CN109400824B - 一种Bt蛋白仿生亲和材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Bt蛋白仿生亲和材料，属于化学与材料领域，它是模拟Bt Cry1Ac蛋白与烟草天蛾中肠刷状缘膜囊受体钙粘蛋白Bt‑R1之间的分子识别机制，以人工合成的丙烯酰胺‑多肽‑酰胺单体与其它共存单体反应后得到的聚合物纳米颗粒，所述多肽包含有NITIHITDTNNK的氨基酸序列。本发明具有昆虫受体类钙粘蛋白Bt‑R1的仿生特点，当其与Bt Cry1Ac蛋白作用时，可以模拟Bt‑R1的识别机理，通过其侧链结构中的NITIHITDTNNK与Bt Cry1Ac蛋白的抗原表位368RRPFNIGINNQQ379结合在一起。该材料对同源性很高的Bt Cry族蛋白均具有非常强的特异性亲和能力，并且具有吸附容量高，吸附平衡速度快，吸附‑解吸过程易于控制等优点，可以用于多种Bt蛋白的特异性识别、分离和富集。
Description
技术领域
本发明属于化学与材料领域，涉及一种Bt蛋白仿生亲和材料及其制备方法，本发明还涉及一种以所述Bt蛋白仿生亲和材料为吸附剂，对土壤Bt蛋白进行提取分离的方法。
背景技术
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种好氧型***、呈杆状、内生芽孢，是一种重要的杀虫细菌。Bt蛋白是苏云金芽孢杆菌菌体生长进入稳定期，在芽孢周围形成的菱形或者双锥形的伴孢晶体蛋白(parasporal crystalprotein)，又称为杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal protein,ICP)或δ-内毒素。
环境和生物介质中Bt蛋白的定性和定量检测方法主要有：生物测定法、凝胶电泳法、免疫检测法(包括酶联免疫吸附测定法，免疫印迹分析法、胶体金免疫层析试纸条法)。酶联免疫吸附测定法是目前应用最广的免疫快速检测方法，具有较高的灵敏度，可同时对大量样本进行检测等优点。该方法首先需要使用缓冲溶液将土壤、叶片或种子中的Bt蛋白提取到水相中，然后再采用试剂盒进行定性分析和定量检测。目前采用的提取方法主要有PBST法、碳酸盐法、SDS提取法以及人造蠕虫肠道蛋白提取法。其中PBST、碳酸盐和 SDS提取法的提取效率普遍偏低、而人造蠕虫肠道蛋白提取法则存在提取成本高的问题。尽管酶联免疫吸附法具有较高的灵敏度，但是对于Bt蛋白含量较低、样品基体吸附很强的土壤样品来说，仍然很难避免由于Bt蛋白提取效率低、基质干扰严重所造成的“假阴性”结果。因此，研制出一种对Bt蛋白具有特异性分子识别能力的亲和配体，建立一套有效的分离纯化和样品前处理方法，对于环境和转基因作物中Bt蛋白的有效监控具有十分重要的意义。
聚合物纳米颗粒是通过疏水性、亲水性以及带电性功能单体之间的自由基引发聚合得到的，其对目标蛋白的识别机理主要基于聚合物侧链结构中的疏水性、亲水性以及带电荷基团与蛋白质氨基酸侧基之间存在的疏水作用、氢键作用、静电作用、π-π堆积作用、π-阳离子相互作用以及范德华力等。这种结合力与天然生物大分子之间(酶-底物、酶-辅基、抗原-抗体、激素-受体)互补的多重相互作用原理是一致的。因此，可以通过调节功能单体的种类和配比，使合成的聚合物纳米颗粒具有与目标生物大分子相匹配的侧链结构以及表面化学性质，从而实现其对目标生物大分子的特异性识别和捕获。目前，人工合成聚合物纳米颗粒作为一种理想的仿生亲和配体，在蛋白质分离纯化、生物毒素去除、热激蛋白保护以及生物大分子样品前处理等方面显示出广阔的应用前景。
