CN109414417A - 通过paris的法尼基化预防或治疗帕金森症的方法 - Google Patents

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Abstract

揭示预防或治疗受试者的帕金森症的方法，其中，将有效量的药物给药至受试者，以造成PARIS的法尼基化以及脑内PGC‑1α表达的提升。这些方法部分地通过预防多巴胺神经元的丢失而减轻受试者帕金森症的效应。

Description

通过PARIS的法尼基化预防或治疗帕金森症的方法
关于政府利益的声明
本发明在美国国立卫生研究院的政府资助(批准号：NS38377)下作出。政府享有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请主张2016年3月17日递交的美国临时专利申请US 62/309,583的优先权，其公开内容通过引用而以其整体并入本文。
背景技术
帕金森症(Parkinson’s disease(PD))是一种无法治愈的进行性神经变性疾病。其临床特征为由于黑质(SN)中多巴胺能神经元的优先丢失造成的运动功能障碍。PD的几种基因性肇因已经得以鉴定，提供了理解该疾病过程的基础性分子机制。目前，用于PD的治疗策略主要受限于以药物如L-DOPA或多巴胺受体进行运动症状的管理以及神脑部刺激。不幸的是，这些疗法没有成功预防多巴胺能神经元(DA)的进行性死亡。此外，没有疗法被证实能迟滞或预防PD的发作或进展。因此，亟需新的药理学途径来治疗PD。
发明内容
本发明通过提供预防或治疗受试者的帕金森症的方法而满足这些需求，该方法通过给药有效量的药物造成parkin相互作用底物(parkin interacting substrate,PARIS)的法尼基化以及提升脑内过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活剂-1α(PGC-1α)的表达。这些方法部分地通过预防多巴胺神经元的丢失而减轻受试者体内的帕金森症效应。
本发明的一种具体实施例为预防或治疗受试者的帕金森症的方法，包含将有效量的一种或多种PGC-1α诱导物给药至该受试者。尽管PGC-1α的任何直接诱导物或间接诱导物均可用于本公开的方法中，但在具体实施例中，该诱导物是法尼醇或其药学可接受的盐、溶剂合物、磷酸酯衍生物或立体异构体。法尼醇的结构为
(2E,6E)-3,7,11-三甲基十二-2,6,10-三烯-1-醇
本发明的另一具体实施例为预防或治疗受试者的帕金森症的方法，包含向该受试者给药有效量的过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活剂-1α(PGC-1α)表达的一种或多种诱导物。优选的诱导物是法尼醇，或其药学可接受的盐、溶剂合物、磷酸酯衍生物或立体异构体。该诱导物可口服给药，通过注射给药，或外用给药。如果法尼醇是该诱导物，则优选以导致该受试者体NRF-1的mRNA水平比未给药法尼醇的受试者增加的量给药法尼醇。还优选以令该受试者脑内的法尼基转移酶活性比未给药法尼醇的受试者增加的量给药法尼醇。还优选以令该受试者脑内的parkin相互作用底物(PARIS)法尼基化比未给药法尼醇的受试者增加的量给药法尼醇。还优选该法尼基化出现在PARIS的残基631处的半胱氨酸残基上。还优选，与未给药法尼醇的受试者相比，法尼醇基本上消除了该受试者体内结合至其靶标DNA的PARIS。还优选，与未给药法尼醇的受试者相比，该法尼醇预防了该受试者体内多巴胺神经元的丢失。
本发明的另一具体实施例为预防或治疗受试者的帕金森症的方法，包含对该受试者给药有效量的选自AVS-3648、ABT-0529、法尼醇、及其组合，或其药学可接受的盐、溶剂合物、磷酸酯衍生物、或其立体所组成组的实体。关于AVS-3648及ABT-0529的化学结构，请参见图9。优选以导致该受试者体NRF-1的mRNA水平比未给药该实体的受试者增加的量给药该实体。优选以令该受试者脑内的法尼基转移酶活性比未给药该实体的受试者增加的量给药该实体。优选以令该受试者脑内的parkin相互作用底物(PARIS)法尼基化比未给药该实体的受试者增加的量给药该实体。优选该法尼基化出现在PARIS的残基631处的半胱氨酸残基上。优选地，与未给药该实体的受试者相比，该实体基本上消除了该受试者体内结合至其靶标DNA的PARIS。还优选地，与未给药该实体的受试者相比，该实体预防了该受试者体内多巴胺神经元的丢失。
本发明的另一具体实施例为鉴别预防或治疗受试者的帕金森症的药物的方法，包含向第一受试者给药该实体，导致该受试者脑内PGC-1α的表达比未给药该实体的第二受试者脑内PGC-1α的表达增强。该实体可口服给药或通过本说明书中提及的其它方法给药。该方法导致该第一受试者的NRF-1的mRNA实体比该第二受试者增加。该方法导致该第一受试者脑内的法尼基转移酶活性比该第二受试者增加。该方法导致该第一受试者脑内的PARIS法尼基化比该第二受试者增加。优选该法尼基化出现在PARIS的残基631处的半胱氨酸残基上。优选地，与该第二受试者相比，该第一受试者体内结合至其靶标DNA的PARIS减少。该方法导致该第一受试者体内的多巴胺神经元的丢失比该第二受试者更少。
本发明的另一具体实施例为对于预防及/或治疗帕金森症的药剂的体外筛选方法，包含下述步骤：提供表达PARIS蛋白或其功能性DNA结合部分的细胞；经一种或多种实体施加至该细胞；确定，与未经该一种或多种实体处理的细胞相比，经该实体处理的一个或多个细胞是否已经失去了该PARIS蛋白或其功能性DNA结合部分与其靶标序列的结合。该实体优选为选自化学品、蛋白质、肽、核酸序列或其组合所组成的组。
附图说明
图1A至图1D举例说明用以鉴定提升PGC-1α表达的化合物的高通量筛选。
图2A至图2J举例说明在PARIS的存在下激活PGC-1α启动子的化合物。
图3A至图3J举例说明，评估在PARIS的存在下激活PGC-1α启动子的9种化合物，以确定哪些化合物诱导SH-SY5Y细胞内的PGC-1α水平。
图4A至图4H举例说明PARIS的法尼基化位点。
图5A至图5I举例说明通过法尼醇保护多巴胺能神经元。
图6A至图6K举例说明法尼醇的保护效果。
图7A至图7G举例说明，PARIS的法尼基化为体内的法尼醇保护效应所需。
图8举例说明法尼醇如本发明所定的作用的方法。
图9举例说明AVS-3648、ABT-0529的化学结构。
图10A至图10D举例说明，本发明中使用的试验对于高通量(HTS)筛选是可靠的。
图11举例说明本发明中使用的高通量筛选方案。
图12举例说明从初步筛选中鉴定的17种化合物。
图13A至图13F举例说明，实时qRT-PCR显示，在肝脏、肾脏、结肠和卵巢中观察到了明显的FXR mRNA，并在脾脏、气管、食道、睾丸和***中观察到了温和表达。
图14A和图14B举例说明，法尼醇彻底清除了结合核染色质的PARIS WT的水平但未清除PARIS C631S，同时，PARIS在细胞质部分、细胞膜部分和可溶性细胞核部分中的分布没有变化。
图15A至图15D举例说明，共免疫染色分析表明，法尼醇导致多巴胺能神经元的PGC-1α免疫反应性增加。
具体实施方式
本公开的具体实施例涉及用于治疗及/或预防与parkin-PARIS-PGC1α途径的调整直接或间接相关的神经障碍的方法及/或组合物。某些具体实施例中，以该途径的调节剂治疗患有神经障碍如帕金森症的个体，而在具体的具体实施例中，向患有PD的个体提供PGC1α表达的调节剂，如其表达的诱导物。
某些具体实施例中，PGC1α表达的诱导物的水平可以是任意水平，只要其提供对包括PD在内的神经障碍的至少一种症状的缓解即可。在至少一些情况下，与标准的表达水平相比，该表达水平被增加至少2、3、4、5、10、25、50、100、1000、或更多倍。可使用该领域中的标准方法，如北方墨点分析法或定量PCR监控个体的PGC1α表达水平。
可向已知罹患PD、疑似罹患PD、或处于罹患PD风险下的个体提供有效量的PGC1α表达诱导物，包括法尼醇。那些处于PD风险下的个体可以是，例如，具有一种或多种遗传因素的个体，可以是年长的个体，及/或可以是具有家族病史的个体。
本公开的特定具体实施例中，除了向个体给予该一种或多种PGC-1α诱导物之外，还基于用于PD治疗的剂。这些额外的治疗可包括，例如，L-DOPA或多巴胺受体激动剂及/或深脑部刺激。当与一种或多种PGC-1α诱导物同时采用联合疗法时，该额外的疗法可以在给药该PGC-1α诱导物之前、同时、及/或之后给予。
本公开的某些方法提供在本公开的治疗方法之前进行的PD诊断方法，且这些诊断可通过任何方法或手段进行，该方法或手段至少包括遗传标记分析、单光子发射计算机断层扫描、嗅觉***测试、自主神经***测试、或其组合。
