CN109444422A - 一种基于upt-lf定量测定血清pivka-ii的检测卡及其构建方法及应用 - Google Patents

一种基于upt-lf定量测定血清pivka-ii的检测卡及其构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于UPT‑LF定量测定血清PIVKA‑II的检测卡及其构建方法及应用，该检测卡包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，所述结合垫上固定有上转换发光纳米粒子‑抗PIVKA‑II单克隆抗体1结合物，所述硝酸纤维素膜检测带和质控带，所述检测带固定有抗PIVKA‑II单克隆抗体2，所述质控带固定有二抗羊抗鼠IgG。本发明的检测卡具有良好的检测线性、灵敏度、稳定性、准确性、精密度与特异性，检测性能良好，可实现对HCC患者血清PIVKA‑II快速、高效的POCT式定量检测。

Description

一种基于UPT-LF定量测定血清PIVKA-II的检测卡及其构建方 法及应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体而言，涉及一种基于上转换发光技术免疫层析法定量测定血清PIVKA-II检测卡的构建方法及应用。
背景技术
维生素K缺乏凝血酶原-II(PIVKA-II)也称之为去γ-羧基凝血酶原(DCP)，是一种失去正常凝血功能的异常凝血酶原。在正常的凝血酶原前体结构中存在十个完全羧基化的谷氨酸残基，这些谷氨酸残基在肝细胞中的谷氨酰基羧化酶的作用下转变成为γ-羧基谷氨酸残基。当维生素K缺乏或者谷氨酰基羧化酶的活性下降时，则可导致缺乏一个到十个不等的γ-羧基谷氨酸残基且无正常凝血功能的异常凝血酶原(PIVKA-II)产生并释放至HCC患者血循环。
研究发现，在肿瘤结节直径大于5厘米的HCC患者中，大约有95％患者血清中的PIVKA-II水平超过6000mAU/ml(S.Nakamura,K.Nouso,K.Sakaguchi,et al.,Sensitivityand specificity of des-gamma-carboxy prothrombin for diagnosis of patientswith hepatocellular carcinomas varies according to tumor size,AM.J.GASTROENTEROL.Sci.101(2006)2038-43.)。Yoon等人发现PIVKA-II对HCC诊断的总体敏感性和特异性分别为48％-62％、81％-98％，优于AFP的39％-64％、76％-91％(Y.J.Yoon,K.H.Han,D.Y.Kim.,Role of serum prothrombin induced by vitamin Kabsence or antagonist-II in the early detection of hepatocellular carcinomain patients with chronic hepatitis B virus infection,Scand.J.Gastroenterol.Sci.44(2009)861-6.)。当血清PIVKA-II水平超过90mAU/ml时，其预测HCC肿瘤细胞侵袭肝脏微血管的敏感性和特异性可分别达到70％与63％(N.Pote,F.Cauchy,M.Albuquerque,et al.,Performance of PIVKA-II for earlyhepatocellular carcinoma diagnosis and prediction of microvascular invasion,J.Hepatol.Sci.62(2015)848-854.)。此外，相比AFP升高的患者，血清PIVKA-II升高HCC患者的肿瘤体积明显增大，发生肿瘤低分化与门静脉栓塞的患者比例明显升高(B.X.Truong,Y.Yano,VT.VAN,et al.,Clinical utility ofprotein induced by vitamin K absencein patients with chronic hepatitis B virus infection,Biomed.Rep.1(2013)122-128.)。因此，PIVKA-II对HCC的早期诊断、病情评估、预后判断具有很高的临床应用价值。
目前，临床实验室对于血清PIVKA-II的检测方法主要包括化学发光酶免疫分析法(CLEIA)，化学发光免疫分析法(CLIA)以及液相结合分析法(LBA)。然而这些测定方法都需要相对复杂的检测设备，应用受限于大型生物化学部门或者特殊化的中心实验室，并不适合于床旁检测(POCT)。鉴于临床有对床旁患者的病情评估需求，POCT检测法对于血清PIVKA-II的检测将是一个很好的选择。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于上转换发光技术免疫层析法定量测定血清PIVKA-II的检测卡及其构建方法及应用。
为了实现本发明的目的，本发明人采用稀土Ln3+系元素镱(Yb3+)与铒(Er3+)共掺杂的纳米颗粒NaYF4:Yb3+,Er3+作为生物标记探针发光基质材料，以免疫试纸条作为反应的固相载体，构建基于上转换发光免疫层析法(UPT-LF)的检测卡，实现了对原发性肝细胞癌患者血清PIVKA-II的快速、高效的POCT式定量检测，有效提高了HCC的早期诊断率、改善患者的预后。
具体地，本发明的技术方案概况如下：
