CN109415341B - 作为TGF-βR1抑制剂的苯并三氮唑衍生的α，β不饱和酰胺类化合物 - Google Patents

作为TGF-βR1抑制剂的苯并三氮唑衍生的α，β不饱和酰胺类化合物 Download PDF

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Abstract

一类作为TGF‑βR1抑制剂的结构如式(I)所示的由苯并三氮唑衍生的α，β不饱和酰胺化合物，或其药学上可接受的盐。

Description

作为TGF-βR1抑制剂的苯并三氮唑衍生的α，β不饱和酰胺类化 合物
技术领域
本发明涉及一类作为TGF-βR1抑制剂的苯并三氮唑衍生的α，β不饱和酰胺化合物，具体公开了式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐。
背景技术
转化生长因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)是一个多功能生长因子超家族，具有广泛的生物学活性，参与早期胚胎发育，软骨和骨的形成，包外基质的合成，炎症，间质纤维化，免疫和内分泌功能的调节，肿瘤的形成和发展。
TGF-β超家族由一类结构和功能相关的多肽生长因子组成，包括TGF-βs(即狭义的TGF-β)、活化素(axtivins)、抑制素(inhibins)、骨形成蛋白(BMPs)即苗勒抑制物(mullerian)等，TGF-β是该家族的重要成员之一。在哺乳动物中TGF-β主要以TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三种形式存在，它们位于不同的染色体上，其中TGF-β1在体细胞中所占比例最高(＞90％)，它活性最强、功能最多，分布也最广泛。新合成的TGF-β以无活性的前体形式出现，由信号肽、潜活相关多肽(LAP)和成熟的TGF-β三部分组成，经酶解后形成有活性的TGF-β，再与其受体结合发挥生物学效应。
TGF-β信号分子通过跨膜的受体复合物进行信号转导。TGF-β受体是存在于细胞表面的跨膜蛋白，分为I型受体(TGF-βR I)、II型受体(TGF-βR II)和III型受体(TGF-βRIII)，其中TGF-βR I又被称作活化素样受体5(activin receptor-like kinase 5，ALK5)。TGF-βRIII缺乏内在活性，主要与TGF-β的储存有关。TGF-βR I和TGF-βR II属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，II型受体能以较高的亲和力与TGF-β配体结合，并与I型受体形成异源受体复合物，将I型受体近膜的一段富含甘氨酸、丝氨酸残基的区域(GS结构域)磷酸化，启动细胞内信号联级反应。
Smads是细胞内重要的TGF-β信号转导和调节分子，可以将TGF-β信号直接由细胞膜转导如细胞核内，TGF-β/Smads信号通路在肿瘤的发生和发展中起到重要的作用。在TGF-β/Smads信号转导中，活化的TGF-β首先与细胞膜表面的TGF-βR II结合，形成异源二聚体复合物，TGF-βR I识别并结合该二元复合物。
TGF-βR II将TGF-βR I胞浆区GS结构域的丝氨酸/苏氨酸磷酸化，从而激活TGF-βRI；活化的TGF-βR I进一步磷酸化R-Smads(Smad2/Smad3)蛋白，后者再与Co-Smad(Smad4)结合成为异三聚体复合物，这一复合物进入细胞核内，与其他辅助活化因子(co-activator)和辅助抑制因子(co-inhibitor)协同作用，调节靶基因的转录。在TGF-β/Smads信号通路中任何一个环节发生改变，都会导致信号转导通路的异常。
目前的研究表明，在肿瘤细胞中，TGF-β能直接影响肿瘤的生长(TGF-β信号的非固有影响)，或者通过诱导上皮间质转化、阻断抗肿瘤免疫应答、增加肿瘤相关纤维化和强化血管再生间接地影响肿瘤生长(TGF-β的固有影响)。同时，TGF-β具有很强的纤维化诱导作用，它是与肿瘤相关的成纤维细胞的激活剂。这些成纤维细胞是胶原I型和其他纤维化因子的主要来源。成纤维细胞和其他纤维化因子的诱导产物可能继续培育出一个微环境，这个环境会减少免疫应答，增加抗药性和强化肿瘤血管生成另外，在个体发育和肿瘤生长过程中，TGF-β影响血管生再生。例如，TGF-βRI型缺陷的小鼠胚胎显示出了严重的血管发育缺陷，证明TGF-β信号通道是血管内皮及平滑肌细胞发育中的关键调节器
2013年，FDA授予礼来公司的小分子TGF-βR I抑制剂LY2157299(WO 2002/094833)用以治疗神经胶质瘤和肝癌。LY2157299是一种在研的孤儿药，名称为Galunisertib。Galunisertib能抑制肿瘤细胞侵袭和转移，同时抑制肿瘤细胞向血管內渗。在治疗肝癌患者的2期临床实验中，经Galunisertib治疗，约23％的患者血清中甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)水平下降20％以上。这些患者与无AFP应答反应的患者相比，肿瘤进展较慢且生存期更久，而且在这些患者体内也发现上皮细胞钙黏蛋白表达增强，这说明Galunisertib可以通过抑制TGF-β信号通路来调节EMT，从而抑制肝癌进展Galunisertib(LY2157299)的结构如式(II)所示：
Figure GPA0000254624350000031
背景研发资料参考以下文献：
WO2009/009059；WO2007/076127；WO2004/026306；WO2004/072033；WO2002/094833.
发明内容
本发明提供式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐，
Figure GPA0000254624350000032
其中，
R1选自氢、羟基、氨基，或选自任选被1、2或3个R取代的C1-3烷基和C3～6环烷基；
R2选自任选被1、2或3个R取代的C1-3烷基、C3～6环烷基和苯基；
R3选自氢，或选自任选被1、2或3个R取代的C1-3烷基；
任选地，R2和R3连接在一起，形成一个任选被1、2或3个R取代的5～6元环；
R4和R5分别独立地选自氢、卤素，或选自任选被1、2或3个R取代的C1-3烷基和C1-3杂烷基；
L选自单键、-(CRR)1-3-；
R选自F、Cl、Br、I、CN、OH、NH2、COOH，或选自任选被1、2或3个R’取代的C1-6烷基、C1-6杂烷基、C3-6环烷基、3～6元杂环烷基、苯基和5～6元杂芳基；
R’选自F、Cl、Br、I、OH、CN、NH2、COOH、Me、Et、CF3、CHF2、CH2F、NHCH3、N(CH3)2；
“杂”表示杂原子或杂原子团，选自-C(＝O)N(R)-、-N(R)-、-C(＝NR)-、-S(＝O)2N(R)-、-S(＝O)N(R)-、-O-、-S-、＝O、＝S、-O-N＝、-C(＝O)O-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-N(R)C(＝O)N(R)-；
以上任何一种情况下，杂原子或杂原子团的数目分别独立地选自1、2或3。
在本发明的一些方案中，上述R选自F、Cl、Br、I、CN、OH，或选自任选被1、2或3个R’取代的C1-6烷基、C3-6环烷基、苯基。
在本发明的一些方案中，上述R选自F、Cl、Br、I、CN、OH、甲基、CHF2、乙基、丙基、环丙基和苯基。
在本发明的一些方案中，上述R1选自氢或选自任选被1、2或3个R取代的：甲基、乙基、
Figure GPA0000254624350000041
在本发明的一些方案中，上述R1选自氢、甲基、乙基、
Figure GPA0000254624350000042
在本发明的一些方案中，上述R2选自任选被1、2或3个R取代的甲基、乙基、异丙基、环戊基和苯基。
在本发明的一些方案中，上述R2选自甲基、乙基、异丙基、环戊基、
Figure GPA0000254624350000043
在本发明的一些方案中，上述R2和R3连接在一起，结构单元
Figure GPA0000254624350000044
为
Figure GPA0000254624350000045
在本发明的一些方案中，上述R4和R5分别独立地选自氢、F、Cl、Br、甲基和乙基。
在本发明的一些方案中，上述结构单元
Figure GPA0000254624350000046
选自
Figure GPA0000254624350000047
Figure GPA0000254624350000048
在本发明的一些方案中，上述L选自单键、-(CH2)1-3-。
在本发明的一些方案中，上述L选自单键、-CH2-、-CH2CH2-。
在本发明的一些方案中，上述R选自F、Cl、Br、I、CN、OH，或选自任选被1、2或3个R’取代的C1-6烷基、C3-6环烷基、苯基，其他变量如上述所定义。
在本发明的一些方案中，上述R选自F、Cl、Br、I、CN、OH、甲基、CHF2、乙基、丙基、环丙基和苯基，其他变量如上述所定义。
在本发明的一些方案中，上述R1选自氢或选自任选被1、2或3个R取代的：甲基、乙基、
Figure GPA0000254624350000049
其他变量如上述所定义。
在本发明的一些方案中，上述R1选自氢、甲基、乙基、
Figure GPA00002546243500000410
其他变量如上述所定义。
在本发明的一些方案中，上述R2选自任选被1、2或3个R取代的甲基、乙基、异丙基、环戊基和苯基，其他变量如上述所定义。
在本发明的一些方案中，上述R2选自甲基、乙基、异丙基、环戊基、
Figure GPA0000254624350000051
其他变量如上述所定义。
在本发明的一些方案中，上述R2和R3连接在一起，结构单元
Figure GPA0000254624350000052
为
Figure GPA0000254624350000053
其他变量如上述所定义。
在本发明的一些方案中，上述R4和R5分别独立地选自氢、F、Cl、Br、甲基和乙基，其他变量如上述所定义。
在本发明的一些方案中，上述结构单元
Figure GPA0000254624350000054
选自
Figure GPA0000254624350000055
Figure GPA0000254624350000056
其他变量如上述所定义。
在本发明的一些方案中，上述L选自单键、-(CH2)1-3-，其他变量如上述所定义。
在本发明的一些方案中，上述L选自单键、-CH2-、-CH2CH2-，其他变量如上述所定义。
在本发明的一些方案中，上述化合物选自
Figure GPA0000254624350000057
其中，R1、R2、R3、R4、R5、L如上述所定义，且R4和R5不同时为H。
在本发明的一些方案中，上述化合物选自
Figure GPA0000254624350000061
其中，R1、R2、R4、R5、L如上述所定义，且R4和R5不同时为H。
本发明还提供化合物或其药学上可接受的盐，选自
Figure GPA0000254624350000062
本发明还提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求上述的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
本发明还提供上述化合物或其药学上可接受的盐或上述的药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用。
在本发明的一些方案中，上述癌症是指乳腺癌。
本发明还有一些方案是由上述变量任意组合而来。
技术效果
本发明化合物的用途主要为TGF-beta R1的抑制剂，通过对TGF-beta R1的抑制，阻断TGF-betade下游信号通路，从而发挥期望的药理作用。同现有技术不同，本发明化合物中苯并三氮唑结构为重要的药效团与TGF-beat R1结合。意想不到的是，本发明化合物的化学结构的组合，带来了较现有技术更优的生物活性。同等剂量下，在小鼠的CT-26Syngeneic模型中，本发明化合物单药以及与PDL-1联用的肿瘤抑制效果，均优于现有技术，揭示本发明化合物有更优的抗肿瘤免疫激活作用；在小鼠4T1原位移植抗转移乳腺癌啊模型中，本发明化合物较现有技术有明显优秀的抗转移能力。本发明化合物对肿瘤在多组织器官上的转移和转移的强度均有明显的抑制作用，显示其做为治疗药物开的巨大潜能。本发明化合物非常有望作为乳腺癌转移抑制剂，在乳腺癌的联合治疗中起到重要的转移抑制作用，为临床乳腺癌的治疗提供了潜在的新的治疗策略。
定义和说明
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。这里所采用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机氨或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括无机酸盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氢根，磷酸、磷酸一氢根、磷酸二氢根、硫酸、硫酸氢根、氢碘酸、亚磷酸等；以及有机酸盐，所述有机酸包括如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸和甲磺酸等类似的酸；还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐(参见Berge et al.，″PharmaceuticalSalts″，Journal of Pharmaceutical Science 66：1-19(1977))。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。
优选地，以常规方式使盐与碱或酸接触，再分离母体化合物，由此再生化合物的中性形式。化合物的母体形式与其各种盐的形式的不同之处在于某些物理性质，例如在极性溶剂中的溶解度不同。
