CN109475598A - 眼部疾病的治疗 - Google Patents

Abstract

提供了使用多肽FKBP‑L及其肽片段的眼部疾病(并且更特别地是角膜病症)治疗。

Description

眼部疾病的治疗

技术领域

本发明涉及使用多肽FKBP-L及其肽片段来治疗眼部疾病(并且更特别地是角膜病症)。

背景技术

健康的角膜对视力至关重要。根据WHO，角膜盲(corneal blindness)是继白内障、青光眼和年龄相关性黄斑变性之后全球失明的第四位主要原因。全世界每年有多于700万人因角膜瘢痕形成和眼内血管异常生长(新血管形成)而失明。在其中发生角膜损伤的临床情况下，必须使瘢痕形成最小化，并且由此使失明减至最小限度。目前用于新血管形成诱发的角膜混浊损伤的治疗是角膜移植，然而，在该高风险群体中，新血管形成的存在本身就导致移植之后预后更差。当将角膜移植物置于无血管受植床中(低风险角膜移植术)时，在表面类固醇的覆盖下，2年移植物存活率接近90％(Küchle等，2002)。在血管化受植床(高风险角膜移植术)中，移植物2年存活率显著降低至低于50％(Cursiefen等，2002)。缝合总是诱导显著的新血管应答，这也与角膜排斥的风险提高相关；因此，甚至将角膜移植物通过自身固定在适当位置的方式也会提高移植物排斥的风险。由于目前可用于这种类型眼病的治疗(例如皮质类固醇)具有有限的效力并且具有副作用的风险，因此迫切需要新的治疗选择，例如本申请中提出的那些。

干眼综合征是极其常见的问题，其影响多至30％群体(Clegg等，2006)，在严重的情况下，其可导致与显著炎症相关的眼表损伤。干眼综合征中的炎症与炎性细胞的浸润和免疫标志物的表达上调相关。该病症主要通过皮质类固醇和/或T细胞抑制剂环孢素来控制(Pflugfelder，2003)。长期皮质类固醇的已知相关并发症使寻找替代的有效治疗成为高度优先事项。由于刺状痛(stinging)和不适而对环孢素缺乏耐受性以及其在显著数目的患者中缺乏效力意味着寻求其他有效治疗极其重要。

儿童期眼红斑痤疮(childhood ocular rosacea)，又称为睑角膜结膜炎，是一种不常见的病症，其特征在于慢性后睑缘炎和前睑缘炎。在一些情况下，相关的眼部炎症可以是显著的，导致角膜浸润、溃疡和角膜血管形成(Doan等，2007)。潜在的病理状况被认为是由于原发性睑板腺炎，其次是细菌过度生长和T细胞介导的炎症。治疗的支柱是经口或表面抗生素、表面类固醇(topical steroid)和/或作为类固醇减量剂(steroid reducingagent)之环孢素的组合。通常可在这种情况下发生的角膜血管形成快速且侵袭性地发生，需要高剂量的表面类固醇以降低或停止其进展。这种情况需要更好的管理策略，其是有效的并且降低目前对儿童眼部长期使用表面类固醇的需求。

诱导角膜内血管消退的大多数治疗策略已经使用抗VEGF治疗，这种类型的治疗如果其在病症的早期发生的话通常相当成功，然而一旦血管已充分建立，其就对于抗VEGF治疗无响应性。任何目前的抗VEGF方法的难点在于其通常需要长期多次注射，特别是由于病症通常起起伏伏，产生更多炎症并且促进进一步的血管形成。目前没有医学治疗可用于去除已在角膜内充分建立的血管。在这些情况下，唯一的治疗是通过使用激光治疗或烧灼术，这两种治疗都远不能令人满意，往往需要多次外科手术干预(Gupta&Illingworth，2011)。

在临床上需要提供可降低或预防角膜新血管形成和/或减轻或预防炎性眼病的新治疗剂。这样的治疗剂可在作为独立治疗或在与其他治疗剂联合使用时具有重要意义。

发明概述

先前已将FKBP-L多肽及其肽片段描述为在癌症(特别是实体瘤)的治疗中具有临床潜力的抗血管生成剂。

现在已将FKBP-L的肽片段在眼部疾病的动物模型(例如大鼠角膜缝合模型和小鼠实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis，EAU)模型)中进行了测试。出乎意料的是，已观察到，向角膜表面施用(topical administration)FKBP-L肽片段导致血管形成显著降低。此外，FKBP-L肽在注射到眼中时和在肠胃外(腹膜内)施用时都也在眼中发挥抗炎剂的作用。这些实验发现支持FKBP-L及其生物活性肽片段在治疗许多以新血管形成和/或炎症为特征/与新血管形成和/或炎症相关的眼部疾病中的临床效用。

因此，根据本发明的第一方面，提供了FKBP-L多肽或其生物活性肽片段，其用于治疗或预防角膜新血管形成。

在一个实施方案中，提供了FKBP-L多肽或其生物活性肽片段，其用于预防或治疗角膜移植手术之后的角膜新血管形成。

在另一个实施方案中，提供了FKBP-L多肽或其生物活性肽片段，其用于治疗或预防眼部炎性病症。

在某些实施方案中，眼部炎性病症是葡萄膜炎、干眼综合征或睑角膜结膜炎。

本发明还提供了在哺乳动物对象中治疗或预防角膜新血管形成的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的FKBP-L多肽或其生物活性肽片段。

一个实施方案涉及在已经经历角膜移植手术的对象中治疗或预防角膜新血管形成的方法。

本发明还提供了在哺乳动物对象中治疗或预防眼部炎性病症的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的FKBP-L多肽或其生物活性肽片段。

在某些实施方案中，眼部炎性病症是葡萄膜炎、干眼综合征或睑角膜结膜炎。

在一个实施方案中，FKBP-L多肽或其生物活性肽片段表面施用于眼部。

在一个实施方案中，FKBP-L多肽或其生物活性肽片段通过结膜下注射、基质内注射或眼内注射施用。

在本发明上述方面中每一个的一些优选实施方案中，用于所述治疗/预防的FKBP-L的生物活性肽片段包含氨基酸序列IRQQPRDPPTETLELEVSPDPAS(SEQ ID NO：3)，或与其具有至少90％同一性的序列。

在另一些实施方案中，用于所述治疗/预防的FKBP-L多肽包含如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％同一性的序列。

在另一些实施方案中，用于所述治疗/预防的FKBP-L的生物活性肽片段包含如SEQID No 4至23中任一个所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％同一性的序列。

在一些优选实施方案中，待治疗的对象是人。

下文中将进一步详细描述本发明的特征。应理解，本发明的应用不限于以下权利要求书、说明书和附图中阐述的细节。本发明能够具有其他实施方案并且能够以多种方式实践或实施。

附图简述

将参照以下附图进一步理解本发明。

图1：大鼠中缝合诱导的新血管形成。黑色箭头指示缝合线的位置，且白色箭头指示新血管形成。

图2：结膜下注射-(A)经曲安西龙处理的大鼠(左图)、PBS对照大鼠(中间图)和经ALM201处理的大鼠(右图)中由缝合诱导的新血管形成。(B)与对照相比的结膜下注射曲安西龙或ALM201的作用。

图3：表面处理-(A)PBS对照大鼠(左图)和经ALM201处理的大鼠(右图)中由缝合诱导的新血管形成。(B)与表面对照相比的表面ALM201的作用。

图4：用结膜下注射***(左图)、ALM201(右图)或PBS对照(中间图)处理的Hooded Lister大鼠中缝合诱导的新血管形成。

图5：在处理过程期间实验小鼠的体重。在10天处理期期间每天测量体重一次。箭头指示ALM201+***处理组中在第3至5天期间两只小鼠的体重下降(E)。

图6：EAU小鼠的视网膜炎症和临床评分。(A)来自发炎小鼠视网膜的示例性眼底图像。(B至F)向小鼠免疫接种IRBP肽1-20。从p.i.第14天开始，每天用PBS(B)、或ALM2010.3mg/kg(C)、或AML2013mg/kg(D)、***0.5mg/kg(E)、或ALM2010.3mg/kg+***0.5mg/kg(F)处理小鼠一次。在p.i.第24天拍摄眼底图像(B至E)，并且使用标准分级***(Xu等，2008a)获得临床评分(G)。

图7：不同组小鼠中EAU的临床评分，其显示在ALM201处理的情况下EAU模型中随时间的变化。使用TEFI***在p.i.第14天和p.i.第24天拍摄实验小鼠的眼底图像。使用先前所述的标准评分***(Xu等，2008a)对临床疾病进行分级。**，P＜0.01，配对t检验(pairedStudent’s t test)。

图8：不同组小鼠中EAU的组织学和组织学评分。在10天的治疗之后，处死小鼠并收集眼用于标准H&E染色。将来自每只眼的不同层的至少三个切片用于组织学评分分析。(A)来自经PBS处理的EAU小鼠的图像。(B)来自经ALM2010.3mg/kg处理的EAU小鼠的图像。(C至D)来自经ALM2013mg/kg处理的小鼠的图像。(E)来自经***处理的小鼠的图像。(F，G)来自经***+ALM2013mg/kg处理的小鼠的图像。(H)对每个处理组小鼠的组织学评分进行整理并绘制成散点图。L，晶状体；Vi，玻璃体腔；GL，神经节层；INL，内核层；ONL，外核层；Ch，脉络膜；POS，光感受器外段。与经PBS处理的组相比，*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001，Mann-Whitney U检验。

图9：(A)m/z 2576.303±0.005Da的肽的FTICR质谱。标准品(STD)100nM，组织外定位(spotting offtissue)；a2)STD 100nM，组织上(on tissue)；a3)肽的理论单一同位素分布。用a4)100μM和a5)100nM肽表面处理角膜组织。观察到的肽单一同位素质量与理论分布一致(在350K质量分辨力下，质量精确度为<5ppm)；(B)m/z 2576.303±0.005Da的ALM201的MALDI-FTICR-MSI热图分布；(C)以下内源性代谢物的热图：m/z 1028.135±0.025Da，主要分布于角膜中；1444.584±0.025Da，主要分布于晶状体中；782.5799±0.025Da，主要分布于房水和玻璃体液中；780.5451±0.025Da，分布在肌肉中(蓝色)；835.5891±0.025Da和分布在整个眼中的肽，2576.303±0.025Da。信号强度以所示的比例描绘。比例尺为1000μm。数据经RMS归一化。空间分辨率为40至50μm。

图10：经H&E染色的大鼠眼切片和在2576.3±0.1Da的MALDI-MSI图像的叠加。每天用100μM的ALM201处理正常眼持续3天，并随后在最后一次处理之后15分钟将眼摘出。图像显示，大部分肽与玻璃体液和可能的晶状体共定位。肽还共定位于角膜、巩膜、脉络膜和视网膜中(空间分辨率为约20μm)。

图11：通过苏木精和伊红(H&E)染色的组织学分析，其显示在缝合和处理之后第6天与经处理样品(ALM201，1μM或100μM)相比对照样品(PBS或***)中细胞的浸润提高。(A)每个实验组的经苏木精和伊红染色切片。白色箭头指示缝合，并且黑色箭头指示血管(比例尺＝500μm)。下面的图示出了来自每个处理组的切片中CD68+细胞的分布。量化每个实验组中总浸润细胞的数目(B)和CD68+浸润细胞的数目(C)，其中与经肽处理的组相比，对照组中存在更高数目的浸润细胞。