一种基于上转换发光技术免疫层析法定量测定血清PIVKA-II的检测卡，该检测卡包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，所述样品垫与结合垫为玻璃纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上设有检测带和质控带，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸先后粘贴在粘性底衬上，采用切条机将其斩切成3-6mm宽的试纸条带，并包装于UPT卡壳；
所述结合垫上固定有上转换发光纳米粒子-抗PIVKA-II单克隆抗体1结合物，所述硝酸纤维素膜检测带和质控带，所述检测带固定有抗PIVKA-II单克隆抗体2，所述质控带固定有二抗羊抗鼠IgG。
进一步的，所述样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫依次以重叠1～2mm的间距交互层叠黏贴到PVC板上，所述试纸条的宽度为4mm。
进一步的，所述的上转换发光纳米粒子为TEOS和APES修饰的NaYF4:Yb3+,Er3+UCPs。通过TEOS修饰，使得NaYF4:Yb3+,Er3+UCPs颗粒表面包裹有一层SiO2；再通过APES修饰，其分子一端与硅相连，另一端则携带有活性羧基基团，功能化的UCPs可与多种生物活性分子结合，如抗体等。
一种基于上转换发光技术免疫层析法定量测定血清PIVKA-II的检测卡的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)NaYF4:Yb3+,Er3+UCPs的制备；
(2)NaYF4:Yb3+,Er3+UCPs的功能化修饰；
(3)上转换发光生物探针的构建；
(4)结合物溶液的配置及包被；
(5)阻断剂样品垫的制作；
(6)质控溶液和检测溶液的配置和包被；
(7)上转换免疫层析法的检测卡的制备。
进一步的，所述步骤(1)NaYF4:Yb3+,Er3+UCPs制备方法如下：
将YCl3(0.2343g),YbCl3(0.0755g)和ErCl3(0.0083g)三种试剂与4.5mL的油酸及26.0ml的1-十八烯混合于100mL的烧瓶中，在氩气氛围中加热至150-160℃至溶液混匀，持续25min后冷却至室温。将15mL含有0.015g的NaOH以及0.222g的NH4F的甲醇溶液缓慢地加入烧瓶中，并在溶液中迅速形成固态沉淀，此时反应体系搅拌30min。随后，将反应液缓慢加热至100℃并维持10min，以将甲醇挥发掉。随后迅速加热至300℃并维持1h。待溶液自然冷却后，使用乙醇将生成物从溶液中析出。沉淀在12000rpm下离心5min，并用水/乙醇(1：1体积比)清洗三次。将制备物溶于5mL环己烷中保存待用。
进一步的，所述步骤(2)的制备方法如下：
称取NaYF4:Yb3+,Er3+UCPs 40mg，加入95mL环己烷，并在超声震动条件下的超纯水中分散并使颗粒完全悬起，随后加入CO-5202.5mL，超声20min；加入氨水0.35mL(30wt％)、TEOS 0.09mL，磁力搅拌反应24h后，加入16ml乙醇并离心，弃去上清液；沉淀使用90mL异丙醇溶解，并向其中加入APES 0.9mL，磁力搅拌反应2.5h，离心并洗涤3次后备用。
进一步的，所述步骤(3)的探针构建方法如下：
5mg的UCPs加入1ml的纯化水中并于超声振动条件下溶解混匀，加入20％的Tween-20活性剂5ul，超声条件下混匀；向反应体系中加入75ug的抗PIVKA-II单克隆抗体1，超声振动条件下反应20min；反应结束后后向其中加入5ul BSA(20％)，超声振动条件下封闭5min；随后于以4℃，12000r/min的高速冷冻离心中离心30min，取出并弃去上清液备用。
进一步的，所述步骤(4)的结合物溶液的配置及包被方法如下：
结合物储存缓冲液配置：0.02mol/l、PH7.4的PBS缓冲液中分别加入0.1％BSA，0.3％TritonX-100，0.02％NaN3；结合物冻干缓冲液配置：0.02mol/l、PH7.4的PBS缓冲液中分别加入5％trehalose，1％BSA，2％mannitol，1％glycine，0.01％TB，0.5％casein，0.1％NaN3。先后向沉淀中分别加入100ul结合物储存缓冲液，5.5ml结合物冻干缓冲液，于超声振动条件水下混匀；将该混合液以600ul/加样枪均匀包被在3*19.33cm2(S＝58cm2)的SB08型玻璃纤维上，并迅速转移至冻干机中进行-60℃冻干处理，冷冻时间为2h；随后将其抽真空并维持至少8h，取出平衡至室温保存备用。
进一步的，所述步骤(5)的阻断剂样品垫的制作方法如下：
将HBR阻断剂使用TB缓冲液(0.01mol/L，PH8.0)稀释至浓度为75ug/mL后，取出10.0ml加入75.0ul Casein(20％)，随后将其均匀地浇在6*19.33cm2(S＝116cm2)的SB08玻璃纤维上，室温晾干后备用。
进一步的，所述步骤(6)的质控溶液和检测溶液的配置和包被方法如下：
将NC膜粘贴于粘性底衬指定位置，吸水纸与NC膜重叠一定宽度并和粘性底衬上端齐平进行粘贴。随后将测试抗体(T抗，PIVKA-II单克隆抗体2)与质控抗体(C抗，羊抗鼠IgG)用PB缓冲液(0.02mol/L,PH7.2)分别稀释成2.0mg/mL、0.6mg/mL；使用连续划膜机在NC膜的距离粘性底衬底端12mm及15mm处(层析方向自上而下)以1ul/cm的速度分别喷上T抗和C抗作为检测带(T线)和质控带(C线)；将包被好的NC膜放置在37℃烘箱中烘干1.5h，封装备用。
进一步的，所述步骤(7)的上转换免疫层析法的检测卡的制备方法如下：