人工合成聚合物纳米颗粒之所以能够体现出生物抗体/受体的仿生特性，主要是因为其模拟了生物大分子之间的特异性相互作用。因此，研究抗原与抗体，抗原与受体之间特有的分子识别机理对于如何设计和筛选聚合物纳米颗粒具有非常重要的借鉴作用。研究Bt Cry1Ac蛋白对烟草天蛾的杀虫机理表明，影响Bt Cry1Ac蛋白杀虫活性的关键步骤是BtCry1Ac蛋白与烟草天蛾中肠刷状缘膜囊受体钙粘蛋白Bt-R1之间特异性的相互作用。两者之间的结合位点分别位于：Bt Cry1Ac蛋白结构域domain II中的loop 2凸环结构上，其抗原表位的氨基酸序列为368RRPFNIGINNQQ379；钙粘蛋白Bt-R1中的钙粘重复单元CR7上，其受体表位的氨基酸序列为865NITIHITDTNNK876。因此，我们可以模拟Bt Cry1Ac蛋白与 Bt-R1受体之间的分子识别机制，以人工合成的含有氨基酸序列 Asn-Ile-Thr-Ile-His-Ile-Thr-Asp-Thr-Asn-Asn-Lys(NITIHITDTNNK)的丙烯酰胺-多肽-酰胺为功能单体(提供特异亲和力)，以亲水性单体，如丙烯酰胺(AAm)、异丙基丙烯酰胺 (NIPAm)、N,N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)或者甲基丙烯酸酯(MMA)为共存单体(作为聚合物纳米颗粒的骨架材料)，来定向设计合成聚合物纳米颗粒，从而将受体蛋白结合位点代表的多肽NITIHITDTNNK引入到聚合物纳米颗粒侧链结构中。当聚合物纳米颗粒与Bt Cry1Ac蛋白作用时，即可通过其侧链结构中的NITIHITDTNNK与Bt Cry1Ac蛋白结构中的368RRPFNIGINNQQ379结合在一起。采用这种定向合成方法得到的聚合物纳米颗粒具有受体蛋白Bt-R1的仿生特点，因此可以大大提高聚合物纳米颗粒对Bt Cry1Ac蛋白的特异性亲和能力。以该聚合物纳米颗粒为仿生亲和配体，有望解决水、土壤以及生物介质等复杂环境中痕量Bt Cry1Ac蛋白的样品前处理问题，从而实现环境及生物样品中Bt Cry1Ac蛋白的有效监控。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于抗原-受体识别机理的Bt蛋白仿生亲和材料及其制备方法，以及一种以所述Bt蛋白仿生亲和材料为吸附剂，对土壤Bt蛋白进行提取分离的方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种Bt蛋白仿生亲和材料，它是模拟Bt Cry1Ac蛋白与烟草天蛾中肠刷状缘膜囊受体钙粘蛋白Bt-R1之间的分子识别机制，以人工合成的丙烯酰胺-多肽-酰胺单体与其它共存单体反应后得到的聚合物纳米颗粒，所述多肽包含有氨基酸序列 Asn-Ile-Thr-Ile-His-Ile-Thr-Asp-Thr-Asn-Asn-Lys(NITIHITDTNNK)，所述共存单体为丙烯酰胺类和/或丙烯酸酯类化合物。
一种制备Bt蛋白仿生亲和材料的方法，它包括以下步骤：
1)人工合成丙烯酰胺-多肽-酰胺单体，所述多肽包含有氨基酸序列 Asn-Ile-Thr-Ile-His-Ile-Thr-Asp-Thr-Asn-Asn-Lys(NITIHITDTNNK)；
2)以过硫酸铵(APS)为引发剂、四甲基乙二胺(TEMED)为催化剂，将丙烯酰胺- 多肽-酰胺单体与其它共存单体反应得到聚合物纳米颗粒，所述共存单体为丙烯酰胺类和/或丙烯酸酯类化合物。