图12：实施例4中所述的ALM201浓度滴定实验的示意图。

图13：(A)用PBS(载剂对照)、***(阳性对照)和数种不同浓度的ALM201(0.01μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM)处理6天之后大鼠眼的临床照片；(B至D)临床评分图，其显示在每种浓度的ALM201以及对照PBS和***下的血管到缝合线的距离(B)、血管密度(C)和炎症(D)。

图14：H&E图像示出了缝合线***之后并且随后用ALM201肽处理之后角膜上皮和支持基质组织的组织学变化。该染色用于计数细胞浸润并且找到缝合区域。黑色箭头＝缝合线。

图15：将相邻的载片用于免疫组织化学染色以显示指定处理组中CD44表达的差异。

图16：将相邻的载片用于免疫组织化学染色以显示指定处理组中FKBPL表达的差异。

图17：在指定处理组中使用抗NFκB p65抗体和DAPI的免疫组织化学染色。

图18：在指定处理组中使用抗p-IκBα p65抗体和DAPI的免疫组织化学染色。

发明详述

定义

除非另外限定，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。对于本领域的定义和术语，从业者被特别地导向Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中用于指代20种常见L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。

提及“并入本文”的任何参考文献应被理解为整体并入。

还应注意，如本说明书中所用的，除非清楚且明确地限于一个/种指示物，否则没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。除非上下文另有清楚说明，否则术语“或/或者”可与术语“和/或”互换使用。

此外，术语“部分”和“片段”可互换使用用于指代多肽、核酸或其他分子构建体的部分。

如本文中所用的，术语“生物活性FKBP-L肽”(例如，片段和/或经修饰的多肽)用于指代与全长FKBP-L多肽显示出相同或相似量和类型的活性的肽或多肽。在这个背景下，FKBP-L多肽、片段或衍生物的“生物活性”包括抗血管生成活性、血管形成和/或血管生长的抑制、以及抗炎活性中的任一种。FKBP-L片段或衍生物的生物活性可使用所附实施例中所述的任何体外或体内测定(例如大鼠角膜缝合模型或EAU模型)与全长FKBP-L进行比较来测试。

如本文中所用的，“对象”可以是动物。例如，对象可以是哺乳动物。此外，对象可以是人。在一些替代实施方案中，对象可以是雄性或雌性。在某些实施方案中，对象可以是患者，其中患者是因病症或疾病而接受医疗护理和/或积极寻求医疗护理的个体。

“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以描述可包含部分或全长蛋白质的蛋白质分子。除非上下文另有说明，否则术语“肽”用于表示短于全长的蛋白质或非常短的蛋白质。

如本领域中所知的，“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“寡肽”是这样的氨基酸(通常为L-氨基酸)的链，其α碳通过由在一个氨基酸的α碳的羧基与另一个氨基酸的α碳的氨基之间的缩合反应形成的肽键连接。通常来说，构成蛋白质的氨基酸按顺序编号，从氨基末端残基开始并且沿朝向蛋白质的羧基末端残基的方向递增。

术语“同一性”或“百分比同一性”是指两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的序列同一性。百分比同一性可通过比对两个序列来确定，并且是指所比较序列共有的位置处的相同残基(即，氨基酸或核苷酸)的数目。可使用本领域中的标准算法(例如Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2：482；Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443；Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，85：2444)或通过可公开获得的这些算法的计算机化版本(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，GeneticsComputer Group，575Science Drive，Madison，WI)(例如BLAST和FASTA)来进行序列比对和比较。此外，通过国立卫生研究院(National Institutes of Health)(Bethesda MD)获得的ENTREZ可用于序列比较。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各个程序的默认参数(例如，BLASTN；可在国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)的因特网网站获得)。在一个实施方案中，可使用GCG以缺口权重为1来确定两个序列的百分比同一性，使得每个氨基酸缺口被加权，就好像其是两个序列之间的单个氨基酸错配一样。或者，可使用ALIGN程序(版本2.0)，其是GCG(Accelrys，San Diego，CA)序列比对软件包的一部分。

如本文中所用的，术语“保守残基”是指在具有相同结构和/或功能的多种蛋自质中相同的氨基酸。保守残基的区域对蛋白质结构或功能可以是重要的。因此，如在三维蛋白质中确定的连续保守残基对蛋白质结构或功能可以是重要的。为了找到保守残基或3-D结构的保守区域，可对来自不同物种或同一物种的个体的相同或类似蛋白质的序列进行比较。

如本文中所用的，当提及氨基酸序列或核苷酸序列时，术语“类似”或“同源物”意指与野生型氨基酸序列具有一定程度的同源性或同一性的多肽。可通过眼或者更通常地借助于可容易获得的序列比较程序进行同源性比较。这些可商购获得的计算机程序可计算两个或更多个序列之间的百分比同源性(例如Wilbur，WJ.和Lipman，D.J.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：726-730)。例如，同源序列可被认为包括以下氨基酸序列，其在一些替代实施方案中彼此具有至少70％同一性、75％同一性、80％同一性、85％同一性、90％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、或98％同一性。

如本文中所用的，术语“与其具有至少90％同一性”包括与指定序列具有90％至99.99％同一性的序列，并且包括在其之间的所有范围。因此，术语与其具有至少90％同一性包括与指定序列具有91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％同一性的序列。类似地，术语“至少70％同一性”包括具有70％至99.99％同一性的序列，以及在其之间的所有范围。百分比同一性的确定是使用本文中所述的算法来确定的。

如本文中所用的，术语“连接的”表示两个不同基团(例如，核酸序列、多肽、多肽结构域)之间的共价连接，其可在所连接的两个基团之间具有间插原子。如本文中所用的，“直接连接的”表示两个不同基团(例如，核酸序列、多肽、多肽结构域)之间的共价连接，其在所连接的两个基团之间不具有任何间插原子。

术语“肽模拟物”是指在分子间相互作用中作为肽的替代物的结构(Morgan等，1989，Ann.Reports Med.Chem.，24：243-252)。肽模拟物可包含合成结构，其可包含或可不包含氨基酸和/或肽键但保留肽、或激动剂、或拮抗剂的结构和功能特征。肽模拟物还包括类肽、寡类肽(Simon等，1972，Proc.Natl.Acad，Sci.，USA，89：9367)；以及含有设计长度之肽的肽文库，其代表对应于本发明肽的所有可能的氨基酸序列。

如本文中所用的，“有效量”意指对在对象中产生期望作用有效的药剂的量。术语“治疗有效量”表示将引起正在寻求的动物或人治疗应答的药物或药剂的量。包含有效量的实际剂量可取决于施用途径、对象的身材大小和健康状况、所治疗的病症等。

术语“药物组合物”在本文中用于表示可在包含常规无毒载体、稀释剂、辅料、载剂等的单位剂量制剂中施用于哺乳动物宿主(例如表面、全身或眼内施用)的组合物。

如本文中所用的，术语“可药用载体”可以指适用于人或动物对象，如例如用于为治疗目的病症或疾病而施用的治疗组合物的化合物和组合物。

“稳定”制剂是这样的制剂，在所述制剂中其中的多肽或蛋白质在储存之后基本上保持其物理和化学稳定性以及生物活性。用于测量蛋白质稳定性的多种分析技术可在本领域中获得，并且在Peptide and Protein Drug Delivery，247-301，Vincent Lee编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，出版(1991)和Jones，A.Adv.Drug DeliveryRev.10：29-90(1993)中进行综述。可在选定的温度下在选定的时间段内测量稳定性。对于迅速筛选，可将目的制剂在40℃下保持1周至1个月，此时测量稳定性。冻干和储存后的聚集程度可用作肽和/或蛋白质稳定性的指标。例如，“稳定”制剂是其中少于约10％并且优选少于约5％的多肽或蛋白质在制剂中作为聚集体存在的制剂。可确定冻干制剂在冻干和储存后聚集体形成的提高。例如，“稳定的”冻干制剂可以是这样的制剂，其中当将冻干制剂在40℃下孵育至少一周时，冻干制剂中聚集体的增多小于约5％或小于约3％。融合蛋白制剂的稳定性可使用生物活性测定(例如本文中所述的结合测定)来测量。

用于治疗眼部疾病的FKBP-L多肽

本发明基于以下观察结果：FKBP-L并且特别是FKBP-L的肽片段当施用于眼部时可降低角膜血管的形成并且也表现出抗炎活性。这些发现支持FKBP-L及其肽片段在治疗一系列眼部病症并且特别是与角膜新血管形成相关或由角膜新血管形成介导的眼部病症以及与炎症相关或由炎症介导的眼部病症中的效用。

术语“FKBP-L”是指蛋白质FK506结合蛋白样蛋白(McKeen等Endocrinology，2008，第149(11)卷，5724-34；基因ID：63943)。先前已经示出FKBP-L及其肽片段具有强效的抗血管生成活性(WO 2007/141533)。FKBP-L肽片段的抗血管生成活性显示取决于位于全长蛋白质的N端区域中第34至57位氨基酸之间的氨基酸序列。这种抗血管生成活性表明该肽在治疗癌症(特别是实体瘤)中的临床效用。本申请通过示出FKBP-L及其肽片段在治疗眼部疾病(例如角膜新血管形成和眼部炎性病症)中的特定临床效用而延伸到超出WO 2007/141533中的发现之外。

本发明的一些实施方案涵盖全长FKBP-L多肽及其表现出生物活性的肽片段以及全长蛋白质或生物活性肽片段的经修饰形式和衍生物作为治疗眼部疾病之治疗剂的用途。

表述“FKBP-L多肽”根据其最广泛的含义用于本说明书中。其表示如SEQ ID NO：1中所示的天然存在的全长蛋白质，以及所述多肽的保留其生物活性的由多态性引起的同源物、其他变体、突变体和部分。例如，在某些实施方案中，FKBP-L多肽包含SEQ ID NO：1(GENBank登录号NP_071393；NM_022110；[gi：34304364])，或SEQ ID NO：2，其在野生型序列的第181位具有苏氨酸并且在第186位具有甘氨酸。其他FKBP-L多肽(例如，片段和其他修饰物)的示例性构建体和编码FKBP-L多肽的多核苷酸构建体描述于WO 2007/141533中，其内容明确地为此目的而通过引用整体并入本文。

与保藏在PUBMED数据库的序列(SEQ ID NO：1)相比，在SEQ ID NO：2中FKBP-L***物(最初由Cambridge Bioscience克隆到PUC18中，现在克隆到pcDNA3.1中)具有两个***的点突变。在540bp(从起始密码子开始)处存在点突变：TCT至ACT，其因而将丝氨酸(S)转换为苏氨酸(T)(氨基酸：181)。还在555bp(从起始密码子开始)处存在点突变：AGG至GGG，其因而将精氨酸(R)转换为甘氨酸(G)(氨基酸：186)。这两种FKBP-L多肽(SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2)都显示出生物活性。