Parkin底物——PARIS(ZNF746)，其在parkin失活模型及人PD脑模型中的水平已经预先得以鉴别。通过胰岛素反应序列(IRS)占据体增殖物激活受体-γ共激活剂-1α(PGC-1α)启动子中的位置，PARIS转录地压制PGC-1α及其靶标基因——核呼吸因子1(NRF-1)的表达。PARIS为有条件地敲除parkin的成年动物体内多巴胺能神经元的进行性丢失所需，且PARIS的过表达导致DA神经元的选择性变性。伴随着该DA神经元变性，出现线粒体质量和呼吸作用的PARIS依赖性下降，表明parkin的丢失损害了线粒体生物发生，与PGC-1α中的缺陷一致。
PGC-1α是线粒体功能的主要调节因子，通过共调节对于线粒体生物发生重要的转录程序以及保护其免受线粒体氧化应激而实现调节。新出现的证据表明，PGC-1α在PD中扮演角色。PD患者体内的PGC-1α水平下降。PD中GC-1α的下调可能是由于PGC-1α启动子的甲基化。PGC-1α敲除鼠更易受到PD神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)的变性效果的影响，而PGC-1α的过表达使其免受MPTP的活性代谢物N-甲基-4-苯基吡啶阳离子(MPP+)毒性的侵害。此外，PGC-1α的过表达使其免受α-突触核蛋白、MPTP、氧化应激和鱼藤酮诱导的变性的侵害。PD的发病年龄和风险与PGC-1α的多态性有关，且在parkin相关的PD中，PGC-1α是功能失调的。在来自PD患者的多巴胺能神经元中，PGC-1α应答基因被下调，表明其在PD发病机理中扮演重要角色。通过PGC-1α过表达阻止了PARIS被过表达时的多巴胺神经元的丢失，表明PGC-1α是将PARIS关联至多巴胺能神经元变性的主要目标。因此，PGC-1α信号传导中的缺陷正在成为PD中多巴胺能变性的重要贡献者，而通过parkin调节PARIS可能是将PGC-1α关联至PD的潜在机制。
由于该parkin-PARIS-PGC-1α途径似乎在PD中多巴胺能神经元的死亡中扮演重要角色，研发并实施了一种无差别筛选，以鉴别在PARIS增加的情况下维持PGC-1α功能的化合物。本发明已经显示，CSU-1806(法尼醇)是经由PARIS的法尼基化而诱导PGC-1α的潜在诱导物，其抑制PGC-1α的转录阻抑。此外，证明法尼醇深刻地预防了PARIS转基因鼠和有条件的parkin敲除成年鼠体内的多巴胺神经元的丢失。
PGC-1α诱导物的高通量筛选
为了鉴别提升PGC-1α表达的化合物，生成了在1Kb人PGC-1α启动子(SH-PGC-1α)的控制下表达荧光素酶并令GFP(dscGFP)去稳定化的稳定细胞系(图1A)。基于化合物的结构性质、药代动力学性质和药效学性质，从230,000中化合物中选择了代表性的化学品库(Korean Chemical Bank,Daegeon)。这一代表性的化学库含有6000中药理学活性化合物，通过液相色谱-质谱(LC-MS)控制其品质。此外，由临床上已核准的药物(60％)、天然产物(25％)、及其它生物活性化合物(15％)所构成的含有2320中化合物的光谱集(Microsource,(www)msdiscovery.com/spectrum.html)也用于筛选。为了确定该分析放大对于高通量筛选(HTS)是否稳健，确定了包括逐板和逐日变更、信背(S/B)比、变更稀释(CV)和Z'因子在内的标准参数。板内及板间的变更及不同日期间的变更非常小(图10A至图10C)。该Z'因子处于0.5至1的范围内，一般用作HTS的试验准备就绪度系数。高达0.5％的DMSO对于试验灵敏度和细胞存活率均无效果(图10B及图10D)。所有HTS过程均根据NIH指南(高通量筛选试验指引策略，(www)ncats.nih.gov/research/reengineering/ncgc/assay/criteria/criteria.html)实施(图11：HTS分析方案)。
以最终浓度为10μM的8320种化合物中的每一种处理SH-PGC-1α细胞，处理时间为48小时。作为初级读数评估荧光素酶活性，并将其归一化至DMSO(图1A)。在初步筛选中，128种化合物将荧光素酶活性增加了1.5倍(图1B)。这些化合物再次进行三次平行筛选(图1C)。全部化合物均增加了荧光素酶活性，而在这些化合物中，17种化合物将荧光素酶活性增加了2.5倍或更高(图1C)。在10μM的工作浓度下，这17种化合物无一显示细胞毒性(图10D和图12)。评价这17种化合物，以鉴别在PARIS过表达设定中的PGC-1α的激活剂(图1D)。将PARIS或Mock转染的SH-PGC-1α细胞曝露于递增浓度(0、0.01μM、0.1μM、1μM、及10μM)的每一化合物中。48小时后，监控荧光素酶活性。在每一设定中均证实了相等的PARIS表达和对PGC-1α的阻抑。该17种化合物中的9种以剂量依赖方式预防了对PARIS存在下的PGC-1α的阻抑，并激活了PGC-1α启动子(图1D)。为了评估这9种化合物中的任何一种是否具有应用于中枢神经***(CNS)的潜能，通过StarDropTM((www)optibrium.com/stardrop/)评估ADME性质(吸收、分布、代谢和***)，揭示了AVS-3648、ABT-0529、及CSU-1806(法尼醇)具备高度的血脑屏障(BBB)渗透的可能性，而不具备与p-糖蛋白转运(P-gp)的相互作用。
法尼醇(CSU-1806)抑制PARIS以诱导PGC-1α
评价了9种在PARIS的存在下激活PGC-1α启动子的化合物，以确定哪些化合物诱导SH-SY5Y中的PGC-1α水平(图2A和图2B)。通过免疫印迹分析所确定，PGC-1α被潜在的CNS渗透药物AVS-3648、ABT-0529、和法尼醇(CSU-1806)显着增加(图2A和图2B)。AVS-3648、ABT-0529、和法尼醇(CSU-1806)被用来确定，PGC-1α的增加是否功能地调节氧化剂代谢、线粒体生物发生、及氧化磷酸化中牵涉的PGC-1α靶标基因。通过实时定量RT-PCR(qRT-PCR)测定PGC-1α靶标基因的mRNA水平，该靶标基因包括铜/锌超氧化物歧化酶(SOD1)、锰SOD
(SOD2)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx1)、过氧化氢酶(CAT)、核呼吸因子-1(NRF-1)、线粒体转录因子A(TFAM)、线粒体解偶联蛋白(UCP2和UCP3)、以及氧化磷酸化调节因子ATP5b、细胞色素C(CytC)和细胞色素C氧化酶(COX II及IV)(图2C)。在以AVS-3648、ABT-0529、或法尼醇(CSU-1806)处理后，PGC-1α、SOD1和ATP5B的mRNA水平增加(图2C)。有趣的是，仅法尼醇(CSU-1806)稳健地增加了NRF-1的mRNA水平，而NRF-1被鉴定为PD模型中潜在的PARIS/PGC-1α靶标基因。
为了确定法尼醇是否诱导在parkin丢失的设定中的PGC-1α，如先前所述，使用慢病毒shRNA-parkin来降低SH-SY5Y细胞中的parkin表达。Parkin的敲除导致PARIS的水平增加2.7倍，而PGC-1α减少65％(图2D及图2E)。法尼醇恢复了PGC-1α的水平，而不影响parkin和PARIS的水平(图2D及图2E)。通过实时qRT-PCR评估在敲除parkin后的PGC-1α及其靶标基因的mRNA水平。如先前所述，在parkin敲除的SH-SY5Y细胞内，PGC-1α和NRF-1的mRNA水平下降，且这一下降被法尼醇拯救(图2F)。再者，在parkin敲除的设定中，SOD2、TFAM、ATP5B、CYTC、和COX II的mRNA水平在法尼醇的存在下得以显着增加(图2F)。总体而言，这些结果表明，法尼醇恢复了在parkin缺失下的PGC-1α水平和NRF-1水平。
