CN109456264B - 一种检测硝基还原酶的荧光探针及其制备方法与酶促反应的应用 - Google Patents

一种检测硝基还原酶的荧光探针及其制备方法与酶促反应的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测硝基还原酶的荧光探针及其制备方法与酶促反应的应用，属于工业分析检测技术领域。所述荧光探针为3‑(4‑(2‑(4'‑(二苯胺基)‑3‑((4‑硝基苄基)氧基)‑[1,1'‑联苯基]‑4‑基)乙烯基)喹啉‑1‑溴)丙烷‑1‑磺酸盐。本发明的探针化合物通过引入亲水性基团磺酸根和喹啉盐类增强其亲水性，在硝基还原酶（NTR）的催化下发生1,6‑重排和消除反应，生成羟基，通过分子内电荷转移效应（ICT）引发的荧光变化来实现对酶促反应中NTR的检测分析。该方法具有制备简便、产率较高、且适用于检测酶促反应中高浓度酶含量等优点，在化工领域中的酶促反应体系酶检测领域显示了极大的应用前景。

Description

一种检测硝基还原酶的荧光探针及其制备方法与酶促反应的 应用
技术领域
本发明属于工业分析检测技术领域，具体涉及一种检测硝基还原酶的荧光探针及其制备方法与酶促反应的应用。
背景技术
硝基化合物广泛应用于医药、染料、农药和***等行业，但是它们大多数对人类有致癌作用，会引起诸多疾病，危害人类健康。而胺类化合物在农药、医药、染料、合成树脂、表面活性剂等诸多精细化工产品和中间体的合成中至关重要，因为，氨基的引入使得精细化学品功能的变化成为可能，例如氨基的引入可以使化合物的吸收和发射光谱红移，在染料生色基团的邻位引入氨基可以导致染料的颜色变化，氨基的引入可以改变染料的印染性能；更重要的是，和硝基化合物相比，胺类化合物毒性较小。目前，工业上大部分芳胺化合物都是经由芳香族硝基化合物还原制得，所以，硝基还原成氨基这一类反应在工业生产中有重要作用。
通常，工业上的主要还原方法是铁粉还原、硫化碱还原和催化加氢还原法等。但这些方法存在工艺流程复杂、后处理麻烦、过程中产生诸多废弃物、制备费用高昂等缺点。近年来，用生物方法将硝基化合物还原成氨基化合物发展迅速，成为构建环境友好的绿色化学的方法之一。酶，又称为酵素，是具有生物催化功能的生物大分子，是一类生物催化剂。绝大多数酶都是蛋白质，其具有较好的生物相容性和环境友好性。酶催化可以看作是介于均相和非均相催化反应之间的一种催化，既具有一般催化剂的特征，也具有不同于一般催化剂的特殊性。相比于一般催化剂，酶催化剂具有诸多优点：1)酶促反应具有很高的效率；2)酶促反应具有高度的专一性；3)酶促反应较为温和；4)酶的种类的多样性，使得酶促反应的多样性；5)可以通过调节酶的活性，进而调节酶促反应的效果。但由于大多数酶本身为蛋白质，其容易被反应过程中的温度、酸碱度、被催化物的浓度等影响其活性甚至失活。因此，酶促反应应尽可能在水相中进行，有利于减少有机溶剂对环境的污染且利于酶促反应的进行。
近些年，随着酶分离纯化技术的提高，用游离酶直接作用于硝基化合物的还原成为生物有机化学中的一个崭新领域，其中氧化还原酶催化还原硝基化合物是研究的热点。目前主要用于此类酶促反应的氧化还原酶主要有硝基还原酶、硝酸还原酶等。其中，硝基还原酶是一类应用相对广泛的酶，且其来源广泛易得，酶促作用条件温和，酶促反应效果较好，对其研究比较深入，作用机理相对成熟，同时其具有对氧敏感和对氧不敏感的两种酶类型，应用范围广泛。因此，为了能够保证酶促反应在工业应用中的硝基类化合物转换成胺类化合物的高效性和稳定性，研究和开发能够测量此类硝基还原酶的荧光探针具有重要意义。
荧光法在分析检测上具有选择性佳、灵敏度高、响应速度快和使用方便等优异特点。同时，荧光化合物在化学结构上易于设计、修饰和改进，能满足不同检测样品的需要；因此，荧光法非常适合工业上酶促反应中硝基还原酶的分析检测。中国专利CN201610050741.X制备了一种用于检测缺氧区硝基还原酶的双光子荧光探针，该化合物中的芳香硝基能够被硝基还原酶还原成芳胺基，并引发1,6-重排与消除反应，释放出荧光主体，导致荧光发生变化，但是该荧光探针水溶性一般，且具有聚集诱导淬灭的性质，难以实现高浓度和水相中的酶检测分析，同时使用双光子检测设备复杂且昂贵，应用领域主要集中于细胞中的缺氧区。中国专利CN201610471060.0公开了一种可以检测硝基还原酶的双光子荧光探针，将硝基直接接在荧光主体上，随着硝基还原酶浓度的增加，荧光强度逐渐增强，发射波长范围在425-475nm和500-550nm之间，该探针不利于在水相中使用，在高浓度的硝基还原酶存在时容易发生荧光淬灭，且主要应用于生物领域的细胞成像，不具备大规模工业酶促反应的应用潜质。
具有聚集诱导发光(AIE)性质的荧光材料在溶液分散状态中以单分子形式存在时，激发态的电子通过分子内的运动回到基态；当分子处于聚集态时，分子内运动受限制，激发态的电子只能通过辐射跃迁的方式回到基态，因而可以观察到荧光增强现象，在诸多领域中都有广泛应用。中国专利CN201710009923.7公开了一种基于AIE的荧光探针用于检测硝基还原酶，其将硝基直接接在四苯基乙烯上，未响应前由于D-π-A的电子效应，使得荧光明显，响应后由于D-π-D结构，导致使荧光变弱且蓝移，利用该荧光的变化实现对硝基还原酶的检测，但该探针主要应用在细胞中，且无法应用于工业酶促反应体系中酶浓度的检测分析。