根据本发明使用的FKBP-L多肽或肽可包括天然和/或化学合成的或人工的FKBP-L肽、肽模拟物、经修饰的肽(例如，磷酸肽(phosphopeptide)、环肽、包含D-氨基酸和非天然氨基酸的肽、钉合肽(stapled peptide)、包含放射性标记的肽)或与以下连接的肽：抗体、碳水化合物、单糖、寡糖、多糖、糖脂、杂环化合物、核苷或核苷酸或者其部分、和/或小的有机或无机分子(例如，用PEG或其他稳定化基团修饰的肽)。因此，本发明的FKBP-L肽(多肽)还包括经化学修饰的肽或异构体和外消旋形式。

本发明的一些实施方案包括分离的FKBP-L多肽或FKBP-L多肽的生物活性片段，或者这样的FKBP-L多肽或片段的生物活性衍生物，其用作用于治疗本文中所述眼部疾病的药物。

本发明的一些优选但非限制性的实施方案包括本文中所述FKBP-L肽或编码FKBP-L肽的核苷酸的用途，其中FKBP-L多肽包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列(IRQQPRDPPTETLELEVSPDPAS)，或与SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。

如本文中所述，根据本发明使用的方法和药物组合物可使用全长FKBP-L多肽或所述多肽的生物活性片段。因此，本发明的某些实施方案包括FKBP-L衍生物，该FKBP-L衍生物包含天然存在FKBP-L的N端氨基酸序列的生物活性部分或由其组成。该序列可包含FKBP-L多肽的活性N端部分、基本上由其组成或由其组成。在一些替代实施方案中，多肽可包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO：2的第1至57位氨基酸(即SEQ ID NO：8)，或SEQ ID NO：2的第34至57位氨基酸(即SEQ ID NO：4)，或SEQ ID NO：2的第35至57位氨基酸(即SEQ ID NO：3)。或者，所述肽可包含以下序列、基本上由其组成或由其组成：含有SEQID NO：4的至少18个连续氨基酸的序列(例如SEQ ID NO：10、12或19)。在一些替代实施方案中，用于本发明方法和组合物的多肽可包含SEQ ID NO：1至23中任一个中所示的一个氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，本发明包括FKBP-L的生物活性片段，其中所述多肽包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的不超过200个连续氨基酸，条件是所述多肽包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

如本文中所述，肽可以是被修饰(例如，以包含PEG和/或His标签或其他修饰)。或者，本发明可包括分离的多肽，其具有与SEQ ID NO：1至23中任一个中所示氨基酸序列具有至少70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％同一性的序列，特别地包括与SEQ ID NO：3所示氨基酸序列具有至少70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％同一性的序列。在这个方面，可基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性或亲水性的类似性在肽中进行有意的氨基酸替换，只要保留所述肽的特定生物活性(即功能)即可。

FKBP-L肽可具有变化的长度，只要其保留其生物活性并且可根据上述本发明的多个方面使用即可。

FKBP-L的片段

本发明的一些实施方案认可，FKBP-L蛋白的N端的某些区域可显示出生物活性，因此本发明涵盖FKBP-L的生物活性片段(特别是表现出与23聚体肽(SEQ ID NO：3)的生物活性基本上相当的生物活性的任何片段)的用途。在某些实施方案中，FKBP-L 23聚体肽(SEQID NO：3；在本文中也称为ALM201)的生物活性表现为在大鼠角膜缝合模型中降低血管形成(图2至4)。在另一些实施方案中，FKBP-L 23聚体肽(SEQ ID NO：3；在本文中也称为ALM201)的生物活性表现为在EAU小鼠中减轻视网膜炎症(图6)。

FKBP-L多肽的“片段”意指包含FKBP-L的至少6个氨基酸、优选至少10个氨基酸、或至少15个氨基酸、或至少20个氨基酸、或至少23个氨基酸的连续序列的分离的肽。所述“片段”优选地包含FKBP-L的不超过50个、或不超过45个、或不超过40个、或不超过35个、或不超过30个、或不超过25个、或不超过23个连续氨基酸。根据本发明使用的一些优选片段是具有SEQ ID No：4至23中任一个中所示氨基酸序列的那些，或其微序列变体(minor sequencevariant)(例如包含一个或更多个保守氨基酸替换的变体)。

衍生物

用于本发明的FKBP-L衍生物包括通过改变FKBP-L的氨基酸序列而修饰的多肽，例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：29，或者其片段，或者与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽，或者已通过添加官能团(例如，PEG)而修饰的这样的肽。这样的肽的产生可通过操作编码多肽的核酸或通过改变蛋白质本身来进行。

FKBP-L衍生物包括天然FKBP-L氨基酸序列的类似物，并且可涉及一个或更多个氨基酸的***、添加、缺失和/或替换，同时提供能够产生类似生物效果的多肽。来自于SEQ IDNo：1至23的多肽也包括在本发明的FKBP-L衍生物之内。

因此，用于本发明方法和组合物的FKBP-L衍生物还包括天然存在FKBP-L的片段、部分或突变体。在某些实施方案中，这样的衍生物涉及5个或更少氨基酸、更优选4个或更少、甚至更优选3个或更少、最优选仅1或2个氨基酸的***、添加、缺失和/或替换。

FKBP-L衍生物还包括包含SEQ ID NO：1至23的FKBP-L多肽的多聚体肽，以及包含这样的序列的前药。例如，在某些实施方案中，FKBP-L或FKBP-L的片段可通过在单体之间形成二硫键而形成多聚体。

FKBP-L多肽的衍生物可包括与偶联配偶体(例如，效应分子、标记物、药物、毒素和/或载体或转运分子)连接的多肽。用于将本发明的多肽与肽基和非肽基偶联配偶体二者偶联的技术是本领域中公知的。

FKBP-L衍生物还包括融合肽。例如，衍生物可包含例如与将肽靶向至患病组织(例如，角膜或视网膜)的抗体连接的本发明多肽肽。

FKBP-L多肽或其类似物可与免疫球蛋白(IgA、IgE、IgG、IgM)的恒定结构域或其部分(CH1、CH2、CH3或其任意组合)融合，产生嵌合多肽。这些融合多肽或融合蛋白可有利于纯化并且可显示出延长的体内半衰期。这样的融合蛋白与单独的单体多肽或其片段相比在结合和中和其他分子方面可更高效。参见例如Fountoulakis等，J.Biochem.，270：3958-3964(1995)。

本发明的融合蛋白还包括与白蛋白(例如重组人血清白蛋白或者其片段或变体)融合的FKBP-L多肽(参见例如美国专利No.5876969、EP专利0413622和美国专利No.5766883)。

编码本文中所述的这样的融合蛋白的多核苷酸的用途也涵盖在本发明内。与细胞毒性剂融合的多核苷酸的用途也涵盖在本发明内。在这种情况下，FKBP-L多肽可与受体结合并且细胞毒性药物可被内化。

例如，在一些替代实施方案中，衍生物可包括：肽的位点特异性PEG化(等)以延长半衰期；或并入非天然氨基酸和骨架修饰以针对蛋白水解稳定化；或环状衍生物(以提供蛋白水解抗性)；或封闭N端和C端以防止或降低外肽酶和/或蛋白酶活性；或在连续链中通过接头链或以树枝状聚合物类型的方法将肽的多个拷贝连接在一起以提高与细胞表面CD44的“亲合力”。例如，24聚体的三聚体共价连接衍生物可用作FKBP-L的衍生物。或者，FKBP-L24聚体可与同三聚化的结构域连接以形成非共价三聚体。或者，与链霉亲和素一起形成四聚体复合物的肽的生物素衍生物可用作FKBP-L的衍生物。或者，FKBP-L或FKBP-L的片段可通过在单体之间形成二硫键而形成多聚体。此外，FKBP-L可通过非共价缔合，可能地通过蛋白质序列内预测的三十四肽(tetratricopeptide)重复结构域而形成寡聚体。

反向肽类似物

用于本发明的类似物还包括天然FKBP-L蛋白、其部分或其合成衍生物的反向或逆向类似物。参见例如EP 0497 366、U.S.5,519,115和Merrifield等，1995，PNAS，92：3449-53，其公开内容通过引用并入本文。如EP 0497 366中所描述的，通过使天然存在或合成的肽的氨基酸序列逆转来产生反向肽。除内部蛋白酶敏感位点周围的构象以及N端和C端的特征之外，这样的反向肽可保留与亲本肽相同的一般三维结构(例如，α-螺旋)。认为反向肽不仅保留非反向“距常”肽的生物活性，而且还可具有增强的特性，包括提高的生物活性。(参见Iwahori等，1997，Biol.Pharm.Bull.20：267-70)。因此，用于本发明的衍生物可包括天然和合成FKBP-L蛋白的反向肽。

用于本发明的肽(包括反向肽和任一的片段)可通过化学合成或通过由核酸表达来完整或部分地产生。用于本发明的肽可根据本领域中已知的已充分确立的标准液相或优选地固相肽合成方法容易地制备(参见例如J.M.Stewart和J.D.Young，Solid PhasePeptide Synthesis，第二版，Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois(1984)，M.Bodanzsky和A.Bodanzsky，The Practice of Peptide Synthesis，Springer Verlag，New York(1984))。

多聚体肽

如上所述，肽可以是多聚体的形式。因此，2、3或更多个单独FKBP-L多肽单体单元，或者两个或更多个FKBP-L片段的多聚体在本发明的范围内。

在一个实施方案中，这样的多聚体可用于如下制备单体肽：制备包含单体单元和可切割位点(即，可酶促切割位点)的多聚体肽，并随后切割该多聚体以产生期望单体。

在一个实施方案中，多聚体的使用可提高对受体的结合亲和力。

多聚体可以是同聚体或异聚体。如本文中所用的，术语同聚体是指以下多聚体，其仅包含对应于特定氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3)的多肽、或变体、剪接变体、融合蛋白、或者本文中所述的其他FKBP-L类似物或衍生物。这些同聚体可包含具有相同或不同氨基酸序列的FKBP-L肽。例如，多聚体可仅包含具有相同氨基酸序列的FKBP-L肽，或可包含不同的氨基酸序列。多聚体可以是同二聚体(例如，仅包含FKBP-L肽，这些肽进而可具有相同或不同的氨基酸序列)、同三聚体或同四聚体。

如本文中所用的，术语异聚体是指除本文中所述的FKBP-L肽(多肽)之外还包含一种或更多种异源多肽(即，非FKBP-L肽或多肽)的多聚体。

多聚体可以是疏水性、亲水性、离子和/或共价缔合的结果和/或可通过例如脂质体形成间接地连接。因此，在一个实施方案中，当本文中所述的FKBP-L肽在溶液中彼此接触时，形成多聚体。在另一个实施方案中，当FKBP-L和非FKBP-L肽(多肽)在溶液中与针对本文中所述肽(多肽)的抗体(包括针对本文中所述融合蛋白中异源肽(多肽)序列的抗体)接触时，形成异多聚体。在另一些实施方案中，本文中所述的多聚体可通过与本文中所述FKBP-L肽(和任选地非FKBP-L肽)共价缔合和/或在其之间共价缔合而形成。