将上转换发光生物探针的玻璃纤维(结合垫)裁剪成宽度为0.5cm大小，将其上端与NC膜重叠1mm的宽度粘贴于粘性底衬上；把含有阻断剂的玻璃纤维(阻断剂样品垫)裁剪成2.0cm宽，将其与粘性底衬下端齐平进行粘贴；用MAX膜对结合垫和样品垫进行再次固定，通过切条机将粘性底衬斩切成4mm宽的试纸条带；将试纸条装在UPT专用卡壳内，完成UPT-LF检测卡的整个制备过程。
本发明采用双抗体夹心模式UPT-LF分析法定量检测血清PIVKA-II，方法如下：样本稀释液配置：0.02mol/l、PH7.4的PBS缓冲液中分别加入0.15％BSA，0.1％NaN3；待测样本与样本稀释液混合体积比4：6，吸取100uL混合液加入至检测卡样本孔，免疫反应15min后，将检测卡***至UPT-3A-1800上转换免疫分析仪的检测孔进行扫描，UCPs在仪器内部近980nm NIR激发下发射出波长为541.5nm可见光，仪器将接收到来源于试纸条带T、C线的光信号转变成电信号并以“T值”和“C值”显示，而分析物的测定结果则以T值与C值的比值(T/C值)表示，同时仪器根据标准曲线将T/C值换算成具体浓度(ng/ml)。
与现有技术相比，本发明构建的基于UPT-LF的检测卡具有良好的检测带性、灵敏度、稳定性、准确性、精密度与特异性，同时具有检测性能良好、检测时间短及使用成本相对较低的优势，不仅适合实验室检测，也非常适用于床旁检测，可实现对HCC患者血清PIVKA-II快速、高效的POCT式定量检测，从而促进PIVKA-II检测在临床(尤其基层医疗单位)应用的推广与普及，满足临床大规模HCC易感人群筛查、检测的需求，有效提高HCC的早期诊断率、改善患者的预后。
附图说明
图1为稀土Ln3+金属Yb3+与Er3+共掺杂的NaYF4(NaYF4:Yb3+,Er3+)上转换纳米颗粒(UCPs)的示意图，其中：(A)NaYF4:Yb3+,Er3+透射电镜图；(B)UCPs在980nm近红外光(NIR)激发下发射出541.5nm的可见光(VIS)；(C)UCPs的SiO2壳层包裹、表面功能化修饰及连接生物活性蛋白。
图2为UPT-LF检测卡结构示意图，其中：(A)检测卡上卡壳示意图；(B)免疫试纸条结构示意图；(C)检测卡卡壳外孔与内部试纸条各部位对应关系。
图3为UPT-LF检测卡检测样本的示意图，其中：(A)UPT-3A-1800上转发光免疫分析仪，(B)UPT-3A-1800上转发光免疫分析仪检测样本后显示检测结果，(C)UPT-LF检测卡内部试纸条免疫反应原理示意图。
图4为UPT-LF分析法的标准定量曲线，其中：T/C值为PIVKA-II校准品每个稀释水平经两次测定所得结果的均值，meanblank和Co分别为本底值与校准品经稀释后的水平(ng/mL)，T/C-meanblank和Co采用同底对数后分别作为Y、X轴来绘制标准曲线。
图5为25℃和37℃存放五个时间点的UPT-LF检测卡对PIVKA-II重组抗原及HCC、LC、CHB、HC血清PIVKA-II的测定结果，其中：(A)、(B)为常温25℃存放0、7、15、30及60d后的检测卡测定结果；(C)、(D)为高温37℃存放0、1、3、5及7d后的检测卡测定结果。
图6为4℃存放0d、常规效期(18m)两个时间点四个批次UPT-LF检测卡对PIVKA-II的测定结果，其中：(A)至(E)依次为UPT-LF检测卡对PIVKA-II重组抗原以及HCC、LC、CHB和HC血清PIVKA-II测定的结果。
图7为UPT-LF检测卡对各组血清PIVKA-II的定量测定结果及对HCC的ROC曲线，其中：(A)UPT-LF检测卡对HCC组、LC组、CHB组、HC组血清PIVKA-II定量测定结果的散点图，横线与竖线分别代表检测各组血清PIVKA-II水平的中位数与四分位间距；(B)UPT-LF检测卡对HCC的ROC曲线【vs LBL(包括LC与CHB)+HC组】，曲线下面积AUC为0.85，P<0.001。
图8为UPT-LF与CLEIA分析法对178例HCC患者血清PIVKA-II定量测定结果的线性回归曲线，其中：UPT-LF与CLEIA分析法定量测定血清PIVKA-II结果之间的相关系数R2为0.901，线性回归方程为Y＝0.08X–4.50，P<0.01。
具体实施方式
本发明构建基于上转换发光免疫层析法(UPT-LF)的检测卡，实现对原发性肝细胞癌(HCC)患者血清PIVKA-II的快速、高效的POCT式定量检测，并对检测卡予以检测性能与诊断性能的评价。方法为，将上转换发光颗粒(UCPs)并与抗PIVKA-II抗体结合形成标记探针，构建可测定血清PIVKA-II的检测卡。通过检测限、线性、稳定性、精密度、回收率测定和干扰试验，评价基于UPT-LF的检测卡对PIVKA-II的检测性能。通过对228例HCC患者组、170例肝脏良性病变(LBL)组【肝硬化(LC)80例、慢性乙型肝炎(CHB)90例】、100例正常对照(HC)组血清PIVKA-II的定量测定，评价检测卡对HCC的诊断敏感性与特异性，以及与化学发光免疫分析法(CLEIA)定量检测结果的相关性。结果显示，修饰并活化的UCPs颗粒水溶液分散状态良好，可与PIVKA-II抗体牢固结合形成稳定的发光探针。构建的UPT-LF检测卡对PIVKA-II的检测限和线性范围分别为2.66ng/mL，4-20000ng/mL。25℃热稳定性与4℃效期稳定性良好、93.1％-99.2％的分析物回收率、批内和批间CV分别在2.6-5.8％与5.4-8.9％范围内、对8种血清常见分析物的抗干扰能力强。UPT-LF检测卡对HCC的诊断敏感性与特异性分别为71.49％、88.89％(vs LBL+HC组)。线性回归曲线分析显示，UPT-LF与CLEIA分析法对血清PIVKA-II定量检测结果的相关系数R2＝0.901。