尽管检测硝基还原酶的荧光探针在生物检测与成像领域目前已经取得了一些进展，但是鲜有将其应用于工业酶促反应中酶活性的检测分析。由此可见，工业酶促反应领域亟待开发能够检测具有特殊催化作用的酶活性检测分析探针。
发明内容
为了解决以上现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种荧光探针化合物。该荧光探针具备聚集诱导发光特性，通过引入亲水性基团磺酸根和喹啉盐类增强其亲水性，在硝基还原酶(NTR)的催化下发生1,6-重排和消除反应，生成羟基，通过分子内电荷转移效应(ICT)引发的荧光变化来实现对工业酶促反应中NTR的检测分析。
本发明的另一目的在于提供上述荧光化合物的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述荧光化合物应用于芳香硝基转化为芳香胺基的工业酶促反应中检测硝基还原酶的活性。
本发明目的通过以下技术方案实现。
一种检测硝基还原酶的荧光探针，所述荧光探针为3-(4-(2-(4'-(二苯胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-基)乙烯基)喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸盐，结构式如下：
Figure BDA0001887488260000031
以上所述的一种检测硝基还原酶的荧光探针的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)将4'-(二苯基胺基)-3-羟基-[1,1'-联苯]-4-甲醛溶于二甲基亚砜中，得溶液1；将对硝基苄溴溶于四氢呋喃中，得溶液2；分别超声溶液1和溶液2后混合在一起，并加入碳酸铯，控制反应温度为50-150℃，反应产物经分离纯化，得到黄色固体粉末4'-(二苯基胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-甲醛；
(2)将3-(4-甲基喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸盐溶于吡啶中，再加入乙酸，充分混合后加入步骤(1)所得到的4'-(二苯基胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-甲醛，搅拌加热至25-80℃反应，反应产物经分离纯化，得到***固体粉末3-(4-(2-(4'-(二苯胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-基)乙烯基)喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸盐。
优选地，步骤(1)中所述的4'-(二苯基胺基)-3-羟基-[1,1'-联苯]-4-甲醛和对硝基苄溴用量的摩尔比为1:(1.5-2)。
优选地，步骤(1)中所述碳酸铯和对硝基苄溴用量的摩尔比为(4-5):1。
优选地，步骤(2)中所述的3-(4-甲基喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸盐和4'-(二苯基胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-甲醛用量的摩尔比为1:(1-2)。
优选地，步骤(2)中所述乙酸和3-(4-甲基喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸用量的摩尔比为(2-4):1。
优选地，步骤(1)所述反应的时间为5h–48h。
优选地，步骤(2)所述反应的时间为3h–24h。
优选地，步骤(1)所述分离纯化步骤为：反应液冷却至室温，用二氯甲烷/去离子水萃取，收集有机相，干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化。
优选地，步骤(2)所述分离纯化步骤为：反应液冷却至室温，旋转蒸发仪除去溶剂，之后加入乙酸乙酯，并分别用盐酸和饱和食盐水洗涤，再干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化。
以上所述的一种检测硝基还原酶的荧光探针用于工业中芳香硝基转化为芳香胺基酶促反应中硝基还原酶的检测分析应用。
本发明所得产物荧光化合物为3-(4-(2-(4'-(二苯胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-基)乙烯基)喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸盐(TAE-NQS)，分子式为C45H37N3O6S，相对分子质量为747.24。TAE-NQS为***无味固体粉末，微溶于水，易溶于DMSO、DMF等溶剂。该化合物光稳定性好，无毒，适合应用于水相体系的酶促反应。因为TAE-NQS本身具有三苯胺基团，且其识别基团上的硝基可以很大程度地淬灭荧光，在500nm的激发光下，在750nm附近几乎没有荧光发射。而当TAE-NQS与硝基还原酶反应后，发生1,6-重排与消除反应，断裂后变成羟基(产物为3-(4-(2-(4'-(二苯胺基)-3-羟基-[1,1'-联苯基]-4-基)乙烯基)喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸盐TAE-NQS-OH)，并且由于供电子基羟基的存在，使得荧光有所变化，在750nm附近发出强烈荧光，同时因为AIE基团的三苯胺存在，使得响应后的探针产物也具备聚集诱导发光特性。本发明荧光探针可用于芳香硝基转化为芳香胺基这一类工业酶促反应中对硝基还原酶活性的检测。其识别机理如下所示：
