CN109430514B - 一种制备罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的方法 - Google Patents

一种制备罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种制备罗非鱼‑豆粕共沉淀蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.将罗非鱼肉和脱脂豆粕粉以1:5‑5:1的质量比混合（干基计），以物料:水=1:5‑15(g:mL)加冰蒸馏水；S2.10000‑15000r/min均质1‑5 min；S3.将均质混合物的pH调整为3.0‑8.0，静置5min；S4.加入2%质量比的助溶剂，室温搅拌溶解5‑30 min；S5.4℃、8000‑11000 r/min下离心10‑20 min；S6.取上清液，调整pH使上清液出现沉淀，重复步骤S5；S7.收集步骤S5、S6离心后的沉淀，真空冷冻干燥，获得罗非鱼‑豆粕共沉淀蛋白。本发明制备出新型“双蛋白”制品，以改善鱼肉蛋白溶解性、乳化性、凝胶特性等，开发动植物蛋白相联合的新型双蛋白制品。

Description

一种制备罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的方法
技术领域
本发明属于水产蛋白高值化利用技术领域，具体涉及一种制备罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的方法。
背景技术
我国是罗非鱼生产大国，贸易大国，也是消费大国，罗非鱼出口主要是鲜销，且产品以冻罗非鱼片和冻整条罗非鱼为主。罗非鱼加工产品中初级加工占主要部分，产品较单一，利润低，因此制约罗非鱼产业的发展。针对以上问题，精深加工以提高罗非鱼附加值和利润率。
不同种类的蛋白一般具有不同营养特性和功能特性，混合不同来源的蛋白可以提高高蛋白质原料的利用，克服单一来源蛋白质中必需氨基酸含量的不足、营养价值不和功能特性较差等问题。蛋白质的混合主要包括蛋白原料直接混合（物理混合）和化学混合。共沉淀蛋白（Co-precipitated protein, Co-PP）是指采用等电点沉淀、酸-热沉淀、或酸-热诱导并辅以沉淀剂如CaCl2等方法，从一种或者多种原料中得到的一种混合蛋白。
不同来源的蛋白质制备的共沉淀蛋白，不仅在营养上可以实现氨基酸的互补，而且有良好的功能特性和理想的感官特性。以上研究说明共沉淀蛋白在食品工业中有巨大的潜在应用。
目前，以罗非鱼为原料，市场上出现的新型产品有鱼糜制品、腌制品、冷冻品等。罗非鱼蛋白在实际生产加工过程中不稳定，易发生变性，且溶解性较差，进而引起蛋白的结构和功能特性发生改变。这使得罗非鱼蛋白凝胶特性和乳化性能较低，影响产品的品质，限制其在食品领域的应用。目前，急需一种提高罗非鱼产品的品质，扩大其在食品领域的应用的方法，提高罗非鱼的整体利润率。
发明内容
有鉴于此，本发明利用罗非鱼蛋白的营养优势和大豆蛋白的功能特性优势，以罗非鱼肉和脱脂豆粕为原料，用pH调节法制备共沉淀蛋白，制备新型“双蛋白”制品，以改善鱼肉蛋白溶解性、乳化性、凝胶特性等，开发动植物蛋白相联合的新型双蛋白制品。
本发明的技术方案为：一种制备罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将罗非鱼肉和脱脂豆粕粉以1:5-5:1的质量比混合（干基计），以物料:水=1:5-15(g:mL)加冰蒸馏水；
S2.10000-15000r/min均质1-5 min；
S3.将均质混合物的pH调整为3.0-8.0，静置5min；
S4.加入2%质量比的助溶剂，室温搅拌溶解5-30 min；所述质量比为助溶剂与加入的罗非鱼和豆粕质量之和的比值。
S5. 4 ℃、8000-11000 r/min下离心10-20 min；
S6.取上清液，调整pH使上清液出现沉淀，重复步骤S5；
S7.收集步骤S5、S6离心后的沉淀，真空冷冻干燥，获得罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白。
进一步的，步骤S3中，是将均质混合物的pH 4.0-6.0。
进一步的，步骤S6中，是将pH调整至4.0-6.0。
通过发现偏离等电点的酸性和碱性pH范围内，可溶性蛋白得率呈现上升趋势，且在极端酸碱pH 2.0、3.0、11.0、12.0条件下溶解得率达到最大。这是因为酸性范围内，部分酸性氨基酸的残基支链羧基所带的负电荷被中和，所以蛋白分子带有净正电荷；碱性条范围内，部分氨基酸的碱性集团发生去质子化反应，导致蛋白分子带有净负电荷，蛋白的水合作用增强，蛋白溶解性增大。本发明通过大量的创造性试验发现，罗非鱼肉和脱脂豆粕粉以质量比（干基计）混合提取的可溶性蛋白溶液在pH 2.0、3.0、11.0和12.0溶解，pH 4.0-6.0时沉淀，沉淀得率为88%-95%，优选的，在pH 4.5沉淀时的得率最高，由此确定罗非鱼-豆粕酸/碱可溶性蛋白的最适等电点为4.5。而对于植物蛋白酸沉等电点pH一般相对较低，罗非鱼与豆粕混合后，酸沉等电点的pH偏向于豆粕的等电点。因此可以确定罗非鱼-豆粕酸/碱可溶性蛋白的沉淀pH为4.0-6.0，优选为pH 4.5。