为了能够更清楚理解本发明的技术构思和技术手段，并可依照说明书的内容和本领域的常规技术手段予以实施，下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细说明，但是以下具体试验例是对本发明的解释而不是限定。
1.材料和方法
1.1材料和检测设备
稀土上转换纳米颗粒(UCPs，NaYF4:Yb3+,Er3+)，UPT专用卡壳，粘性底衬，吸水纸，硝酸纤维素膜(NC膜，503C型)，玻璃纤维SB08，PIVKA-II(单克隆抗体1，mIgG1)，PIVKA-II(单克隆抗体2，mIgG2)，羊抗鼠IgG，PIVKA-II重组抗原以及异噬性抗体阻断剂IgG(HBR-IgG)。以上材料均由北京热景生物有限公司提供。3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APES)，非离子乳化剂CO-520，四乙氧基硅烷(TEOS)购自杭州大地化工有限公司。G PIVKA-II检测试剂盒购自日本FUJIREBIO公司。连续式划膜机和高速感应切条机为杭州Autokun科技有限公司产品；上转换发光免疫分析仪(UPT-3A-1800型)为北京热景生物有限公司产品；G1200免疫分析仪为日本FUJIREBIO公司产品。
1.2试剂
本研究所需的反应试剂均按照以下配方以及条件进行制备：样本稀释液(0.02mol/l PBS，0.15％BSA，0.1％NaN3；pH 7.4)，PIVKA-II重组抗原与抗体的稀释缓冲液(0.02mol/l PB；pH 7.4)，反应体系缓冲液(0.02mol/l Tris-HCl，0.1％Tween-20，0.15％BSA；pH 7.4)，结合物储存缓冲液(0.02mol/l PBS，0.1％BSA，0.3％TritonX-100，0.02％NaN3；pH 7.4)，结合物冻干缓冲液(5％trehalose，1％BSA，2％mannitol，1％glycine，0.01％TB，0.5％casein，0.1％NaN3；pH 7.4)。以上所有试剂均由北京热景生物有限公司提供。
1.3患者和样本
本研究涉及的448例研究对象来自2015年6月至2017年12月期间的福建省立医院，入选研究对象血清样本的使用获得福建省立医院伦理审查委员会的批准，伦理审批号：2016[K2016-10-28]。
448例研究对象包括健康对照(HC)100例(中位年龄44岁，男性47例，女性53例)；肝脏良性疾病(LBL)患者170例，含慢性乙型肝炎(CHB)患者90例(中位年龄48岁，男性57例，女性33例)和肝硬化(LC)患者80例(中位年龄63岁，男性54例，女性26例)；HCC患者228例(中位年龄56岁，男性199例，女性29例)。HC的乙肝表面抗原均为阴性，且肝功能正常、在超声或CT/MRI成像中无肝脏肿块；LC患者均经腹部超声或肝组织活检确认；CHB患者血清乙肝表面抗原阳性均持续半年以上；HCC患者均在超声引导下行肝脏活检或肝脏外科手术后的病理确认。所有研究对象的血清样本均严格按以下要求留取：采集清晨空腹外周静脉血5ml，室温放置2小时，以3000rpm离心5分钟分离出血清，分装2管，-80℃冻存备用。
1.4UPT-LF检测卡的构建
1.4.1UCPs的壳层包裹即表面修饰活化
将YCl3(0.2343g),YbCl3(0.0755g)和ErCl3(0.0083g)三种试剂与4.5mL的油酸及26.0ml的1-十八烯混合于100mL的烧瓶中，在氩气氛围中加热至150-160℃至溶液混匀，持续25min后冷却至室温。将15mL含有0.015g的NaOH以及0.222g的NH4F的甲醇溶液缓慢地加入烧瓶中，并在溶液中迅速形成固态沉淀，此时反应体系搅拌30min。随后，将反应液缓慢加热至100℃并维持10min，以将甲醇挥发掉。随后迅速加热至300℃并维持1h。待溶液自然冷却后，使用乙醇将生成物从溶液中析出。沉淀在12000rpm下离心5min，并用水/乙醇(1：1体积比)清洗三次，得到UCPs。
称取UCPs 40mg，加入95mL环己烷，并在超声震荡条件下的超纯水中溶解并使颗粒完全悬起，随后加入CO-5202.5mL，超声20min；加入氨水0.35mL(30wt％)、TEOS 0.09mL，磁力搅拌反应24h后，加入16ml乙醇并离心，弃去上清液；沉淀使用90mL异丙醇溶解，并向其中加入APES 0.9mL，磁力搅拌反应2.5h，离心并洗涤3次后备用。
1.4.2UPT-LF检测卡的构建
将5mg修饰并活化后具有蛋白结合活性的UCPs颗粒与标记抗体mIgG1(0.075mg/ml)在反应体系缓冲液中结合并形成发光标记探针，将UCPs-mIgG1复合物用结合物缓冲液及结合物冻干液进行稀释，随后将其以0.1ml/cm的体积量附着于空白玻璃纤维SB08上形成结合垫。将结合垫放于-60℃下的冷冻干燥机中冻干8h以上。将空白玻璃纤维SB08使用HBR阻断剂进行处理后形成阻断剂样品垫；将测试抗体(T抗，mIgG2)与质控抗体(C抗，羊抗鼠IgG)用抗体稀释缓冲液分别稀释浓度至2.0mg/mL、0.6mg/mL后，使用连续划膜机在NC膜上划出相距3mm的检测带(T带)和质控带(C带)，随后将NC膜放至37℃烘箱中2h；结合垫与样品垫分别裁剪宽度0.5cm、2.0cm，将吸水纸、结合垫、样品垫先后粘贴于粘性底衬上，采用切条机将其斩切成4mm宽的试纸条带(图2B)，并包装于UPT专用卡壳(图2A)内，完成UPT-LF检测卡的整个组装过程。检测卡内部试纸条结构与卡壳孔位关系如图2C所示。
1.5UPT-LF检测法的测定过程