Figure BDA0001887488260000041
本发明提供了一种可用于检测工业酶促反应中苯硝基转化成苯胺基这一类反应的硝基还原酶荧光探针，该探针本身只有极弱荧光，但是在硝基还原酶作用下，苯硝基还原成苯胺基，引发1,6-重排与消除反应，断裂后变成羟基，发出强烈荧光。
相对于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：
(1)本发明的荧光化合物TAE-NQS具有聚集诱导发光的特性，在化工领域的酶促反应中为了提高反应效率，大多数情况下会添加高浓度的酶参与反应，而本探针在高浓度的检测底物存在下，不会产生淬灭，所得检测效果灵敏度高、准确性好。
(2)本发明的TAE-NQS探针在硝基还原酶的催化反应后，可以发生1,6-重排和消除反应，断裂后由于AIE基团三苯胺的存在，内部的“机械旋转”被限制，非辐射跃迁回基态的能量耗散通道被限制，依旧具备聚集诱导发光的特性，同时，由于羟基的生成，可以使得荧光发生变化，因此可用于工业中酶促反应特别是芳香硝基转化为芳香胺基这一类反应中硝基还原酶的检测分析。
(3)本发明的荧光探针本身具有较长的发射波长，达到750nm，且具有明显的荧光增强效果。
(4)本发明的荧光探针能够适应在工业上的酶促反应中较苛刻和复杂的环境，结构稳定性良好，便于在化工行业的酶促反应中推广使用。
附图说明
图1为本发明所述荧光探针化合物的合成路线图。
图2为实施例1中4'-(二苯基胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-甲醛的核磁共振氢谱图。
图3为实施例1中3-(4-(2-(4'-(二苯胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-基)乙烯基)喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸盐的核磁共振氢谱图。
图4为本发明的荧光探针响应前后的吸收光谱图。
图5为本发明的荧光探针响应前后的荧光光谱图。
图6为TAE-NQS-OH荧光探针响应后产物的聚集诱导发光效应荧光光谱图。
图7为TAE-NQS荧光探针对硝基还原酶不同响应时间的荧光光谱图。
图8为TAE-NQS荧光探针对不同浓度硝基还原酶响应的荧光光谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明的荧光探针化合物的合成路线图如图1所示。
实施例1
(1)将365mg的4'-(二苯基胺基)-3-羟基-[1,1'-联苯]-4-甲醛溶于10mL二甲基亚砜，将324mg对硝基苄溴溶于10mL四氢呋喃，分别超声后混合在一起，并加入1.96g碳酸铯，控制反应温度为50℃，反应5h，反应液冷却至室温，用二氯甲烷/去离子水萃取，收集有机相，干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(所用的洗脱剂为二氯甲烷/石油醚，V/V＝2:1)，得到黄色固体粉末4'-(二苯基胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-甲醛405mg(产率81％)；通过核磁共振氢谱对该产物进行表征，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(TMS,ppm):10.58(s,1H),8.27(d,J＝8.6Hz,2H),8.07(d,J＝2.4Hz,1H),7.74(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H),7.65(d,J＝8.5Hz,2H),7.43(d,J＝8.6Hz,2H),7.28(s,1H),7.24(d,J＝10.8,4.8Hz,2H),7.12(d,J＝8.3Hz,6H),7.04(dd,J＝12.8,5.6Hz,4H),5.33(s,2H)。其中，10.58ppm处的质子峰水杨醛结构上的醛基质子峰，8.02ppm、7.75ppm和7.28ppm处的质子峰为水杨醛芳环上的3个H质子峰，8.26ppm和7.66ppm处的质子峰为对硝基苄溴上的4个H质子峰，7.40ppm和7.27ppm附近为三苯胺其中一个芳环上的4个质子的特征峰，7.0-7.24ppm为三苯胺芳环上剩余的10个质子的特征峰，5.33ppm处的质子峰为对硝基苄溴上的亚甲基特征峰。通过核磁的分析可以确定所合成的产物为目标中间体。所得产物的核磁共振氢谱图如图2所示。