这样的共价缔合可涉及在FKBP-L序列(例如，在SEQ ID NO：1至23中记载的那些)中包含的一个或更多个氨基酸残基。在一个实施方案中，所述共价缔合是化学或重组操作的结果。或者，这样的共价缔合可涉及FKBP-L融合蛋白中异源多肽序列中包含的一个或更多个氨基酸残基。在一个实例中，共价缔合发生在本文中所述的融合蛋白中包含的异源序列之间(参见例如美国专利No.5478925)。在另一个具体实例中，本文中所述的融合蛋白的共价缔合使用来自能够形成共价缔合多聚体的另一蛋白质(例如，骨保护素(oesteoprotegerin))的异源多肽序列(参见例如国际公开NO：WO 98/49305)。在另一个实施方案中，本文中所述的两个或更多个多肽通过肽接头连接。一些实例包括美国专利No.5073627中所述的那些肽接头。包含通过肽接头隔离的多个FKBP-L肽的蛋白质可使用常规的重组DNA技术来产生。

多聚体还可通过使FKBP-L肽(多肽)与亮氨酸拉链或异亮氨酸拉链多肽序列融合来制备。已知的亮氨酸拉链中有天然存在的肽及其二聚化或三聚化的衍生物。适合于产生本文中所述的可溶性多聚体蛋白质的亮氨酸拉链结构域的一些实例是PCT申请WO 94/10308中描述的那些。包含与在溶液中二聚化或三聚化的多肽序列融合的本文中所述多肽的重组融合蛋白可在合适的宿主细胞中表达，并且所得可溶性多聚体融合蛋白可使用本领域中已知的技术从培养物上清液中回收。

多聚体还可使用本领域中已知的化学技术来产生。例如，可使用本领域中已知的接头分子和接头分子长度优化技术使待包含于本文中所述多聚体中的多肽化学交联(参见例如美国专利No.5478925)。另外，多聚体可使用本领域中已知的技术来产生，以在位于期望包含在多聚体中的多肽序列内的半胱氨酸残基之间形成一个或更多个分子间交联(参见例如美国专利No.5478925)。此外，本文中所述的多肽可通过向多肽的C端或N端添加半胱氨酸或生物素来常规修饰，并且可应用本领域中已知的技术来产生包含这些经修饰多肽中一种或更多种的多聚体(参见例如美国专利No.5478925)。另外，可使用本领域中已知的技术来制备包含期望包含在多聚体中的两种或更多种C-12-C肽的脂质体(参见例如美国专利No.5478925)。

或者，仅包含天然存在氨基酸的那些多聚体可使用本领域中已知的遗传工程技术形成。或者，包含翻译后修饰或其他修饰的那些可通过重组技术和化学修饰的组合来制备。在一个实施方案中，FKBP-L肽使用本文中所述或本领域以其他方式已知的融合蛋白技术重组产生(参见例如美国专利No.5478925，其通过引用整体并入本文)。例如，编码本文中所述同二聚体的多核苷酸可如下产生：在从原始C端到N端的反向方向上，使编码本文中所述FKBP-L肽的多核苷酸序列与编码接头多肽的序列连接，并随后进一步与编码多肽的翻译产物的合成多核苷酸连接(缺少前导序列)(参见例如美国专利No.5478925)。可使用本文中所述或本领域以其他方式已知的重组技术来产生包含跨膜结构域(或者疏水性肽或信号肽)并且可通过膜重建技术并入到脂质体中的重组FKBP-L肽(多肽)(参见例如美国专利No.5478925)。

前药

本文中所述的多肽旨在(至少在一些实施方案中)施用于人或其他哺乳动物以治疗或预防眼部病症，例如角膜新血管形成或眼部炎性疾病。如下所讨论，肽通常如下施用于眼部：表面、通过结膜下注射、基质内注射或任何其他眼内注射途径，或甚至通过全身施用，例如经口施用或肠胃外途径，例如腹膜内施用。

肽或多肽可与多种部分(例如聚合物部分)缀合以改变肽药物的生理化学特性，例如以提高对酸性和酶促降解的抗性和增强这样的药物穿过黏膜的渗透。例如，Abuchowski和Davis已描述了用于使酶衍生化以提供水溶性、非免疫原性、在体内稳定化的产物的多种方法(“Soluble polymers-Enzyme adducts，”Enzymes as Drugs，编辑.Holcenberg和Roberts，J.Wiley and Sons，New York，N.Y.(1981))。

因此，在某些实施方案中，FKBP-L肽可与聚合物(例如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、糖肽、聚乙二醇和聚氨基酸)缀合。得到的缀合多肽保留其生物活性和在水中的溶解性以肠胃外施用。在一个实施方案中，FKBP-L肽可与分子量为500至20,000道尔顿的聚乙二醇或聚丙二醇偶联以提供生理活性的非免疫原性水溶性多肽组合物(参见例如美国专利No.4,179,337；以及Garman，A.J.，和Kalindjian，S.B.，FEBS Lett.，1987，223，361-365)。聚乙二醇或聚丙二醇可保护多肽免于活性丧失，并且所述组合物可注射到哺乳动物循环***中而基本上没有免疫原性应答。在另一些实施方案中，FKBP-L与包含亲脂性和亲水性部分的寡聚体偶联(参见例如，美国专利No.5681811、5438040和5359030)。

前药可例如如下制备：首先由多分散的MPEG5000制备马来酸酐试剂，并随后使该试剂与本文中公开的多肽缀合。氨基酸与马来酸酐的反应是公知的。马来酰基-酰胺键水解以重新形成含胺药物是由邻近游离羧基的存在和由双键建立的攻击的几何形状辅助的。肽可在生理条件下释放(通过前药的水解)。

多肽还可通过可降解连接(例如Roberts，M.J.，等，Adv.Drug Delivery Rev.，2002，54，459-476中所示的可降解连接(关于PEG化干扰素))与聚合物(例如多分散的PEG)偶联。

多肽还可如下与聚合物(例如PEG)连接：使用1，6或1，4苄基消除(benzylelimination，BE)策略(参见例如Lee，S.，等，Bioconjugate Chem.，(2001)，12，163-169；Greenwald，R.B.，等，美国专利No.6,180,095，2001；Greenwald，R.B.，等，J.Med.Chem.，1999，42，3657-3667.)；使用三甲基锁内酯化(trimethyl lock lactonization，TML)(Greenwald，R.B.，等，J.Med.Chem.，2000，43，475-487)；使PEG羧酸与羟基封端的羧酸接头偶联(Roberts，M.J.，J.Pharm.Sci.，1998，87(11)，1440-1445)；以及以下PEG前药，其涉及通过氨基甲酸芳基酯与含胺药物连接的MPEG苯基醚和MPEG苯甲酰胺家族(Roberts，M.J.，等，Adv.Drug Delivery Rev.，2002，54，459-476)，包括涉及氨基甲酸酯与PEG酰胺或醚之间的间位关系的前药结构(Bently等的美国专利No.6413507)；以及涉及与水解机理相反的还原机理的前药(Zalipsky，S.，等，Bioconjugate Chem.，1999，10(5)，703-707)。

本发明的FKBP-L多肽具有游离的氨基、酰氨基、羟基和/或羧基，并且这些官能团可用于将肽转化为前药。前药包括以下化合物，其中氨基酸残基或者两个或更多个(例如，两个、三个或四个)氨基酸残基的多肽链通过肽键与多种聚合物(例如，聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇))的游离氨基、羟基或羧酸基团共价连接。包含本发明多肽的前药或者从中释放或可从中释放本发明肽(包括类似物和片段)的前药被认为是本发明的类似物。

前药还包括其中PEG、碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺和烷基酯通过C端羧酸与上述肽共价键合的化合物。因此，本发明的一些实施方案包括位点特异性PEG添加。

角膜新血管形成的治疗/预防

本申请的一些实施例令人信服地示出，将FKBP-L肽(特别是SEQ IDNO：3的肽)表面施用于角膜表面可显著地降低血管形成。此外，FKBP-L肽(特别是SEQ ID NO：3的肽)也用作抗炎剂，其在大鼠角膜缝合模型中具有优于现有药物治疗的效力。该结果清楚地支持FKBP-L多肽及其肽片段在治疗/预防角膜新血管形成中的效用。

多种眼部病症与角膜新血管形成相关和/或由角膜新血管形成介导，并且可使用本文中所述的FKBP-L肽化合物、组合物和方法进行治疗。角膜新血管性疾病的特征在于新血管侵入角膜组织中并且是失明的常见原因。与角膜新血管形成相关的其他疾病包括但不限于流行性角膜结膜炎、维生素A缺乏、特应性角膜炎、上缘角膜炎、翼状胬肉干燥性角膜炎、类天疱疮放射状角膜切开术(periphigoid radial keratotomy)和角膜移植排斥。

用于新血管形成诱发的角膜混浊损伤的目前治疗是角膜移植；然而，在该高风险群体中，新血管形成的存在本身就导致移植之后预后更差。当将角膜移植物置于无血管受植床中(低风险角膜形成术)时，在表面类固醇的覆盖下，2年移植物存活率接近90％(Küchle等，2002)。在血管化受植床(高风险角膜形成术)中，移植物2年存活率显著降低至低于50％(Cursiefen等，2002)。缝合总是引起显著的新血管应答，这也与角膜排斥的风险提高相关；因此，甚至将角膜移植物通过自身固定在适当位置的方式也提高移植物排斥的风险。由于目前可用于这种类型眼病的治疗(例如皮质类固醇)具有有限的效力并且具有副作用的风险，因此迫切需要新的治疗选择，例如本申请中提出的那些。因此，本发明的一个特别重要的方面涉及在已经经历角膜移植手术的患者中预防和/或治疗角膜新血管形成。考虑使用FKBP-L肽的治疗可在角膜移植手术前和/或手术后施用以降低移植物排斥的风险。

角膜血管形成也经常发生在来自疱疹病毒的角膜基质感染之后，通常继发于病毒从其在三叉神经节内的潜伏位置再活化(在初始原发感染之后)(Liu等，2006)。许多因子以参与新血管形成过程的诱导，其也可在疾病发病机制的演变过程期间改变(Suryawanshi等，2011)，但最新近的工作集中于VEGF-A。这种生长因子由直接感染的细胞产生并且还由旁观者细胞和通过多种旁分泌因子(包括I1-6)诱导以产生这种生长因子的浸润的炎性细胞产生(Kanangat等，1996)。在HSV-1感染期间，炎症和血管生成相互触发，其中新形成的渗漏血管缺乏周细胞和分离的内皮细胞释放炎性细胞和细胞因子到角膜基质中，这具有诱导更多血管向内生长以使问题复杂化的作用(Azar，2006)。

诱导角膜内血管消退的大多数治疗策略已经使用抗VEGF治疗。这种类型的治疗如果其在病症的早期发生的话通常相当成功，但是一旦血管已充分建立，其就对于抗VEGF治疗无响应性。任何目前抗VEGF方法的难点在于其通常需要长期多次注射，特别是由于病症通常起起伏伏，产生更多炎症并且促进进一步血管形成。目前没有医学治疗可用于去除已在角膜内充分建立的血管。在这些情况下，唯一的治疗是通过使用激光治疗或烧灼术，这两种治疗都远不能令人满意，往往需要多次外科手术干预(Gupta&Illingworth，2011)。