本文所用的“药学上可接受的盐”属于本发明化合物的衍生物，其中，通过与酸成盐或与碱成盐的方式修饰所述母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于：碱基比如胺的无机酸或有机酸盐、酸根比如羧酸的碱金属或有机盐等等。药学上可接受的盐包括常规的无毒性的盐或母体化合物的季铵盐，例如无毒的无机酸或有机酸所形成的盐。常规的无毒性的盐包括但不限于那些衍生自无机酸和有机酸的盐，所述的无机酸或有机酸选自2-乙酰氧基苯甲酸、2-羟基乙磺酸、乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、碳酸氢根、碳酸、柠檬酸、依地酸、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、富马酸、葡庚糖、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸盐、羟基、羟萘、羟乙磺酸、乳酸、乳糖、十二烷基磺酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲烷磺酸、硝酸、草酸、双羟萘酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、多聚半乳糖醛、丙酸、水杨酸、硬脂酸、亚乙酸、琥珀酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、硫酸、单宁、酒石酸和对甲苯磺酸。
本发明的药学上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。一般地，优选醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈等非水介质。
除了盐的形式，本发明所提供的化合物还存在前药形式。本文所描述的化合物的前药容易地在生理条件下发生化学变化从而转化成本发明的化合物。此外，前体药物可以在体内环境中通过化学或生化方法被转换到本发明的化合物。
本发明的某些化合物可以以非溶剂化形式或者溶剂化形式存在，包括水合物形式。一般而言，溶剂化形式与非溶剂化的形式相当，都包含在本发明的范围之内。
本发明的某些化合物可以具有不对称碳原子(光学中心)或双键。外消旋体、非对映异构体、几何异构体和单个的异构体都包括在本发明的范围之内。
本文中消旋体、ambiscalemic and scalemic或者对映体纯的化合物的图示法来自Maehr，J.Chem.Ed.1985，62：114-120。1985年，62：114-120。除非另有说明，用楔形键和虚线键表示一个立体中心的绝对构型。当本文所述化合物含有烯属双键或其它几何不对称中心，除非另有规定，它们包括E、Z几何异构体。同样地，所有的互变异构形式均包括在本发明的范围之内。
本发明的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本发明设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本发明的范围之内。烷基等取代基中可存在另外的不对称碳原子。所有这些异构体以及它们的混合物，均包括在本发明的范围之内。
可以通过的手性合成或手性试剂或者其他常规技术制备光学活性的(R)-和(S)-异构体以及D和L异构体。如果想得到本发明某化合物的一种对映体，可以通过不对称合成或者具有手性助剂的衍生作用来制备，其中将所得非对映体混合物分离，并且辅助基团裂开以提供纯的所需对映异构体。或者，当分子中含有碱性官能团(如氨基)或酸性官能团(如羧基)时，与适当的光学活性的酸或碱形成非对映异构体的盐，然后通过本领域所公知的常规方法进行非对映异构体拆分，然后回收得到纯的对映体。此外，对映异构体和非对映异构体的分离通常是通过使用色谱法完成的，所述色谱法采用手性固定相，并任选地与化学衍生法相结合(例如由胺生成氨基甲酸盐)。
本发明的化合物可以在一个或多个构成该化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素标记化合物，比如氚(3H)，碘-125(125I)或C-14(14C)。本发明的化合物的所有同位素组成的变换，无论放射性与否，都包括在本发明的范围之内。
术语“药学上可接受的载体”是指能够递送本发明有效量活性物质、不干扰活性物质的生物活性并且对宿主或者患者无毒副作用的任何制剂或载体介质代表性的载体包括水、油、蔬菜和矿物质、膏基、洗剂基质、软膏基质等。这些基质包括悬浮剂、增粘剂、透皮促进剂等。它们的制剂为化妆品领域或局部药物领域的技术人员所周知。关于载体的其他信息，可以参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，21st Ed.，Lippincott，Williams&Wilkins(2005)，该文献的内容通过引用的方式并入本文。
术语“赋形剂”通常是指配制有效的药物组合物所需要载体、稀释剂和/或介质。
针对药物或药理学活性剂而言，术语“有效量”或“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。对于本发明中的口服剂型，组合物中一种活性物质的“有效量”是指与该组合物中另一种活性物质联用时为了达到预期效果所需要的用量。有效量的确定因人而异，取决于受体的年龄和一般情况，也取决于具体的活性物质，个案中合适的有效量可以由本领域技术人员根据常规试验确定。
术语“活性成分”、“治疗剂”，“活性物质”或“活性剂”是指一种化学实体，它可以有效地治疗目标紊乱、疾病或病症。
“任选”或“任选地”指的是随后描述的事件或状况可能但不是必需出现的，并且该描述包括其中所述事件或状况发生的情况以及所述事件或状况不发生的情况。
术语“被取代的”是指特定原子上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，可以包括重氢和氢的变体，只要特定原子的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为酮基(即＝O)时，意味着两个氢原子被取代。酮取代不会发生在芳香基上。术语“任选被取代的”是指可以被取代，也可以不被取代，除非另有规定，取代基的种类和数目在化学上可以实现的基础上可以是任意的。
当任何变量(例如R)在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被0-2个R所取代，则所述基团可以任选地至多被两个R所取代，并且每种情况下的R都有独立的选项。此外，取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。
当一个连接基团的数量为0时，比如-(CRR)0-，表示该连接基团为单键。
当其中一个变量选自单键时，表示其连接的两个基团直接相连，比如A-L-Z中L代表单键时表示该结构实际上是A-Z。
当一个取代基为空缺时，表示该取代基是不存在的，比如A-X中X为空缺时表示该结构实际上是A。当一个取代基的键可以交叉连接到一个环上的两个原子时，这种取代基可以与这个环上的任意原子相键合。当所列举的取代基中没有指明其通过哪一个原子连接到化学结构通式中包括但未具体提及的化合物时，这种取代基可以通过其任何原子相键合。取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。例如，结构单元
Figure GPA0000254624350000091
表示其可在环己基或者环己二烯上的任意一个位置发生取代。
除非另有规定，术语“杂”表示杂原子或杂原子团(即含有杂原子的原子团)，包括碳(C)和氢(H)以外的原子以及含有这些杂原子的原子团，例如包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)、锗(Ge)、铝(Al)、硼(B)、-O-、-S-、＝O、＝S、-C(＝O)O-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(＝O)、-S(＝O)2-，以及任选被取代的-C(＝O)N(H)-、-N(H)-、-C(＝NH)-、-S(＝O)2N(H)-或-S(＝O)N(H)-。
除非另有规定，“环”表示被取代或未被取代的环烷基、杂环烷基、环烯基、杂环烯基、环炔基、杂环炔基、芳基或杂芳基。所谓的环包括单环、联环、螺环、并环或桥环。环上原子的数目通常被定义为环的元数，例如，“5～7元环”是指环绕排列5～7个原子。除非另有规定，该环任选地包含1～3个杂原子。因此，“5～7元环”包括例如苯基、吡啶和哌啶基；另一方面，术语“5～7元杂环烷基环”包括吡啶基和哌啶基，但不包括苯基。术语“环”还包括含有至少一个环的环系，其中的每一个“环”均独立地符合上述定义。
除非另有规定，术语“杂环”或“杂环基”意指稳定的含杂原子或杂原子团的单环、双环或三环，它们可以是饱和的、部分不饱和的或不饱和的(芳族的)，它们包含碳原子和1、2、3或4个独立地选自N、O和S的环杂原子，其中上述任意杂环可以稠合到一个苯环上形成双环。氮和硫杂原子可任选被氧化(即NO和S(O)p，p是1或2)。氮原子可以是被取代的或未取代的(即N或NR，其中R是H或本文已经定义过的其他取代基)。该杂环可以附着到任何杂原子或碳原子的侧基上从而形成稳定的结构。如果产生的化合物是稳定的，本文所述的杂环可以发生碳位或氮位上的取代。杂环中的氮原子任选地被季铵化。一个优选方案是，当杂环中S及O原子的总数超过1时，这些杂原子彼此不相邻。另一个优选方案是，杂环中S及O原子的总数不超过1。如本文所用，术语“芳族杂环基团”或“杂芳基”意指稳定的5、6、7元单环或双环或7、8、9或10元双环杂环基的芳香环，它包含碳原子和1、2、3或4个独立地选自N、O和S的环杂原子。氮原子可以是被取代的或未取代的(即N或NR，其中R是H或本文已经定义过的其他取代基)。氮和硫杂原子可任选被氧化(即NO和S(O)p，p是1或2)。值得注意的是，芳香杂环上S和O原子的总数不超过1。桥环也包含在杂环的定义中。当一个或多个原子(即C、O、N或S)连接两个不相邻的碳原子或氮原子时形成桥环。优选的桥环包括但不限于：一个碳原子、两个碳原子、一个氮原子、两个氮原子和一个碳-氮基。值得注意的是，一个桥总是将单环转换成三环。桥环中，环上的取代基也可以出现在桥上。
杂环化合物的实例包括但不限于：吖啶基、吖辛因基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并巯基呋喃基、苯并巯基苯基、苯并恶唑基、苯并恶唑啉基、苯并噻唑基、苯并***基、苯并四唑基、苯并异恶唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH-咔唑基、咔啉基、苯并二氢吡喃基、色烯、噌啉基十氢喹啉基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、二氢呋喃并[2，3-b]四氢呋喃基、呋喃基、呋咱基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、吲哚烯基、二氢吲哚基、中氮茚基、吲哚基、3H-吲哚基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异二氢吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异恶唑基、亚甲二氧基苯基、吗啉基、萘啶基，八氢异喹啉基、恶二唑基、1，2，3-恶二唑基、1，2，4-恶二唑基、1，2，5-恶二唑基、1，3，4-恶二唑基、恶唑烷基、恶唑基、羟吲哚基、嘧啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩嗪、吩噻嗪、苯并黄嘌呤基、酚恶嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并恶唑、吡啶并咪唑、吡啶并噻唑、吡啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、2H-吡咯基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基、奎宁环基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、四唑基，6H-1，2，5-噻二嗪基、1，2，3-噻二唑基、1，2，4-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、异噻唑基噻吩基、噻吩并恶唑基、噻吩并噻唑基、噻吩并咪唑基、噻吩基、三嗪基、1，2，3-***基、1，2，4-***基、1，2，5-***基、1，3，4-***基和呫吨基。还包括稠环和螺环化合物。
除非另有规定，术语“烃基”或者其下位概念(比如烷基、烯基、炔基、芳基等等)本身或者作为另一取代基的一部分表示直链的、支链的或环状的烃原子团或其组合，可以是完全饱和的(如烷基)、单元或多元不饱和的(如烯基、炔基、芳基)，可以是单取代或多取代的，可以是一价(如甲基)、二价(如亚甲基)或者多价(如次甲基)，可以包括二价或多价原子团，具有指定数量的碳原子(如C1-C12表示1至12个碳，C1-12选自C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11和C12；C3-12选自C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11和C12。)。“烃基”包括但不限于脂肪烃基和芳香烃基，所述脂肪烃基包括链状和环状，具体包括但不限于烷基、烯基、炔基，所述芳香烃基包括但不限于6-12元的芳香烃基，例如苯、萘等。在一些实施例中，术语“烃基”表示直链的或支链的原子团或它们的组合，可以是完全饱和的、单元或多元不饱和的，可以包括二价和多价原子团。饱和烃原子团的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、异丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基，以及正戊基、正己基、正庚基、正辛基等原子团的同系物或异构体。不饱和烃基具有一个或多个双键或三键，其实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基，3-丁炔基，以及更高级的同系物和异构体。