(2)取265mg的3-(4-甲基喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸盐溶于10mL吡啶，再加入114μL乙酸，充分混合后加入500mg的4'-(二苯基胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-甲醛，搅拌加热至25℃反应3h，反应液冷却至室温，旋干溶剂，之后加入过量乙酸乙酯，并分别用盐酸和饱和食盐水洗涤3次和1次，再用无水硫酸钠干燥，抽滤，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(所用的洗脱剂为二氯甲烷/甲醇，V/V＝5:1)，得到***固体粉末3-(4-(2-(4'-(二苯胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-基)乙烯基)喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸盐448mg(产率60％)；通过核磁共振氢谱对该产物进行表征，1H NMR(600MHz,DMSO)δ(TMS,ppm):9.41(d,J＝6.5Hz,1H),8.81(d,J＝8.2Hz,1H),8.64(d,J＝9.0Hz,1H),8.46(t,J＝11.2Hz,2H),8.37-8.29(m,4H),8.27-8.22(m,1H),7.98-7.94(m,1H),7.87(d,J＝8.7Hz,2H),7.72(dd,J＝20.4,9.8Hz,3H),7.37-7.31(m,4H),7.30(d,J＝8.8Hz,1H),7.11-7.04(m,8H),5.53(s,2H),5.02(t,J＝7.5Hz,2H),2.12-2.05(m,2H),1.76-1.69(m,2H)。其中，a、b、c三处分别为烷基磺酸盐上的三个亚甲基质子特征峰，d处为对硝基苄溴上的亚甲基质子的特征峰，e为共轭双键结构上的质子特征峰，g为三苯胺及其偶联的是水杨醛芳环结构上的16个H质子的特征峰，7.78-9.5ppm为喹啉盐、对硝基苄溴上芳环结构以及水杨醛上偶联双键旁的质子峰，共计11个H质子的特征峰。通过核磁的分析可以确定所合成的产物为目标中间体。所得产物的核磁共振氢谱图如图3所示。
实施例2
(1)将365mg的4'-(二苯基胺基)-3-羟基-[1,1'-联苯]-4-甲醛溶于10mL二甲基亚砜，将389mg对硝基苄溴溶于10mL四氢呋喃，分别超声后混合在一起，并加入2.64g碳酸铯，控制反应温度为100℃，反应24h，反应液冷却至室温，用二氯甲烷/去离子水萃取，收集有机相，干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(所用的洗脱剂为二氯甲烷/石油醚，V/V＝2:1)，得到黄色固体粉末4'-(二苯基胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-甲醛415mg(产率83％)；
(2)取265mg的3-(4-甲基喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸盐溶于10mL吡啶，再加入171μL乙酸，充分混合后加入750mg的4'-(二苯基胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-甲醛，搅拌加热至50℃反应12h，反应液冷却至室温，旋转蒸发仪除去溶剂，之后加入过量乙酸乙酯，并分别用盐酸和饱和食盐水洗涤3次和1次，再用无水硫酸钠干燥，抽滤，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(所用的洗脱剂为二氯甲烷/甲醇，V/V＝5:1)，得到***固体粉末3-(4-(2-(4'-(二苯胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-基)乙烯基)喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸盐485mg(产率65％)。
本实施例所得荧光化合物TAE-NQS的中间体以及最终的化合物表征与实施例1中的结果是相同的。
实施例3
(1)将365mg的4'-(二苯基胺基)-3-羟基-[1,1'-联苯]-4-甲醛溶于10mL二甲基亚砜，将432mg对硝基苄溴溶于10mL四氢呋喃，分别超声后混合在一起，并加入3.26g碳酸铯，控制反应温度为150℃，反应48h，反应液冷却至室温，用二氯甲烷/去离子水萃取，收集有机相，干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(所用的洗脱剂为二氯甲烷/石油醚，V/V＝2:1)，得到黄色固体粉末4'-(二苯基胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-甲醛430mg(产率86％)；
