CN109423461A - 一种制备枯草芽孢杆菌的微生物制剂的方法及其应用 - Google Patents

一种制备枯草芽孢杆菌的微生物制剂的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种制备枯草芽孢杆菌的微生物制剂的方法，包括加料、发酵罐灭菌、添加种子液、热处理、发酵培养以及收集产品步骤。通过现场移动发酵，非常方便的获得发酵后的微生物制剂，可直接用于田间，大大提高药效和农业上的实用性，该方法制得的微生物菌剂中枯草芽孢杆菌活菌量高达在20～200亿/ml，现场自行发酵成本低，综合成本仅相当于商品化微生物菌剂的1/5～1/3。本发明还公开了所述微生物制剂用于防治黄瓜根腐病和防治黄瓜立枯病的应用，其防治效果达到90％。

Description

一种制备枯草芽孢杆菌的微生物制剂的方法及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种制备枯草芽孢杆菌的微生物制剂的制备方法及其应用。
背景技术
植物土传病害是一类重要的植物病害，土传病害的土传病原物(如镰刀Fusarium、疫霉Phytophthora、疫霉Pythium、立枯丝核菌Rhizoctonia Solani和假单胞杆菌Pseuodomonos等病原菌)通常侵染植物根部，引起作物根部乃至全株的病害，主要有瓜类、茄果、豆类、叶菜类立枯病、枯萎病、猝倒病、菌核病、炭疽病、根腐病等，造成重大的经济损失。
传统土传病害防治，主要是通过二氧化氯、溴甲烷熏蒸、撒生石灰、或者灌施D-D乳剂、***、棉隆、苯来特、多菌灵、甲基托布津和五氯硝基苯等土壤杀菌剂或微生物菌剂产品。其中，二氧化氯、溴甲烷等土壤熏蒸剂和D-D乳剂、***、棉隆等土壤消毒剂的施用影响土壤肥力，杀灭有益微生物；苯来特、多菌灵和甲基托布津易被土壤吸附而药效降低，对有益微生物有杀灭或抑制作用；五氯硝基苯是良好的土壤杀菌剂，但其有致癌及高残留缺点。至此熏蒸、生石灰以及使用化学农药，仅仅能解决短期的土传病害问题同时影响土壤肥力、杀灭有益微生物。使用传统的微生物菌剂产品灌根，往往出现成本高，微生物活性不足造成效果差的问题。
在防治方面,化学防治和抗病品种目前只对少数土传病害有效，对大多数病害防效甚微。且使用化学农药还会造成农药残留,环境污染，同时化学农药的长期使用,使得病原菌对其产生抗药性,因而导致防效下降甚至失败；生物防治由于克服了化学防治的上述弊病，且研究和实践已证明其对部分土传病害经济有效。
芽孢杆菌是已开发为防治土传病害的一种生防细菌产品，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。枯草芽孢杆菌通过成功定殖到植物根际、体表或体内，同病原菌竞争植物周围的营养、分泌抗菌物质抑制病原菌生长，同时诱导植物防御***抵御病原菌入侵，从而达到生防的目的。其主要防治对象大部分为丝状真菌所引起的植物病害，如水稻纹枯病(Stagonospora curtisii)、番茄叶霉病(Cladosporium fulvum)、大豆根腐病(Fusariumgraminerarum)、苹果霉心病(Alternaria alternata)、棉花立枯病(Rhizoctoniasolani)、棉花枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)等。枯草芽孢杆菌生防机制主要为竞争(营养竞争和位点竞争)、拮抗(微生物的同化作用产生抗菌物质抑制有害病原物的生长或直接将病原物杀灭)和诱导抗性(通过诱发植物自身抗病机制从而增强植物的抗病性能)三个方面。
现已开发的微生物制剂易受外界条件的影响，不容易在植物体内定殖，防治效果不稳定。其次，生防菌发酵液不易储存和运输，在使用过程中，制发酵液繁琐，不易操纵，不利于进一步推广应用。黄瓜立枯病和黄瓜根腐病是黄瓜的常见病害，发病严重时常造成秧苗成片死亡，目前采用生防菌发酵液对这两种病症的防治效果并不理想，防治效果都只能达到50％左右。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种制备枯草芽孢杆菌的微生物制剂的方法，通过现场移动发酵，非常方便的获得发酵后的微生物制剂，可直接用于田间，大大提高药效和农业上的实用性。
为了解决上述技术问题，本发明提高的技术方案是：一种制备枯草芽孢杆菌的微生物制剂的方法，包括以下步骤：