除非另有规定，术语“杂烃基”或者其下位概念(比如杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂芳基等等)本身或者与另一术语联合表示稳定的直链的、支链的或环状的烃原子团或其组合，有一定数目的碳原子和至少一个杂原子组成。在一些实施例中，术语“杂烷基”本身或者与另一术语联合表示稳定的直链的、支链的烃原子团或其组合物，有一定数目的碳原子和至少一个杂原子组成。在一个典型实施例中，杂原子选自B、O、N和S，其中氮和硫原子任选地被氧化，氮杂原子任选地被季铵化。杂原子或杂原子团可以位于杂烃基的任何内部位置，包括该烃基附着于分子其余部分的位置，但术语“烷氧基”、“烷氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)属于惯用表达，是指分别通过一个氧原子、氨基或硫原子连接到分子的其余部分的那些烷基基团。实例包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3。
除非另有规定，术语“环烃基”、“杂环烃基”或者其下位概念(比如芳基、杂芳基、环烷基、杂环烷基、环烯基、杂环烯基、环炔基、杂环炔基等等)本身或与其他术语联合分别表示环化的“烃基”、“杂烃基”。此外，就杂烃基或杂环烃基(比如杂烷基、杂环烷基)而言，杂原子可以占据该杂环附着于分子其余部分的位置。环烃基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环基的非限制性实例包括1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基，3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃吲哚-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基，1-哌嗪基和2-哌嗪基。
除非另有规定，术语“烷基”用于表示直链或支链的饱和烃基，可以是单取代(如-CH2F)或多取代的(如-CF3)，可以是一价(如甲基)、二价(如亚甲基)或者多价(如次甲基)。烷基的例子包括甲基(Me)，乙基(Et)，丙基(如，n-丙基和异丙基)，丁基(如，n-丁基，异丁基，s-丁基，t-丁基)，戊基(如，n-戊基，异戊基，新戊基)等。
除非另有规定，“烯基”指在链的任何位点上具有一个或多个碳碳双键的烷基，可以是单取代或多取代的，可以是一价、二价或者多价。烯基的例子包括乙烯基，丙烯基，丁烯基，戊烯基，己烯基，丁间二烯基，戊间二烯基，己间二烯基等。
除非另有规定，“炔基”指在链的任何位点上具有一个或多个碳碳三键的烷基，可以是单取代或多取代的，可以是一价、二价或者多价。炔基的例子包括乙炔基，丙炔基，丁炔基，戊炔基等。
除非另有规定，环烷基包括任何稳定的环状或多环烃基，任何碳原子都是饱和的，可以是单取代或多取代的，可以是一价、二价或者多价。这些环烷基的实例包括，但不限于，环丙基、降冰片烷基、[2.2.2]二环辛烷、[4.4.0]二环癸烷等。
除非另有规定，环烯基包括任何稳定的环状或多环烃基，该烃基在环的任何位点含有一个或多个不饱和的碳-碳双键，可以是单取代或多取代的，可以是一价、二价或者多价。这些环烯基的实例包括，但不限于，环戊烯基、环己烯基等。
除非另有规定，环炔基包括任何稳定的环状或多环烃基，该烃基在环的任何位点含有一个或多个碳-碳三键，可以是单取代或多取代的，可以是一价、二价或者多价。
除非另有规定，术语“卤代素”或“卤素”本身或作为另一取代基的一部分表示氟、氯、溴或碘原子。此外，术语“卤代烷基”意在包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基”意在包括但不仅限于三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基和3-溴丙基等等。除非另有规定，卤代烷基的实例包括但不仅限于：三氟甲基、三氯甲基、五氟乙基，和五氯乙基。
“烷氧基”代表通过氧桥连接的具有特定数目碳原子的上述烷基，除非另有规定，C1-6烷氧基包括C1、C2、C3、C4、C5和C6的烷氧基。烷氧基的例子包括但不限于：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基和S-戊氧基。除非另有规定，术语“芳基”表示多不饱和的芳族烃取代基，可以是单取代或多取代的，可以是一价、二价或者多价，它可以是单环或多环(比如1至3个环；其中至少一个环是芳族的)，它们稠合在一起或共价连接。术语“杂芳基”是指含有一至四个杂原子的芳基(或环)。在一个示范性实例中，杂原子选自B、N、O和S，其中氮和硫原子任选地被氧化，氮原子任选地被季铵化。杂芳基可通过杂原子连接到分子的其余部分。芳基或杂芳基的非限制性实施例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-恶唑基、4-恶唑基、2-苯基-4-恶唑基、5-恶唑基、3-异恶唑基、4-异恶唑基、5-异恶唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述任意一个芳基和杂芳基环系的取代基选自下文所述的可接受的取代基。
除非另有规定，芳基在与其他术语联合使用时(例如芳氧基、芳硫基、芳烷基)包括如上定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳烷基”意在包括芳基附着于烷基的那些原子团(例如苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，包括其中碳原子(如亚甲基)已经被例如氧原子代替的那些烷基，例如苯氧基甲基、2-吡啶氧甲基3-(1-萘氧基)丙基等。
术语“离去基团”是指可以被另一种官能团或原子通过取代反应(例如亲和取代反应)所取代的官能团或原子。例如，代表性的离去基团包括三氟甲磺酸酯；氯、溴、碘；磺酸酯基，如甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、对溴苯磺酸酯、对甲苯磺酸酯等；酰氧基，如乙酰氧基、三氟乙酰氧基等等。
术语“保护基”包括但不限于“氨基保护基”、“羟基保护基”或“巯基保护基”。术语“氨基保护基”是指适合用于阻止氨基氮位上副反应的保护基团。代表性的氨基保护基包括但不限于：甲酰基；酰基，例如链烷酰基(如乙酰基、三氯乙酰基或三氟乙酰基)；烷氧基羰基，如叔丁氧基羰基(Boc)；芳基甲氧羰基，如苄氧羰基(Cbz)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)；芳基甲基，如苄基(Bn)、三苯甲基(Tr)、1，1-二-(4′-甲氧基苯基)甲基；甲硅烷基，如三甲基甲硅烷基(TMS)和叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)等等。术语“羟基保护基”是指适合用于阻止羟基副反应的保护基。代表性羟基保护基包括但不限于：烷基，如甲基、乙基和叔丁基；酰基，例如链烷酰基(如乙酰基)；芳基甲基，如苄基(Bn)，对甲氧基苄基(PMB)、9-芴基甲基(Fm)和二苯基甲基(二苯甲基，DPM)；甲硅烷基，如三甲基甲硅烷基(TMS)和叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)等等。
本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。
本发明所使用的溶剂可经市售获得。
本发明采用下述缩略词：aq代表水；HATU代表O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐；EDC代表N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐；m-CPBA代表3-氯过氧苯甲酸；eq代表当量、等量；CDI代表羰基二咪唑；DCM代表二氯甲烷；PE代表石油醚；DIAD代表偶氮二羧酸二异丙酯；DMF代表N，N-二甲基甲酰胺；DMSO代表二甲亚砜；EtOAc代表乙酸乙酯；EtOH代表乙醇；MeOH代表甲醇；CBz代表苄氧羰基，是一种胺保护基团；BOC代表叔丁基羰基是一种胺保护基团；HOAc代表乙酸；NaCNBH3代表氰基硼氢化钠；r.t.代表室温；O/N代表过夜；THF代表四氢呋喃；Boc2O代表二-叔丁基二碳酸酯；TFA代表三氟乙酸；DIPEA代表二异丙基乙基胺；SOCl2代表氯化亚砜；CS2代表二硫化碳；TsOH代表对甲苯磺酸；NFSI代表N-氟-N-(苯磺酰基)苯磺酰胺；NCS代表1-氯吡咯烷-2，5-二酮；n-Bu4NF代表氟化四丁基铵；iPrOH代表2-丙醇；mp代表熔点；LDA代表二异丙基胺基锂；FBS代表胎牛血清；DPBS代表杜氏磷酸缓冲液；EDTA代表乙二胺四乙酸；DMEM代表杜尔伯科改良伊格尔培养基；CellTiter-Glo(CTG)代表ATP荧光活性检测方法；PO代表灌胃给药；IP代表腹腔给药。
化合物经手工或者
Figure GPA0000254624350000131
软件命名，市售化合物采用供应商目录名称。
附图说明
图1为实施例1、LY2157299和BioXcell-mPD-L1对CT-26细胞皮下异种移植肿瘤雌性BALB/c小鼠模型的体重影响。
图2为CT-26移植瘤模型荷瘤鼠在给予实施例1、LY2157299和BioXcell-mPD-L1后的肿瘤生长曲线。
图3为鼠源乳腺癌4T1细胞BALB/c小鼠原位移植模型肿瘤细胞转移抑制实验中动物相对体重变化。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
实施例1
Figure GPA0000254624350000141
中间体1-6的制备：
Figure GPA0000254624350000142
步骤A：将乙酸乙酯(291.41毫升，2.98摩尔)溶于甲苯(750.00毫升)中，然后在室温下分批加入乙醇钠(135.06克，1.98摩尔)，反应混合物在室温下搅拌1小时。将6-甲基吡啶-2-甲酸甲酯(150.00克，992.33毫摩尔)在25摄氏度下加入到上述反应液中，然后加热至95摄氏度并搅拌15小时。反应混合物冷却到30摄氏度，用醋酸调节pH至7，加水(500毫升)稀释，然后用乙酸乙酯(500毫升)萃取。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用硅胶柱纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝50/1)，得到3-(6-甲基-2-吡啶)-3-氧-丙酸乙酯(120.00克，收率：58.35％)。
步骤B：将3-(6-甲基-2-吡啶)-3-氧-丙酸乙酯(120.00克，579.07毫摩尔)溶解于吡啶(300毫升)中，然后加入1-氨基吡咯烷-2-酮的对甲基苯磺酸盐(172.01克，631.66毫摩尔)。反应混合物在25摄氏度下搅拌16小时，然后减压浓缩除去溶剂。剩余物加水(300毫升)稀释，然后用乙酸乙酯(300毫升×2)萃取。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到3-(6-甲基-2-吡啶)-3-(2-羰基-吡咯烷)亚氨基-丙酸乙酯(150克，收率：90.28％)。
步骤C：将3-(6-甲基-2-吡啶)-3-(2-羰基-吡咯烷)亚氨基-丙酸乙酯(155.00克，535.72毫摩尔)溶解于甲苯中，然后加入乙醇钠(72.91克，1.07摩尔)。反应混合物加热至100摄氏度并搅拌16小时，随后冷却到室温。缓慢加水(1.5升)稀释，用浓盐酸调节pH至4，并用二氯甲烷/异丙醇(10/1)(1升×7)萃取。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用石油醚/乙酸乙酯＝10/1(200毫升)打浆，过滤并收集固体。该固体减压干燥后得到2-(6-甲基-2-吡啶)-5，6-二氢-4H-吡咯[1，2-b]吡唑-3-羧酸(52.80克，收率：40.52％)。
步骤D：将2-(6-甲基-2-吡啶)-5，6-二氢-4H-吡咯[1，2-b]吡唑-3-羧酸(45.00克，184.99毫摩尔)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(650.00毫升)中，然后加入NBS(49.09克，258.99毫摩尔)。反应混合物在30-40摄氏度下搅拌60小时，然后用水(600毫升)稀释，并用二氯甲烷/异丙醇(10/1)(500毫升×3)萃取。合并的有机相用氢氧化钠(0.5摩尔/升，800毫升)洗涤一次，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。得到的固体用油醚/乙酸乙酯＝10/1(200毫升)打浆，过滤并收集固体。该固体减压干燥后得到3-溴-2-(6-甲基-2-吡啶)-5，6-二氢-4H-吡咯[1，2-b]吡唑(33.00克，收率：64.13％)。
步骤E：将3-溴-2-(6-甲基-2-吡啶)-5，6-二氢-4H-吡咯[1，2-b]吡唑(1.00克，3.60毫摩尔)和硼酸三异丙酯(1.79克，9.54毫摩尔)溶解于四氢呋喃(20.00毫升)中。反应混合物冷却至零下70摄氏度，然后逐滴加入正丁基锂(2.5M，3.74毫升)。滴加完成后，反应混合物在25摄氏度下搅拌1小时后，用盐酸水溶液(0.5摩尔/升)调节pH至7。然后减压浓缩除去四氢呋喃，再冷却到15摄氏度。将该混合物过滤，滤饼用油醚/乙酸乙酯＝10/1(5.5毫升)打浆，过滤并收集固体，该固体减压干燥后得到[2-(6-甲基-2-吡啶)-5，6-二氢-4H-吡咯[1，2-b]吡唑-3-基]硼酸(750毫克，收率：85.71％)。
实施例1的制备：
Figure GPA0000254624350000151