(2)取265mg的3-(4-甲基喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸盐溶于10mL吡啶，再加入228μL乙酸，充分混合后加入1000mg的4'-(二苯基胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-甲醛，搅拌加热至80℃反应24h，反应液冷却至室温，旋转蒸发仪除去溶剂，之后加入过量乙酸乙酯，并分别用盐酸和饱和食盐水洗涤3次和1次，再用无水硫酸钠干燥，抽滤，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(所用的洗脱剂为二氯甲烷/甲醇，V/V＝5:1)，得到***固体粉末3-(4-(2-(4'-(二苯胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-基)乙烯基)喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸盐470mg(产率63％)。
本实施例所得荧光化合物TAE-NQS的中间体以及最终的化合物表征与实施例1中的结果是相同的。
本发明所得荧光探针化合物在酶促反应体系中检测硝基还原酶的活性测试：
将1.5mg固体荧光化合物3-(4-(2-(4'-(二苯胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-基)乙烯基)喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸盐(TAE-NQS，实施例1制备)溶于2mL的DMSO中，配置成1mM的荧光化合物母液。测试之前，用磷酸盐缓冲液(10mM，pH 7.4)稀释至荧光化合物浓度为10μM，得到含有1％DMSO的测试溶液体系。
(1)探针化合物TAE-NQS的荧光性质：
吸取3μL上述荧光化合物母液，用PBS缓冲溶液(10mM，pH＝7.4)配置空白对照样和测试样，控制空白样中探针化合物浓度为10μM，其中不加入硝基还原酶和辅酶物质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)作为对照组，测试样中探针化合物浓度为10μM，并控制最终硝基还原酶的浓度为2μg/mL，辅酶物质NADH的浓度为100μM，在37℃温育15min，之后分别检测350nm到700nm之间的吸收光谱，以及在波长500nm的激发光照射下测试其荧光光谱，结果如图4和图5所示。测试样相比于空白样，吸收发生了红移，且荧光强度发生明显变化，这是因为测试样中的探针分子在NTR存在时，发生了1,6-重排和消除反应，断裂后生成的羟基为供电子基，得到3-(4-(2-(4'-(二苯胺基)-3-羟基-[1,1'-联苯基]-4-基)乙烯基)喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸盐(TAE-NQS-OH)，导致了分子内电荷转移效应(ICT效应)发生，使得荧光发生红移；同时由于具有AIE基团的三苯胺存在，使得荧光分子本身具备较好的AIE效果。TAE-NQS-OH的AIE效果(通过调节水和N,N-二甲基甲酰胺的比例为0％-99％，控制每组的探针浓度为10μM，配制成聚集诱导发光性质的测试体系)的测试具体结果如图6所示。
(2)探针化合物TAE-NQS在PBS缓冲液中对不同浓度NTR的荧光响应测试，以及响应时间测试：
测试了当NTR浓度为2μg/mL，探针浓度为10μM时，荧光强度随时间的变化，如图7所示。并且配置NTR浓度分别为0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、5μg/mL，探针浓度为10μM的一系列PBS缓冲液(pH＝7.4)，控制温度为37℃，响应时间为5min，分别测定每组测试样在波长500nm的激发波长下的荧光光谱图，测试结果如图8所示。从图7和图8中可以看出，本发明所制得的荧光探针对酶促反应体系中的NTR有较好的检测效果，随着NTR(0-5μg/mL)的增加在30min内反应充分，响应前后荧光变化明显，可以说明其适用于芳香硝基转化为芳香胺基这一类反应中硝基还原酶的检测。
该方法具有制备简便、产率较高、且适用于酶促反应中检测高浓度含量酶等优点，在化工行业中的酶促反应体系酶检测领域显示了极大的应用前景。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测硝基还原酶的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针为3-(4-(2-(4'-(二苯胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-基)乙烯基)喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸盐，结构式如下：
Figure FDA0001887488250000011
2.制备权利要求1所述的一种检测硝基还原酶的荧光探针的方法，其特征在于，包括如下制备步骤：
(1)将4'-(二苯基胺基)-3-羟基-[1,1'-联苯]-4-甲醛溶于二甲基亚砜中，将对硝基苄溴溶于四氢呋喃中，分别超声后混合在一起，并加入碳酸铯，控制反应温度为50-150℃，反应产物经分离纯化，得到黄色固体粉末4'-(二苯基胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-甲醛；
