1所述的一种制备伊文氏蓝衍生物的方法，其特征是：保护基为Fmoc-。
4.根据权利要求1所述的一种制备伊文氏蓝衍生物的方法，其特征是：步骤（2）中双功能螯合剂是指DOTA及其衍生物或NOTA及其衍生物。
5.根据权利要求1所述的一种制备伊文氏蓝衍生物的方法，其特征是：步骤（2）中偶联所用的活化试剂为：HOBt/DIC、HOBt/DCC、HBTU/HOBt或TBTU/HOBt、PyBOP、HATU、HBTU试剂中的一种或二种。
6.根据权利要求5所述的一种制备伊文氏蓝衍生物的方法，其特征是：活化试剂为HATU或HBTU。
7.根据权利要求1所述的一种制备伊文氏蓝衍生物的方法，其特征是：步骤（3）中多肽修饰的4,4'-二氨基-3,3'-二甲基联苯在酸性条件下以NaNO2重氮化与1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸一锅法反应后，直接分离纯化得到伊文氏蓝衍生物。
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