法尼醇是存在于植物和动物中的天然有机化合物。法尼醇的磷酸酯衍生物是哺乳动物细胞内胆固醇的构建模块。为了确定外源性法尼醇是否穿透CNS，以法尼醇饮食(反式法尼醇于AIN-76A饮食中，浓度为0.5％w/w，研究性饮食，NJ)喂养小鼠7天，并通过质谱测量脑及血浆中的法尼醇浓度(图2G)。将法尼醇喂养的小鼠与对照(AIN-76A)喂养的小鼠相比，前者的法尼醇血浆水平从后者的未检出水平增加至113ng/ml。将法尼醇喂养的小鼠与对照喂养的小鼠相比，前者的脑内法尼醇水平显着增加了37％，达到155ng/g(图2G)。测量了来自法尼醇喂养的小鼠的不同脑部区域的PGC-1α水平。与正常饮食的小鼠相比，法尼醇喂养的小鼠的嗅球(OB)内的PGC-1α水平增加了2.7倍，海马体(HIP)内增加了1.6倍，而黑质(SN)内增加了1.7倍(图2H及图2I)。小脑(CBM)、脑干(BS)、纹状体(STR)、或前额叶(CTX)中的PGC-1α水平没有显着变化(图2H及图2I)。这些数据表明，通过法尼醇改变PGC-1α可能是脑区特异性的。此外，测量了法尼醇喂养的小鼠的STR、HIP、及SN中的PGC-1α及多种PGC-1α靶标基因的mRNA水平。由于法尼醇并不影响STR中的PGC-1α水平，将其用作负对照。与正常饮食喂养的小鼠相比，法尼醇喂养的小鼠的HIP及SN中的PGC-1α的mRNA水平得以显着上调，但STR中未见上调，表明HIP及SN中PGC-1α的蛋白质水平的增加主要是由于转录过程(图2J)。有趣的是，与正常饮食喂养的小鼠相比，法尼醇喂养的小鼠的HIP及SN两处的NRF-1、COXII、及COX IV的mRNA水平得以上调(图2J)。但是，仅法尼醇喂养的小鼠的SN中的SOD2、TFAM、UCP2、及CYTC的mRNA水平得以增加，而HIP及STR中未见增加。这些发现表明，法尼醇以脑区特异性的模式沿着PGC-1α靶标基因的不同子集上调PGC-1α的水平。
已知，法尼醇激活主要见于肝脏、肾脏及肠内的法尼酯X受体(FXR)。为了确定FXR是否在脑内表达，通过实时qRT-PCR测定了人类多个组织内FXR的mRNA，该人类组织包括心、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾、脾、结肠、气管、甲状腺、胸腺、膀胱、食道、脂肪、睾丸、***、子宫颈、及卵巢(Master panel IITM,Clontech)。如先前所报导，实时qRT-PCR显示，FXRmRNA在肝、肾、结肠及卵巢内明显可见，而在脾、气管、食道、睾丸及***中轻微表达(图13)。如先前所报导，在脑、心、胎盘、肺、骨骼肌、甲状腺、胸腺、膀胱、脂肪及子宫颈内为检出FXR mRNA。为了确定这些组织内是否存在低水平的FXR mRNA，令RT-PCR在饱和状态进行45次循环，仅在一种组织即膀胱中观察到了FXR。评估HepG2细胞(肝源的)、HEK293细胞(肾源的)、及SH-SY5Y细胞(神经源的)中的FXR mRNA表达。在HepG2细胞内发现FXR的稳健的mRNA表达，而该HEK293细胞及SH-SY5Y细胞内未见该表达。但是，在半定量RT-PCR运行45次循环后，在SH-SY5Y细胞内检出了FXR的mRNA表达。为了测试在经法尼醇处理的SH-SY5Y细胞内FXR与PGC-1α诱导之间是否存在关联，使用FXR靶向的siRNA来敲除FXR。在FXR敲除的设定中，法尼醇处理在PGC-1α水平上没有效果。这些发现表明，PGC-1α的法尼醇诱导是不依赖FXR的。
为了证实法尼醇造成的PGC-1α及NRF-1水平的增加是PARIS依赖性的，将法尼醇给药至进行PARIS的shRNA敲除后的SH-SY5Y细胞。如先前所述PARIS的敲除导致PGC-1α及NRF-1水平增加2倍以上。法尼醇未能进一步提升该水平，表明法尼醇提高PGC-1α及NRF-1水平需要PARIS。由于法尼醇也能在体外激活PPARα及PPARγ，评估了PPARα及PPARγ及它们的一些靶标基因的水平。法尼醇未能影响PPARα及PPARγ蛋白及mRNA或其部分靶标基因的水平，该靶标基因例如乙酰辅酶A氧化酶1(ACOX1)、肉毒碱O-棕榈酰基转移酶1(CPT-1A)、中链特异性乙酰-CoA脱氢酶(MCAD)及长链特异性乙酰-CoA脱氢酶(LCAD)。有趣的是，在缺失PARIS的情况下，mRNA PPARγ的水平下降，而ACOX1及CPT-1A得以上调，表明这些基因可能是PARIS的靶标。在法尼醇喂养的小鼠体内，PPARα及PPARγ的水平也没有改变，而PGC-1α及NRF-1水平增加。此外，在法尼醇喂养的小鼠的SN中，法尼醇治疗降低了PPARγ及ACOX1的mRNA水平，且增加了MCAD的水平。法尼醇也未能激活SH-SY5Y细胞内的PPAR应答元件。总体而言，这些发现表明，法尼醇在脑内的效果不依赖于PPARα及PPARγ，且需要PARIS。
PARIS的法尼基化转录地调节PGC-1α
法尼基转移酶(FTase)使用法尼醇及其中间体用于经由以CaaX基序修饰位于羧基端的半胱氨酸残基而完成蛋白质的法尼基化。法尼基化是使用作为指定的蛋白质异戊烯化的类异戊二烯进行的蛋白质的转译后脂化。生物信息学分析显示了位于CGLS(氨基酸631至634)的PARIS碳端的推定的CaaX基序(图3A)。FTase在CaaX一致情境下识别半胱氨酸，其中，C是半胱氨酸，A是脂肪族氨基酸，且X是靶标蛋白的C端氨基酸。FTase优选位于X位置的甲硫氨酸或丝氨酸，并转移15-碳法尼基。PARIS的预定亚型之间及物种(人、小鼠、大鼠、牛及大猩猩)之间的CGLS序列具有高度一致性。为了确定PARIS是否经法尼基化，以Flag-标记的PARIS加上或siRNA对照或siRNA靶向的FTaseα转染经[3H]-法尼基焦磷酸(FPP)处理的SH-SY5Y细胞。放射自显影法显示，经免疫沉淀的Flag-标记的PARIS被法尼基化，而FTaseα被敲除的SH-SY5Y细胞消除了PARIS的法尼基化(图3B)。使用α-法尼基抗体进行的免疫印迹分析证实了经[3H]-FPP处理的SH-SY5Y细胞内PARIS的法尼基化，而FTaseα的敲除减少了PARIS的法尼基化(图3B)。
之后，应用了一种证实PARIS被异戊烯化的生物技术途径(Nguyen et al.,2009)。将以Flag-标记的PARIS转染的SH-SY5Y细胞的全细胞裂解液使用生物素功能化的焦磷酸香叶酯类似物(Biotin-GPP)及重组FTase W102T/Y154T突变体孵化，其经工程化以使用Biotin-GPP作为脂质供体(Nguyen et al.,2009)。在进行Flag-标记的PARIS的免疫沉淀之后，通过α-链霉亲和素抗体检测到了Biotin-GPP-缀合的PARIS，表明PARIS是进行FTase异戊烯化的底物(图3C)。此外，将来自以siRNA对照或siRNA-FTaseα转染的SH-SY5Y细胞的Flag-标记的PARIS的免疫沉淀物与NBD-GPP混合，其中，NBD-GPP是用于体外法尼基化试验(IVF)的FPP的Cy3荧光类似物。在经免疫沉淀的Flag-标记的PARIS中观察到NBD-GPP荧光信号，证明内源性FTase与Flag-标记的PARIS共同免疫沉淀，且该免疫沉淀的FTase成功地将NBD-GPP转移至PARIS(图3D)。为了确定FTase是否直接法尼基化PARIS，在FTase抑制剂FTI-277的存在和不存在下，以FTase及FPP孵化重组GST-PARIS。GST-PARIS通过FTase进行法尼基化，而通过加入FTase抑制剂FTI-277，该法尼基化被废止(图3E)。
为了探明法尼醇是否导致PARIS的法尼基化提升，以Flag-标记的PARIS转染SH-SY5Y细胞，以法尼醇处理转染后的细胞48小时，之后进行免疫沉淀(图3F)。法尼醇以剂量依赖模式增加了PARIS的法尼基化(图3F及图3G)。伴随着PARIS法尼基化的增肌，PGC-1α也随之增加(图3F及图3G)。为了探明法尼醇的特异性，使用具有与法尼醇类似的结构的香叶醇和香叶基香叶醇。香叶醇或香叶基香叶醇对于PGC-1α水平无效(图3H)。为了确定法尼醇是否增加体内的PARIS法尼基化，对法尼醇喂养的小鼠的SN进行PARIS的免疫沉淀。免疫印迹分析显示，内源性PARIS被法尼基化，且随着PGC-1α的上调，法尼醇提升了经法尼基化的PARIS的水平(图3I及图3J)。
为了证实PARIS的CGLS(氨基酸631至634)含有法尼基化位点，对通过IVF法尼基化的PARIS进行质谱分析(microTOF-Q及HCT超离子阱)(图4A)。由于该肽(618GPLASTDLVTDWTCGLSVLGPTDGGDM644)含有大量酸性氨基酸及一疏水性脂质部分，用于MS/MS的例子碎片化被干扰，因此我们仅能经由分子量的增加与法尼基部分的加入相一致而证实法尼基存在于61 8GPLASTDLVTDWTCGLSVLGPTDGGDM644肽上。由于该肽仅在残基631处具有一个半胱氨酸残基，该残基很可能就是PARIS的法尼基化位点(图4A)。为了证实残基631就是法尼基化位点，生成了PARIS的保守C631S突变。