步骤A：将6-碘-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶(16.00克，65.30毫摩尔)溶解于四氢呋喃(800.00毫升)中，冷却至零下60-70摄氏度后，滴加六甲基二硅基氨基锂(1摩尔/升，130.60毫升，65.30毫摩尔)。反应混合物在零下60-70摄氏度下搅拌15分钟，加入N，N-二甲基甲酰胺(14.32克，195.90毫摩尔，15.07毫升)。然后在零下60至70摄氏度下继续搅拌15分钟，随后用饱和氯化铵水溶液(500毫升)淬灭。反应混合物升至室温后用乙酸乙酯(500毫升×2)萃取。合并的有机相用盐水(500毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用硅胶柱纯化(洗脱剂：二氯甲烷/乙酸乙酯＝10/1)，得到6-碘-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-甲醛(6.40克，收率：35.90％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.46(s，1H)，8.62(s，1H)，8.16(d，J＝9.3Hz，1H)，7.88(d，J＝9.3Hz，1H)。
步骤B：在装有温度计和氮气球的500毫升三口瓶中，加入2-二乙氧基磷酰基乙腈(3.83克，21.61毫摩尔，3.48毫升)和四氢呋喃(80毫升)。将混合物冷却至0摄氏度，然后分批加入叔丁醇钾(2.42克，21.61毫摩尔)。反应混合物在0摄氏度下搅拌15分钟后通过滴液漏斗滴加至另一悬浮液(将6-碘-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-甲醛分散在四氢呋喃(120毫升)并冷却至0摄氏度)中。反应混合物在0摄氏度下搅拌15分钟，然后倒入水(300毫升)中淬灭，并用乙酸乙酯(200毫升)和二氯甲烷(200毫升×2)萃取。合并的有机相用盐水(300毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用硅胶柱纯化(洗脱机：二氯甲烷/乙酸乙酯＝200/1至10/1)，得到(E)-3-(6-碘-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基)丙-2-烯腈(4.2克，收率：65.66％)。1H NMR(400MHz，CHLOROFORM-d)δ8.42(s，1H)，8.03(d，J＝9.3Hz，1H)，7.98-7.91(m，1H)，7.85-7.78(m，1H)，7.60(d，J＝9.2Hz，1H)。
步骤C：将(E)-3-(6-碘-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基)丙-2-烯腈(4.50克，15.20毫摩尔)，[2-(6-甲基-2-吡啶基)-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-3-基]硼酸(4.43克，18.24毫摩尔)，碳酸钠(4.83克，45.60毫摩尔)，[1，1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(556.07毫克，759.96微摩尔)，2-双环己基膦-2’，6’-二甲氧基联苯(311.98毫克，759.96微摩尔)和[2-(2-氨基苯基)苯基]-氯-钯-环己基-[2-(2，6-二甲氧基苯基)苯基]膦(547.64毫克，759.96微摩尔)加入到二氧六环(100毫升)和水(20毫升)的混合溶剂中。用氮气置换3次然后加热至90-100摄氏度并搅拌2小时。将反应混合物倒入水(200毫升)中淬灭，并用二氯甲烷(200毫升×2)萃取。合并的有机相用盐水(200毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用硅胶柱纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝30/1)，得到粗品，粗品在石油醚/乙酸乙酯＝5/1的混合溶剂中搅拌12小时，过滤并收集固体，该固体经减压浓缩干燥得到(E)-3-[6-[2-(6-甲基-2-吡啶基)-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-3-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯腈(5.37克，收率：96.16％)。1H NMR(400MHz，CHLOROFORM-d)δ8.49(s，1H)，7.82-7.74(m，2H)，7.59-7.46(m，4H)，6.99(dd，J＝2.6，6.1Hz，1H)，4.39(d，J＝6.3Hz，2H)，2.90-2.70(m，4H)，2.20(s，3H)。
步骤D：将(E)-3-[6-[2-(6-甲基-2-吡啶基)-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-3-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯腈(5.37克，14.62毫摩尔)溶解于二氯甲烷(20毫升)，二甲基亚砜(70毫升)和水(20毫升)的混合溶剂中，然后分别加入双氧水(8.29克73.10毫摩尔，7.02毫升，30％)和氢氧化钠(2摩尔/升，14.62毫升)。混合物在15-20摄氏度下搅拌12小时。将混合物倒入水(200毫升)中淬灭，并用二氯甲烷/异丙醇(3/1)的混合溶剂(200毫升×1)萃取。有机相用饱和硫代硫酸钠水溶液(200毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物经制备高效液相色谱法纯化(柱子：Phenomenex Gemini C18 250×50毫米×10微米；流动相：[水(0.05％氨水v/v)-乙腈]；梯度：5％-32％，33；80％分钟)得到实施例1(3.6克，收率：63.82％)。1H NMR(400MHz，CHLOROFORM-d)δ8.45(s，1H)，8.09(d，J＝15.6Hz，1H)，7.85(d，J＝15.6Hz，1H)，7.69(d，J＝9.2Hz，1H)，7.55-7.45(m，2H)，7.37(d，J＝7.8Hz，1H)，6.99(d，J＝7.7Hz，1H)，5.93-5.65(m，2H)，4.35(br.s.，2H)，2.99-2.64(m，4H)，2.33(s，3H)。
实施例2
Figure GPA0000254624350000161
实施例2的制备：
Figure GPA0000254624350000171
步骤A：将2-二乙氧基磷酰基乙酸乙酯(295.93毫克，1.32毫摩尔，261.88微升)溶解于四氢呋喃(6毫升)中，冷却至0摄氏度后，一次性加入钠氢(52.80毫克，1.32毫摩尔)。反应混合物在0摄氏度下搅拌15分钟后滴加至另一悬浮液(将6-碘-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-甲醛(300毫克，1.10毫摩尔)分散在四氢呋喃(6毫升)并冷却至零下10至15摄氏度)中。反应混合物在零下10-15摄氏度下搅拌15分钟后，倒入饱和氯化铵水溶液(20毫升)中淬灭，并用二氯甲烷(20毫升×3)萃取。合并的有机相用盐水(30毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，并减压浓缩。剩余物用硅胶柱纯化(洗脱机：二氯甲烷/乙酸乙酯＝10/1)，得到(E)-3-(6碘-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基)丙-2-烯酸乙酯(330毫克，收率：87.43％)。
步骤B：将(E)-3-(6碘-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基)丙-2-烯酸乙酯(330毫克，961.76微摩尔)，[2-(6-甲基-2-吡啶基)-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-3-基]硼酸(268.84毫克，1.11毫摩尔)，碳酸钠(305.81毫克，2.89毫摩尔)，[1，1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯.二氯甲烷(39.27毫克，48.09微摩尔)，双环己基膦-2’，6’-二甲氧基联苯(19.74毫克，48.09微摩尔)和[2-(2-氨基苯基)苯基]-氯-钯；环己基-[2-(2，6-二甲氧基苯基)苯基]膦(34.65毫克，48.09微摩尔)加入到二氧六环(10毫升)和水(2毫升)的混合溶剂中。反应混合物用氮气置换3次，然后加热至90-100摄氏度并搅拌2小时。将反应混合物倒入水(20毫升)中淬灭，并用二氯甲烷(200毫升×3)萃取。合并的有机相用盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用制备硅胶板纯化(展开剂：二氯甲烷/甲醇＝30/1)，得到(E)-3-[6-[2-(6-甲基-2-吡啶基)-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-3-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯酸乙酯(359毫克，收率：81.57％)。
步骤C：将(E)-3-[6-[2-(6-甲基-2-吡啶基)-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-3-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯酸乙酯(359.00毫克，866.19微摩尔)溶解于四氢呋喃(6毫升)和水(2毫升)的混合溶剂中，然后一次性加入一水合氢氧化锂(109.04毫克，2.6毫摩尔)。反应混合物在15-20摄氏度下搅拌12小时，然后用水(15毫升)稀释并用稀盐酸(1摩尔/升)调节pH至5-6，然后用二氯甲烷(20毫升×1)萃取。有机相用盐水(30毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到(E)-3-[6-[2-(6-甲基-2-吡啶基)-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-3-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯酸(330毫克，收率：98.59％)。
步骤D：将(E)-3-[6-[2-(6-甲基-2-吡啶基)-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-3-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯酸(65毫克，168.22微摩尔)，甲胺盐酸盐(22.72毫克，336.44微摩尔)，HATU(127.92毫克，336.44微摩尔)和三乙胺(68.09毫克，672.88微摩尔，93.27微升)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(2毫升)中。反应混合物在15-20摄氏度下搅拌12小时，直接用甲醇(2毫升)稀释后，经高效液相制备色谱法纯化(柱子：Phenomenex Gemini 150*25毫米*10微米；流动相：[水(0.05％氨水v/v)-乙腈]；梯度：21％-51％，15分钟)得到实施例2(27.79毫克，收率：41.36％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.67(s，1H)，8.43(d，J＝4.6Hz，1H)，7.93-7.80(m，2H)，7.68-7.61(m，2H)，7.60-7.49(m，2H)，7.02(dd，J＝1.6，6.8Hz，1H)，4.29(d，J＝9.0Hz，2H)，2.84-2.72(m，2H)，2.69-2.57(m，5H)，1.99(s，3H)。
实施例3至5均可参照实施例2的制备流程制得。
实施例3
Figure GPA0000254624350000181
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.67(s，1H)，8.48(brt，J＝5.3Hz，1H)，7.95-7.78(m，2H)，7.69-7.46(m，4H)，7.02(dd，J＝1.6，6.7Hz，1H)，4.29(br d，J＝7.5Hz，2H)，3.26-3.08(m，2H)，2.81-2.58(m，4H)，1.99(s，3H)，1.04(t，J＝7.2Hz，3H)。
实施例4
Figure GPA0000254624350000182
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.66(s，1H)，8.53(d，J＝4.8Hz，1H)，8.14(s，1H)，7.89-7.81(m，2H)，7.69-7.61(m，2H)，7.60-7.48(m，2H)，7.06-7.00(m，1H)，4.30(d，J＝8.9Hz，2H)，2.83-2.73(m，3H)，2.66-2.60(m，2H)，1.99(s，3H)，0.65(d，J＝5.6Hz，2H)，0.46(d，J＝2.8Hz，2H)。
实施例5
Figure GPA0000254624350000191
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.67(s，1H)，8.50(t，J＝5.6Hz，1H)，7.93(d，J＝15.6Hz，1H)，7.83(d，J＝9.2Hz，1H)，7.69-7.61(m，2H)，7.59-7.49(m，2H)，7.02(dd，J＝1.8，6.7Hz，1H)，4.69(t，J＝5.5Hz，1H)，4.34-4.24(m，2H)，3.43(q，J＝5.9Hz，2H)，3.21(d，J＝3.1Hz，2H)，2.83-2.73(m，2H)，2.62(quin，J＝7.2Hz，2H)，1.99(s，3H)。