进一步的，步骤S1中，是将罗非鱼肉和脱脂豆粕粉以1:2-2:1的质量比混合（干基计），以物料:水=1:7-10(g:mL)加冰蒸馏水。本发明通过大量创造性实验，结合两种不同蛋白质的特性，获得最佳的混合比例以及溶解时的料水比，获得最佳的共沉淀蛋白制备条件。
进一步的，所述助溶剂包括以下重量份数组分：卵磷脂 1-10、甘露糖 12-19、二氧化硅3-9、溶菌酶 0.2-0.9、赖氨酸 11-18、精氨酸 14-22、谷氨酸 7-16。本发明中，添加的助溶剂的作用是能够在罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的形成的过程中，增强其在等电点附近蛋白质的交互作用，使罗非鱼蛋白与豆粕蛋白进一步的结合形成稳定的共沉淀蛋白结构，提高共沉淀蛋白的得率。
具体的，在溶菌酶、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸共存的环境下，有助于蛋白质复性，促进蛋白质正确折叠成天然活性态，避免蛋白质在形成共沉淀蛋白前提前发生不可逆聚集和沉淀，确保罗非鱼蛋白与豆粕蛋白在等电点的交互作用；同时，卵磷脂、甘露糖、二氧化硅能够提高整个反应体系的均一性和稳定性，使得罗非鱼蛋白与豆粕蛋白在等电点附近的不会出现不理想的反应。
进一步的，所述助溶剂包括以下重量份数组分：卵磷脂 3-7、甘露糖 14-16、二氧化硅4-7、溶菌酶 0.3-0.6、赖氨酸 13-17、精氨酸 15-20、谷氨酸 9-14。
进一步的，所述助溶剂包括以下重量份数组分：卵磷脂 5、甘露糖 15、二氧化硅5.5、溶菌酶 0.4、赖氨酸 14、精氨酸 17、谷氨酸 11。特别的，所述溶菌酶的酶活为100-300U/g，优选的，所述溶菌酶的酶活为150U/g。
本发明的创新点在于：由于罗非鱼蛋白在实际生产加工过程中不稳定，易发生变性，且溶解性较差，进而引起蛋白的结构和功能特性发生改变，使得罗非鱼蛋白凝胶特性和乳化性较低。本发明通过结合大豆分离蛋白较好的溶解性、乳化稳定性、发泡性和良好的感官特性等优点，开发制备出一种罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白，使得鱼肉蛋白溶解性、乳化性、凝胶特性等具有很好地改善，本发明开发出了一种动植物蛋白相联合的新型双蛋白制品。通过发明制备的罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白得率高，安全稳定，为提高罗非鱼产品的品质，扩大其在食品领域的应用的方法，提高罗非鱼的整体利润率提供一种有效途径。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
一种制备罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将罗非鱼肉和脱脂豆粕粉以1:5的质量比混合（干基计），以物料:水=1:5 (g:mL)加冰蒸馏水；
S2.10000r/min均质1 min；
S3.将均质混合物的pH调整为3.0，静置5min；
S4.加入2%质量比的助溶剂，室温搅拌溶解5min；
S5. 4 ℃、8000 r/min下离心10 min；
S6.取上清液，调整pH使上清液出现沉淀，重复步骤S5；
S7.收集步骤S5、S6离心后的沉淀，真空冷冻干燥，获得罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白。
进一步的，步骤S6中，是将pH调整至4.5。
进一步的，所述助溶剂包括以下重量份数组分：卵磷脂 1、甘露糖 12、二氧化硅3、150U/g 溶菌酶 0.2、赖氨酸 11、精氨酸 14、谷氨酸 7。本发明中，添加的助溶剂的作用是能够在罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的形成的过程中，增强其在等电点附近蛋白质的交互作用，使罗非鱼蛋白与豆粕蛋白进一步的结合形成稳定的共沉淀蛋白结构，提高共沉淀蛋白的得率。
实施例2
一种制备罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将罗非鱼肉和脱脂豆粕粉以5:1的质量比混合（干基计），以物料:水=1: 15(g:mL)加冰蒸馏水；
S2.15000r/min均质5 min；
S3.将均质混合物的pH调整为8.0，静置5min；
S4.加入2%质量比的助溶剂，室温搅拌溶解30 min；
S5. 4 ℃、11000 r/min下离心20 min；
S6.取上清液，调整pH使上清液出现沉淀，重复步骤S5；
S7.收集步骤S5、S6离心后的沉淀，真空冷冻干燥，获得罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白。
进一步的，步骤S6中，是将pH调整至4.5。