UPT-LF检测卡加样体积为100uL，待检样本体积与样本稀释液体积混合比例为4：6，样本从检测卡样本孔加入，样本液在吸水纸的虹吸作用下，依次经过样品垫、结合垫、NC膜、最后达到吸水纸(图3C)。当加样后反应至15min，将检测卡放入UPT-3A-1800上转换免疫分析仪(如图3A)的检测孔进行检测，标记探针在仪器内部980nmNIR激发光照射下发射出541.5nm的可见光(图1B)，仪器将接收到来源于T、C线的光信号转变成电信号并以“T值”和“C值”表示，而被检物的测定结果则以T值与C值的比值(T/C值)表示，如图3B。T/C值与分析物的水平具有正相关关系。
1.6.UPT-LF分析法的评价
1.6.1检测限(LoD)和线性
空白检测限(LoB)的评估方法为重复测定60次不含分析物的样本稀释液，LoB＝meanblank+2(SD blank)。UPT-LF检测卡的检测限LoD的评估方法为重复测定60次低浓度的样本(0.5ng/ml)，LoD＝LoB+2(SD lowlevelsample)。
将PIVKA-II校准品(PIVKA-II重组抗原)系列稀释至40000,20000,10000,5000,2500,1250,625,312,156,78,39,19.5,9.7,4.8以及2.4ng/ml，每一种水平的校准品重复测定两次，计算测定的每一个水平分析物平均值(Co)，将Co的对数log(Co)作为X轴，T/C-meanblank的对数log(T/C-meanblank)作为Y轴来绘制线性回归曲线，通过拟合该曲线得到相应的线性回归方程："Y＝a×X+b"，公式中的系数a与b为检测卡的参数，决定了T/C值与分析物血清水平的换算关系。
1.6.2稳定性评价
使用在25℃下存放0、7、15、30、60天(d)共五个时间点的UPT-LF检测卡测定PIVKA-II重组抗原以及HCC、LC、CHB和HC的血清；使用在37℃下存放0、1、3、5、7d共五个时间点的检测卡测定上述五种样本；使用在4℃下存放0d、常规效期18个月(m)(参考北京热景公司基于UPT-LF的其他项目检测卡的效期)共两个时间点的检测卡测定上述五种样本，每份标本均检测两次后取均值。检测卡存放各时间点的测定结果与0d相比较，计算相对偏差δ，δ<15％为可接受范围。
2.6.3回收率测定
将PIVKA-II重组抗原分别配制成低浓度的55ng/mL、中浓度的1000ng/mL以及高浓度的15000ng/mL，以1：9的比例加入至正常人血清基质中，混合样本和血清基质均重复测定三次后取均值，按照下列公式计算回收率：
公式中PIVKA-II重组抗原体积为V0，浓度为C0；血清基质体积为V1，测定浓度为C1；混合样本测定浓度为C；回收率为R。85％～115％为R的可接受范围。
1.6.4精密度评价
在线性范围内选定低(26.3ng/mL)、中(1052.9ng/mL)以及高(15925.9ng/ml)三种水平的血清样本作为批内与批间精密度评估对象。三种水平的样本各重复检测20次以评估批内精密度；将上述血清样本分别在不同的20天内进行测定，每种水平样本均重复测定两次来获得批间精密度。精密度通过批内/批间变异系数(CV％)来评估，批内和批间精密度的CV％分别低于10％、15％可以接受范围。
1.6.5干扰实验
在PIVKA-II水平分别为7.7ng/ml(HC组)、527.8ng/ml(HCC组)的血清样本中分别加入浓度为5mg/dL的AFP、浓度为0.2ug/ml的CEA、浓度为750.0IU/mL的类风湿因子(RF)、浓度为65.0mg/dL的胆红素、浓度为7.0g/dL的白蛋白、浓度为12.3mg/dL的维生素C、浓度为0.35g/dL的血红蛋白(HB)、浓度为500.0mg/dL的甘油三酯(TG)，并以蒸馏水作为对照，8种混合物与血清样本均重复测定3次。UPT-LF分析法的抗干扰性能通过偏差(δ％)来评估，δ％＝(混合物的分析物水平-血清样本的分析物水平)/血清样本的分析物水平×100％。δ％<15％为可接受范围。
1.6.6UPT-LF分析法对HCC诊断的Cutoff，敏感性与特异性
使用UPT-LF检测卡对HCC组228例、LBL组170例(LC患者80例、CHB患者90例)以及HC组100例的血清样本进行PIVKA-II的定量测定。HCC组与对照组(LBL+HC组)的分析物水平差异比较采用非参数统计的Mann-Whitney U检验；对照组内各组间的分析物水平差异比较采用非参数统计的Kruskal-Wallis H秩和检验；对HCC的诊断性能分析采用受试者工作特征曲线(ROC)进行分析，将最大约登指数(YI)作为确定诊断HCC的cutoff值依据。
1.6.7UPT-LF与CLEIA分析法的检测性能比较
随机选取HCC组178例、LBL组60例(LC患者、CHB患者各30例)、HC组35例的血清样本，分别采用UPT-LF检测卡与G PIVKA-II试剂盒(CLEIA)进行定量检测，比较两种方法对HCC诊断敏感性与特异性(vs LBL+HC组)的差异，并绘制两种方法对178例HCC患者血清PIVKA-II定量测定结果的线性回归曲线，进行相关性分析。G PIVKA-II检测试剂盒的检测限(LoD)、线性范围以及诊断cutoff值分别为1.37mAU/ml、5-75000mAU/mL与40mAU/mL。
2.统计学分析
两组非正态分布的连续变量之间的差异性比较采用Mann-Whitney U检验，而对照组三组非正态分布的连续变量之间的差异性比较采用Kruskal-Wallis检验。两方法检测分析物的结果之间的相关性评估采用皮尔森相关系数(R)。本研究所涉及的统计分析采用SPSS 20.0，GraphPad Prism 5.0以及Excel进行，P<0.05认为具有统计学意义。