所述丙烯酰胺类化合物包括但不限于丙烯酰胺(AAm)、异丙基丙烯酰胺(NIPAm)、N,N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)。
所述丙烯酸酯类化合物包括但不限于甲基丙烯酸甲酯(MMA)。
优选地，所述聚合反应在氮气保护氛围下，于4～40℃条件下进行，其最佳反应温度为25℃。
优选地，所述丙烯酰胺-多肽-酰胺单体与其它共存单体的摩尔比为5～50：95～50，其最佳摩尔比为30：70。
优选地，所述过硫酸铵在反应体系中的浓度为6～120mg/25ml，其最佳浓度为30mg/25ml。
优选地，所述四甲基乙二胺在反应体系中的浓度为5～25μL/25ml，其最佳浓度为15μl /25ml。
优选地，所述反应体系中含有0～30mg/25ml的表面活性剂，所述表面活性剂为十二烷基磺酸钠(SDS)，其最佳浓度为10mg/25ml。
一种土壤Bt蛋白提取分离方法，它包括以下步骤：首先对土壤中的Bt蛋白进行提取，然后向提取液中加入以上所述的Bt蛋白仿生亲和材料为吸附剂，调节吸附pH为6～9，对提取液中的Bt蛋白进行吸附，最后在解吸pH为10～13的条件下使吸附剂上的Bt蛋白解吸。
优选地，所述吸附pH为8。
优选地，所述解吸pH为10。
本发明的有益效果是：
采用本发明的技术方案制备的聚合物纳米颗粒，由于利用了Bt Cry1Ac蛋白与烟草天蛾中肠刷状缘膜囊受体钙粘蛋白Bt-R1之间的分子识别机制，将Bt-R1结合位点代表的多肽丙烯酸-865NITIHITDTNNK876-NH2作为功能单体来定向设计合成聚合物纳米颗粒，使其具有昆虫受体Bt-R1的仿生特点，即可以通过聚合物纳米颗粒侧链结构中引入的865NITIHITDTNNK876与Bt Cry1Ac蛋白特异性地结合在一起。
1)该类聚合物纳米颗粒对Bt Cry1Ac蛋白具有很强的亲和力，最大理论吸附容量可达 1000mg/g，其与Bt Cry1Ac蛋白的结合也非常迅速，2min即可达到吸附平衡。
2)与几种常规模式蛋白相比，该类聚合物纳米颗粒对同为Bt Cry族的Bt Cry1Ac，Bt Cry1Ab，Bt Cry1C，Bt Cry1F和Bt Cry2A蛋白均具有非常强的特异性，可以同时用于多种 Bt蛋白的识别、分离和富集。
3)该类聚合物纳米颗粒对Bt蛋白的响应具有pH敏感性，可以通过调节缓冲溶液的pH 值轻易地实现Bt蛋白在聚合物纳米颗粒表面的吸附和解吸。
4)以该类聚合物纳米颗粒为吸附剂材料，对土壤中痕量Bt蛋白进行提取、分离和富集后，即可采用酶联免疫吸附法将Bt蛋白浓度检测出来，从而避免土壤Bt蛋白检测的“假阴性”结果。
本发明基于Bt蛋白-昆虫受体识别机理设计合成的聚合物纳米颗粒所展示出的这些优良性能使其在Bt蛋白的分子识别、分离纯化、样品前处理以及分析检测方面均具有良好的应用前景。本方明的技术方案也为其它特殊蛋白和生物毒素的仿生亲和聚合物纳米颗粒的研制提供了一种借鉴。
附图说明
图1：聚合物纳米颗粒对Bt Cry1Ac与其它Bt Cry族蛋白，如Cry1Ab、Cry1C、Cry1F和 Cry2A选择性吸附能力比较。
图2：聚合物纳米颗粒对Bt Cry1Ac与其他常规模式蛋白，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、胰蛋白酶、细胞色素C和溶菌酶选择性吸附能力比较。
图3：pH调控的Bt Cry1Ac蛋白吸附、解吸过程以及吸附和解吸后上清液的SDS-PAGE 分析结果。
具体实施方式
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1：