在治疗/预防角膜新血管形成中使用FKBP-L肽(例如SEQ ID NO：3的肽)的一个特别的(出乎意料的)益处是血管形成的降低也与抗炎作用组合。在表面施用所述肽之后实现这样的作用也是高度有益的，但是还考虑肽可通过其他途径(例如结膜下注射或其他眼内注射模式)施用。

由于肽渗透至眼的所有隔室，因此除治疗/预防角膜新血管形成之外，表面施用FKBP-L肽(例如SEQ ID NO：3的肽)还可有效地治疗/预防与眼中其他部位的新血管形成相关的适应证。可通过施用(例如表面施用)FKBP-L肽(例如SEQ ID NO：3的肽)治疗/预防的与眼部新血管形成相关的疾病包括例如早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity，ROP)、糖尿病性视网膜病、新血管性年龄相关性黄斑变性、镰状红细胞性视网膜病变和/或视网膜静脉阻塞。

眼部炎症的治疗/预防

本申请的一些实施例还令人信服地示出，施用FKBP-L肽(特别是SEQ ID NO：3的肽)在实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)的小鼠模型中以剂量依赖性方式抑制视网膜炎症。此外，如上报道的，表面施用FKBP-L肽也在大鼠角膜缝合模型中产生抗炎作用。例如，表面施用FKBP-L肽(SEQ ID NO：3)在这样的模型中降低总细胞浸润和炎性细胞浸润二者(使用例如CD68+或CD44+细胞测量)。总之，这些结果清楚地支持FKBP-L多肽及其肽片段在治疗/预防眼部炎性疾病(特别是与视网膜炎症和/或角膜炎症相关/由视网膜炎症和/或角膜炎症介导的疾病)中的效用。此外，表面施用FKBP-L肽(SEQ ID NO：3)导致肽渗透至眼的所有层。因此，FKBPL肽具有治疗与眼中其他元件的炎症(例如脉络膜、巩膜和/或眼肌的炎症)相关/由其介导的眼部炎性疾病的潜力。

可通过施用FKBP-L多肽及其肽片段(特别是SEQ ID NO：3的肽)治疗/预防的炎性眼部疾病的一些实例包括(但不限于)葡萄膜炎、干眼综合征、睑角膜结膜炎和多种形式的角膜炎。

施用的制剂/途径

如本文中所用的，“治疗(treatment或therapy)”包括可使人或非人动物受益的任何方案。治疗可以是关于现有病症或可以是预防性的(预防性治疗)。治疗可包括治愈性、缓解性或预防性作用。

角膜新血管形成可通过向需要此类治疗的患者施用有效量的FKBP-L多肽或其肽片段来降低。

施用的FKBP-L多肽的剂量可根据所治疗的病症的确切性质而变化。在一些替代实施方案中，待在体内达到的剂量应相当于以下体外水平：大于10^-12M、或10^-11M、或10^-10M、或10^-9M、或10^-8M、或10^-7M、或10^-6M、或10^-5M。因此，待在体内达到的剂量可相当于以下体外水平：10^-12M至10^-5M、或10^-11M至10^-6M、或10^-10M至10^-7M、或10^-9M至10^-7M，或其中的范围。在一些替代实施方案中，所使用的剂量可相当于以下体外水平：约1至10000ng/ml、或约10至5000ng/ml、或约100至1000ng/ml。或者，在某些实施方案中，剂量可包括约0.00001至500mg/kg/天、或约0.0001至300mg/kg/天、或约0.003至100mg/kg/天、或约0.03至30mg/kg/天、或约0.1mg/kg/天至10mg/kg/天、或约0.3mg/kg/天至3mg/kg/天。在另一些替代实施方案中，所使用的人体内剂量可相当于10^-9M至10^-8M的大鼠体内剂量。在另一些替代实施方案中，所使用的人体内剂量可以是10^-10至10^-5或10^-9至10^-6M。在某些实施方案中，人体内剂量可以是10^-9M至10^-8M。

施用途径也可根据所治疗的病症的确切性质而变化。合适的施用途径可包括但不限于表面施用于眼部，例如表面施用于角膜表面或眼部的其他外表面、眼内注射、结膜下注射、玻璃体内注射、腹膜内施用、经口施用。

对于施用于人对象，可将FKBP-L多肽或其肽片段配制成适合于通过所选的递送途径施用的药物组合物/剂型。

考虑FKBP-L多肽或其肽片段可用作独立的治疗，或用作组合治疗的组分。

本发明的一个实施方案涉及用于治疗眼部炎性疾病(例如葡萄膜炎、干眼综合征或睑角膜结膜炎)的组合治疗，其包含FKBP-L多肽或其肽片段(并且特别是SEQ ID NO：3的肽)与***(或者其任何衍生物或类似物)的组合。

实施例

实施例1-ALM201对眼表面上的新血管形成的作用

为了评估ALM201(SEQ ID NO：3)对眼表面的作用，测量了其停止血管生长的能力。通过公认的模型刺激血管生长(Shi等，2011)，其中将缝合线置于大鼠眼的中央角膜中(图1)。我们已经表明，大鼠眼在解剖学上与人眼类似(Moore JE，McMullen CB，Mahon G和Adamis AP.The corneal epithelial stem cell.DNA Cell Biol.2002；21(5-6)：443-51；其通过引用并入本文)。

实验组

实验组为：

结膜下注射肽(5只大鼠)、对照组(5只大鼠)和阳性对照组(5只大鼠)

基质内注射肽(5只大鼠)、对照组(5只大鼠)和阳性对照组(5只大鼠)

表面施用肽(5只大鼠)、对照组(5只大鼠)和阳性对照组(5只大鼠)

方法

将缝合线置于每只动物的一只眼的中央角膜中，同时使对照眼保持不动。对于注射组，在第0天、第3天和第6天向大鼠的眼添加肽。对于表面施用组，每天添加肽和阳性对照。在缝合之后的每一天，监测大鼠的血管生长并使用鹰眼便携式数字缝灯(Hawk EyePortable Digital Slit Lamp)(Dioptrix，France)和倒置显微镜(Nikon E600FN；Surrey，UK)拍照。在未经处理的动物和经肽处理的动物之间观察到差异时(例如第6天)的时间点，使其接受8μg/g的内皮特异性荧光素缀合凝集素(番茄(Lycopersicon esculentum)；Vector Laboratories，Burlingame，CA)的尾静脉注射。30分钟后，收获眼并用10％中性缓冲***固定24小时。将角膜分离并平坦安装在载玻片上。使用Leica SP5多光子显微镜(Milton Keynes，UK)捕获经灌注血管中的荧光。标记信息文件格式(.tiff)文件中的血管形成通过用Image J进行可视化来测量(Rasband，1997-2014)。

在第6天，由对处理不知情的眼科医生对所有大鼠进行分级。分级等级如下：

血管与缝合线的距离：0＝不可达；1＝短距离；2＝中等距离；3＝3/4路径；4＝到达缝合线；

血管密度分级：0＝无密度；1＝轻度；2＝中等；3＝高

炎症分级：0＝无；1＝极低；2＝中等；3＝严重；

结果

结膜下注射

对于统计分析，将曲安西龙处理和100nM ALM201处理均与PBS对照处理进行比较。由缝合诱导的新血管形成在图3中的对照图像中用黑色箭头显示；这些血管朝向缝合线以直线生长，并且与在曲安西龙和ALM201处理中观察到的正常血管***不同(图2(a))。当与PBS对照相比时，100nM ALM201的血管与缝合线的距离显示出p＜0.01的显著性差异(图2(b))。

表面处理

对照图像中的黑色箭头显示新血管***，而ALM201图像显示大鼠眼内的正常血管***(图3(a))。与PBS对照处理相比，在ALM201处理中血管与缝合线的距离、血管密度和炎症全部均具有显著性差异(图3(b))。

使用Hooded Lister大鼠的结膜下注射

具有无色素眼(non-pigmented eye)的动物中血管***的图像可难以看到。在Hooded Lister大鼠中重复表面ALM201的实验以提供抗血管作用的更清晰照片。

在图4中，在对照图像(中间图)和经***处理的大鼠(左图)中用黑色箭头显示由缝合诱导的新血管形成。这些血管朝向缝合线以直线生长。在经***处理的大鼠中，新血管形成没有在对照图像中观察到的那样显著。在100nMALM201处理图像中不存在新血管形成(右图)。

结论

ALM201(SEQ ID NO：3)在结膜下注射或表面施用之后在缝合模型中防止角膜损伤之后的新血管生长。该肽在注射时也具有抗炎活性。在表面施用之后未评估炎症。这些初步实验显示ALM201在降低角膜损伤后新血管形成中有明显的积极作用，表明ALM201可有效地治疗多种眼部病症。

实施例2-ALM201对自身免疫性葡萄膜炎的作用

在实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)的小鼠模型中测试ALM201对自身免疫性葡萄膜炎的作用。

方法

动物

60只C57BL/6J小鼠(38只雌性、22只雄性，9至12周龄)购自贝尔法斯特女王大学(Queen’s University Belfast)的生物资源单元(Biological Resource Unit，BRU)。将所有小鼠维持在正常的实验室中并暴露于12小时黑暗-12小时光照周期。本研究中涉及动物使用的所有操作均根据视觉和眼科研究协会(Association for Research in Vision andOphthalmology，ARVO)对眼科和视觉研究中使用动物的声明并且在United KingdomAnimal(Scientific Procedure)1986的法规下进行。

EAU的诱发

使用先前所述方案(Chen M.，Copland D.A.，Zhao J.，Liu J.，Forrester J.V.，Dick A.D.，Xu H.，2012.Persistent inflammation subverts thrombospondin-1-induced regulation of retinal angiogenesis and is driven byCCR2ligation.Am.J.Pathol.180，235-245；Xu H.，Manivannan A.，Crane I.，Dawson R.，Liversidge J.，2008.Critical but divergent roles for CD62L and CD44indirecting blood monocyte trafficking in vivo during inflammation.Blood 112，1166-1174.，其各自通过引用并入本文)向小鼠免疫接种人光感受器间类视黄醇结合蛋白(Interphotoreceptor Retinoid Binding Protein，IRBP)肽1-20(GPTHLFQPSLVLDMAKVLLD，GL Biochem，Shanghai，China)。简言之，向每只小鼠中皮下注射500mg(100μl)在完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant)(DIFCO Laboratories，Detroit，USA)中以1：1乳化的IRBP肽1-20与另外的2.5mg/ml结核分枝杆菌H37Ra(Mycobacterium tuberculosis H37Ra)(DIFCO Laboratories)。在肽注射之后立即腹膜内施用另外的1mg百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)毒素(Tocris Bioscience，Bristol，UK)。

局部内窥镜眼底成像(Topic Endoscopic Fundus Imaging，TEFI)