1、加料：将发酵营养剂溶解后加入到移动发酵罐内，补水至60～80％罐体积，再加入发酵助剂；
2、发酵罐灭菌：采用蒸汽使发酵罐加热至120～125℃，高温灭菌30分钟；
3、添加种子液：将枯草芽孢杆菌的种子液通过火焰接种口接种至发酵罐内；
4、热处理：将接种后的料液在70-80℃的条件下保温30分钟；
5、发酵培养：设定相应的参数，进行发酵培养；
6、收集产品：发酵结束后，收集活菌体及活菌体的代谢产物，冷藏待用。
按上述步骤制得枯草芽孢杆菌的微生物制剂(又称“百喜乐”微生物菌剂)。
具体的，步骤1中，优选为发酵罐200L，补水至140L。
具体的，步骤2中，采用蒸汽加热至121℃高温灭菌。
具体的，步骤6中，收集的产品中含有枯草芽孢杆菌活菌量为20～200亿个/ml，优选为40～200亿个/ml。
本发明还提供所述制备枯草芽孢杆菌的微生物制剂的方法在防治黄瓜的土传病害中的应用，是将前述发酵制得的微生物制剂用水稀释后直接灌根。
具体的，所述应用包括用于防治黄瓜根腐病和用于防治黄瓜立枯病。
具体的，用水稀释80～120倍后，每穴250～400ml灌根。优选为用水稀释100倍后，每穴300ml灌根。
本发明还提供所述制备枯草芽孢杆菌的微生物制剂的方法在促进农作物生长中的应用，是将前述发酵制得的微生物制剂用水稀释后直接灌根，所述农作物包括小白菜。
本发明采用移动发酵技术，将微生物发酵工厂智能化、微缩化，放到农场后，只需加入特定的发酵包，调整好参数，即可自行生产微生物菌剂产品，新鲜的微生物菌剂可马上施入田间。
本发明方法制得的微生物菌剂中枯草芽孢杆菌活菌量高达在20～200亿/ml，现场自行发酵成本低，综合成本仅相当于商品化微生物菌剂的1/5～1/3。
本发明制得的新鲜的微生物菌剂的活性高，在田间定植扩散能力强，见效快，持效期长，用于黄瓜根腐病和黄瓜立枯病的防治效果能达90％。
本发明制得的新鲜的微生物菌剂同时具有促进作物生长，提高作物抗逆性的功效。
附图说明
图1～图3为按本发明的方法制备的微生物菌剂检测报告。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的实质性特点可从下述实施例中得以体现。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明的，均为常规方法。本发明的枯草芽孢杆菌菌株为安徽棵康生物科技有限公司提供，菌株产品编号为KKB02。
实施例1：现场制备百喜乐微生物菌剂
具体步骤如下：
1、加料：将百喜乐发酵包中的发酵营养剂溶解后加入到200L的移动发酵罐内，用自来水补水至140L，最后加入发酵助剂。
2、发酵罐灭菌：采用蒸汽使发酵罐加热至121℃，高温灭菌30分钟。
3、添加种子液：将枯草芽孢杆菌种子液通过火焰接种口接种至发酵罐内。
4、热处理：将接种后的料液在70-80℃的条件下保温30分钟。
5、发酵培养：设定温度、转速、通气量、时间，进行发酵培养。
6、收集成品：发酵结束后，将产品收集，冷藏待用。
如图1-图3所示，为本发明所制备的三批百喜乐微生物菌剂的检测报告，报告显示三批产品的有效活菌数为40～66亿个/ml。
实施例2：百喜乐微生物菌剂对小白菜生长的影响
本实施例设3个试验组。试验组1：小白菜撒播后，将百喜乐微生物菌剂稀释100倍后，将稀释液进行灌根，间隔7～10天，连续使用3次；试验组2：小白菜撒播后，将与百喜乐微生物菌剂稀释液等量等次清水进行灌根，间隔7～10天，连续使用3次；试验组3：小白菜撒播后，将与百喜乐微生物菌剂稀释液等量等次基质进行灌根，间隔7～10天，连续使用3次。收获时调查株高、平均叶片数、平均单株重。
表2百喜乐微生物菌剂对小白菜生长的影响
试验表明：试验组1即在小白菜撒播后，将百喜乐微生物菌剂稀释液进行灌根，间隔7～10天，连续使用3次，促进小白菜生长，株高13.8cm、平均叶片数9.3片、平均单株重为17.1g。
实施例3：百喜乐微生物菌剂不同次数对设施黄瓜根腐病试验
试验时间：2016年9～10月
试验地点：大团镇多利农庄黄瓜根腐病历年发病的地区
试验品种：荷兰黄瓜
试验产品：由实施案例1获得的百喜乐微生物菌剂，对照为清水。
试验方法：选取黄瓜根腐病自然发病较重温室大棚为试验大棚，设置3个试验组。试验组1：定植时在定植穴中分别按照每穴100倍稀释液300ml进行灌根处理，间隔7～10天，连续使用2次；试验组2：定植时在定植穴中分别按照每穴100倍稀释液300ml进行灌根处理，间隔7～10天，连续使用4次；试验组3清水对照。每个小区20棵苗，重复6次，处理小区随机分布；当对照小区黄瓜苗发病时调查各处理的发病情况，计算防效。