丙烯酰胺-Asn-Ile-Thr-Ile-His-Ile-Thr-Asp-Thr-Asn-Asn-Lys(NITIHITDTNNK)-酰胺单体的制备：
以侧链全保护氨基酸为原料，Rink-Amide-AM Resin树脂为固相载体，采用Fmoc固相合成法从多肽序列C端向N端合成。首先，将C端第一个氨基酸反应至树脂上，然后通过氨基酸脱水缩合将下一个氨基酸依次反应至前一个氨基酸上，接完最后一个氨基酸后在树脂中加入丙烯酸溶液进行缩合反应，最后采用三氟乙酸切割液将合成的丙烯酰胺-多肽 -酰胺单体从树脂上切割下来。具体方法如下：
称取1mmol Fmoc-D-Lys(Boc)-OH，3mmol Fmoc-D-Asn(Trt)-OH，3mmol Fmoc-D-Thr(tBu)-OH，1mmol Fmoc-Asp(OBzl)-OH，3mmol Fmoc-D-Ile-OH，1mmol Fmoc-His(Trt)-OH和300mg Rink-Amide-AM Resin树脂为反应原料。首先，将 Rink-Amide-AM Resin树脂用二氯甲烷浸泡5分钟，把二氯甲烷抽干，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤3次。然后，加入哌啶脱帽液反应15分钟，脱去Fmoc保护基团，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤6次去除脱帽液，再加入Fmoc-D-Lys(Boc)-OH进行缩合反应，从而将第一个氨基酸共价连接到树脂上，得到Fmoc-D-Lys(Boc)-Amide-AM Resin。接下来，加入哌啶将 Fmoc-D-Lys(Boc)-Amide-AM Resin上的Fmoc保护基团去掉，然后将Fmoc-D-Asn(Trt)-OH 上的羧基采用N,Nˊ-二环己基碳二亚胺进行活化。活化后的Fmoc-D-Asn(Trt)-OH再与 D-Lys(Boc)-Amide-AM Resin树脂发生缩合反应，得到Fmoc-D-Asn(Trt)- D-Lys(Boc)-Amide-AM Resin。重复上述肽键合成步骤，使肽链从C端向N端延长。接完最后一个氨基酸Fmoc-D-Asn(Trt)-OH后，脱除Fmoc保护基团，然后加入丙烯酸溶液，在 O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯，N,N-二异丙基乙胺和N,N-二甲基甲酰胺体系中进行缩合发应。抽掉反应溶液，用N,N-二甲基甲酰胺反复洗涤5次。最后采用TFA 切割液将合成的丙烯酰胺-NITIHITDTNNK-酰胺单体从树脂上切割下来，滤液中加入***使多肽析出，得到粗产品，然后经过多次纯化，得到所需的丙烯酰胺-NITIHITDTNNK-酰胺单体，其纯度为95.22％。
实施例2
聚合物纳米颗粒的制备：称取摩尔百分数为30％的丙烯酰胺-NITIHITDTNNK-酰胺、 68％的丙烯酰胺和2％的N,N-亚甲基双丙烯酰胺于100mL圆底烧瓶中，加入5mL超纯水，超声5min使其充分溶解。向溶解好的功能单体溶液(总物质的量为0.8125mmol)中加入10mg十二烷基磺酸钠，补加二次蒸馏水至25mL，继续超声5min使其充分溶解后加入磁力搅拌子，用橡胶塞密封圆底烧瓶。将圆底烧瓶置于磁力搅拌器上，以160r/min的速度进行搅拌。将一根长的连接氮气钢瓶的针头穿过橡胶塞***到溶液底部，另一根短的针头***橡胶塞置于圆底烧瓶顶部，持续通氮气30min，以将反应溶液中溶解的氧气驱除完全。然后用微量注射器穿过橡胶塞加入1mL过硫酸铵溶液(30mg/mL)和15μL四甲基乙二胺，继续通氮气15min后拔出通气针头，用封口膜密封橡胶塞，在氮气氛围下于25℃反应18h。将反应后的聚合物纳米颗粒溶液转移至透析袋(14000KDa)中，于3L超纯水中透析4天，每天早晚各换水一次。透析结束后，将聚合物纳米颗粒溶液转入具塞离心管中，置于4℃冰箱留待备用。取5mL聚合物纳米颗粒溶液冷冻干燥，测定并计算聚合物纳米颗粒的产率为 61.41％，溶液中聚合物纳米颗粒的质量浓度为9.64mg/mL。