将FLAG-PARIS WT或FLAG-PARIS C631S突变体免疫沉淀，并测定在法尼醇存在下的法尼基化水平。PARIS WT被法尼基化，且其法尼基化随着法尼醇处理而增肌，而PARISC631S突变体上不存在法尼基化(图4B)。伴随通过法尼醇进行的PARIS WT的法尼基化，PGC-1α也随着上调(图4B)。而在PARIS C631S突变体设定中，法尼醇对于PGC-1α水平的恢复并无效果(图4B)。为了证实PARIS的法尼基化需要FTase，实施了PARIS过表达设定中的FTase的siRNA-FTaseα敲除或FTI-277抑制(图4C)。FTaseα敲除或FTI-277抑制强烈阻止通过法尼醇进行的PARIS法尼基化(图4C)。为了探明PARIS的法尼基化是否影响PGC-1α促进子的IRS基序上的PARIS的DNA结合活性，从以GFP-标记的PARIS WT或GFP-标记的PARIS C631S转染的SH-SY5Y实施核染色质免疫沉淀试验(ChIP)。法尼醇降低了PARIS WT的核染色质占有率，但对PGC-1α启动子上的PARIS C631S无效(图4D及图4E)。为了检查PARIS法尼基化改变其亚细胞分布的可能性，通过免疫印迹分析使用亚细胞分级来监控细胞浆、细胞膜、可溶性核、及结合有核染色质的核部分内的PARIS水平(图4F)。与ChIP试验一致，法尼醇废止了结合有核染色质的PARIS WT的该水平，但对PARIS C631S无影响，同时，在细胞浆、细胞膜、及可溶性核部分内的PARIS分别无变化(图4F及图14)。伴随着通过法尼醇进行的PARIS WT的法尼基化，PGC-1α启动子活性随之增加，而在PARIS C631S突变体中未观察到这一现象(图4G)。电泳迁移率变动分析(EMSA)显示，经体外法尼基化的GST-标记的PARIS WT未能结合至PGC-1α启动子中的胰岛素反应序列(IRS)，而天然的GST-标记的PARIS WT及C631S形成DNA-蛋白质复合体。总体而言，这些数据表明，PARIS得以法尼基化，且PARIS的法尼基化消除了其DNA结合的亲和性，因此阻止了其对PGC-1α的阻抑。
法尼醇保护PD模型中的多巴胺能神经元不丢失
为了确定法尼醇能否保护多巴胺能神经元不受体内PARIS表达增加及PGC-1α水平下降的影响，创造了可Tet诱导的有条件的PARIS转基因鼠(Tg-PARIS)。使用在四环素应答调节因子控制下的C-端FLAG标记的人PARIS(TetP-PARIS-Flag)来生成四环素应答转基因鼠(图S5A)。经由四环素启动子的PCR筛选，鉴别出29只表达TetP-PARIS的转基因鼠(图S5B)。三只最高拷贝数的雄性转基因鼠与CamKIIα-tTA转基因鼠杂交，以实现贯穿该鼠前脑的转基因表达(Mayford et al.,1996)。没有诞生表达CamKIIα-tTA及PARIS两者的鼠，表明发育过程中的PARIS过表达是胚胎致死的。因此，在出生后三周内，dam依靠强力霉素供养以阻抑PARIS，而pup依靠强力霉素饮食供养。在这些条件下，通过PCR鉴别表达CamKIIα-tTA及PARIS两者的鼠(图S5C)。达到5周龄后，与仅表达CamKIIα-tTA或仅表达TetP-PARIS的同窝对照仔畜(对照–CTL)相比，在Tg-PARIS的嗅球(OB)、大脑皮层(CTX)、纹状体(STR)、及腹侧中脑(VM)中检测到了PARIS的过表达(图5A)。在Tg-PARIS系#158中，OB、CTX、及STR中的PARIS被15至20倍过表达(图5A及图5B)。在VM中，PARIS被3倍表达，与有条件的parkin敲除鼠体内及来自散发性PD患者的人类尸体脑部中PARIS表达的提升类似(Shin et al.,2011)(图5B)。由于强力霉素给药完全地阻断了PARIS的上调，PARIS的过表达是四环素响应性的(图S5D)。两种额外的独立Tg-PARIS系(系#121及系#158)以与CTX及VM相等的水平表达PARIS(图S5E)。全部3系在诱导(6周龄)并随后发展出抱紧、痉挛及不能移动的3周后均死亡。为了证实PARIS被表达在多巴胺神经元中，使用酪氨酸羟化酶(TH)与FLAG抗体实施共免疫染色(图5C)。整个SN中，通过FLAG免疫染色指明的PARIS与TH阳性神经元共局部化。此外，通过令CamKIIα-tTA鼠与tetP-LacZ报告鼠杂交而证实了多巴胺神经元中CamKII的表达(图S5G)。尽管CamKII启动子以高水平在海马体(HIP)及前脑内驱动，其驱动LacZ报告因子在VM及SN中的表达(图5A至图5C及图S5G)。当通过TH及Nissl阳性神经元的无偏性体视学计数令该鼠濒死时，评估6周龄鼠的多巴胺神经元数目。Tg-PARIS系#158中，多巴胺神经元减少量超过30％，且纹状体TH免疫反应性减少45％(图5D至图5F)。在Tg-PARIS系#121中存在大约25％的多巴胺神经元减少。在Tg-PARIS的CTX中不存在神经元丢失，表明由PARIS过表达诱导的SN多巴胺神经元的丢失对于多巴胺神经元是选择性的。伴随Tg-PARIS系#158体内多巴胺神经元的丢失，通过HPLC测得的纹状体内多巴胺及其代谢物随之减少(图5G及图5H)。对多巴胺周转率的测量显示，Tg-PARIS的STR中的多巴胺分解代谢比CTL鼠显着增加。去甲肾上腺素及肾上腺素的水平不变。在5至6周龄时，在多巴胺功能的灵敏测量——爬杆实验(Pole Test)中，存在显着的下行时间延迟(图5I)。
使用这一新的鼠模型，评价法尼醇治疗的潜在保护效果。一组Tg-PARIS鼠在停止投喂强力霉素之前，以法尼醇饮食喂养3天。第二组Tg-PARIS鼠在停止投喂强力霉素之前维持正常鼠饮食。两组非转基因对照(CamKIIα-tTA或TetP-PARIS)鼠实行相同的喂养方案。为了确定法尼醇是否保护多巴胺神经元不丢失，实施TH及Nissl立体测量。法尼醇治疗完全阻止了Tg-PARIS的SN中多巴胺神经元的丢失(图6A及6B)。此外，如通过爬杆实验所评估，存在完全的行为拯救(behavioral rescue)(图6C)。此外，法尼醇延迟了由于PARIS过表达所致的早产儿死亡(图S6A)。进行正常鼠饮食的Tg-PARIS鼠显示，通过法尼醇治疗阻断，PGC-1α水平下降了大约50％且NRF-1水平下降40％(图6D及图6E)。对对照鼠的法尼醇治疗增加PGC-1α及NRF-1水平(图6D及图6E)。通过使用FLAG进行免疫沉淀并使用抗法尼基的抗体探查，法尼醇治疗导致PARIS的法尼基化升高(图6D及图6E)。此外，测量喂食法尼醇的小鼠的SN中PGC-1α及多种PGC-1α靶标基因的mRNA水平，并与正常喂食的鼠比较。喂食法尼醇的鼠体内的PGC-1α及NRF-1的mRNA水平得以显着上调(图6F)。为了探究Tg-PARIS SN的多巴胺能神经元中PGC-1α的下降是否为法尼醇所恢复，实施共免疫染色分析，表明法尼醇导致多巴胺能神经云PGC-1α免疫活性的增加(图15B及图15C)。
之后，在有条件的成年parkin敲除(cPK-KO)鼠体内评估法尼醇治疗的潜在保护效果，该鼠体内存在PARIS依赖性的多巴胺神经元的进行性丢失。通过将AAV-GFPCre立体定位注射入Parkinflox/flox鼠的SN中而产生cPK-KO。在病毒注射之前直至分析为止，以法尼醇饮食或正常鼠饮食喂养cPK-KO鼠7天。使用野生型Parkinflox/flox同窝仔畜(WTflox/flox)作为对照，在病毒注射之前直至分析为止，以法尼醇饮食或正常鼠饮食喂养7天，并对其注射AAV-GFPCre。在cPK-KO鼠的SN中观察到，法尼醇治疗完全且显着地阻止了多巴胺神经元的丢失(图6G及6H)。这一设定下，监控以正常饮食或法尼醇饮食喂养的cPK-KO鼠的SN中经法尼基化的PARIS的水平。cPK-KO鼠体内的PARIS水平增加超过2倍，与在散发性PD的SN中观察到的相等(图6I及图6J)。进行正常鼠饮食喂养的cPK-KO鼠展现了PGC-1α及NRF-1水平的下降，与在Tg-PARIS鼠体内观察到的类似(图6I及图6J)。法尼醇治疗增加了对照鼠SN中的PGC-1α及NRF-1水平，且导致PARIS的法尼基化升高并阻止了cPK-KO鼠的SN中PGC-1α及NRF-1水平的衰减(图6I及图6J)。测量喂食法尼醇的鼠的SN中PGC-1α及多种PGC-1α靶标基因的mRNA水平并与正常饮食喂养的鼠比较，发现了PGC-1α、NRF-1、SOD2、TFAM、UCP2、CytC、COX II及COX 1的上调，证明法尼醇提高了PGC-1α及其多个靶标基因的水平(图6K)。