用1％硫酸阿托品和2.5％苯福林盐酸盐(Chauvin，Essex，UK)扩张小鼠瞳孔。用异氟烷麻醉动物。在免疫接种之后(post-immunisation，p.i.)第12天、第14天和第24天使用先前所述的TEFI***(Paques M.，Guyomard J.L，Simonutti M.，Roux M.J.，Picaud S.，Legargasson J.F.，Sahel J.A.，2007.Panretinal，high-resolution color photographyofthe mouse fundus.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.48，2769-2774.；Xu H.，Koch P，ChenM.，Lau A.，Reid D.M.，Forrester J.V.，2008.A clinical grading system for retinalinflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitisusing digital fundus images.Exp.Eye Res.87，319-326.，其各自通过引用并入本文)以获得眼底图像。使用尼康D90相机捕获图像并以TFPI格式保存。使用我们先前所述的标准(Xu等，2008a)获得视网膜炎症的临床评分。

组分配

基于视网膜炎症的临床评分，将小鼠指定成五组以确保不同组之间的平均临床评分相当。向每个组中分配10只小鼠。表1示出了不同组中在p.i.第14天(处理开始的当天)的平均临床EAU评分。

表1

*单因素ANOVA，然后进行Tukey多重比较检验。NS，在其他组之间无显著性差异

处理

将所有动物从p.i.第14天至第24天处理10天。以下是处理细节：

第1组：100ml PBS，i.p.注射，每日一次。

第2组：ALM201 100ml中0.3mg/kg，i.p.注射，每日一次。

第3组：ALM201 100ml中3mg/kg，i.p.注射，每日一次。

第4组：***100ml中0.5mg/kg，p.o.(管饲)，每日一次。

第5组：ALM201 100ml中0.3mg/kg，i.p.注射+***100ml中0.5mg/kg，p.o.(管饲)，每日一次。

样品收集和组织病理学

在p.i.第24天，使用TEFI***从所有实验小鼠获取眼底图像。然后，通过吸入CO2处死小鼠并小心地摘除眼。将所有眼在室温下在2.5％(w/v)戊二醛(Agar ScientificLtd，Cambridge，UK)中固定2天。将眼包埋在石蜡中用于标准H&E染色。使用先前所述的标准评分***(Dick A.D.，Cheng Y.F.，Liversidge J.，Forrester J.V.，1994.Immunomodulation of experimental autoimmune uveoretinitis：a model oftolerance induction with retinal antigens.Eye 8(Pt 1)，52-59，其通过引用并入本文)对视网膜炎症的组织学评分进行分级。使用来自每只眼的至少三个不同层的视网膜切片用于组织病理学分析。将来自三个层的平均评分用作眼的最终病理学评分。

统计分析

数据(临床评分和组织学评分)表示为平均值±SD。使用单因素ANOVA和随后的Tukey多重比较检验检测所有处理组之间的差异。此外，使用Mann-Whitney U检验(双尾)检测ALM201或***处理组与PBS对照组之间的差异。使用配对t检验比较处理之前和之后的临床评分。

结果

体重

在处理过程期间每天监测每只小鼠的体重(bodyweight，BW)。结果显示，来自PBS对照组、ALM2010.3mg/kg组、ALM 3mg/kg组和***0.5mg/kg组的所有小鼠在10天处理期期间具有稳定的BW(图5A-5D)。来自ALM201+***处理组的两只小鼠在第3天、第4天和第5天具有降低的BW，但在第6天恢复BW并且在实验结束时保持稳定(图5E)。

在EAU中的作用

临床炎症：

在正常的未经免疫接种小鼠中，视盘(optic disc，OD)和视网膜血管可在眼底图像中清晰地可视化(图6A)。在p.i.第24天在用PBS处理的大多数EAU小鼠中观察到严重的炎症(图6B)，包括OD周围的浸润、血管周围的多个大浸润(图6B中的箭头)、多个小浸润(星号，图6B)和视网膜血管周围的浸润。在接受0.3mg/kg ALM201处理的小鼠中也观察到视网膜炎症，但是浸润数量少于经PBS处理的EAU小鼠中的浸润数量(图6C)。在接受3mg/kg ALM201(图6D)、***(0.5mg/kg)(图6E)和ALM201 0.3mg/kg+***(0.5mg/kg)处理的EAU小鼠中观察到血管周围的小的发白片状物(血管炎)。在来自这些组的小鼠中很少观察到视网膜血管周围的大浸润(图6D至图6F)。临床评分分析显示ALM201剂量依赖性地抑制EAU中的炎症(图6G)。***(0.5mg/kg)强烈抑制视网膜炎症(图6G)。虽然在用3mg/kg ALM201和0.5mg/kg***处理的小鼠之间在临床评分方面没有统计学显著性差异，但后者显示具有较低的临床评分。与单独的***相比，0.5mg/kg***和ALM201 0.3mg/kg的组合没有进一步减小临床评分(图6G)。

当比较同一小鼠在处理之前(p.i.第14天)和处理之后(p.i.第24天)的临床评分时，PBS处理组中的所有小鼠的评分均提高(临床评分的平均增量为1.82，图7A和表2)，表明从p.i.第14天至第24天炎症进一步发展。

在用0.3mg/kg ALM201处理的小鼠中，一只小鼠具有减小的临床评分并且一只保持不变，而另外8只小鼠从p.i.第14天至第24天经历略微提高的临床评分(平均评分增量0.68，图7B)。然而，在该组小鼠中，总体临床评分从p.i.第14天至第24天没有显著变化(图7B，表2)。ALM201 3mg/kg处理在3只小鼠中减小EAU临床评分(临床评分的平均减量：0.33)，并且在3只小鼠中防止临床评分进一步提高(图7C，表2)，表明这种处理能够降低或防止EAU中视网膜炎症的发展。四只小鼠的临床评分提高，其中平均增量为0.82分(表2，图7C)。***处理在3只小鼠中减小EAU评分(平均减小0.69)并且在4只小鼠中维持EAU评分(图7D，表2)，并且3只小鼠在处理之后具有提高的EAU评分(平均增量0.80)。ALM201和***的组合治疗在6只小鼠中减小EAU评分(平均减小0.69)并且在2只小鼠中维持EAU评分(图7E，表2)。只有两只小鼠经历进行性视网膜炎症。结果表明，在该EAU模型中，***和ALM201的组合比单独的***或ALM201具有更强的免疫抑制作用。

表2

组织病理学：

PBS处理：在经PBS处理的对照EAU小鼠的玻璃体腔和视神经视网膜中观察到显著的细胞浸润(图8A)。频繁观察到视网膜皱襞(白色箭头，图4A)。没有光感受器外段(photoreceptor outer segment，POS)(图8A)。正常的视网膜结构被严重破坏(图8A)。

ALM201(0.3mg/kg)处理：在用0.3mg/kg ALM201处理的小鼠中观察到较少的浸润细胞(图8B)。尽管偶尔检测到肉芽肿样病变(绿色箭头，图8B)，但与经PBS处理的小鼠相比(图8A)，视网膜结构被更好地保持(图4B)。

ALM201(3mg/kg)处理：在处理之前具有严重炎症的眼中，观察到少数具有视网膜瘢痕的浸润细胞(箭头，图8C)。在处理之前具有轻度炎症的眼中，仅观察到很少的浸润细胞，并且包括POS在内的视网膜结构在很大程度上保持(图8D)。

***(0.5mg/kg，图8E)和***(0.5mg/kg)+ALM201 0.3mg/kg(图8F，8G)处理：与经ALM201 3mg/kg处理的小鼠类似，在治疗之前具有严重炎症的眼中，观察到瘢痕病变(箭头，图8E、8F)。在经***处理的小鼠中观察到少数浸润细胞(图8E)。包括POS在内的视网膜层被保持(除具有瘢痕的区域之外)。在治疗之前具有轻度炎症的眼中，很少检测到浸润细胞，并且没有观察到显著的结构损伤(图8G)。当使用将免疫细胞浸润的数量/面积和视网膜结构损伤考虑在内的标准组织学评分***对视网膜炎症进行分级时，ALM201剂量依赖性地抑制视网膜炎症(图8H)。

结论

该试验性研究的主要发现包括：

-ALM201 0.3mg/kg处理在临床和组织学上轻微减轻视网膜炎症。

-ALM201 3mg/kg处理在临床和组织学上显著减轻视网膜炎症。

-单独的***0.5mg/kg或***+ALM201处理显著减轻视网膜炎症。

-低剂量ALM201(0.3mg/kg)处理能够在20％小鼠中防止进展或减轻炎症，并且在80％小鼠中降低EAU进展的水平。

-高剂量ALM201(3mg/kg)处理能够在30％小鼠中防止炎症的进展并且在30％小鼠中减轻预先存在的炎症。

-***(0.5mg/kg)处理在30％小鼠中减轻预先存在的视网膜炎症，并且在40％小鼠中防止EAU进展。

-***(0.5mg/kg)和ALM201(0.3mg/kg)处理的组合治疗在60％小鼠中减轻预先存在的视网膜炎症，并且在20％小鼠中防止EAU进展。

-

我们的结果表明，ALM201剂量依赖性地抑制EAU小鼠模型中的视网膜炎症。***和ALM201的组合显示比单独的***或ALM201具有更强的免疫抑制作用。ALM201的潜在机制可涉及(1)防止/降低从循环到发炎视网膜中的白细胞运输；(2)调节免疫细胞功能和活化。

实施例3-ALM201在表面施用之后在眼中的分布及其对炎症的作用

使用基质辅助激光解吸/电离(matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)质谱成像(mass spectrometry imaging，MSI)对ALM201在眼中的分布进行作图。

方法

在第0天，将缝合线置于大鼠角膜中以诱发角膜新血管形成和炎症。用16μl的ALM201(100nM和100μM)或PBS(载剂对照)处理眼3天或6天。

在第3天或第6天在处理之后1小时摘出眼，并将其冷冻在明胶中。在眼中心获取横切片(10μm)用于MSI，将相邻切片用苏木精和伊红(H&E)染色。

所有MALDI-MS成像实验均使用MADI-TOF/TOF(Ultraflextreme，BrukerDaltonics)或MALDI-FT-ICR(Solarix XR 12T，Bruker Daltonics)质谱仪使用SmartbeamII 2kHz激光器以正离子模式进行。选择激光光斑尺寸以产生中等且锐的聚焦水平(约40μm和10μm激光光斑直径)，用于低和高空间分辨率分析。使用FlexImaging(BrukerDaltonics)4.1版使MS成像数据可视化。将CHCA(5mg/ml，溶于含有0.2％TFA的50％ACN中)用作MALDI基质，并且使用自动喷雾器(TM-Sprayer，HTX Technologies)施加。

结果

MALDI-MS成像结果示于图9中。

图9A示出了m/z 2576.303±0.005 Da的ALM201肽的FTICR质谱。示出了来自用100μM(倒数第二迹线)和100nM肽(底部迹线)表面处理的角膜组织的结果。观察到的肽单一同位素质量与理论分布一致(在350K质量分辨力下，质量准确度为＜5ppm)。

图9B示出了m/z 2576.303±0.005 Da的ALM201的MALDI-FTICR-MSI热图分布，并且图9C示出了以下内源性代谢物的热图：m/z 1028.135±0.025 Da，主要分布在角膜中；1444.584±0.025 Da，主要分布于晶状体中；782.5799±0.025 Da，主要分布于房水和玻璃体液中；780.5451±0.025 Da，分布于肌肉中；835.5891±0.025 Da和分布于整个眼中的ALM201，2576.303±0.025 Da。这些数据表明，ALM201在表面处理之后已渗透至眼的所有层。