进一步的，所述助溶剂包括以下重量份数组分：卵磷脂 10、甘露糖 19、二氧化硅9、150U/g 溶菌酶 0.9、赖氨酸 18、精氨酸 22、谷氨酸 16。本发明中，添加的助溶剂的作用是能够在罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的形成的过程中，增强其在等电点附近蛋白质的交互作用，使罗非鱼蛋白与豆粕蛋白进一步的结合形成稳定的共沉淀蛋白结构，提高共沉淀蛋白的得率。
实施例3
一种制备罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 将罗非鱼肉和脱脂豆粕粉以1:2的质量比混合（干基计），以物料:水=1:7 (g:mL)加冰蒸馏水；
S2.10000r/min均质2.5 min；
S3.将均质混合物的pH调整为4.0，静置5min；
S4.加入2%质量比的助溶剂，室温搅拌溶解10 min；
S5. 4 ℃、9000 r/min下离心12min；
S6.取上清液，调整pH使上清液出现沉淀，重复步骤S5；
S7.收集步骤S5、S6离心后的沉淀，真空冷冻干燥，获得罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白。
进一步的，步骤S6中，是将pH调整至4.0。
进一步的，所述助溶剂包括以下重量份数组分：卵磷脂 3、甘露糖 14、二氧化硅4、150U/g 溶菌酶 0.3、赖氨酸 13、精氨酸 15、谷氨酸 9。
实施例4
一种制备罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 将罗非鱼肉和脱脂豆粕粉以2:1的质量比混合（干基计），以物料:水=1: 10(g:mL)加冰蒸馏水；
S2.13000r/min均质3.5 min；
S3.将均质混合物的pH调整为6.0，静置5min；
S4.加入2%质量比的助溶剂，室温搅拌溶解25 min；
S5. 4 ℃、10000 r/min下离心17 min；
S6.取上清液，调整pH使上清液出现沉淀，重复步骤S5；
S7.收集步骤S5、S6离心后的沉淀，真空冷冻干燥，获得罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白。
进一步的，步骤S6中，是将pH调整至6.0。
进一步的，所述助溶剂包括以下重量份数组分：卵磷脂 7、甘露糖 16、二氧化硅7、150U/g 溶菌酶 0.6、赖氨酸 17、精氨酸 20、谷氨酸 14。
实施例5
一种制备罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将罗非鱼肉和脱脂豆粕粉以2:3的质量比混合（干基计），以物料:水=1:9(g:mL)加冰蒸馏水；
S2.12000r/min均质2 min；
S3.将均质混合物的pH调整为4.2，静置5min；
S4.加入2%质量比的助溶剂，室温搅拌溶解20 min；
S5. 4 ℃、9500 r/min下离心15 min；
S6.取上清液，调整pH使上清液出现沉淀，重复步骤S5；
S7.收集步骤S5、S6离心后的沉淀，真空冷冻干燥，获得罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白。
进一步的，步骤S6中，是将pH调整至4.5。
进一步的，所述助溶剂包括以下重量份数组分：卵磷脂 5、甘露糖 15、二氧化硅5.5、150U/g 溶菌酶 0.4、赖氨酸 14、精氨酸 17、谷氨酸 11。
对比例1
一种制备罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将罗非鱼肉和脱脂豆粕粉以2:3的质量比混合（干基计），以物料:水=1:9(g:mL)加冰蒸馏水；
S2.12000r/min均质2 min；
S3.将均质混合物的pH调整为4.2，静置5min；
S4.加入2%质量比的助溶剂，室温搅拌溶解20 min；
S5. 4 ℃、9500 r/min下离心15 min；
S6.取上清液，调整pH使上清液出现沉淀，重复步骤S5；
S7.收集步骤S5、S6离心后的沉淀，真空冷冻干燥，获得罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白。
进一步的，步骤S6中，是将pH调整至4.5。
进一步的，所述助溶剂包括以下重量份数组分：卵磷脂 5、甘露糖 15、二氧化硅5.5。
对比例2
一种制备罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将罗非鱼肉和脱脂豆粕粉以2:3的质量比混合（干基计），以物料:水=1:9(g:mL)加冰蒸馏水；
S2.12000r/min均质2 min；
S3.将均质混合物的pH调整为4.2，静置5min；
S4.加入2%质量比的助溶剂，室温搅拌溶解20 min；
S5. 4 ℃、9500 r/min下离心15 min；
S6.取上清液，调整pH使上清液出现沉淀，重复步骤S5；