为了确定PARIS的法尼基化对于法尼醇的体内保护效果而言是必需的，将AAV-PARIS WT、AAV-PARIS C631S或AAV-GFP立体定位注射如C57BL/6J鼠的SN中。在AAV-PARISWT、AAV-PARIS C631S或AAV-GFP的立体定位注射之前，以正常鼠饮食或法尼醇饮食喂养鼠一周(图7A)。转导AAV载体的等效表达得以证实。AAV-PARIS WT及AAV-PARIS C631S均导致PARIS的表达增加3至4倍，与在有条件的parkin敲除鼠中及散发性PD的黑质中观察到的相等(图7B及图7C)。法尼醇并未影响PARIS WT或PARIS C631S的水平(图7B及图7C)。实施AAV注射的两周后，通过使用抗法尼基抗体探查经免疫沉淀的喂食法尼醇的PARIS，评估鼠体内PARIS的法尼基化。与注射AAV-PARIS C631S的鼠相比，在注射AAV-PARIS WT的鼠体内稳健地观察到经法尼基化的PARIS(图7B及图7C)。注射AAV-PARIS C631S的鼠体内的最低水平的经法尼基化的PARIS是内源性PARIS造成的。将AAV-PARIS WT注射入喂食法尼醇的鼠的CTX及SN内，以评估是否存在区域特异性的PARIS法尼基化。有趣的是，SN中的PARIS法尼基化与SN中FTase的稳健水平高度一致，而CTX中的法尼基化之低与CTX中FTase的低水平一致(图7D)。通过TH及Nissl体视学进行评价，AAV-PARIS WT及AAV-PARIS C631S均导致多巴胺神经元的丢失(图7E及图7F)。法尼醇治疗完全地阻止了AAV-PARIS WT鼠体内多巴胺神经元的丢失，与其在Tg-PARIS鼠及成年cPK-KO体内的保护类似，但法尼醇对于AAV-PARIS C631S鼠体内的多巴胺神经元存活无效(图7E及图7F)。在AAV-PARIS WT体内，伴随由法尼醇造成的多巴胺神经元恢复，***诱导的运动行为的恢复随之出现(图7G)。
本发明的主要发现为，法尼醇(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯-1-醇)，一种类倍半萜烯分子，是潜在的PGC-1α诱导物，通过对PARIS的法尼基化及抑制完成诱导。对PGC-1α诱导物进行筛选，之后在PARIS表达的设定中进行PGC-1α诱导物的二次筛选，鉴别了阻止PARIS对PGC-1α的抑制的若干种化合物。由于法尼醇具有ADME性质，选择法尼醇进行进一步的表征，表明其有可能是可口服生物利用的及能渗透入脑内的可改变PGC-1α水平的化合物。法尼醇在鼠饮食中口服给药有效的渗透BBB以提升PGC-1α水平。对法尼醇提升PGC-1α水平的机制的探究，导致了PARIS在半胱氨酸631上被法尼基化的发现。PARIS的法尼基化阻止了其结合核染色质及抑制基因转录的能力。法尼醇对PARIS的抑制导致在PD模型中对抗PARIS过表达诱导的多巴胺神经元的丢失。
法尼基化及香叶基香叶基化(蛋白质异戊烯化)是一种脂质修饰，牵涉将法尼基或香叶基香叶基类异戊二烯共价加成至位于多种蛋白质C端的保守半胱氨酸残基。已知大量蛋白质被异戊烯化，其中，异戊烯化牵涉入蛋白质的膜靶向、蛋白质-蛋白质相互作用中，并因此改变蛋白质细胞活性。PARIS与FTase相互作用而导致前者的法尼基化。就我们所知，通过蛋白质异戊烯化进行的转录上调是空前的。已经揭示了拟南芥属(Arabidopsis)MADSbox转录因子APETALA1(AP1)的法尼基化，但需要确定其在AP1的功能及特异性中扮演的角色。PARIS的法尼基化阻止其结合至不能影响基因转录处的染色质，是转录控制的独特机制。确定其它转录调节因子在哪里受控于蛋白质异戊烯化将是重要的。
尤其是发现，经由有条件的转基因途径以等于在来自有条件的parkin敲除鼠及散发性PD的人类尸体黑质中所观察到的水平达成的PARIS过表达，导致多巴胺神经元的选择性丢失。当与即使PARIS水平高得多但不展现变性的其它脑区如皮质相比时，PARIS转基因鼠体内的神经元变性被局限于SN内的多巴胺神经元。清楚地表明，AAV介导的PARIS过表达导致由parkin或PGC-1α过表达挽回的DA神经元的丢失。有趣的是，PARIS转基因鼠过早死亡。早期致死性的肇因未知，但可能是由于PARIS在CamKIIα启动子指向区域的表达。法尼醇完全阻止了DA神经元的丢失，且部分地挽回了PARIS转基因鼠的早期致死性，表示PGC-1α的下降至少部分地导致早期致死性以及多巴胺神经元的丢失。法尼醇通过提升PARIS法尼基化而阻止其转录抑制，从而达成法尼醇保护效果。与此概念一致，观察到法尼醇不能阻止突变体PARIS631S的法尼基化衰减。法尼醇也完全地阻止了成年鼠体内由于有条件的parkin敲除造成的多巴胺神经元的丢失。由于PARIS的删除通过阻止PGC-1α的衰减及PGC-1α下降的有害后果，而阻止了有条件的parkin敲除成年鼠体内多巴胺神经元的丢失，法尼醇对有条件的parkin敲除成年鼠体内PARIS法尼基化的提升及PGC-1α水平及PGC-1α靶标基因的恢复，可能导致法尼醇的保护性作用。
法尼醇是已知的Farensoid X受体(FXR，亦称为NR1H4)激动剂。由于其他人和我们已经发现FXR不在脑内表达，这里所报导的法尼醇的效果似乎是不依赖于FXR的。法尼醇也能在体外激活PPARα及PPARγ两者，其对于PPARα具备更高的潜在效果。在鼠脑内及SH-SY5Y细胞内没有观察到法尼醇对于PARα及PPARγ的效果，表明法尼醇对脑内PGC1-α的作用是不依赖于PPARα及PPARγ的。此外，由于法尼醇通过PARIS的法尼基化提升了PGC1-α的水平而未能在PARIS缺席下增加PGC1-α水平，以及由于尚未知PPARγ能调节PGC1-α的水平，法尼醇对PGC1-α的作用更像是通过其对PARIS的法尼基化完成的且独立于其对于PPAR的作用。
已经在碳水化合物及脂质代谢情形中研究了大鼠饮食中与本文所用者类似浓度的法尼醇，该法尼醇经由其对FXR及PPARα的作用而降低了血清甘油三酯、胆固醇的水平。啮齿动物饮食中的法尼醇也通过提升蛋白质香叶基香叶基化而展现心脏保护效果，且这一保护效果独立于其对于FXR及PPAR的作用。法尼醇通常见于禾本植物、浆果及水果中，法尼醇可能部分地导致这些植物、浆果及水果对于脂质代谢失调及心血管健康障碍产生有益效果。法尼醇可在体内被磷酸化以形成FPP，从而其可提升蛋白质的法尼基化及香叶基香叶基化。因此，法尼醇提升蛋白质异戊烯化似乎是其在脑及心两处的有益效果的主要机制。
法尼醇也是香烟中的常用添加剂。法尼醇有可能是香烟烟雾中导致吸烟对于PD发展具有防护作用的流行病理学数据的成分。确定人体可安全容忍的法尼醇的量及其药代动力学性质，以及法尼醇是否保护人体不受PD的变性效果影响是重要的。
方法/实施例
报告细胞系的生成和化学筛选
对于稳定的报告SH-SY5Y细胞(SH-PGC-1α-Luc)，将1-Kb人PGC-1α启动子***慢病毒pGreenFire(System Biosciences)中。如补充信息中所述，以浓缩病毒转导SH-SY5Y细胞并使用嘌呤霉素(1μg/ml)选择细胞。将处于100μl DMEM中的SH-PGC-1α-Luc细胞以10,000细胞/孔置于白色、平底的96孔板内，并在37℃、5％CO2下孵化过夜。次日，以化合物处理，并在孵化48小时后使用SteadyGlo试剂(Promega)测量荧光素酶活性。各板具有三种内标：大豆苷元(作为阳性对照，10μM)及两个阴性对照(不做处理及DMSO)。如补充信息中所述将各孔的原始荧光素酶数据归一化。
质粒构建
如现有文献所述(Shin et al.,2011)生成pCMV-PARIS野生型(pCMV-Tag2A,Stratagene)，并使用QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene)生成pCMV-PARIS C631S突变体。更多细节可从补充信息中获得。
体外法尼基化试验
如文献所述实施体外法尼基化实验(IVF)(Nguyen et al.,2009；Nguyen et al.,2010；Wu et al.,2007)。简而言之，对于代谢的全局法尼基化，以5μCi[3H]-法尼基焦磷酸(FPP)(NET1042001MC,PerkinElmer)在细胞内处理SH-SY5Y细胞，并通过使用法尼基抗体的免疫印迹分析来监控免疫沉淀物。对于人工IVF，使用生物素-焦磷酸香叶酯(Biotin-GPP，RabGGTase的特异性底物，LI-015，Jena Bioscience)及重组FTase W102T/Y154T突变体(PR-952,Jena Bioscience)将该细胞裂解液孵化6h。对于基于荧光的IVF，使用NBD-GPP(LI-014,Jena Bioscience)将免疫沉淀的Flag标记的PARIS孵化20min。SDS-PAGE后，通过荧光成像器(FluorChemTMQ system)扫描该凝胶。更多细节可从补充信息中获得。
CAST、EMSA、ChIP、qRT-PCR试验
如补充信息中所述，将GST、GST-PARIS、GST-PARIS-C631S用于电泳迁移率变动分析(EMSA)。如补充信息中所述，根据制造商的使用说明书实施染色质免疫沉淀。