3.实验结果
3.1UCPs的表面修饰及功能化
UCPs因受到合成方法影响，表面常带有一层疏水性的油酸配体。非离子乳化剂CO-520可降低颗粒表面张力，提高水溶性，使颗粒尽可能处于单分散状态。UCPs的修饰及活化原理如图1C所示。在加入TEOS与氨水后，TEOS在氨水作用下形成的纳米SiO2附着在颗粒表面，使得颗粒表面包裹有一层SiO2。当溶液中存在硅烷偶联剂APES时，其分子一端与硅相连，另一端则携带有活性羧基基团，功能化的UCPs可与多种生物活性分子结合，如抗体等。
3.2UPT-LF分析法的检测体系
该检测体系由PIVKA-II样本稀释液、检测卡以及检测设备UPT-3A-1800上转换发光免疫分析仪组成(图3)。检测卡由卡壳和内部试纸条组成。卡壳包括上卡壳和底壳，上卡壳按层析方向依次有加样窗、检测窗和层析结束指示窗，试纸条则存放于底壳的凹槽内。免疫试纸条层析方向依次为HBR-IgG阻断剂样品垫、含有生物探针的结合垫、具有T线(2.0mg/ml)和C线(0.6mg/ml)的NC膜以及吸水纸。样品垫和结合垫总宽度为2.5cm，结合垫覆盖在NC膜上的宽度为1mm。便携式UPT-3A-1800分析仪内置廉价红外光源和可充电式电池，轻便型小，非常适合于POCT式检测。
3.3UPT-LF分析法的检测限及线性评价
测定的空白样本稀释液均值Mean blank(T/C值)和标准方差SD blank，低浓度样本的标准方差SD lowlevelsample分别为0.112，0.0064和0.0041。LoB和LoD的T/C值分别为0.125与0.129，经线性回归方程(如下所示)换算出相应的浓度值为2.25ng/ml、2.66ng/ml。定量测定PIVKA-II的UPT-LF分析法的线形回归曲线见图4。图4可见在4.8-20000ng/ml的水平区间具有显著的线性关系(R2＝0.984,P<0.01)，但当分析物水平超过20000ng/mL或低于4.8ng/mL时，不具有明显的线性关系(数据未显示)，因而本研究决定将4.8-20000ng/mL作为检测卡定量测定血清PIVKA-II浓度的线性范围。通过计算13个相应浓度点的Log(Co)与Log(T/C-mean blank)拟合曲线得到线性回归方程：Y＝0.827X–1.871(N＝13,P<0.01)。
3.4稳定性评价
25℃存放0、7、15、30、60d的检测卡样本测定结果见图5A和图5B，从图中可以看出25℃两个月内存放对检测卡的检测性能影响很小，不同时间点检测卡的测定结果与0d相比较，偏倚δ均小于15％。37℃存放0、1、3、5及7d的检测卡样本测定结果见图5C和图5D，图中可以看出37℃存放可引起检测卡检测性能出现一定程度的下降，存放至第7d的测定结果与0d相比较，δ>15％。研究最后对检测卡效期进行了评估，4℃存放0d、常规效期18m(基于北京热景生物有限公司所推荐的效期)的检测卡样本测定结果见图6。经计算分析，4℃存放至18m的四个批次检测卡检测结果与0d相比较，偏倚δ均<15％。
3.5回收率测定
UPT-LF检测法的测定分析物的准确性通过回收率测定来评估。将低中高三种水平的PIVKA-II重组抗原加入至健康正常人血清后进行测定，经公式计算分析得出低中高三种水平分析物的回收率分别为93.1％,97.7％和99.2％，都在85％-115％的可接受范围内。
3.6精密度评价
通过测定三种不同水平的PIVKA-II血清样本得到的批内及批间精密度评估结果见表1。从表中可以看出批内精密度CV％小于5％，而批间精密度CV％小10％。
表1 UPT-LF检测卡测定血清PIVKA-II的批内与批间精密度
3.7干扰性实验
UPT-LF分析法的特异性通过干扰实验进行评估。八种常规干扰物分别加入到HC组和HCC组血清样本中进行测定，UPT-LF检测方法的抗干扰性能评价结果见表2所示，从表可见八种干扰物的δ(％)都小于10％。
表2 UPT-LF分析法的干扰性评价
AFP：甲胎蛋白5mg/dl，CEA：癌胚抗原0.20ug/ml，RF：类风湿关节因子750IU/ml，Bilirubin：胆红素65mg/dl，Albumin：白蛋白7g/dl,Vitamin C：维生素C 12.30mg/dl，Hb：血红蛋白0.35g/dl，TG：甘油三酯500mg/dl。
3.8UPT-LF检测法对HCC诊断的cutoff值，敏感性和特异性
UPT-LF检测法的定量测定血清样本的结果见图7A所示。HCC组的血清PIVKA-II水平(中位数53.2ng/ml，四分位间距20.6-322.3ng/ml)要显著高于对照组(LBL+HC组)(中位数9.2ng/ml，四分位间距4.8-15.4ng/ml)(Z＝-13.7,P<0.01)的水平；对照组的LC组血清PIVKA-II水平(中位数10.8ng/ml，四分位间距7.0-20.1ng/ml)与CHB组(中位数10.7ng/ml，四分位间距5.4-16.3ng/ml)以及HC组(中位数6.7ng/ml，四分位间距3.1-14.2ng/ml)之间的差异没有统计学意义(X2＝5.67,P>0.05)。ROC曲线分析(HCC组vs LBI+HC组)显示，检测卡测定血清PIVKA-II的曲线下面积AUC为0.85(P<0.001)，见图7B大约登指数YI＝0.60所对应的肝癌诊断cutoff值为25.3ng/ml(T/C值＝0.29)，此时UPT-LF检测法对HCC诊断的敏感性与特异性分别为71.49％、88.89％。
3.9UPT-LF分析法与CLEIA分析法对HCC诊断性能的比较以及定量检测结果的相关性分析