(2)将3-(4-甲基喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸盐溶于吡啶中，再加入乙酸，充分混合后加入步骤(1)所得到的4'-(二苯基胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-甲醛，搅拌加热至25-80℃反应，反应产物经分离纯化，得到***固体粉末3-(4-(2-(4'-(二苯胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-基)乙烯基)喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸盐。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的4'-(二苯基胺基)-3-羟基-[1,1'-联苯]-4-甲醛和对硝基苄溴用量的摩尔比为1:(1.5-2)。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述碳酸铯和对硝基苄溴用量的摩尔比为(4-5):1。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的3-(4-甲基喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸盐和4'-(二苯基胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1,1'-联苯基]-4-甲醛用量的摩尔比为1:(1-2)。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述乙酸和3-(4-甲基喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸盐用量的摩尔比为(2-4):1。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述反应的时间为5h–48h。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述反应的时间为3h–24h。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述分离纯化步骤为：反应液冷却至室温，用二氯甲烷/去离子水萃取，收集有机相，干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化；步骤(2)所述分离纯化步骤为：反应液冷却至室温，旋转蒸发仪除去溶剂，之后加入乙酸乙酯，并分别用盐酸和饱和食盐水洗涤，再干燥，过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化。
10.权利要求1所述的一种检测硝基还原酶的荧光探针用于工业中芳香硝基转化为芳香胺基酶促反应中硝基还原酶的检测分析应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109456264B (zh) 2018-11-30 2021-03-30 华南理工大学 一种检测硝基还原酶的荧光探针及其制备方法与酶促反应的应用
CN114436947B (zh) * 2020-11-01 2024-01-05 复旦大学 一种对粘度和硝基还原酶双响应的荧光探针及其制备方法和应用
CN112710838A (zh) * 2020-11-26 2021-04-27 华东理工大学 喹啉腈衍生物在蛋白质印记法检测蛋白质的应用及其制备方法
CN112592283B (zh) * 2021-01-25 2022-06-07 井冈山大学 一种用于酒类饮品粘度检测的荧光化合物及其制备和应用
CN112552208B (zh) * 2021-01-25 2022-06-10 井冈山大学 一种用于滴眼液质量检测的荧光分子及其制备和应用
CN115232120B (zh) * 2021-04-23 2023-09-05 香港理工大学深圳研究院 pH荧光探针及其合成方法与应用
CN113651748B (zh) * 2021-07-19 2023-05-23 华南理工大学 一种挥发性盐基氮响应型化合物、便携式检测试纸及制备方法与应用
CN113563279B (zh) * 2021-08-25 2022-07-26 安徽大学 一种检测硝基还原酶的双光子荧光探针及其制备方法和用途
CN114539230A (zh) * 2022-01-14 2022-05-27 东南大学 一类电化学发光体及其制备方法和应用
CN114436892B (zh) * 2022-01-27 2023-05-23 中国药科大学 一种Aβ响应的光激活荧光探针及其制备方法和应用
CN114736938A (zh) * 2022-03-21 2022-07-12 华南理工大学 一种乏氧响应型炔-胺点击聚合的细胞内聚合方法及其应用
CN114805447B (zh) * 2022-04-13 2023-11-24 兰州大学 一种铱配合物光敏剂及其制备方法与应用
CN114989081B (zh) * 2022-05-10 2023-06-13 南华大学 一种比色探针及其制备方法与应用