有条件的PARIS转基因鼠和有条件的Parkin敲除鼠
为了生产切除tet的有条件的PARIS转基因鼠，将线性化转基因构造(NotI消解，8kbp)显微注射入胚胎中，并将给胚胎转移至B6D2F1假孕雌性鼠(美国国家癌症研究所转基因动物中心(Transgenic Animal Core of National Cancer Institute))体内。令三个高拷贝样本(系#121、158、179)与C57/BL6杂交2至3代，以构建转基因系。通过以含有强力霉素食物(强力霉素无菌饮食，200mg/kg的强力霉素，Bio-Serv)喂食，有条件的转基因鼠体内的PARIS诱导得到抑制。
为了生成parkin敲除的Cre-flox条件模型，将表达GFP融合Cre重组酶的腺相关病毒载体(AAV-GFPCre)立体定向地引入flox化parkin鼠(parkinFlox/Flox)的外显子7的SN中。
统计
通常，定量的数据表示为均值±SEM。经由不成对双尾学生t测试或使用Student-Newman-Keuls析因分析的ANOVA测试来评价统计学显着性。当p<0.05时视为差异显着。
药学制剂
本发明的医药组合物包括溶解或分散在药学可接受的载体中的有效量的一种或多种过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC-1α)表达的诱导物，如法尼醇。短语“药学或药理学可接受的”指的是，当视需要给药至动物如人时不产生副作用、过敏反应或其它不良反应的分子实体及组合物。该领域技术人员根据于公开文献如通过借由引用并入本文的《雷明顿：药物科学及实践(第二十一版)》(Remington:The Science andPractice of Pharmacy,21st Ed.Lippincott Williams and Wilkins,2005)，可获知包含至少一种PGC-1α表达的诱导物或其它活性成分的医药组合物的制剂。而且应理解，对于动物(如，人)给药，制剂应该符合FDA生物学标准办公室所要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。
本文中，“药学可接受的载剂”包括任何及全部溶剂、分散接枝、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐类、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、芳香剂、染料、类似材料及其组合，如该领域技术人员所知(见，例如，马克出版公司(Mack Printing Company)在1990年出版的《雷明顿药物科学(第十八版)》(Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.)第1289至1329页，通过引用并入本文)。除了在任何传统载剂与该活性成分不相容的范围以外，其在医药组合物中的使用是适宜的。
依据其是都待以固体、液体或气溶胶形式给药及其是否需要经无菌化以用于诸如注射的给药途径，PGC-1α表达的诱导物可包含不同类型的载剂。本发明的组合物可静脉给药、皮内给药、透皮给药、鞘内给药、动脉给药、腹腔给药、鼻内给药、***给药、直肠给药、外用给药、肌肉给药、皮下给药、粘膜给药、口服给药、外用给药、局部给药、吸入(如，气溶胶吸入)、注射、输液、连续输液、局部地直接灌注淹没靶标细胞、经导管给药、经灌洗给药、在乳膏中给药、在脂质组合物(如，脂质体)中给药，或通过其它方法或如该领域技术人员所知的前述给药途径的任意组合给药(见，例如，马克出版公司(Mack Printing Company)在1990年出版的《雷明顿药物科学(第十八版)》(Remington's Pharmaceutical Sciences,18thEd.)，通过引用并入本文)。PGC-1α表达的诱导物(包括法尼醇)可通过食用一种或多种包含该诱导物的食物如草药、浆果及/或水果提供至个体。
PGC-1α表达的诱导物可以游离碱、中性或盐形式配制在组合物中。药学可接受的盐类包括酸加成盐类，如与类蛋白质组合物的游离胺基形成的那些盐；或与无机酸类如盐酸或磷酸形成的盐类；或有机酸类如醋酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的盐类。与游离羧基形成的盐类亦可衍生自无机碱类，例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或有机碱类如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。一经配制，溶液将以与剂型相容的方式及治疗有效的量给药。该配方可以多种剂型容易地给药，如配制为用于肠胃外给药如可注射溶液、或用于肺部输送的气溶胶、或配制为用于消化给药的释药胶囊等。
进一步根据本公开，本发明的适用于给药的组合物被提供在具有或不具有惰性稀释剂的药学可接受的载剂中。该载剂应该是可吸收的，且包括液体、半固体即贴剂、或固体载剂。除了在任何传统介质、剂、稀释剂或载剂有害于接纳者或其内部所含组合物的疗效的范围以外，其在用于实践本发明方法的可给药组合物中的使用是适宜的。载剂或稀释剂的实例包括脂肪、油类、水、盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填料等，或其组合。该组合物也可包含多种抗氧化剂，以阻止一种或多种组分的氧化。此外，对微生物作用的预防可由防腐剂如多种抗细菌剂及抗真菌剂带来，该抗细菌剂及抗真菌剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯类(如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。根据本发明，将该组合物与载剂以任何便利且可实践的方式组合，如通过溶液、悬浮液、乳液、混合、胶囊化、吸收等组合。这些途径对于该领域技术人员是常规途径。
本发明的具体具体实施例中，该组合物与半固体或固体载剂充分合并或混合。该混合可以任何便利的方式如研磨进行。为了保护该组合物而令其不丢失治疗活性即不在胃中变性，该混合中也可加入稳定剂。用于该组合物中的稳定剂的实例包括缓冲剂；氨基酸如甘氨酸和赖氨酸；碳水化合物如右旋葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇等。
进一步的具体实施例中，本发明可涉及药学脂质媒介组合物的使用，该组合包括PGC-1α表达的诱导物、一种或多种脂质、及一水性溶剂。本文中，术语“脂质”将被定义为包括一大类其典型特征为不溶于水但可使用有机溶剂萃取的物质。这一大类化合物为该领域技术人员所熟知，且本文中使用的术语“脂质”并不限于任何特定结构。实例包括含有长链脂肪烃及其衍生物的化合物。脂质可以是天然出现的或合成的(即，人类设计或制造的)。但是，脂质通常是生物学物质。生物学脂质是该领域中周知的，且包括例如天然脂肪、磷脂质、甘油磷脂、类固醇、萜类、溶液脂质、鞘糖脂、糖脂质、硫脂类、具有醚及酯链结的脂肪酸的脂质、可聚合脂质、及其组合。当然，除本文中具体揭示的化合物外，作为脂质而为该领域技术人员所知的化合物也涵盖于本发明的组合物及方法中。
该领域技术人员应通晓可用来将组合物分散于液体媒介中的技术范围。例如，可将PGC-1α表达的诱导物分散于含有脂质的溶液中、以脂质溶解、以脂质乳化、与脂质混合、与脂质组合、共价交联至脂质、作为悬浮液包含在脂质中、包含在胶束或脂质体内或与胶束或脂质体复合、或通过该领域技术人员所知的任何手段与脂质或脂质结构关联。该分散可能导致或不导致脂质体的形成。
可通过物理及生理学因素如体重、状况的严重性、待治疗疾病的类型、先前或同时进行的治疗性干预、患者的特发病及给药途径确定给药至受试者的本发明组合物的实际剂量。依据该剂量及给药途径，优选剂量及/或有效量的给药数字可根据该受试者的反应而变。无论如何，对给药负责的从业者将去顶用于个体受试者的组合物中活性成分的浓度及适宜的剂量。
某些具体实施例中，医药组合物可包含，例如，至少约0.1％的活性化合物。其它具体实施例中，所包含的该活性化合物的量可为，例如，该单位重量的约2％至约75％之间，或约25％至约60％之间，及其间可衍生的任何范围。理所当然，每一治疗上有用的组合物中活性化合物的量可以下述方式制备：在任何给定单位剂量的该化合物中将获得适当的剂量。制备此类医药配方的领域的技术人员将能够设想各种因素，如溶解度、生物利用度、生物半衰期、给药途径、产品保质期、以及其它药理学注意事项，由是，多种剂量及治疗方案可以是所希望的。