实施例6
中间体6-4的制备：
Figure GPA0000254624350000192
步骤A：将1-四氢吡喃-2-基-5-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧硼戊环-2-基)吡唑(10.96克，39.41毫摩尔)，2-溴-6-甲基-吡啶(6.00克，34.88毫摩尔，3.97毫升)，[1，1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(1.28克，1.74毫摩尔)和碳酸钠(11.09克，104.64毫摩尔)加入到二氧六环(200.00毫升)和水(40.00毫升)的混合溶剂中。反应混合物用氮气置换3次，然后加热至80-90摄氏度并搅拌3小时，随后倒入水(200毫升)中淬灭，并用乙酸乙酯(180毫升×2)萃取。合并的有机相用食盐水(200毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用硅胶柱纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10/1-5/1)得到2-甲基-6-(2-四氢吡喃-2-基吡唑-3-基)吡啶(4.10克，粗品)。产品经核磁鉴定为粗品。
步骤B：将2-甲基-6-(2-四氢吡喃-2-基吡唑-3-基)吡啶(2.10克，粗品)溶解于乙酸(20.00毫升)中，然后一次性加入NIS(2.04克，9.06毫摩尔)。混合物加热至70-80摄氏度并搅拌1小时，随后倒入饱和碳酸氢钠水溶液(50毫升)中淬灭，然后用乙酸乙酯(50毫升×3)萃取。合并的有机相用盐水(30毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用硅胶柱纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10/1)得到2-(4-碘-2-四氢吡喃-2-基-吡唑-3-基)-6-甲基吡啶(1.60克，收率：50.22％)。
步骤C：将2-(4-碘-2-四氢吡喃-2-基-吡唑-3-基)-6-甲基吡啶(500.00毫克，1.35毫摩尔)和硼酸三异丙酯(672.82毫克，3.58毫摩尔，820.51微升)溶解于四氢呋喃(10毫升)中。反应混合物冷却至零下78摄氏度后，滴加正丁基锂(2.5M，1.40毫升)，并在零下78-60摄氏度下搅拌30分钟。将该反应混合物倒入饱和氯化铵溶液(20毫升)中淬灭并搅拌10分钟，然后用乙酸乙酯(20毫升×2)萃取。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物用制备硅胶板纯化(展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/1)得到[5-(6-甲基-2-吡啶基)-1-四氢吡喃-2-基-吡唑-4-基]硼酸(200.00毫克，收率：51.60％)。
实施例6的制备：
Figure GPA0000254624350000201
步骤A：将[5-(6-甲基-2-吡啶基)-1-四氢吡喃-2-基-吡唑-4-基]硼酸(200.00毫克，696.57微摩尔)，(E)-3-(6碘-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基)丙-2-烯酸乙酯(239.01毫克，696.57微摩尔)，碳酸钠(221.49毫克，2.09毫摩尔)，[1，1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(50.97毫克，69.66微摩尔)，双环己基膦-2’，6’-二甲氧基联苯(28.60毫克，69.66微摩尔)和[2-(2-氨基苯基)苯基]-氯-钯；环己基-[2-(2，6-二甲氧基苯基)苯基]膦(50.20毫克，69.66微摩尔)加入到二氧六环(3毫升)和水(1毫升)的混合溶剂中。用氮气置换3次，然后加热至80-90摄氏度并搅拌3小时。反应混合物倒入水(30毫升)中淬灭，然后用乙酸乙酯(30毫升×2)萃取。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用制备硅胶板纯化(展开剂：二氯甲烷/甲醇＝30/1)得到(E)-3-[6-[5-(6-甲基-2-吡啶基)-1-四氢吡喃-2-基-吡唑-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯酸乙酯(250.00毫克，收率：78.27％)。
步骤B：将(E)-3-[6-[5-(6-甲基-2-吡啶基)-1-四氢吡喃-2-基-吡唑-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯酸乙酯(250.00毫克，545.24微摩尔)溶解于乙醇(3毫升)中，然后加入盐酸二氧六环(4M，5.01毫升)。反应混合物在15-20摄氏度下搅拌12小时后，减压浓缩除去溶剂，再用饱和碳酸氢钠溶液(20毫升)调节pH至8-9，然后用二氯甲烷(20毫升×2)萃取。合并的有机相用盐水(30毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到(E)-3-[6-[5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑1-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯酸乙酯(230.00毫克，粗品)。
步骤C：将(E)-3-[6-[5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑1-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯酸乙酯(230.00毫克，粗品)溶接于四氢呋喃(5毫升)中。反应混合物冷却至零下20摄氏度后加入钠氢(27.03毫克，675.75微摩尔)，随后在零下20摄氏度下搅拌30分钟。接着加入3-氰基苄溴(132.47毫克，675.75微摩尔)。反应混合物升温至15-20摄氏度并继续搅拌4小时，然后倒入水(20毫升)中淬灭，并用稀盐酸(1M)调节pH至5-6，用乙酸乙酯(20毫升×2)萃取。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物经制备硅胶板纯化(展开剂：二氯甲烷/甲醇＝30/1)得到(E)-3-[6-[1-[(3-苯腈)甲基]-3-(6-甲基-2-吡啶基)吡唑-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯酸乙酯(150.00毫克，收率：46.67％)。
步骤D：将(E)-3-[6-[1-[(3-苯腈)甲基]-3-(6-甲基-2-吡啶基)吡唑-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯酸乙酯(150.00毫克，306.42微摩尔)溶解于四氢呋喃(3毫升)中，然后一次性加入一水合氢氧化锂(38.57毫克，919.26微摩尔)。反应混合物在15-20摄氏度下搅拌12小时，然后倒入水(10毫升)中淬灭，并用稀盐酸(1M)调节pH至5-6，再用二氯甲烷(20毫升×2)萃取。合并的有机相用盐水(30毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到(E)-3-[6-[1-[(3-苯腈)甲基]-3-(6-甲基-2-吡啶基)吡唑-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯酸(130.00毫克，收率：91.94％)。
步骤E：将(E)-3-[6-[1-[(3-苯腈)甲基]-3-(6-甲基-2-吡啶基)吡唑-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯酸(130.00毫克，281.71微摩尔)，HATU(214.23毫克，563.42微摩尔)和三乙胺(57.01毫克，563.42微摩尔，78.10微升)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(2毫升)中。反应混合物在15-20摄氏度下搅拌1小时后，加入3毫升氨的四氢呋喃溶液(0摄氏度下饱和)。反应混合物继续在15-20摄氏度下搅拌30分钟，压浓缩除去溶剂，然后用甲醇(2毫升)稀释。剩余物经高效液相制备色谱法纯化(柱子：Phenomenex Synergi C18150*30毫米*4微米；流动相：[水(0.225％甲酸)-乙腈]；梯度：15％-45％，12分钟)得到实施例6(53.00毫克，收率：40.32％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.69(s，1H)，8.25(s，1H)，7.93-7.81(m，5H)，7.67-7.52(m，6H)，7.24(br.s.，1H)，7.04(dd，J＝2.0，6.2Hz，1H)，5.61(s，2H)，1.98(s，3H)。
实施例7可参照实施例6的制备流程制得。
实施例7
Figure GPA0000254624350000211
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.67(s，1H)，8.41-8.36(m，1H)，8.38(s，1H)，8.09(s，1H)，7.89-7.78(m，3H)，7.69-7.58(m，3H)，7.51(d，J＝15.7Hz，1H)，7.16(br s，1H)，7.02(d，J＝6.8Hz，1H)，4.86(quin，J＝6.9Hz，1H)，2.22-2.16(m，2H)，2.14-2.04(m，2H)，1.97(s，3H)，1.92-1.83(m，2H)，1.76-1.66(m，2H)。
实施例8
Figure GPA0000254624350000221
中间体8-2的制备：
Figure GPA0000254624350000222
步骤A：将[5-(6-甲基-2-吡啶基)-1-四氢吡喃-2-基-吡唑-4-基]硼酸(470.00毫克，1.64毫摩尔)，(E)-3-(6-碘-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基)丙-2-烯腈(485.55毫克，1.64毫摩尔)，碳酸钠(521.47毫克，4.92毫摩尔)，[1，1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(36.00毫克，49.20微摩尔)，双环己基膦-2’6’-二甲氧基联苯(6.73毫克，16.40微摩尔)和[2-(2-氨基苯基)苯基]-氯-钯；环己基-[2-(2，6-二甲氧基苯基)苯基]膦(11.82毫克，16.40微摩尔)加入到二氧六环(20毫升)和水(5毫升)的混合溶剂中。反应混合物用氮气置换3次后加热至80-90摄氏度并搅拌12小时，然后倒入水(30毫升)中淬灭，并用乙酸乙酯(30毫升×2)萃取。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。得到的粗品在石油醚(12毫升)和乙酸乙酯(4毫升)的混合溶剂中搅拌30分钟后过滤。收集固体，并减压浓缩干燥得到(E)-3-[6-[5-(6-甲基-2-吡啶基)-1-四氢吡喃-2-基-吡唑-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯腈(554.00毫克，收率：82.32％)。
步骤B：将(E)-3-[6-[5-(6-甲基-2-吡啶基)-1-四氢吡喃-2-基-吡唑-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯腈(554.00毫克，1.35毫摩尔)溶解于甲醇(5毫升)中，然后加入盐酸二氧六环(4摩尔/升，5毫升)。反应混合物在15-20摄氏度下搅拌12小时，随后减压浓缩除去溶剂，用饱和碳酸氢钠溶液(20毫升)调节pH至8-9，再用二氯甲烷(20毫升×2)萃取。合并的有机相用盐水(30毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到(E)-3-[6-[5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]并-2-烯酸甲酯(500.00毫克，粗品)。
实施例8的制备：
Figure GPA0000254624350000231
步骤A：将(E)-3-[6-[5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]并-2-烯酸甲酯(260.00毫克，粗品)溶解于四氢呋喃(4毫升)中。反应混合物冷却至0摄氏度，一次性加入钠氢(31.75毫克，793.63微摩尔)，然后在0摄氏度下搅拌30分钟，随后加入碘代异丙烷(134.91毫克，793.63微摩尔)。反应混合物在15-20摄氏度下搅拌12小时。LCMS监测显示(E)-3-[6-[5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]并-2-烯酸甲酯消耗完全，但是未生成目标产物(MS(ESI)m/z：347[M+H+])。混合物减压浓缩除去四氢呋喃，将剩余物溶解于N，N-二甲基甲酰胺(3毫升)中，然后分别加入2-碘代异丙烷(613.22毫克，3.61毫摩尔，360.72微升)和碳酸钾(498.58毫克，3.61毫摩尔)。反应混合物在15-20摄氏度下继续搅拌12小时。LCMS监测显示反应完成。将混合物倒入水(20毫升)中淬灭，然后用乙酸乙酯(30毫升×3)萃取。合并的有机相用盐水(60毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物用制备硅胶板纯化(展开剂：二氯甲烷/甲醇＝30/1)得到(E)-3-[6-[1-异丙基-3-(6-甲基-2-吡啶基)吡唑-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯酸异丙酯(100.00毫克，粗品)。