S7.收集步骤S5、S6离心后的沉淀，真空冷冻干燥，获得罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白。
进一步的，步骤S6中，是将pH调整至4.5。
进一步的，所述助溶剂包括以下重量份数组分：150U/g 溶菌酶 0.4、赖氨酸 14、精氨酸 17、谷氨酸 11。
对比例3
一种制备罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将罗非鱼肉和脱脂豆粕粉以2:3的质量比混合（干基计），以物料:水=1:9(g:mL)加冰蒸馏水；
S2.12000r/min均质2 min；
S3.将均质混合物的pH调整为4.2，静置5min；
S4.室温搅拌溶解20 min；
S5. 4 ℃、9500 r/min下离心15 min；
S6.取上清液，调整pH使上清液出现沉淀，重复步骤S5；
S7.收集步骤S5、S6离心后的沉淀，真空冷冻干燥，获得罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白。
进一步的，步骤S6中，是将pH调整至4.5。
实验测试
共沉淀蛋白得率
对实施例1-5以及对比例1-3的上清液进行SDS-PAGE电泳分析，获得可溶性蛋白的含量，通过扣除可溶性蛋白的含量，获得沉淀蛋白得率，即为共沉淀蛋白的粗得率。采用分离胶浓度为12%、浓缩胶浓度为5%进行SDS-PAGE电泳。样品上清液与SDS-PAGE上样缓冲液相混合（4:1，v/v），加入电泳槽之前煮沸6 min，等体积即上样体积均为10 μL，用R-250考马斯亮蓝进行染色，脱色采用高甲醇的醋酸溶液，即加75 mL的醋酸，50 mL甲醇，然后用水定容至1 L。结果如下表所示：
Figure 69205DEST_PATH_IMAGE002
。
共沉淀蛋白乳化性能测试
配置蛋白浓度0.5%，采用浊度法测定蛋白的乳化活性（EA）和乳化稳定性（ES）。取6mL样品于50 mL小烧杯中，加入2 mL的金龙鱼一级大豆油，用均质机均质1 min（固定转速12000 r/min）。用紫外在500 nm波长下以0.1%的SDS为空白，迅速从烧杯底部取20 μL乳状液分溶于4 mL 0.1%的SDS溶液中，摇匀，测定0 min的吸光度值（A 0）；静置10 min后再取20μL乳状液测定吸光度值（A 10）。EA用乳化活性指数（EAI）表示，ES用乳化稳定性指数（ESI）来表示。公式如下：
Figure 252DEST_PATH_IMAGE004
；
Figure DEST_PATH_IMAGE006
；
其中：D为稀释倍数，D＝200；C为蛋白质浓度，C=0.5%（g/mL）；Φ为油体积分数，Φ=1/4；L为比色皿的厚度，L=1 cm；△t=10 min。结果如下表所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。需注意的是，本发明中所未详细描述的技术特征，均可以通过本领域任一现有技术实现。

Claims (4)

1.一种制备罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将罗非鱼肉和脱脂豆粕粉以1:5-5:1的质量比混合（干基计），以物料:水=1:5-15(g:mL)加冰蒸馏水；
S2.10000-15000r/min均质1-5min；
S3.将均质混合物的pH调整为pH4.0-6.0，静置5min；
S4.加入2%质量比的助溶剂，室温搅拌溶解5-30min；所述助溶剂包括以下重量份数组分：卵磷脂1-10、甘露糖12-19、二氧化硅3-9、溶菌酶0.2-0.9、赖氨酸11-18、精氨酸14-22、谷氨酸7-16；
S5.4℃、8000-11000r/min下离心10-20min；
S6.取上清液，调整pH使上清液出现沉淀，重复步骤S5；
S7.收集步骤S5、S6离心后的沉淀，真空冷冻干燥，获得罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白；
步骤S6中，是将pH调整至4.0-6.0。
2.根据权利要求1所述的制备罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的方法，其特征在于，步骤S1中，是将罗非鱼肉和脱脂豆粕粉以1:2-2:1的质量比混合（干基计），以物料:水=1:7-10(g:mL)加冰蒸馏水。
3.根据权利要求1所述的制备罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的方法，其特征在于，所述助溶剂包括以下重量份数组分：卵磷脂3-7、甘露糖14-16、二氧化硅4-7、溶菌酶0.3-0.6、赖氨酸13-17、精氨酸15-20、谷氨酸9-14。
4.根据权利要求3所述的制备罗非鱼-豆粕共沉淀蛋白的方法，其特征在于，所述助溶剂包括以下重量份数组分：卵磷脂5、甘露糖15、二氧化硅5.5、溶菌酶0.4、赖氨酸14、精氨酸17、谷氨酸11。
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