其它非限制性实例中，每次给药的剂量可包含从约1μg/kg体重、约5μg/kg体重、约10μg/kg体重、约50μg/kg体重、约100μg/kg体重、约200μg/kg体重、约350μg/kg体重、约500μg/kg体重、约1mg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约50mg/kg体重、约100mg/kg体重、约200mg/kg体重、约350mg/kg体重、约500mg/kg体重至约1000mg/kg体重或更高，以及可从其中引出的任何范围。在来自本文中列举的数字的可衍生范围的非限制性实例中，基于上述数字，可以约5mg/kg体重至约100mg/kg体重、约5μg/kg体重至约500mg/kg体重等的范围给药。
A.饮食组合物和配方
本公开的一种具体实施例中，PGC-1α表达的诱导物被配制为待经由饮食途径给药。饮食途径包括令该组合物与消化道直接接触的全部可能的给药途径。具体地，本文中揭示的医药组合物可口服给药、经颊腔给药、直肠给药、或舌下给药。由是，这些组合物可与惰性稀释剂配伍或与可吸收的食用载剂配伍，或它们可密封在硬壳或软壳胶囊内，或它们可压制为片剂，或它们可直接与食品合并。
某些具体实施例中，该活性化合物可与赋形剂合并，并以可消化的片剂、含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆、原片等形式使用(Mathiowitz et al.,1997；Hwang et al.,1998；US 5,641,515；US 5,580,579及US 5,792,451，各自通过引用而以其整体明确地并入本文)。该片剂、锭剂、丸剂、胶囊等亦可含有下列：粘合剂，如黄芪胶、***树胶、玉米淀粉、明胶或其组合；赋形剂，如磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸或其组合；润滑剂，如硬脂酸镁；甜味剂，如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；芳香剂，如薄荷油、冬青油、樱桃香精、橙味剂等。当单元剂型是胶囊时，其除了含有上述类型的材料外，还可含有液体载剂。多种其它材料可作为包衣存在，或用来修饰该单元剂量的物理形式。例如，片剂、丸剂、或胶囊剂可包覆有虫胶、糖、或两者。当单元剂型是胶囊时，其除了含有上述类型的材料外，还可含有液体载剂。明胶胶囊、片剂、或丸剂可包覆有肠溶衣。肠溶衣可防止该组合物在pH为酸性的胃部或上消化道内变性。见，如，US 5,629,001。一旦到达小肠，小肠内的碱性pH溶解该包衣，释放该组合物，且令该组合物被特定细胞如肠上皮细胞及派尔集合***(Peyer's patch)M细胞吸收。酏剂的糖浆可含有该活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯、染料及芳香剂如樱桃香精或橙味剂。当然，在制备任何剂量单元中使用的任何材料均应为医药纯的且在所采用的量下基本无毒。此外，可将该活性化合物并入缓释制剂及配方中。
对于经口给药，还可以选择将本公开的组合物与一种或多种赋形剂合并，其形势为漱口水、牙膏、含片、口腔喷雾剂、或舌下口服给药制剂。例如，可将所需量的活性成分并入适宜溶剂如硼酸钠溶液(Dobell溶液)中而制备漱口水。或者，可将该活性成分并入口服溶液如含有硼酸钠、甘油及碳酸氢钾的溶液中，或将该活性成分分散于牙膏内，或将治疗有效量的该活性成分加入可包括水、粘合剂、研磨剂、芳香剂、起泡剂及润湿剂的组合物中。或者，该组合物可塑造为可置于舌下或在口内溶解的片剂或溶液形式。
适用于其它营养性给药模式的其它制剂包括栓剂。栓剂是多种重量和形状的固体剂型，一般含有药物且塞入直肠内使用。塞入后，栓剂润滑、熔融或溶解于空腔流体中。通常，对于栓剂，传统载剂可包括，例如，聚亚烷基二醇、甘油三酯或其组合。某些具体实施例中，栓剂可从含有例如约0.5％至约10％且优选约1％至约2％范围内的活性成分的混合物形成。
B.肠胃外组合物和配方
进一步的具体实施例中，PGC-1α表达的诱导物可经由肠胃外途径给药。本文中，术语“肠胃外”包括不经过消化道的途径。具体而言，本文中揭示的医药组合物可例如但不限于，静脉给药、皮内给药、肌肉给药、动脉给药、鞘内给药、皮下给药或腹腔给药，US 6,7537,514、US 6,613,308、US 5,466,468、US 5,543,158、US 5,641,515、及US5,399,363(各自通过引用而以其整体明确地并入本文)。
作为游离碱或药学可接受盐的该活性化合物的溶液可在适当地与表面活性剂如羟丙基纤维素混合的水中制备。亦可在甘油、液体聚乙二醇类及其混合物中或在油类中制备分散体。在一般储存及使用条件下，这些制剂含有防腐剂以阻止微生物的生长。适用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液及用于临时制备无菌可注射人员或分散体的无菌粉末(US 5,466,468，通过引用而以其整体明确地并入本文)。所有情形中，该形式必须是无菌的，且必须是达到容易注射程度的液体。其在制造及储存条件下必须是稳定的，且必须是防腐的以对抗微生物如细菌及真菌的污染作用。采集可以是溶剂或分散介质，其含有，例如，水、乙醇、多元醇(如，甘油、丙二醇、及液体聚乙二醇等)、其适当混合物、及/或植物油。可通过例如使用涂层如卵磷脂、在分散体情况下通过维持所需粒径、及通过使用表面活性剂，维持适宜的流动性。可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂如对羟苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，带来对微生物作用的阻止。在许多情况下，优选包括等渗剂如糖类或氯化钠。可通过在可注射组合物中使用延迟吸收剂如单硬脂酸铝及明胶，为该组合物带来延长的吸收。
对于水溶液形式的肠胃外给药，例如，该溶液应视需要而得以稳定缓冲化，且使用足量的盐水或葡萄糖首先令液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液尤其适用于静脉给药、肌肉给药、皮下给药、及腹腔给药。在这一点上，该领域技术人员可鉴于本公开而获知可采用的无菌水性介质。例如，一个剂量可溶解于等渗NaCl溶液中，以及加入皮下输液流体中或在建议输液部位注射(见，例如，《雷明顿药物科学(第十五版)》(Remington'sPharmaceutical Sciences,15th Edition)第1035至1038页及第1570至1580页)。依据待治疗的受试者的情况，可视需要出现一些剂量方面的变动。无论如何，对给药负责的人将确定用于个体受试者的适宜剂量。而且，对于人类给药，制剂应符合FDA生物学标准办公室所要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。
通过按照需要将处于适宜溶剂中的所需量的活性化合物与上文枚举的多种其它成分合并，之后过滤、无菌化，制备无菌的可注射溶液。通常，通过将多种无菌化的活性成分并入含有基础分散介质和来自上文所枚举的所需其它成分合并，制备分散体。在用于制备无菌的可注射溶液的无菌粉末的情形中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，该技术从先前无菌过滤的溶液中获得该活性成分加上任何附加的所希望成分的粉末。粉末状的组合物与液体载剂如具有或不具有稳定剂的水或盐水溶液合并。
C.混成药物组合物和配方
本发明的其它优选具体实施例中，该PGC-1α表达的活性化合物诱导物可配制为用于经多种途径给药，例如，外用(即，透皮)给药、粘膜给药(鼻内给药、***给药等)及/或吸入。
用于外用给药的医药组合物可包括配制为药用如油膏、贴剂、乳膏或粉末的活性化合物。油膏包括所有用于外用的油性基质、吸收基质、乳液基质及水溶性基质的组合物，而乳膏和洗剂是那些仅包括乳液基质的组合物。外用给药的药物可含有渗透促进剂，以促进通过皮肤吸收活性成分。适当的渗透促进剂包括甘油、醇类、烷基甲基亚砜类、吡咯烷酮类和月桂氮卓酮(luarocapram)。用于外用组合物的可能基质包括聚乙二醇、羊毛脂、冷霜和凡士林油，以及任何其它适当的吸收基质、乳化基质或水溶性油膏基质。外用制剂亦可包括保存该活性成分和提供均质混合物所需的乳化剂、胶凝剂、以及抗微生物性防腐剂。本发明的透皮给药亦可包含“贴剂”的使用。例如，贴剂可在固定时间段内以预设的速度和连续模式供应一种或多种活性物质。