当将分析物的水平25.3ng/ml作为UPT-LF分析法对HCC诊断cutoff值时，测定HCC组178例、LBL组60例(LC组、CHB组各30例)、HC组35例的血清样本的检测结果经统计分析得到诊断敏感性和特异性分别为70.2％与90.5％，而CLEIA分析法测定上述标本时所取得的诊断敏感性和特异性分别为67.4％与91.6％。由此可见，两种分析方法的诊断性能差异性较小。此外，在我们的研究中还发现二者测定血清PIVKA-II还具有显著的线性相关关系(P<0.01)。图8可见，线性回归方程为Y＝0.08X–4.50，R2＝0.901。
4.讨论
在本研究中，我们首次报道使用基于UPT-LF分析法的检测卡定量测定血清PIVKA-II。在该检测卡中，UCPs标记的抗PIVKA-II单克隆抗体被用作生物探针，而试纸条则用作免疫反应的固相载体。研究结果表明，我们所构建的UPT-LF检测卡不仅对血清PIVKA-II检测具有4.8-20000ng/mL的较宽检测带性范围，且最低检测限LoD低至2.66ng/mL，可见检测灵敏度高。稳定性评价结果表明UPT-LF检测卡在4℃可长期稳定保存，在25℃具较好热稳定性，表现为在4℃存放至常规效期(18个月)、25℃存放至60天的检测卡检测性能未发生明显的改变；但相比25℃，检测卡在37℃的热稳定效果不佳，表现为37℃存放至第7d的测定结果与0d相比较的偏倚δ>15％，推测这可能与结合垫中的标记抗体或NC膜上的包被抗体在高温下发生了一定程度的降解有关。此外，UPT-LF检测卡对于PIVKA-II重组抗原的低中高三种浓度的分析物测定所取得回收率在93.1％-99.2％之间、批内与批间变异CV分别低于5％与10％、8种血清常见干扰物测定结果的偏倚δ(％)均低于10％，表明UPT-LF检测卡同时具有良好的检测准确性、精密度以及特异性，以上结果均提示构建的UPT-LF检测卡对血清PIVKA-II的检测性能良好。尤其是，在UPT-LF检测***中的检测设备UPT-3A-1800上转发光免疫分析仪采用较为廉价的的近红外半导体激光器作为激发光源，满足POCT式的检测条件，具有体积小、重量轻、便于携带、检测时间短仅需15min的特点，说明UPT-LF检测卡的使用可实现对血清PIVKA-II快速、高效的POCT式定量检测。当前在临床实验室，血清PIVKA-II测定通常是在诸如CLEIA分析仪这样复杂的设备上分批进行，同时测定也并不是每天都会开展；而使用本研究构建的UPT-LF检测分析法，则可以避免大型临床实验室生化部门或专业化中心实验室等特殊场所对样品运输的依赖性，实现对患者血清PIVKAII的床旁检测以及临床诊疗现场决策的实施。
进一步研究基于UPT-LF的血清PIVKA-II检测卡对HCC的诊断性能，结果显示HCC组的血清PIVKA-II水平显著高于对照组(LBL+HC组)(P<0.01)，而作为对照的LC组，CHB组和HC组之间血清PIVKA-II水平的比较差异性无统计学意义(P>0.05)。此外，UPT-LF法检测血清PIVKA-II对HCC的ROC曲线下面积(AUC)达到0.85，表明其对HCC具有良好的诊断性能；当将分析物的25.3ng/ml水平作为HCC诊断的cutoff值时，UPT-LF法能够获得最佳的诊断性能，其诊断敏感性和特异性分别为70.2％和90.5％，具有和PIVKA-II的商用CLEIA法试剂盒相类似的诊断性能。线性回归曲线分析结果表明UPT-LF与CLEIA两种方法对178例HCC患者血清PIVKA-II定量测定结果的相关系数R2＝0.901，呈现出良好的线性关系。
综上所述，本研究构建基于UPT-LF分析法的检测卡可实现对HCC患者血清PIVKA-II的快速、高效及便捷POCT式定量测定。本研究成果的实现将有望促进PIVKA-II在临床实验室的推广应用，进一步提高HCC早期检出率，降低患者死亡率。

Claims (10)

1.一种基于上转换发光技术免疫层析法定量测定血清PIVKA-II的检测卡，其特征在于，该检测卡包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，所述样品垫与结合垫为玻璃纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上设有检测带和质控带，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸先后粘贴在粘性底衬上，采用切条机将其斩切成3-6mm宽的试纸条带，并包装于UPT卡壳；所述结合垫上固定有上转换发光纳米粒子-抗PIVKA-II单克隆抗体1结合物，所述检测带固定有抗PIVKA-II单克隆抗体2，所述质控带固定有二抗羊抗鼠IgG。
2.根据权利要求1所述基于上转换发光技术免疫层析法定量测定血清PIVKA-II的检测卡，其特征在于，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次以重叠1～2mm的间距交互层叠粘贴在粘性底衬上，所述试纸条的宽度为4mm。
3.根据权利要求1所述基于上转换发光技术免疫层析法定量测定血清PIVKA-II的检测卡，其特征在于，所述的上转换发光纳米粒子为TEOS和APES修饰的NaYF4:Yb3+,Er3+UCPs。
4.一种基于上转换发光技术免疫层析法定量测定血清PIVKA-II的检测卡的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)NaYF4:Yb3+,Er3+UCPs的制备；
(2)NaYF4:Yb3+,Er3+UCPs的功能化修饰；
(3)上转换发光生物探针的构建；
(4)结合物溶液的配置及包被；
(5)阻断剂样品垫的制作；
(6)质控溶液和检测溶液的配置和包被；