实施例3
聚合物纳米颗粒的制备：称取摩尔百分数为5％的丙烯酰胺-NITIHITDTNNK-酰胺、95％的异丙基丙烯酰胺于100mL圆底烧瓶中，加入8mL超纯水，超声3min使其充分溶解。向溶解好的功能单体溶液(总物质的量为0.8125mmol)中加入15mg十二烷基磺酸钠，补加二次蒸馏水至25mL，继续超声6min使其充分溶解后加入磁力搅拌子，用橡胶塞密封圆底烧瓶。将圆底烧瓶置于磁力搅拌器上，以160r/min的速度进行搅拌。将一根长的连接氮气钢瓶的针头穿过橡胶塞***到溶液底部，另一根短的针头***橡胶塞置于圆底烧瓶顶部，持续通氮气30min，以将反应溶液中溶解的氧气驱除完全。然后用微量注射器穿过橡胶塞加入1mL过硫酸铵溶液(60mg/mL)和5μL四甲基乙二胺，继续通氮气15min后拔出通气针头，用封口膜密封橡胶塞，在氮气氛围下于15℃反应18h。将反应后的聚合物纳米颗粒溶液转移至透析袋(14000KDa)中，于3L超纯水中透析4天，每天早晚各换水一次。透析结束后，将聚合物纳米颗粒溶液转入具塞离心管中，置于4℃冰箱留待备用。取5mL 聚合物纳米颗粒溶液冷冻干燥，测定并计算聚合物纳米颗粒的产率为65.94％，溶液中聚合物纳米颗粒的质量浓度为3.84mg/mL。
实施例4
聚合物纳米颗粒的制备：称取摩尔百分数为50％的丙烯酰胺-NITIHITDTNNK-酰胺、 48％的甲基丙烯酸甲酯和2％的N,N-亚甲基双丙烯酰胺于100mL圆底烧瓶中，加入8mL超纯水，超声10min使其充分溶解。向溶解好的功能单体溶液(总物质的量为0.8125mmol)中加入20mg十二烷基磺酸钠，补加二次蒸馏水至25mL，继续超声8min使其充分溶解后加入磁力搅拌子，用橡胶塞密封圆底烧瓶。将圆底烧瓶置于磁力搅拌器上，以300r/min的速度进行搅拌。将一根长的连接氮气钢瓶的针头穿过橡胶塞***到溶液底部，另一根短的针头***橡胶塞置于圆底烧瓶顶部，持续通氮气20min，以将反应溶液中溶解的氧气驱除完全。然后用微量注射器穿过橡胶塞加入1mL过硫酸铵溶液(120mg/mL)和15μL四甲基乙二胺，继续通氮气10min后拔出通气针头，用封口膜密封橡胶塞，在氮气氛围下于40℃反应4h。将反应后的聚合物纳米颗粒溶液转移至透析袋(14000KDa)中，于3L超纯水中透析4天，每天早晚各换水一次。透析结束后，将聚合物纳米颗粒溶液转入具塞离心管中，置于4℃冰箱留待备用。取5mL聚合物纳米颗粒溶液冷冻干燥，测定并计算聚合物纳米颗粒的产率为60.29％，溶液中聚合物纳米颗粒的质量浓度为15.02mg/mL。
实施例5
聚合物纳米颗粒的制备：称取摩尔百分数为10％的丙烯酰胺-NITIHITDTNNK-酰胺、 85％的丙烯酰胺和5％的N,N-亚甲基双丙烯酰胺于100mL圆底烧瓶中，加入5mL超纯水，超声5min使其充分溶解。向溶解好的功能单体溶液(总物质的量为0.8125mmol)中加入10mg十二烷基磺酸钠，补加二次蒸馏水至25mL，继续超声5min使其充分溶解后加入磁力搅拌子，用橡胶塞密封圆底烧瓶。将圆底烧瓶置于磁力搅拌器上，以120r/min的速度进行搅拌。