图10示出了经H&E染色的大鼠眼切片和在2576.3±0.1 Da的MALDI-MSI图像的叠加。将正常眼每天用100μM的ALM201处理持续3天，并随后在最后一次处理之后15分钟摘出。如热图所示，图像显示大部分肽与玻璃体液和可能的晶状体共定位。该肽还共定位在角膜、巩膜、脉络膜和视网膜中。

图11示出了组织学分析的结果。与对照相比，来自用ALM201处理的大鼠的眼显示出降低的新血管形成(图11A，白色箭头指示缝合线，且黑色箭头指示血管)。

此外，与经PBS处理的对照和还有经***处理的动物相比，经ALM201处理的动物显示出降低的总细胞浸润(图110B)和CD68+细胞浸润(图11C)。CD68+是巨噬细胞和单核细胞的标志物，并且CD68+细胞浸润的降低表明这些样品中的炎症减轻。

结论

这些数据表明，表面施用于角膜的ALM201迅速渗透并分布至眼的所有层。因此，ALM201可提供对前部眼部疾病和后部疾病的有效治疗。H&E和CD68+染色显示表面施用的ALM201抑制新血管形成、总细胞浸润和炎性细胞浸润。

实施例4-ALM201在防止受损角膜中新血管形成和炎症中的用途

ALM201浓度滴定

方法

将每只大鼠麻醉，并将两个10-0缝合线基质内置于左眼的颞角膜(temporalcornea)中，离角膜缘(limbus)1.5mm。在整个实验中将缝合线放置在适合位置。将右眼保持为无缝合线对照，但与左眼给予相同的处理。在缝合线放置之后约24小时开始处理，并且继续每天一次持续6天。根据图12中所示的处理方案处理大鼠。

在最后一次处理之后约24小时，对眼进行成像并进行临床评分。根据血管密度、血管到缝合线的距离和炎症对缝合眼进行评分。在以下三个中对血管密度进行评分：0＝无密度，1＝轻度，2＝中等，3＝高。在以下4个中对血管到缝合线的距离进行评分：0＝不可达，1＝短距离，2＝中等距离，3＝3/4路径，4＝到达缝合线；并且在以下3个中对炎症进行评分：0＝无，1＝极低，2＝中等，3＝严重。在临床评分之后，将眼摘出，进行组织处理，蜡包埋并切成5μm切片，同时小心以找到缝合区域。将切片用苏木精和伊红(H&E)进行染色以确定每只眼中的缝合线位置，然后使用相邻载片用于免疫组织化学以鉴定CD44+细胞和FKBPL表达以及NFκB和p-IκBα。

结果

在缝合之后第7天，获取每只大鼠的图像(图13A)并对角膜损伤进行临床评分。临床评分的结果显示，当与PBS载剂对照相比时，在1μM ALM201和***处理组中血管到缝合线的距离显著不同(图13B)。

血管密度的临床评分也显示，当与PBS对照组相比时，在ALM2011μM、10μM、100μM处理组和***中血管密度存在显著性降低(图13C)。

炎症评分显示，与PBS处理组相比，在***、ALM201 10μM和100μM之间存在显著性差异。在炎症和血管密度评分两方面在100μM ALM201和***之间也存在评分的显著性差异。

根据这些结果，1μM和10μM是ALM201防止血管生成和炎症的最有效浓度。

免疫组织化学和H&E

将切片(5μm)用苏木精和伊红(H&E)染色以确定每只眼中的缝合线位置。然后，使用相邻载片用于免疫组织化学以鉴定CD44+细胞和FKBPL表达。

H&E染色(图14)显示，当ALM201浓度从0.01μM提高至10μM时，细胞浸润、角膜肿胀和血管降低。然而，在100μM ALM201下，观察到更多的角膜肿胀。

对CD44的免疫组织化学染色(图15)显示CD44在无缝合角膜中在角膜上皮、基质角膜细胞和角膜内皮中内源性表达。在经PBS处理的缝合角膜中，CD44表达提高，最可能是由于基质中CD44+炎性细胞的提高。当与缝合的PBS对照相比时，用1μM ALM201处理的缝合角膜显示CD44表达降低。因此，显示1μM ALM201防止CD44+炎性细胞进入角膜。

ALM201是天然存在FKBPL蛋白的衍生物。FKBPL的免疫组织化学(图16)显示FKBPL在正常角膜中在角膜上皮和内皮中内源性表达。在缝合的经PBS处理角膜中，FKBPL也在基质中表达。令人感兴趣的是，与经PBS处理的缝合角膜和正常角膜相比，在缝合的经1μMALM201处理角膜中，角膜上皮和基质中的FKBPL表达提高(图16)。

NFκB途径

在该实验中还使用NFκB和磷酸化IκBα抗体以观察ALM201是否影响NFκB途径。B细胞的核因子κ轻链增强子或NFκB是转录因子，其参与包括炎症、B细胞发育、凋亡、免疫调节和细胞增殖在内的数个过程。在NFκB家族中存在5种不同的NFκB异二聚体，这根据哪种异二聚体被活化，其可以活化或抑制上述过程的转录。NFκB途径是非常复杂的途径，其被许多不同的配体(例如TNFα、生长因子和IL-1b)活化，并且作用于许多不同的基因(包括CD44)。使用抗NFκB和磷酸化IκBκ(p-IκBα)以发现ALM201是否对该途径具有作用以进一步洞察其作用模式。

在未经刺激的细胞中，IκBα在细胞质中与NFκB结合，抑制NFκB核定位。当NFκB途径被活化时，IκBα被磷酸化，促使其释放NFκB，从而露出其核定位信号。然后，NFκB自由地移动进入到细胞核中，在细胞核中其发挥转录因子的作用。

游离NFκB表达的免疫组织化学分析(图17)显示，在未缝合的角膜中，NFκB在角膜上皮、内皮和基质角膜细胞中内源性表达。用PBS或1μM ALM201处理对未缝合角膜中这种模式的NFκB表达没有作用。然而，在用PBS处理的缝合角膜中，当与无缝合线对照相比时，NFκB表达提高。相反，与PBS对照缝合角膜相比，用1μM ALM201处理的缝合角膜显示基质中NFκB表达的降低。

为了证实对游离NFκB表达的观察结果，还对角膜中的p-IκBα表达进行免疫组织化学确定。在经PBS和1μM ALM201处理的未缝合角膜中均不存在p-IκBα表达。在经PBS处理的缝合角膜中，p-IκBα表达提高，这通过用1μM ALM201处理而降低(图18)。

根据这些结果，ALM201可直接影响NFκB途径，或者可由于与经ALM201处理的角膜相比在经PBS处理的缝合角膜中炎性细胞的存在提高而存在表达差异。

表3：FKBP-L肽

序列表

<110> 阿尔麦克探索有限公司

<120> 眼部疾病的治疗

<130> P148326WO00

<150> GB1610938.1

<151> 2016-09-22

<150> GB1705435.4

<151> 2017-04-04

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 349

<212> PRT

<213> 人

<400> 1

Met Glu Thr Pro Pro Val Asn Thr Ile Gly Glu Lys Asp Thr Ser Gln

1 5 10 15

Pro Gln Gln Glu Trp Glu Lys Asn Leu Arg Glu Asn Leu Asp Ser Val

20 25 30

Ile Gln Ile Arg Gln Gln Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu

35 40 45

Leu Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser Gln Ile Leu Glu His Thr Gln

50 55 60

Gly Ala Glu Lys Leu Val Ala Glu Leu Glu Gly Asp Ser His Lys Ser

65 70 75 80

His Gly Ser Thr Ser Gln Met Pro Glu Ala Leu Gln Ala Ser Asp Leu

85 90 95

Trp Tyr Cys Pro Asp Gly Ser Phe Val Lys Lys Ile Val Ile Arg Gly

100 105 110

His Gly Leu Asp Lys Pro Lys Leu Gly Ser Cys Cys Arg Val Leu Ala

115 120 125

Leu Gly Phe Pro Phe Gly Ser Gly Pro Pro Glu Gly Trp Thr Glu Leu

130 135 140

Thr Met Gly Val Gly Pro Trp Arg Glu Glu Thr Trp Gly Glu Leu Ile

145 150 155 160

Glu Lys Cys Leu Glu Ser Met Cys Gln Gly Glu Glu Ala Glu Leu Gln

165 170 175

Leu Pro Gly His Ser Gly Pro Pro Val Arg Leu Thr Leu Ala Ser Phe

180 185 190

Thr Gln Gly Arg Asp Ser Trp Glu Leu Glu Thr Ser Glu Lys Glu Ala

195 200 205

Leu Ala Arg Glu Glu Arg Ala Arg Gly Thr Glu Leu Phe Arg Ala Gly

210 215 220

Asn Pro Glu Gly Ala Ala Arg Cys Tyr Gly Arg Ala Leu Arg Leu Leu

225 230 235 240

Leu Thr Leu Pro Pro Pro Gly Pro Pro Glu Arg Thr Val Leu His Ala

245 250 255

Asn Leu Ala Ala Cys Gln Leu Leu Leu Gly Gln Pro Gln Leu Ala Ala

260 265 270

Gln Ser Cys Asp Arg Val Leu Glu Arg Glu Pro Gly His Leu Lys Ala

275 280 285

Leu Tyr Arg Arg Gly Val Ala Gln Ala Ala Leu Gly Asn Leu Glu Lys

290 295 300

Ala Thr Ala Asp Leu Lys Lys Val Leu Ala Ile Asp Pro Lys Asn Arg

305 310 315 320

Ala Ala Gln Glu Glu Leu Gly Lys Val Val Ile Gln Gly Lys Asn Gln

325 330 335

Asp Ala Gly Leu Ala Gln Gly Leu Arg Lys Met Phe Gly

340 345

<210> 2

<211> 349

<212> PRT

<213> 人

<400> 2

Met Glu Thr Pro Pro Val Asn Thr Ile Gly Glu Lys Asp Thr Ser Gln

1 5 10 15

Pro Gln Gln Glu Trp Glu Lys Asn Leu Arg Glu Asn Leu Asp Ser Val

20 25 30

Ile Gln Ile Arg Gln Gln Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu

35 40 45

Leu Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser Gln Ile Leu Glu His Thr Gln