(7)上转换免疫层析法的检测卡的制备；
(8)双抗体夹心模式UPT-LF分析法定量检测血清PIVKA-II；
步骤(2)的修饰方法如下：取NaYF4:Yb3+,Er3+UCPs，加入环己烷，在超声震动条件下的超纯水中分散并使颗粒完全悬起，随后加入CO-520，超声10-40min；加入氨水、TEOS，磁力搅拌反应16-32h后，加入乙醇并离心，弃去上清液；沉淀使用异丙醇溶解，并向其中加入APES，磁力搅拌反应2-4h，离心并洗涤后，得到功能化修饰的NaYF4:Yb3+,Er3+UCPs。
5.根据权利要求4所述基于上转换发光技术免疫层析法定量测定血清PIVKA-II的检测卡的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中NaYF4:Yb3+,Er3+UCPs的制备方法如下：将0.2343gYCl3,0.0755g YbCl3和0.0083g ErCl3三种试剂与4.5mL的油酸及26.0ml的1-十八烯混合于烧瓶中，在氩气氛围中加热至150-160℃至溶液混匀，持续25min后冷却至室温；将15mL含有0.015g的NaOH以及0.222g的NH4F的甲醇溶液加入烧瓶中，并在溶液中迅速形成固态沉淀，此时反应体系搅拌20-40min；随后，将反应液缓慢加热至100℃并维持8-15min，以使甲醇挥发掉；随后迅速加热至300℃并维持1h；待溶液自然冷却后，使用乙醇将生成物从溶液中析出；沉淀在12000rpm下离心5-10min，并用1：1体积比的水/乙醇溶液清洗2-4次，得到NaYF4:Yb3+,Er3+UCPs。
6.根据权利要求4所述基于上转换发光技术免疫层析法定量测定血清PIVKA-II的检测卡的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的修饰方法如下：称取NaYF4:Yb3+,Er3+UCPs 40mg，加入95mL环己烷，并在超声震动条件下的超纯水中分散并使颗粒完全悬起，随后加入CO-5202.5mL，超声20min；加入30wt％氨水0.35mL、TEOS 0.09mL，磁力搅拌反应24h后，加入16ml乙醇并离心，弃去上清液；沉淀使用90mL异丙醇溶解，并向其中加入APES 0.9mL，磁力搅拌反应2.5h，离心并洗涤3次后，得到功能化修饰的NaYF4:Yb3+,Er3+UCPs。
7.根据权利要求6所述基于上转换发光技术免疫层析法定量测定血清PIVKA-II的检测卡的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的上转换发光生物探针的构建方法如下：将5mg的功能化修饰的NaYF4:Yb3+,Er3+UCPs加入1ml的纯化水中并于超声振动条件下溶解混匀，加入20％的Tween-20活性剂5ul，超声条件下混匀；向反应体系中加入75ug的抗PIVKA-II单克隆抗体1，超声振动条件下反应20min；反应结束后后向其中加入5ul 20％BSA，超声振动条件下封闭5min；随后以4℃，12000r/min的高速冷冻离心中离心30min，取沉淀并弃去上清液备用。
8.根据权利要求7所述基于上转换发光技术免疫层析法定量测定血清PIVKA-II的检测卡的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)的结合物溶液的配置及包被方法如下：
a.结合物储存缓冲液配置：0.02mol/l、pH7.4的PBS缓冲液中加入0.1％BSA，0.3％TritonX-100，0.02％NaN3；
b.结合物冻干缓冲液配置：0.02mol/l、pH7.4的PBS缓冲液中加入5％trehalose，1％BSA，2％mannitol，1％glycine，0.01％TB，0.5％casein，0.1％NaN3；
c.先后向步骤(3)所得沉淀中分别加入100ul结合物储存缓冲液，5.5ml结合物冻干缓冲液，于超声振动条件水下混匀；将该混合液以600ul/加样枪均匀包被在3*19.33cm2的SB08型玻璃纤维上，并迅速转移至冻干机中进行-60℃冻干处理，冷冻时间为2h；随后将其抽真空并维持至少8h，取出平衡至室温保存备用。
9.根据权利要求4所述基于上转换发光技术免疫层析法定量测定血清PIVKA-II的检测卡的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)的阻断剂样品垫的制作方法如下：将HBR阻断剂使用0.01mol/L，pH8.0TB缓冲液稀释至浓度为75ug/mL后，取出10.0ml加入75.0ul 20％Casein，随后将其均匀地浇在6*19.33cm2的SB08玻璃纤维上，室温晾干后备用。
10.根据权利要求4所述基于上转换发光技术免疫层析法定量测定血清PIVKA-II的检测卡的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)的质控溶液和检测溶液的配置和包被方法如下：将硝酸纤维素膜粘贴于粘性底衬指定位置，吸水纸与硝酸纤维素膜重叠1-2mm并和粘性底衬上端齐平进行粘贴，随后将测试抗体PIVKA-II单克隆抗体2与质控抗体羊抗鼠IgG用0.02mol/L,pH7.2PB缓冲液分别稀释成2.0mg/mL、0.6mg/mL；使用连续划膜机在硝酸纤维素膜的距离粘性底衬底端12mm及15mm处以1ul/cm的速度分别喷上PIVKA-II单克隆抗体2和羊抗鼠IgG作为检测带和质控带；将包被好的硝酸纤维素膜放置在37℃烘箱中烘干1.5h，封装备用。
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