发病率＝调查小区发病株数/调查总株数×100％；
防效＝(对照小区的发病率-处理小区的发病率)/对照小区的发病率×100％
试验结果见表3：
表3百喜乐微生物菌剂对黄瓜根腐病的防效
试验组1 试验组2 清水对照
发病率 1.79％ 0.67％ 6.5％
防治效果 72.46％ 89.69％ --
试验结果表明，试验组2即定植时在定植穴中分别按照每穴100倍稀释液300ml进行灌根处理，间隔7～10天，连续使用4次，防治黄瓜根腐病效果最好，达到89.67％。
实施例4：百喜乐微生物菌剂不同次数对设施黄瓜立枯病试验
试验时间：2016年9～10月
试验地点：大团镇多利农庄黄瓜立枯病历年发病的地区
试验品种：荷兰黄瓜
试验产品：由实施案例1获得的百喜乐微生物菌剂，对照为清水。
试验方法：选取黄瓜立枯病自然发病较重温室大棚为试验大棚，设置3个试验组。试验组1：定植时在定植穴中分别按照每穴100倍稀释液300ml进行灌根处理，间隔7～10天，连续使用2次；试验组2：定植时在定植穴中分别按照每穴100倍稀释液300ml进行灌根处理，间隔7～10天，连续使用4次；试验组3清水对照。每个小区20棵苗，重复6次，处理小区随机分布；当对照小区黄瓜苗发病时调查各处理的发病情况,计算防效。
发病率＝调查小区发病株数/调查总株数×100％；
防效＝(对照小区的发病率-处理小区的发病率)/对照小区的发病率×100％
试验结果见表4：
试验组1 试验组2 清水对照
发病率 2.7％ 0.75％ 8.3％
防治效果 67％ 90.9％ --
试验结果表明，试验组2即定植时在定植穴中分别按照每穴100倍稀释液300ml进行灌根处理，间隔7～10天，连续使用4次，防治黄瓜立枯病效果最好，达到90.9％。
综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种制备枯草芽孢杆菌的微生物制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、加料：将发酵营养剂溶解后加入到移动发酵罐内，补水至60～80％罐体积，再加入发酵助剂；
步骤2、发酵罐灭菌：采用蒸汽使发酵罐加热至120～125℃，高温灭菌30分钟；
步骤3、添加种子液：将枯草芽孢杆菌的种子液通过火焰接种口接种至发酵罐内；
步骤4、热处理：将接种后的料液在70-80℃的条件下保温30分钟；
步骤5、发酵培养：设定参数，进行发酵培养；
步骤6、收集产品：发酵结束后，收集活菌体及活菌体的代谢产物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中发酵罐为200L，补水至140L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中，采用蒸汽加热至121℃高温灭菌。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤6中，收集的产品中含有枯草芽孢杆菌活菌量为20～200亿个/ml。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤6中，收集的产品中含有枯草芽孢杆菌活菌量为40～200亿个/ml。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法在防治黄瓜的土传病害中的应用，其特征在于，将发酵所制得的微生物制剂用水稀释后直接灌根。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为用于防治黄瓜根腐病和用于防治黄瓜立枯病。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，用水稀释80～120倍后，每穴250～400ml灌根。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，用水稀释100倍后，每穴300ml灌根。
10.如权利要求1-5任一项所述的方法在促进农作物生长中的应用，其特征在于，将发酵所制得的微生物制剂用水稀释后直接灌根。
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