50 55 60

Gly Ala Glu Lys Leu Val Ala Glu Leu Glu Gly Asp Ser His Lys Ser

65 70 75 80

His Gly Ser Thr Ser Gln Met Pro Glu Ala Leu Gln Ala Ser Asp Leu

85 90 95

Trp Tyr Cys Pro Asp Gly Ser Phe Val Lys Lys Ile Val Ile Arg Gly

100 105 110

His Gly Leu Asp Lys Pro Lys Leu Gly Ser Cys Cys Arg Val Leu Ala

115 120 125

Leu Gly Phe Pro Phe Gly Ser Gly Pro Pro Glu Gly Trp Thr Glu Leu

130 135 140

Thr Met Gly Val Gly Pro Trp Arg Glu Glu Thr Trp Gly Glu Leu Ile

145 150 155 160

Glu Lys Cys Leu Glu Ser Met Cys Gln Gly Glu Glu Ala Glu Leu Gln

165 170 175

Leu Pro Gly His Thr Gly Pro Pro Val Gly Leu Thr Leu Ala Ser Phe

180 185 190

Thr Gln Gly Arg Asp Ser Trp Glu Leu Glu Thr Ser Glu Lys Glu Ala

195 200 205

Leu Ala Arg Glu Glu Arg Ala Arg Gly Thr Glu Leu Phe Arg Ala Gly

210 215 220

Asn Pro Glu Gly Ala Ala Arg Cys Tyr Gly Arg Ala Leu Arg Leu Leu

225 230 235 240

Leu Thr Leu Pro Pro Pro Gly Pro Pro Glu Arg Thr Val Leu His Ala

245 250 255

Asn Leu Ala Ala Cys Gln Leu Leu Leu Gly Gln Pro Gln Leu Ala Ala

260 265 270

Gln Ser Cys Asp Arg Val Leu Glu Arg Glu Pro Gly His Leu Lys Ala

275 280 285

Leu Tyr Arg Arg Gly Val Ala Gln Ala Ala Leu Gly Asn Leu Glu Lys

290 295 300

Ala Thr Ala Asp Leu Lys Lys Val Leu Ala Ile Asp Pro Lys Asn Arg

305 310 315 320

Ala Ala Gln Glu Glu Leu Gly Lys Val Val Ile Gln Gly Lys Asn Gln

325 330 335

Asp Ala Gly Leu Ala Gln Gly Leu Arg Lys Met Phe Gly

340 345

<210> 3

<211> 23

<212> PRT

<213> 人

<400> 3

Ile Arg Gln Gln Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu Glu

1 5 10 15

Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser

20

<210> 4

<211> 24

<212> PRT

<213> 人

<400> 4

Gln Ile Arg Gln Gln Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu

1 5 10 15

Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser

20

<210> 5

<211> 199

<212> PRT

<213> 人

<400> 5

Met Glu Thr Pro Pro Val Asn Thr Ile Gly Glu Lys Asp Thr Ser Gln

1 5 10 15

Pro Gln Gln Glu Trp Glu Lys Asn Leu Arg Glu Asn Leu Asp Ser Val

20 25 30

Ile Gln Ile Arg Gln Gln Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu

35 40 45

Leu Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser Gln Ile Leu Glu His Thr Gln

50 55 60

Gly Ala Glu Lys Leu Val Ala Glu Leu Glu Gly Asp Ser His Lys Ser

65 70 75 80

His Gly Ser Thr Ser Gln Met Pro Glu Ala Leu Gln Ala Ser Asp Leu

85 90 95

Trp Tyr Cys Pro Asp Gly Ser Phe Val Lys Lys Ile Val Ile Arg Gly

100 105 110

His Gly Leu Asp Lys Pro Lys Leu Gly Ser Cys Cys Arg Val Leu Ala

115 120 125

Leu Gly Phe Pro Phe Gly Ser Gly Pro Pro Glu Gly Trp Thr Glu Leu

130 135 140

Thr Met Gly Val Gly Pro Trp Arg Glu Glu Thr Trp Gly Glu Leu Ile

145 150 155 160

Glu Lys Cys Leu Glu Ser Met Cys Gln Gly Glu Glu Ala Glu Leu Gln

165 170 175

Leu Pro Gly His Thr Gly Pro Pro Val Gly Leu Thr Leu Ala Ser Phe

180 185 190

Thr Gln Gly Arg Asp Ser Trp

195

<210> 6

<211> 150

<212> PRT

<213> 人

<400> 6

Met Glu Thr Pro Pro Val Asn Thr Ile Gly Glu Lys Asp Thr Ser Gln

1 5 10 15

Pro Gln Gln Glu Trp Glu Lys Asn Leu Arg Glu Asn Leu Asp Ser Val

20 25 30

Ile Gln Ile Arg Gln Gln Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu

35 40 45

Leu Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser Gln Ile Leu Glu His Thr Gln

50 55 60

Gly Ala Glu Lys Leu Val Ala Glu Leu Glu Gly Asp Ser His Lys Ser

65 70 75 80

His Gly Ser Thr Ser Gln Met Pro Glu Ala Leu Gln Ala Ser Asp Leu

85 90 95

Trp Tyr Cys Pro Asp Gly Ser Phe Val Lys Lys Ile Val Ile Arg Gly

100 105 110

His Gly Leu Asp Lys Pro Lys Leu Gly Ser Cys Cys Arg Val Leu Ala

115 120 125

Leu Gly Phe Pro Phe Gly Ser Gly Pro Pro Glu Gly Trp Thr Glu Leu

130 135 140

Thr Met Gly Val Gly Pro

145 150

<210> 7

<211> 85

<212> PRT

<213> 人

<400> 7

Met Glu Thr Pro Pro Val Asn Thr Ile Gly Glu Lys Asp Thr Ser Gln

1 5 10 15

Pro Gln Gln Glu Trp Glu Lys Asn Leu Arg Glu Asn Leu Asp Ser Val

20 25 30

Ile Gln Ile Arg Gln Gln Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu

35 40 45

Leu Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser Gln Ile Leu Glu His Thr Gln

50 55 60

Gly Ala Glu Lys Leu Val Ala Glu Leu Glu Gly Asp Ser His Lys Ser

65 70 75 80

His Gly Ser Thr Ser

85

<210> 8

<211> 57

<212> PRT

<213> 人

<400> 8

Met Glu Thr Pro Pro Val Asn Thr Ile Gly Glu Lys Asp Thr Ser Gln

1 5 10 15

Pro Gln Gln Glu Trp Glu Lys Asn Leu Arg Glu Asn Leu Asp Ser Val

20 25 30

Ile Gln Ile Arg Gln Gln Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu

35 40 45

Leu Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser

50 55

<210> 9

<211> 47

<212> PRT

<213> 人

<400> 9

Met Glu Thr Pro Pro Val Asn Thr Ile Gly Glu Lys Asp Thr Ser Gln

1 5 10 15

Pro Gln Gln Glu Trp Glu Lys Asn Leu Arg Glu Asn Leu Asp Ser Val

20 25 30

Ile Gln Ile Arg Gln Gln Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu

35 40 45

<210> 10

<211> 18

<212> PRT

<213> 人

<400> 10

Gln Gln Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu Glu Val Ser

1 5 10 15

Pro Asp

<210> 11

<211> 21

<212> PRT

<213> 人

<400> 11

Gln Ile Arg Gln Gln Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu

1 5 10 15

Glu Val Ser Pro Asp

20

<210> 12

<211> 18

<212> PRT

<213> 人

<400> 12

Gln Ile Arg Gln Gln Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu

1 5 10 15

Glu Val

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> 人

<400> 13

Gln Ile Arg Gln Gln Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> 人

<400> 14

Gln Ile Arg Gln Gln Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu

1 5 10

<210> 15

<211> 21

<212> PRT

<213> 人

<400> 15

Gln Gln Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu Glu Val Ser

1 5 10 15

Pro Asp Pro Ala Ser

20

<210> 16

<211> 18

<212> PRT

<213> 人

<400> 16

Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu Glu Val Ser Pro Asp Pro

1 5 10 15

Ala Ser

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> 人

<400> 17

Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser

1 5 10 15

<210> 18

<211> 12

<212> PRT

<213> 人

<400> 18

Thr Leu Glu Leu Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser

1 5 10

<210> 19

<211> 19

<212> PRT

<213> 人

<400> 19

Arg Gln Gln Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu Glu Val

1 5 10 15

Ser Pro Asp

<210> 20

<211> 18

<212> PRT

<213> 人

<400> 20

Arg Gln Gln Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu Glu Val

1 5 10 15

Ser Pro

<210> 21

<211> 17

<212> PRT

<213> 人

<400> 21

Arg Gln Gln Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu Glu Val

1 5 10 15

Ser

<210> 22

<211> 16

<212> PRT

<213> 人

<400> 22

Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu Glu Val Ser Pro Asp

1 5 10 15

<210> 23

<211> 15

<212> PRT

<213> 人

<400> 23

Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu Glu Val Ser Pro Asp

1 5 10 15

Claims (23)

1.FKBP-L多肽或其生物活性肽片段，其用于治疗或预防角膜新血管形成。

2.根据权利要求1所述应用的FKBP-L多肽或其生物活性肽片段，其用于预防或治疗角膜移植手术之后的角膜新血管形成。

3.FKBP-L多肽或其生物活性肽片段，其用于治疗或预防眼部炎性病症。

4.根据权利要求3所述应用的FKBP-L多肽或其生物活性肽片段，其中所述眼部炎性病症是葡萄膜炎。

5.根据权利要求3所述应用的FKBP-L多肽或其生物活性肽片段，其中所述眼部炎性病症是干眼综合征。

6.根据权利要求3所述应用的FKBP-L多肽或其生物活性肽片段，其中所述眼部炎性病症是睑角膜结膜炎。

7.根据前述权利要求中任一项所述应用的FKBP-L多肽或其生物活性肽片段，其中所述FKBP-L多肽或其生物活性肽片段表面施用于眼部。

8.根据权利要求1至6中任一项所述应用的FKBP-L多肽或其生物活性肽片段，其中所述FKBP-L多肽或其生物活性肽片段通过结膜下注射、基质内注射或眼内注射施用。

9.根据权利要求1至8中任一项所述应用的FKBP-L多肽或其生物活性肽片段，其中所述生物活性肽片段包含氨基酸序列IRQQPRDPPTETLELEVSPDPAS(SEQ ID NO：3)，或与其具有至少90％同一性的序列。

10.根据权利要求1至8中任一项所述应用的FKBP-L多肽或其生物活性肽片段，其中所述FKBP-L多肽包含如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％同一性的序列。

11.根据权利要求1至8中任一项所述应用的FKBP-L多肽或其生物活性肽片段，其中所述生物活性肽片段包含如SEQ ID No 4至23中任一个所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％同一性的序列。

12.在哺乳动物对象中治疗或预防角膜新血管形成的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的FKBP-L多肽或其生物活性肽片段。

13.根据权利要求12所述的方法，其中待治疗的所述对象已经经历角膜移植手术。

14.在哺乳动物对象中治疗或预防眼部炎性病症的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的FKBP-L多肽或其生物活性肽片段。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述眼部炎性病症是葡萄膜炎。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述眼部炎性病症是干眼综合征。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述眼部炎性病症是睑角膜结膜炎。

18.根据权利要求12至17中任一项所述的方法，其中所述FKBP-L多肽或其生物活性肽片段表面施用于眼部。

19.根据权利要求12至17中任一项所述的方法，其中所述FKBP-L多肽或其生物活性肽片段通过结膜下注射、基质内注射或眼内注射施用。

20.根据权利要求12至19中任一项所述的方法，其中所述生物活性肽片段包含氨基酸序列IRQQPRDPPTETLELEVSPDPAS(SEQ ID NO：3)，或与其具有至少90％同一性的序列。

21.根据权利要求12至19中任一项所述的方法，其中所述FKBP-L多肽包含如SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％同一性的序列。

22.根据权利要求12至19中任一项所述的方法，其中所述生物活性肽片段包含如SEQID No 4至23中任一个所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％同一性的序列。

23.根据权利要求12至22中任一项所述的方法，其中待治疗的所述对象是人。