将一根长的连接氮气钢瓶的针头穿过橡胶塞***到溶液底部，另一根短的针头***橡胶塞置于圆底烧瓶顶部，持续通氮气60min，以将反应溶液中溶解的氧气驱除完全。然后用微量注射器穿过橡胶塞加入1mL过硫酸铵溶液(30mg/mL)和10μL四甲基乙二胺，继续通氮气15min后拔出通气针头，用封口膜密封橡胶塞，在氮气氛围下于4℃反应24h。将反应后的聚合物纳米颗粒溶液转移至透析袋(14000KDa)中，于3L超纯水中透析4天，每天早晚各换水一次。透析结束后，将聚合物纳米颗粒溶液转入具塞离心管中，置于4℃冰箱留待备用。取5mL聚合物纳米颗粒溶液冷冻干燥，测定并计算聚合物纳米颗粒的产率为 76.74％，溶液中聚合物纳米颗粒的质量浓度为5.09mg/mL。
实施例6
聚合物纳米颗粒的制备：称取摩尔百分数为40％的丙烯酰胺-NITIHITDTNNK-酰胺、 50％的丙烯酰胺和10％的N,N-亚甲基双丙烯酰胺于100mL圆底烧瓶中，加入25mL超纯水，超声15min使其充分溶解后加入磁力搅拌子，用橡胶塞密封圆底烧瓶。配制的功能单体溶液的总物质的量为0.8125mmol。将圆底烧瓶置于磁力搅拌器上，以240r/min的速度进行搅拌。将一根长的连接氮气钢瓶的针头穿过橡胶塞***到溶液底部，另一根短的针头***橡胶塞置于圆底烧瓶顶部，持续通氮气30min，以将反应溶液中溶解的氧气驱除完全。然后用微量注射器穿过橡胶塞加入1mL过硫酸铵溶液(90mg/mL)和20μL四甲基乙二胺，继续通氮气15min后拔出通气针头，用封口膜密封橡胶塞，在氮气氛围下于25℃反应18h。将反应后的聚合物纳米颗粒溶液转移至透析袋(14000KDa)中，于3L超纯水中透析4天，每天早晚各换水一次。透析结束后，将聚合物纳米颗粒溶液转入具塞离心管中，置于4℃冰箱留待备用。取5mL聚合物纳米颗粒溶液冷冻干燥，测定并计算聚合物纳米颗粒的产率为55.21％，溶液中聚合物纳米颗粒的质量浓度为10.92mg/mL。
实施例7
聚合物纳米颗粒的制备：称取摩尔百分数为30％的丙烯酰胺-NITIHITDTNNK-酰胺、 68％的异丙基丙烯酰胺和2％的N,N-亚甲基双丙烯酰胺于100mL圆底烧瓶中，加入5mL超纯水，超声5min使其充分溶解。向溶解好的功能单体溶液(总物质的量为0.8125mmol)中加入10mg十二烷基磺酸钠，补加二次蒸馏水至25mL，继续超声5min使其充分溶解后加入磁力搅拌子，用橡胶塞密封圆底烧瓶。将圆底烧瓶置于磁力搅拌器上，以160r/min的速度进行搅拌。将一根长的连接氮气钢瓶的针头穿过橡胶塞***到溶液底部，另一根短的针头***橡胶塞置于圆底烧瓶顶部，持续通氮气30min，以将反应溶液中溶解的氧气驱除完全。然后用微量注射器穿过橡胶塞加入1mL过硫酸铵溶液(30mg/mL)和15μL四甲基乙二胺，继续通氮气15min后拔出通气针头，用封口膜密封橡胶塞，在氮气氛围下于25℃反应18h。将反应后的聚合物纳米颗粒溶液转移至透析袋(14000KDa)中，于3L超纯水中透析4天，每天早晚各换水一次。透析结束后，将聚合物纳米颗粒溶液转入具塞离心管中，置于4℃冰箱留待备用。取5mL聚合物纳米颗粒溶液冷冻干燥，测定并计算聚合物纳米颗粒的产率为56.24％，溶液中聚合物纳米颗粒的质量浓度为9.34mg/mL。
实施例8