某些具体实施例中，该医药组合物可通过滴眼液、鼻内喷雾、吸入、及/或其它气溶胶输送介质输送。经由鼻内气溶胶喷雾剂将组合物直接输送至肺部的方法已经揭示在例如US 5,756,353和US 5,804,212(各自通过引用而以其整体明确地并入本文)中。同样，使用鼻内微粒树脂(Takenaga et al.,1998)和溶血磷脂酰基-甘油化合物(US 5,725,871，通过引用而以其整体明确地并入本文)输送药物也是医药领域周知的。同样，以聚四氟乙烯支持基质进行跨粘膜药物输送揭示在US5,780,045(通过引用而以其整体明确地并入本文)中。
术语气溶胶指的是将细微分割的固体或液体颗粒分散于经液化或加压的气体推进剂中的胶体***。本发明的用于吸入的典型气溶胶将由活性成分在液体推进剂或液体推进剂混合物中的悬浮物及适当溶剂组成。适当的推进剂包括烃类和烃醚类。适当的容器将根据该推进剂的压力需求而变。该气溶胶的给药将根据受试者的年龄、体重和严重性以及该症状的响应而变。
本公开的试剂盒
本文中揭示的任何组合物均可包含在试剂盒内。一非限制性实例中，PGC-1α表达的诱导物(例如，法尼醇)可包含在试剂盒内。
该试剂盒可包含经适当等分的PGC-1α表达的诱导物，在一些情况下，还包含一种或多种添加剂。该试剂盒的组分可包装在水性介质内或包装为冻干形式。该试剂盒的容器机构通常将包括至少一个药水瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器机构，其内部可置有一种组分，优选置有经适当等分的一种组分。若该试剂盒中存在超过一种组分，则该试剂盒通常还将含有其内部单独置有该附加组分的第二、第三或其它附加容器。但是，组分的多种组合可包含于一个药水瓶内。典型地，本发明的试剂盒还将包括其商业销售受到严格限制的用于容纳PGC-1α表达的诱导物的机构以及其它试剂容器。这些容器可包括其内部留存所希望的药水瓶的注塑或吹塑的塑料容器。
当该试剂盒的组分被提供为一种及/或多种溶液时，该溶液时水溶液，尤其优选无菌水溶液。PGC-1α表达的诱导物的组合物可配制为可注射的组合物。在这种情况下，容器机构本身可以是注射器、移液管、及/或其它类似设备，该制剂可从该容器机构被施加至身体的被感染区域、注射如动物体内、及/或甚至施加至该试剂盒的其它组分及/或与后者混合。但是，该试剂盒的组分可提供为干粉。当试剂及/或组分被提供为干粉时，该粉末可通过加入适当溶剂而得以重构。设想该溶剂亦可提供于另一容器机构中。
本文中引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均通过引用并入本文，引用程度为每一参考文献独立且具体地通过引用而合并且以其整体陈述于本文中。
除非本文中另有指明或与语境明显矛盾，否则语境中(尤其在权利要求书的语境中)用于揭示本发明的术语“一(a)”和“一(an)”和“该(the)”及类似术语解释为覆盖单数和复数。除非明确排除，否则术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containing)”解释为开放性术语(即，意为“包括，但不限于”)。除非本文中另有指明，对本文中数值范围的描述仅意图用作单独指代对于落入该范围内每一独立数值的缩写方法；且每一独立数值以其单独为本文所引用的程度并入说明书。除非本文中另有指明或与语境明显矛盾，否则本文中揭示的所有方法均可以任何适当次序实施。除非另有主张，本文中提供的任何和全部实施例或例示性语句(如，“例如”)，仅试图更好地举例说明本发明，而不造成对本发明范畴的显着。说明书中任何语句均不解释为指明任何未主张的元件对于实践本发明是必不可少的。
本文中揭示本发明的优选具体实施例，包括发明人已知的用于完成本发明的最佳模式。在阅读前述说明书后，该领域技术人员可明了那些优选具体实施例的变更。发明人期待该领域技术人员酌情采用这些变更，且发明人希望本发明以本文中具体揭示者之外的方式得以实践。据此，本发明包括本文所附权利要求书中主题的适用法律所允许的全部修饰和等效物。另外，除非本文中明确否定或与语境明显矛盾，否则上述元件以其全部可能变更方式的任何组合均为本发明所涵盖。

Claims (29)

1.一种预防或治疗受试者的帕金森症的方法，其包含向该受试者给药有效量的一种或多种诱导物，该诱导物诱导过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活剂-1α(PGC-1α)的表达。
2.如权利要求1所述的方法，其中，该诱导物是法尼醇或其药学可接受的盐、溶剂合物、磷酸酯衍生物或立体异构体。
3.如权利要求2所述的方法，其中，该法尼醇是口服给药。
4.如权利要求2或3所述的方法，其中，该法尼醇的给药量为导致该受试者体内NRF-1的mRNA水平增加至高于未向该受试者给药法尼醇时水平的量。
5.如权利要求2至4中任一项所述的方法，其中，该法尼醇的给药量为令该受试者脑内法尼基转移酶的活性比未向该受试者给药法尼醇时的活性增加的量。
6.如权利要求2至5中任一项所述的方法，其中，该法尼醇的给药量为令该受试者脑内parkin相互作用底物(PARIS)的法尼基化比未向该受试者给药法尼醇时的法尼基化增加的量。
7.如权利要求6所述的方法，其中，该法尼基化出现于PARIS的残基631处的半胱氨酸残基上。
8.如权利要求2至7中任一项所述的方法，其中，当与未给药法尼醇的该受试者相比，该法尼醇实质上消除了结合至其靶标DNA的PARIS。
9.如权利要求2至8中任一项所述的方法，其中，当与未给药法尼醇的该受试者相比，该法尼醇预防该受试者体内多巴胺神经元的丢失。
10.一种预防或治疗受试者的帕金森症的方法，包含向该受试者给药有效量的选自由AVS-3648、ABT-0529、法尼醇、及其组合、或其药学可接受的盐、溶剂合物、磷酸酯衍生物或立体异构体所组成组的实体。
11.如权利要求10所述的方法，其中，该实体是口服给药的。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中，该实体的给药量为导致该受试者体内NRF-1的mRNA水平增加至高于未向该受试者给药该实体时水平的量。
13.如权利要求10、11或12所述的方法，其中，该实体的给药量为令该受试者脑内法尼基转移酶的活性比未向该受试者给药该实体时的活性增加的量。
14.如权利要求10至13中任一项所述的方法，其中，该实体的给药量为令该受试者脑内的PARIS法尼基化比未向该受试者给药该实体时的法尼基化增加的量。
15.如权利要求14所述的方法，其中，该法尼基化出现于PARIS的残基631处的半胱氨酸残基上。
16.如权利要求10至15中任一项所述的方法，其中，当与未给药该实体的该受试者相比，该实体实质上消除了该受试者体内结合至其靶标DNA的PARIS。
17.如权利要求10至16任一项所述的方法，其中，当与未给药该实体的该受试者相比，该实体预防该受试者体内多巴胺神经元的丢失。
18.如权利要求10至17中任一项所述的方法，其中，该实体是AVS-3648。
19.如权利要求10至17中任一项所述的方法，其中，该实体是ABT-0529。
20.一种鉴定预防或治疗受试者的帕金森症的药物的方法，包含向第一受试者给药实体，导致该受试者脑内的PGC-1α表达比未给药该实体的第二受试者脑内的PGC-1α表达提升。
21.如权利要求20所述的方法，其中，该实体是口服给药的。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中，与该第二受试者相比，该第一受试者体内的NRF-1的mRNA水平增加。
23.如权利要求20、21、或22所述的方法，其中，与该第二受试者相比，该第一受试者脑内的法尼基转移酶活性增加。
24.如权利要求20至23中任一项所述的方法，其中，与该第二受试者相比，该第一受试者脑内的PARIS法尼基化增加。
25.如权利要求24所述的方法，其中，该法尼基化出现于PARIS的残基631处的半胱氨酸残基上。
26.如权利要求20至25中任一项的方法，其中，当与该第二受试者相比时，该第一受试者体内结合至其靶标DNA的PARIS降低。
27.如权利要求20至26中任一项的方法，其中，当与该第二受试者相比时，该第一受试者体内多巴胺神经元的丢失较低。
28.一种筛选用来预防及/或治疗帕金森症的药剂的体外方法，包含下述步骤：
a.提供表达PARIS蛋白质或其功能性DNA结合部分的细胞；
b.将一种或多种实体应用至该细胞；
c.当与并未经该一种或多种实体处理的细胞相比时，确定经该经实体处理的一个或多个细胞是否已经丢失了该PARIS蛋白质或其功能性DNA结合部分与其靶标序列的结合。
29.如权利要求28所述的方法，其中，该实体选自化学品、蛋白质、肽、核酸序列或其组合所组成的组。
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