步骤B：将(E)-3-[6-[1-异丙基-3-(6-甲基-2-吡啶基)吡唑-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯酸异丙酯(100.00毫克，粗品)溶解于四氢呋喃(1毫升)，甲醇(1毫升)和水(1毫升)的混合溶剂中，然后一次性加入一水合氢氧化锂(29.24毫克，696.87微摩尔)。反应混合物在15-20摄氏度下搅拌3小时，然后用稀盐酸(5％)调节pH至5-6，并用乙酸乙酯(20毫升×3)萃取。合并的有机相用盐水(30毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到(E)-3-[6-[1-异丙基-3-(6-甲基-2-吡啶基)吡唑-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯酸(100.00毫克，粗品)。
步骤C：将(E)-3-[6-[1-异丙基-3-(6-甲基-2-吡啶基)吡唑-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯酸(100.00毫克，粗品)溶解于四氢呋喃(3毫升)中，然后一次性分别加入HATU(195.78毫克，514.90微摩尔)和三乙胺(52.10毫克，514.90微摩尔，71.37微升)。反应混合物在15-20摄氏度下搅拌1小时后，加入3毫升氨的四氢呋喃溶液(0摄氏度下饱和)。反应混合物在15-20摄氏度下继续搅拌12小时，经减压浓缩除去溶剂并用甲醇(3毫升)稀释，然后用制备高效液相色谱法纯化(柱子：Phenomenex Synergi C18 150*30毫米*4微米；流动相：[水(0.225％甲酸)-乙腈]；梯度：10％-40％，12分钟)得到实施例8(30.50毫克，收率：30.08％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.68(s，1H)，8.10(s，1H)，7.89-7.81(m，3H)，7.68-7.59(m，3H)，7.51(d，J＝15.7Hz，1H)，7.18(br s，1H)，7.02(dd，J＝1.2，7.1Hz，1H)，4.67(quin，J＝6.7Hz，1H)，1.97(s，3H)，1.55(d，J＝6.7Hz，6H)。
实施例9
Figure GPA0000254624350000241
实施例9的制备：
Figure GPA0000254624350000242
步骤A：将(E)-3-[6-[5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]并-2-烯酸甲酯(200.00毫克，粗品)溶解于四氢呋喃(5毫升)中，冷却至0摄氏度后，一次性加入钠氢(24.42毫克，610.49微摩尔)。反应混合物在0摄氏度下搅拌30分钟，然后加入1-(溴甲基)-3-(二氟甲基)苯(134.94毫克，610.49微摩尔)，随后升温至15-20摄氏度并继续搅拌5小时。反应混合物倒入水(20毫升)中淬灭，然后用乙酸乙酯(20毫升×3)萃取。合并的有机相用盐水(30毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到(E)-3-[6-[1-[[3-(二氟甲基)苯基]甲基]-3-(6-甲基-2-吡啶基)吡唑-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯酸甲酯(150.00毫克，粗品)。
步骤B：将(E)-3-[6-[1-[[3-(二氟甲基)苯基]甲基]-3-(6-甲基-2-吡啶基)吡唑-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯酸甲酯(150.00毫克，粗品)溶解于四氢呋喃(1毫升)，甲醇(1毫升)和水(1毫升)的混合溶剂中，然后一次性加入一水合氢氧化锂(37.73毫克，899.10微摩尔)。反应混合物在15-20摄氏度下搅拌10分钟，然后用稀盐酸(0.5M)调节pH至5-6，此时有固体析出。过滤并收集固体得到(E)-3-[6-[1-[[3-(二氟甲基)苯基]甲基]-3-(6-甲基-2-吡啶基)吡唑-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯酸(120.00毫克，收率：60.34％)。
步骤C：将(E)-3-[6-[1-[[3-(二氟甲基)苯基]甲基]-3-(6-甲基-2-吡啶基)吡唑-4-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯酸(120.00毫克，180.83微摩尔)，HATU(187.59毫克，493.36微摩尔)和三乙胺(49.92毫克，493.36微摩尔68.38微升)溶解于四氢呋喃(3毫升)中。反应混合物在15-20摄氏度下搅拌1小时，然后加入3毫升氨的四氢呋喃溶液(0摄氏度下饱和)。反应混合物在15-20摄氏度下搅拌12小时，然后倒入水(15毫升)中淬灭，用乙酸乙酯(20毫升×3)萃取。合并的有机相用盐水(50毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用高效液相制备色谱法纯化(柱子：Phenomenex Synergi C18 150*30毫米*4微；流动相：[水(0.225％甲酸)-乙腈]；梯度15％-45％，12分钟)得到实施例9(47.85毫克，收率：39.81％)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.70(s，1H)，8.26(s，1H)，7.95-7.83(m，3H)，7.67-7.51(m，8H)，7.28(d，J＝11.2Hz，1H)，7.07-6.96(m，1H)，7.12(s，1H)，5.61(s，2H)，1.97(s，3H)。
实施例10
Figure GPA0000254624350000251
中间体10-3的制备：
Figure GPA0000254624350000252
步骤A：将6-氯吡啶-2-羧酸乙酯(500.00毫克，2.69毫摩尔)，乙烯基三丁基锡(887.12毫克，2.80毫摩尔，813.87微升)和四(三苯基膦)钯(155.42毫克，134.50微摩尔)溶解于甲苯(10毫升)中。反应混合物用氮气置换3次，然后加热至110-120摄氏度并搅拌3小时。冷却后倒入饱和氟化钾溶液(30毫升)中并搅拌30分钟。将该混合物过滤，滤饼用乙酸乙酯(10毫升×3)洗涤。滤液用乙酸乙酯(30毫升×2)萃取。合并的有机相用盐水(50毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用硅胶柱纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10/1)得到6-乙烯基吡啶-2-羧酸乙酯(364.00毫克，收率：76.21％)。1H NMR(400MHz，CHLOROFORM-d)8.00(dd，J＝0.8，7.8Hz，1H)，7.81(t，J＝7.8Hz，1H)，7.61(dd，J＝0.9，7.9Hz，1H)，6.96(dd，J＝10.9，17.6Hz，1H)，6.25(dd，J＝0.6，17.6Hz，1H)，5.67-5.56(m，1H)，4.50(q，J＝7.2Hz，2H)，1.46(t，J＝7.2Hz，3H)。
步骤B：将6-乙烯基吡啶-2-羧酸乙酯(364.00毫克，2.05毫摩尔)溶解于乙醇(4毫升)中，然后一次性加入钯碳(40.00毫克，10％)。反应混合物用氢气置换3次，然后在15psi氢气压力，15-20摄氏度下搅拌3小时。随后过滤除去钯碳，滤液减压浓缩的到6-乙基吡啶-2-羧酸乙酯(320.00毫克，收率：87.10％)。1H NMR(400MHz，CHLOROFORM-d)7.95(d，J＝7.7Hz，1H)，7.75(t，J＝7.8Hz，1H)，7.37(d，J＝7.8Hz，1H)，4.49(q，J＝7.1Hz，2H)，2.96(q，J＝7.7Hz，2H)，1.44(t，J＝7.2Hz，3H)，1.34(t，J＝7.7Hz，3H)。
实施例10可参照实施例1的制备流程制得
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.66(s，1H)，7.81-7.91(m，3H)，7.61-7.72(m，2H)，7.57(d，J＝9.03Hz，1H)，7.49(d，J＝15.69Hz，1H)，7.21(br s，1H)，6.96-7.03(m，1H)，4.21-4.37(m，2H)，2.70-2.92(m，2H)，2.62(q，J＝7.18Hz，2H)，2.27(q，J＝7.53Hz，2H)，0.48(t，J＝7.53Hz，3H)。
实施例11
Figure GPA0000254624350000261
中间体的11-2制备：
Figure GPA0000254624350000262
步骤A：在0摄氏度搅拌下，将三正丁基氯化稀(72.09毫升，268.00毫摩尔)逐滴加入(不少于30分钟)乙炔基氯化镁的四氢呋喃溶液(0.5摩尔/升，800.00毫升)。反应混合物在30摄氏度下搅拌0.5小时，然后升温至35摄氏度并搅拌1小时。随后再冷却到0摄氏度，加入氯化铵水溶液(800毫升)淬灭，然后用石油醚(800毫升×2)萃取，合并的有机相用盐水(400毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到2-氯乙炔三正丁基锡(84.00克，收率：60.08％)。1H NMR(400MHz，CHLOROFORM-d)δ：1.54-1.67(m，6H)，1.32-1.35(m，6H)，0.88-1.04(m，15H)。
中间体11-6的制备：
Figure GPA0000254624350000263
步骤A：将L-脯氨酸(50克，434.29毫摩尔)和亚硝酸钠(41.95克，608.01毫摩尔)溶解于水中，然后在零下10摄氏度至0摄氏度下滴加浓盐酸(50毫升)，并控制温度不高于10摄氏度。加料完成后，反应混合物在0摄氏度下搅拌0.5小时，然后升至25摄氏度并搅拌16小时。混合物用水(200毫升)稀释，然后用甲基叔丁基醚(300毫升×5)萃取，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到N-硝基-L-脯氨酸(57.00克，粗品)。
步骤B：将N-硝基-L-脯氨酸(57.00克，粗品)溶解在甲苯(90毫升)中，冷却至0摄氏度，逐滴加入三氟乙酸酐(82.51毫升，593.21毫摩尔)，一个小时滴完。反应混合物在25摄氏度下搅拌2小时。将碳酸钾(87.45克，632.76毫摩尔)分散于水(50毫升)和二氯甲烷(100毫升)中，在0摄氏度下将上一反应液逐滴加入到该溶液中，一小时滴完。加料完成后，混合物在25摄氏度下搅拌1小时。混合物用二氯甲烷(100毫升×5)萃取。合并的有机相用盐水(200毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物用硅胶柱纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝0/1)得到5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-C]恶二唑-7-鎓-3-酚盐(39.00克，收率：78.20％)。
步骤C：在氮气保护下，将5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-C]恶二唑-7-鎓-3-酚盐(23.5克，186.35毫摩尔)溶解在二甲苯(120毫升)中，然后加入2-氯乙炔三正丁基锡(84.67克，242.26毫摩尔)。反应混合物在150摄氏度下搅拌40小时，直接经硅胶柱纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/0-20/1)得到三丁基(5，6-二氢-4H-吡咯[1，2-b]吡唑-2-基)锡(13.00克，收率：17.56％)。
实施例11的制备：
Figure GPA0000254624350000271
步骤A：将三丁基(5，6-二氢-4H-吡咯[1，2-b]吡唑-2-基)锡(1.49克，3.76毫摩尔)，2-溴-4，6-二甲基-吡啶(700.00毫克，3.76毫摩尔)，氯化锂(318.98毫克，7.52毫摩尔)和四(三苯基膦)钯(434.77毫克，376.24微摩尔)加入到二氧六环(20毫升)中。反应混合物用氮气置换3次，然后加热至100-110摄氏度并搅拌12小时。LCMS监测显示三丁基(5，6-二氢-4H-吡咯[1，2-b]吡唑-2-基)锡未消耗完全。反应物在100-110摄氏度下继续搅拌12小时。再次LCMS监测显示三丁基(5，6-二氢-4H-吡咯[1，2-b]吡唑-2-基)锡未消耗完全。反应物在100-110摄氏度下继续搅拌12小时。最后经LCMS监测反应完成。将反应混合物倒入水(50毫升)中淬灭，然后用乙酸乙酯(50毫升×3)萃取。合并的有机相用盐水(100毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用制备硅胶板纯化(展开剂：二氯甲烷/甲醇＝30/1)得到2-(4，6-二甲基-2-吡啶基)-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑(649.00毫克，收率：63.81％，纯度：78.847％)。