CN114907416B (zh) * 2022-05-17 2024-01-02 西安交通大学 一类含硒紫精坠饰的配位金属大环超分子及其合成方法和应用
CN114989080B (zh) * 2022-05-23 2023-12-22 井冈山大学 一种荧光化合物及其制备方法和应用以及一种荧光试条
CN115304630A (zh) * 2022-07-06 2022-11-08 福州大学 碳硼烷基苯并咪唑鎓环蕃受体及其在识别ump中的应用
CN115109266A (zh) * 2022-07-11 2022-09-27 江西理工大学 一种对苯甲醛和水杨醛具有选择性荧光识别的铽基金属有机框架及其制备方法
CN115356315A (zh) * 2022-08-25 2022-11-18 沈阳感光化工研究院有限公司 一种用荧烷类衍生物探针检测硫化氢方法
CN115466292B (zh) * 2022-09-19 2023-12-26 兰州大学 一种钌配合物探针及其制备方法和应用
CN115505008B (zh) * 2022-09-19 2023-12-22 兰州大学 一种铱配合物探针及其制备方法和应用
CN115872910B (zh) * 2022-12-16 2024-06-11 湖南工程学院 光/酶双重响应药物前体化合物及其制备方法和应用
CN116655544A (zh) * 2023-04-13 2023-08-29 大连理工大学 加速硝基还原酶检测的主-客体超分子探针及应用
CN116789631B (zh) * 2023-07-06 2024-05-31 陕西理工大学 一种酶协同光控一氧化氮供体、其制备及应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008030120A1 (en) * 2006-09-07 2008-03-13 Auckland Uniservices Limited A method for the fluorescent detection of nitroreductase activity using nitro-substituted aromatic compounds
CN103614135A (zh) * 2013-11-29 2014-03-05 安徽大学 一种双光子荧光探针及其制备方法和用途
CN105732564A (zh) * 2016-01-26 2016-07-06 济南大学 一种双光子荧光探针及在检测缺氧区硝基还原酶中的应用
CN104876863B (zh) * 2015-05-29 2017-02-22 北京农学院 荧光探针化合物及其制备方法和应用
CN107056618A (zh) * 2017-01-06 2017-08-18 济南大学 一种检测硝基还原酶的荧光探针
CN108191752A (zh) * 2017-12-21 2018-06-22 中山大学 一种选择性检测细胞内rna g-四链体的荧光探针及其制备方法和应用
CN108727223A (zh) * 2018-07-24 2018-11-02 南京工业大学 一种可双光子荧光检测硝基还原酶ntr探针及其制备方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105884734B (zh) 2016-06-24 2018-12-07 济南大学 一种快速检测硝基还原酶的双光子荧光探针
CN109456264B (zh) * 2018-11-30 2021-03-30 华南理工大学 一种检测硝基还原酶的荧光探针及其制备方法与酶促反应的应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008030120A1 (en) * 2006-09-07 2008-03-13 Auckland Uniservices Limited A method for the fluorescent detection of nitroreductase activity using nitro-substituted aromatic compounds
CN103614135A (zh) * 2013-11-29 2014-03-05 安徽大学 一种双光子荧光探针及其制备方法和用途
CN104876863B (zh) * 2015-05-29 2017-02-22 北京农学院 荧光探针化合物及其制备方法和应用
CN105732564A (zh) * 2016-01-26 2016-07-06 济南大学 一种双光子荧光探针及在检测缺氧区硝基还原酶中的应用
CN107056618A (zh) * 2017-01-06 2017-08-18 济南大学 一种检测硝基还原酶的荧光探针
CN108191752A (zh) * 2017-12-21 2018-06-22 中山大学 一种选择性检测细胞内rna g-四链体的荧光探针及其制备方法和应用
CN108727223A (zh) * 2018-07-24 2018-11-02 南京工业大学 一种可双光子荧光检测硝基还原酶ntr探针及其制备方法

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