步骤B：将2-(4，6-二甲基-2-吡啶基)-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑(150.00毫克，703.30微摩尔)和NBS(137.69毫克，773.63微摩尔)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(3毫升)中。反应混合物在15-20摄氏度下搅拌2小时后，倒入水(15毫升)中淬灭，用乙酸乙酯(20毫升×3)萃取。合并的有机相用盐水(15毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用制备硅胶板纯化(展开剂：二氯甲烷/甲醇＝30/1)得到3-溴-2-(4，6-二甲基-2-吡啶基)-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑(150.00毫克，收率：73.00％)。
步骤C：将3-溴-2-(4，6-二甲基-2-吡啶基)-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑(150.00毫克，513.40微摩尔)和硼酸三异丙酯(255.87毫克，1.36毫摩尔，312.04微升)溶解于四氢呋喃(4毫升)中。混合物冷却至零下78至零下60摄氏度，然后滴加正丁基锂(2.5M，533.94微升)。反应混合物升至15-20摄氏度并搅拌30分钟，随后倒入饱和氯化铵溶液(20毫升)淬灭，并用乙酸乙酯(20毫升×2)萃取。合并的有机相用盐水(30毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用制备硅胶板纯化(展开剂：二氯甲烷/甲醇＝30/1)得到[2-(4，6-二甲基-2-吡啶基)-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-3-基]硼酸(90.00毫克，收率：68.18％)。
步骤D：将(E)-3-(6-碘-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基)丙-2-烯腈(100.00毫克，337.76微摩尔)，[2-(4，6-二甲基-2-吡啶基)-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-3-基]硼酸(86.84毫克，337.76微摩尔)，碳酸钠(107.40毫克，1.01毫摩尔)，[1，1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(7.41毫克，10.13微摩尔)，双环己基膦-2’6’-二甲氧基联苯(1.39毫克，3.38微摩尔)和[2-(2-氨基苯基)苯基]-氯-钯；环己基-[2-(2，6-二甲氧基苯基)苯基]膦(12.17毫克，16.89微摩尔)加入到二氧六环(20毫升)和水(4毫升)的混合溶剂中。反应混合物用氮气置换3次，然后加热至80-90摄氏度并搅拌12小时，然后倒入水(30毫升)中淬灭，并用乙酸乙酯(30毫升×2)萃取。合并的有机相用盐水(40毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用制备硅胶板纯化(展开剂：二氯甲烷/甲醇＝30/1)得到(E)-3-[6-[2-(4，6-二甲基-2-吡啶基)-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-3-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯腈(80.00毫克，粗品)。
步骤E：将(E)-3-[6-[2-(4，6-二甲基-2-吡啶基)-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-3-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯腈(80.00毫克，粗品)溶解于水(1毫升)和二甲基亚砜(2毫升)的混合溶剂中，然后一次性分别加入如氢氧化钠(10.49毫克，262.18微摩尔)和双氧水(74.31毫克，655.45微摩尔)。反应混合物在15-20摄氏度下搅拌2小时，然后倒入水(20毫升)中淬灭，并用二氯甲烷(20毫升×3)萃取。合并的有机相用盐水(50毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物先经制备硅胶板纯化(展开剂：二氯甲烷/甲醇＝30/1)，得到的固体经LCMS监测不纯。粗品经制备高效液相法再次纯化(柱子：Phenomenex Synergi C18 150*30毫米*4微米；流动相：[水(0.225％甲酸)-乙腈]；梯度：10％-40％，12分钟)得到实施例11(12.00毫克，甲酸盐，收率：22.90％)。1H NMR(400MHz，METHANOL-d4)δ8.53(s，1H)，8.21(br s，1H)，8.00(d，J＝15.8Hz，1H)，7.76(d，J＝9.2Hz，1H)，7.68-7.56(m，2H)，7.38(s，1H)，6.99(s，1H)，4.34(t，J＝6.7Hz，2H)，2.97-2.89(m，2H)，2.80-2.69(m，2H)，2.31(s，3H)，2.17(s，3H)。
实施例12
Figure GPA0000254624350000291
中间体12-3的制备：
Figure GPA0000254624350000292
步骤A：将三丁基(5，6-二氢-4H-吡咯[1，2-b]吡唑-2-基)锡(2.69克，6.78毫摩尔)，6-溴-3-氯-2-甲基-吡啶(700.00毫克，3.39毫摩尔)，氯化锂(287.43毫克，6.78毫摩尔)和四(三苯基膦)钯(391.77毫克，339.00微摩尔)加入到二氧六环(30毫升)中。反应混合物用氮气置换3次，然后加热至100-110摄氏度并搅拌12小时。将混合物倒入水(50毫升)中淬灭，然后用乙酸乙酯(50毫升×3)萃取。合并的有机相用盐水(100毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用硅胶柱纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10/1至5/1)得到2-(5-氯-6-甲基-2-吡啶基)-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑(600.00毫克，收率：67.19％)。1H NMR(400MHz，CHLOROFORM-d)7.65(q，J＝8.4Hz，2H)，6.59(s，1H)，4.22(t，J＝7.2Hz，2H)，2.95(t，J＝7.3Hz，2H)，2.71-2.59(m，5H)。
步骤B：将2-(5-氯-6-甲基-2-吡啶基)-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑(200.00毫克，855.80微摩尔)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(3毫升)中，然后一次性加入NIS(211.79毫克，941.38微摩尔)。反应混合物在15-20摄氏度下搅拌12小时后过滤，收集滤饼并减压浓缩干燥得到2-(5-氯-6-甲基-2-吡啶基)-3碘-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑(264.00毫克，收率：85.79％)。
实施例12的制备：
Figure GPA0000254624350000293
步骤A：将(E)-3-(6-碘-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基)丙-2-烯腈(200.00毫克，675.52微摩尔)，双联频哪醇硼酸酯(205.85毫克，810.62微摩尔)，[1，1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(49.43毫克，67.55微摩尔)和乙酸钾(132.59毫克，1.35毫摩尔)加入到二氧六环(20毫升)中。反应混合物用氮气置换3次，然后加热至100-110摄氏度并搅拌12小时。该反应未经处理，溶液直接用于下一步反应。
步骤B：向步骤A中的混合物中加入2-(5-氯-6-甲基-2-吡啶基)-3碘-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑(121.43毫克，337.69微摩尔)，碳酸钠(107.38毫克，1.01微摩尔)，[1，1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(24.71毫克，33.77微摩尔)，双环己基膦-2’6’-二甲氧基联苯(13.86毫克，33.77微摩尔)，[2-(2-氨基苯基)苯基]-氯-钯；环己基-[2-(2，6-二甲氧基苯基)苯基]膦(24.33毫克，33.77微摩尔)，二氧六环(4.00毫升)和水(4.00毫升)，用氮气置换3次后，加热至90-100摄氏度并搅拌2小时。将反应混合物倒入水(30毫升)中淬灭，然后用乙酸乙酯(30毫升×2)萃取。合并的有机相用盐水(50毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用制备硅胶板纯化(展开剂：二氯甲烷/甲醇＝30/1)得到(E)-3-[6-[2-(5-氯-6-甲基-2-吡啶基)-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-3-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯腈(120.00毫克，收率：88.43％)。
步骤C：将(E)-3-[6-[2-(5-氯-6-甲基-2-吡啶基)-5，6-二氢-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-3-基]-[1，2，4]***并[1，5-a]吡啶-5-基]丙-2-烯腈(120.00毫克，298.62微摩尔)溶解于二甲基亚砜(2毫升)和水(1毫升)的混合溶剂中，然后依次加入双氧水(338.54毫克，2.99毫摩尔)和氢氧化钠(2摩尔/升，597.24微升)。反应混合物在15-20摄氏度下搅拌12小时。LCMS监测反应未完成。将反应混合物加热至40-50摄氏度并搅拌2小时。LCMS监测显示反应完成。将该混合物倒入水(10毫升)中淬灭，然后用二氯甲烷(30毫升×2)萃取。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用高效液相制备色谱法纯化(柱子：Phenomenex Synergi C18 150*30毫米*4微米；流动相：[水(0.225％甲酸)-ACN]；梯度：24％-54％，12分钟)得到实施例12(21.46毫克，收率：15.72％)。1H NMR(400MHz，METHANOL-d4)δ8.56(s，1H)，8.06(d，J＝15.6Hz，1H)，7.79(d，J＝9.0Hz，1H)，7.73-7.61(m，4H)，4.34(br d，J＝6.0Hz，2H)，2.94-2.85(m，2H)，2.73(br s，2H)，2.17(s，3H)。
实验例1：TGFβ-R1体外抑制活性实验
实验方法：
1)待测化合物：采用10个梯度点每个梯度稀释三倍的方法检测IC50，起始浓度为5μM。
2)阳性参照化合物LDN193189采用10个梯度点每个梯度稀释三倍的方法检测IC50，起始浓度为20μM。
3)反应体系中含有10μM的ATP。
4)样品最高浓度条件下酶活百分比(与溶剂组相比)低于65％时进行曲线拟合计算IC50值。
实验结果：见表1。
结论：本发明化合物具有优异的体外抑制活性。
表1
样品 TGF-βR1 IC50 样品 TGF-βR1 IC50
实施例1 A 实施例7 B
实施例2 B 实施例8 B
实施例3 B 实施例9 B
实施例4 B 实施例10 B
实施例5 B 实施例11 C
实施例6 B 实施例12 C
【注】IC50值的范围如下所示：50nM≥A≥1nM；500nM≥B＞50nM；C＞500nM。
实验例2：NIH/3T3小鼠胚胎细胞的增殖抑制实验
实验原理：
Promega(普洛麦格)公司的Luminescent Cell Viability Assay(
Figure GPA0000254624350000311
方法，即ATP荧光活性检测分析)，将化合物加入细胞培养板中孵育。在检测当天加入检测细胞内ATP含量的底物缓冲液。轻微震荡并1000rpm离心1分钟。静置10分钟后检测。检测板使用PerkinElmer(珀金埃尔默)公司的易美逊(Envision)多功能酶标仪进行分析，分析模式为荧光检测，数据用化学发光信号400-700nm的读数来表示。
实验步骤：
1)待细胞生长覆盖率达70％左右时，先用10mL无钙、镁离子的杜氏磷酸缓冲液(D-PBS)润洗细胞层，加入2mL 0.25％胰酶-EDTA消化液，并将细胞培养瓶置于37℃的CO2二氧化碳培养箱孵育3～5分钟，之后加入8mL含有2％FBS DMEM细胞完全培养基，将细胞吹打均匀成单个细胞，并用Vi-cell细胞计数仪计数，稀释NIH/3T3细胞悬液至0.375×105/mL个细胞。
2)于384孔细胞培养板四周加入50μL含有2％的DMEM培养基，向剩余孔中分别加入40μL的细胞悬浮液至每孔1500个细胞，并在显微镜下观察细胞的分布均匀情况，将细胞板放置37℃，5％CO2的细胞培养箱内培养。
3)化合物的稀释，参考化合物的准备。
4)向化合物中间板中手工加入含有1ng/mL TGF-β1的2％胎牛血清的DMEM培养基的混合液于化合物板，每孔20μL。
5)将化合物中间板稍微震荡10秒，1000rpm/min，离心10秒.备用。
6)利用布拉沃(Bravo)液体工作站，转移步骤4、5混合好的液体每孔10uL至已接种好的细胞板中，使其终体积为50μL，TGF-β1最终浓度稀释为0.2ng/mL。1000rpm/min，离心10秒。将板子放置于37℃，5％二氧化碳的培养箱中72小时。化合物的终浓度为：(单位：μM)
30 9.488 3.001 0.949 0.300 0.095 0.030 0.009 0.003
7)将含有化合物的细胞板置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养3天。
8)之后，在细胞板的每孔中加入25μL ATP荧光活性检测液，轻柔振荡1分钟左右，500rpm/min离心30秒左右，避光室温静置10分钟后于Envision仪器中读数。
实验结果：见表2。
表2
样品 NIH3T3细胞抑制IC50 样品 NIH3T3细胞抑制IC50
实施例1 A 实施例6 A
实施例2 B 实施例8 B
实施例3 B 实施例9 A
实施例4 B 实施例10 B
实施例5 C
【注】IC50值的范围如下所示：2μM≥A≥0.5μM；5μM≥B＞2μM；C＞5μM。
结论：本发明化合物优异的NIH3T3细胞增殖抑制活性。
实验例3：与BioXcell-mPD-L1联用，对鼠源直肠癌CT-26细胞皮下移植肿瘤BALB/c小鼠模型的肿瘤细胞增殖抑制实验
实验设计：
下表列举了实施例1，阳性参照化合物LY2157299和BioXcell公司PD-L1单克隆抗体(BioXcell-mPD-L1)受试药单用和联合使用在体内药效实验的动物分组及给药方案，见表3。
表3实验动物分组及给药方案
Figure GPA0000254624350000321
实验方法与步骤：
1)细胞培养
鼠源结肠癌CT-26细胞体外单层培养，培养条件为RPMI1640培养基(洛斯维·帕克纪念研究所1640号培养基)中加10％胎牛血清，37℃ 5％CO2培养。一周两次用胰酶-EDTA进行常规消化处理传代。当细胞饱和度为80％-90％时，收取细胞，计数，接种。
2)肿瘤细胞接种
将0.1mL(1×105)CT-26细胞皮下接种于每只BALB/c小鼠的右后背。接种细胞第二天根据小鼠体重开始分组给药。
3)肿瘤测量和实验指标
实验指标是考察肿瘤生长是否被抑制、延缓或治愈。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
化合物的抑瘤疗效用TGI(％)或肿瘤增殖率T/C(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝【(1-(某处理组给药结束时平均瘤体积-该处理组开始给药时平均瘤体积))/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积-溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)】×100％。
肿瘤增殖率T/C(％)：计算公式如下：T/C％＝T/C×100％(T：治疗组；C：阴性对照组)。
在实验结束后将检测肿瘤重量，并计算T/Cweight百分比，Tweight和Cweight分别表示给药组和溶媒对照组的瘤重。
4)PK样品采集
给药后第20天时，按给药方案进行给药。
将12只小鼠分成4组，分别在最后一次给药后0.25，1，1.5，4，8小时采血；分别在0.25，1，4，8小时处死小鼠采集肿瘤和肝脏。全血置于0.5毫升的EDTA-2K的抗凝管中，7000rpm，4℃，离心10分钟，得到血浆。肿瘤组织置于10毫升的冻存管中。将血浆和肿瘤组织迅速转移到-80℃冰箱中保存。
5)统计分析
统计分析，包括每个组的每个时间点的肿瘤体积的平均值和标准误(SEM)(具体数据见表4)。治疗组在试验结束时给药后第20天表现出最好的治疗效果，因此基于此数据进行统计学分析评估组间差异。两组间比较用T-test进行分析，三组或多组间比较用单因素方差分析法进行分析，如果F值有显著性差异，应用盖姆斯一霍威尔(Games-Howell)法进行检验。如果F值无显著性差异，应用Dunnet(2-sided)法进行分析。用SPSS 17.0进行所有数据分析。p＜0.05认为有显著性差异。
实验结果：
1)死亡率、发病率及体重变化情况
实验动物的体重作为间接测定药物毒性的参考指标。在此模型中所有给药组均未显示有显著性体重下降，无发病或死亡现象。
实施例1、LY2157299和BioXcell-mPD-L1对CT-26细胞皮下异种移植肿瘤雌性BALB/c小鼠模型的体重影响如图1所示。数据点代表组内平均体重，误差线代表标准误(SEM)。
2)肿瘤体积
给予CT-26细胞皮下移植肿瘤雌性BALB/c小鼠模型实施例1，LY2157299和BioXcell-mPD-L1治疗后各组肿瘤体积变化如表4所示。
3)肿瘤生长曲线
CT-26移植瘤模型荷瘤鼠在给予实施例1、LY2157299和BioXcell-mPD-L1后的肿瘤生长曲线如图2所示。数据点代表组内平均肿瘤体积，误差线代表标准误(SEM)。
表4各组不同时间点的瘤体积
Figure GPA0000254624350000341
【注】：a.平均值±SEM。
结论：
本实验评价了实施例1，阳性对照LY2157299和BioXcell-mPD-L1在鼠源结肠癌CT-26移植瘤模型中的体内药效。开始给药后20天，溶剂对照组荷瘤鼠的瘤体积达到2578mm3。实施例1(75mg/kg)和BioXcell-mPD-L1(10mg/kg)联合给药组与溶剂对照组相比具有显著的抑瘤作用(T/C＝38％，TGI＝62.2％，p＝0.012)，瘤体积为975mm3；实施例1(75mg/kg)，LY2157299(75mg/kg)，BioXcell-mPD-L1(10mg/kg)单独给药组和LY2157299(75mg/kg)和BioXcell-mPD-L1(10mg/kg)联合给药组与溶剂对照组相比均未显示有显著的抑瘤作用，瘤体积分别为1331，2186，2218和1381mm3(T/C＝51％，85％，86％和54％，p＝0.071，0.906，0.932和0.089)。
实验例4：鼠源乳腺癌4T1细胞BALB/c小鼠原位移植模型中肿瘤细胞转移抑制实验
实验方法：
1)原位4T1肿瘤模型的建立：
荧光标记的小鼠乳腺癌4T1-Luc细胞经体外培养扩增，细胞收集接种前，小鼠经腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，麻醉的小鼠固定后，用70％酒精消毒腹部皮肤，将100ul磷酸盐缓冲液(含0.5×106个4T1-luc2细胞)接种于小鼠第4对腹部乳腺脂肪垫左侧，缝合切口，消毒皮肤。动物苏醒过程用保温毯保温，观察动物直至其苏醒，将动物放回笼子。手术前30分钟、手术后6小时皮下注射0.1mg/kg丁丙诺非止痛。
2)分组治疗方案：
建模后第3天，用红外数据成像对动物进行生物荧光检测，按照荧光值进行随机分组，分组后根据下表实验方案给药治疗，见表5。
3)实验终点设计：
为观察实施例1对肿瘤生长和转移的抑制作用，参考该模型的历史数据，设计实验终点在给药后的30-35天。实验结束后，解剖分取原位肿瘤和各脏器组织，肿瘤称重，IVIS荧光检测各脏器的荧光强度。对原位肿瘤的生长抑制可通过实验终点原位瘤体的重量比较，抑制曲线由实验过程中每周两次的瘤体积测量数据生成。对肿瘤转移的抑制作用通过各脏器荧光检测的有无和相对荧光强度的分析进行判定。
在实验结束后将被检测肿瘤重量，并计算相对肿瘤增值率T/C(％)；肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。同时剥离肺、肝、脾、肾、肠和左上肢，分别检测荧光，判断是否有转移及转移强度和比率。
化合物的抑瘤疗效用肿瘤生长抑制率TGI(％)或相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。
TGI(％)的计算：
TGI(％)＝【(1-(某处理组给药结束时平均瘤体积-该处理组开始给药时平均瘤体积))/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积-溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)】×100％。
相对肿瘤增殖率T/C(％)的计算：
T/C(％)＝Tt(治疗组)/Ct(对照组)×100％，Tt为某一次测量时的平均肿瘤体积，Ct取同一天数据。
实验结果用one-way ANOVA进行统计分析。如果F值有显著性差异，应在ANOVA分析之后再进行多重比较。本实验所有数据采用SPSS 17.0分析。p＜0.05认为有显著性差异。
表5实验动物分组及给药方案
Figure GPA0000254624350000351
实验结果：
1)动物体重的变化：
相对体重变化基于开始给药时动物体重计算得出，如图3所示。数据点代表组内平均体重变化百分比，误差线代表标准误(SEM)。
2)实施例1对肿瘤转移发生率的抑制作用：
实验终点剥离各脏器组织，在8分钟内用IVIS进行40秒曝光测定荧光成像和荧光强度值记录。各组经最大值和最小值剔除后的10只动物的受检测组织的荧光成像结果如表6。
表6实施例1治疗对4T1肿瘤转移发生率的影响
Figure GPA0000254624350000352
【注】：a.每组有转移的动物数/整组动物数。
3)实施例1对各脏器肿瘤转移强度的抑制作用：
根据实验终点测量得到的各组脏器组织荧光强度，以对照组为参比做归一化处理，得到各组脏器组织的相对荧光强度比值，该比值反应了相应脏器上的转移强度水平，结果如表7所示。
表7实施例1对脏器肿瘤转移强度的影响
Figure GPA0000254624350000361
【注】：a.给药组某一脏器检测到的平均荧光值/对照组某一脏器检测到的平均荧光值
结论：
比较表中数值可见，实施例1对4T1的肝，脾，肾和肠的转移发生有明显的抑制，且抑制作用明显优于阳性对照药。实施例1对该肿瘤的转移发生和转移的强度在多器官组织上均表现出了明显的良好抑制作用，并显著优于本实验所用的阳性对照药物。

Claims (16)

1.式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐，
Figure FDA0002809771750000011
其中，
R1选自氢、羟基、氨基，或选自任选被1、2或3个R取代的C1-3烷基和C3～6环烷基；
R2选自任选被1、2或3个R取代的C1-3烷基、C3～6环烷基和苯基；
R3选自氢，或选自任选被1、2或3个R取代的C1-3烷基；
任选地，R2和R3连接在一起，形成一个任选被1、2或3个R取代的5～6元环；
R4和R5分别独立地选自氢、卤素，或选自任选被1、2或3个R取代的C1-3烷基；
L选自单键、-(CH2)1-3-；
R选自F、Cl、Br、I、CN、OH，或选自任选被1、2或3个R’取代的C1-6烷基、C3-6环烷基、苯基；
R’选自F、Cl、Br、I、OH、CN、Me、Et、CF3、CHF2。
2.根据权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，R选自F、Cl、Br、I、CN、OH、甲基、CHF2、乙基、丙基、环丙基和苯基。
3.根据权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，R1选自氢或选自任选被1、2或3个R取代的：甲基、乙基、
Figure FDA0002809771750000012
4.根据权利要求3所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，R1选自氢、甲基、乙基、
Figure FDA0002809771750000013
Figure FDA0002809771750000014
5.根据权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，R2选自任选被1、2或3个R取代的甲基、乙基、异丙基、环戊基和苯基。
6.根据权利要求5所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，R2选自甲基、乙基、异丙基、环戊基、
Figure FDA0002809771750000015
7.根据权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，R2和R3连接在一起，结构单元
Figure FDA0002809771750000021
为
Figure FDA0002809771750000022
8.根据权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，R4和R5分别独立地选自氢、F、Cl、Br、甲基和乙基。
9.根据权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，结构单元
Figure FDA0002809771750000023
选自
Figure FDA0002809771750000024
Figure FDA0002809771750000025
10.根据权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，L选自单键、-CH2-、-CH2CH2-。
11.根据权利要求1～10任意一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，化合物选自
Figure FDA0002809771750000026
其中，R1、R2、R3、R4、R5、L如权利要求1～10所定义，且R4和R5不同时为H。
12.根据权利要求11所述的化合物或其药学上可接受的盐，化合物选自
Figure FDA0002809771750000027
其中，R1、R2、R4、R5、L如权利要求11所定义，且R4和R5不同时为H。
13.化合物或其药学上可接受的盐，选自
Figure FDA0002809771750000031
14.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1～13任意一项所述的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
15.根据权利要求1～13任意一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或根据权利要求14所述的药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用。
16.根据权利要求15所述的应用，其中，癌症是指乳腺癌。
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