聚合物纳米颗粒的制备：称取摩尔百分数为30％的丙烯酰胺-NITIHITDTNNK-酰胺、 68％的甲基丙烯酸甲酯和2％的N,N-亚甲基双丙烯酰胺于100mL圆底烧瓶中，加入5mL超纯水，超声5min使其充分溶解。向溶解好的功能单体溶液(总物质的量为0.8125mmol)中加入10mg十二烷基磺酸钠，补加二次蒸馏水至25mL，继续超声5min使其充分溶解后加入磁力搅拌子，用橡胶塞密封圆底烧瓶。将圆底烧瓶置于磁力搅拌器上，以160r/min的速度进行搅拌。将一根长的连接氮气钢瓶的针头穿过橡胶塞***到溶液底部，另一根短的针头***橡胶塞置于圆底烧瓶顶部，持续通氮气30min，以将反应溶液中溶解的氧气驱除完全。然后用微量注射器穿过橡胶塞加入1mL过硫酸铵溶液(30mg/mL)和15μL四甲基乙二胺，继续通氮气15min后拔出通气针头，用封口膜密封橡胶塞，在氮气氛围下于25℃反应18h。将反应后的聚合物纳米颗粒溶液转移至透析袋(14000KDa)中，于3L超纯水中透析4天，每天早晚各换水一次。透析结束后，将聚合物纳米颗粒溶液转入具塞离心管中，置于4℃冰箱留待备用。取5mL聚合物纳米颗粒溶液冷冻干燥，测定并计算聚合物纳米颗粒的产率为63.16％，溶液中聚合物纳米颗粒的质量浓度为10.32mg/mL。
实施例9
聚合物纳米颗粒的制备：称取摩尔百分数为20％的丙烯酰胺-NITIHITDTNNK-酰胺、 48％的丙烯酰胺，30％的异丙基丙烯酰胺和2％的N,N-亚甲基双丙烯酰胺于100mL圆底烧瓶中，加入5mL超纯水，超声5min使其充分溶解。向溶解好的功能单体溶液(总物质的量为0.8125mmol)中加入30mg十二烷基磺酸钠，补加二次蒸馏水至25mL，继续超声5min使其充分溶解后加入磁力搅拌子，用橡胶塞密封圆底烧瓶。将圆底烧瓶置于磁力搅拌器上，以160r/min的速度进行搅拌。将一根长的连接氮气钢瓶的针头穿过橡胶塞***到溶液底部，另一根短的针头***橡胶塞置于圆底烧瓶顶部，持续通氮气30min，以将反应溶液中溶解的氧气驱除完全。然后用微量注射器穿过橡胶塞加入1mL过硫酸铵溶液(30mg/mL)和15 μL四甲基乙二胺，继续通氮气15min后拔出通气针头，用封口膜密封橡胶塞，在氮气氛围下于25℃反应18h。将反应后的聚合物纳米颗粒溶液转移至透析袋(14000KDa)中，于3L 超纯水中透析4天，每天早晚各换水一次。透析结束后，将聚合物纳米颗粒溶液转入具塞离心管中，置于4℃冰箱留待备用。取5mL聚合物纳米颗粒溶液冷冻干燥，测定并计算聚合物纳米颗粒的产率为63.70％，溶液中聚合物纳米颗粒的质量浓度为7.34mg/mL。
实施例10
聚合物纳米颗粒的制备：称取摩尔百分数为15％的丙烯酰胺-NITIHITDTNNK-酰胺、 30％的丙烯酰胺，53％的甲基丙烯酸甲酯和2％的N,N-亚甲基双丙烯酰胺于100mL圆底烧瓶中，加入5mL超纯水，超声5min使其充分溶解。向溶解好的功能单体溶液(总物质的量为0.8125mmol)中加入10mg十二烷基磺酸钠，补加二次蒸馏水至25mL，继续超声5min使其充分溶解后加入磁力搅拌子，用橡胶塞密封圆底烧瓶。将圆底烧瓶置于磁力搅拌器上，以160r/min的速度进行搅拌。将一根长的连接氮气钢瓶的针头穿过橡胶塞***到溶液底部，另一根短的针头***橡胶塞置于圆底烧瓶顶部，持续通氮气40min，以将反应溶液中溶解的氧气驱除完全。然后用微量注射器穿过橡胶塞加入1mL过硫酸铵溶液(6mg/mL)和10μL 四甲基乙二胺，继续通氮气10min后拔出通气针头，用封口膜密封橡胶塞，在氮气氛围下于20℃反应18h。将反应后的聚合物纳米颗粒溶液转移至透析袋(14000KDa)中，于3L 超纯水中透析4天，每天早晚各换水一次。透析结束后，将聚合物纳米颗粒溶液转入具塞离心管中，置于4℃冰箱留待备用。取5mL聚合物纳米颗粒溶液冷冻干燥，测定并计算聚合物纳米颗粒的产率为66.76％，溶液中聚合物纳米颗粒的质量浓度为6.29mg/mL。
实施例11
聚合物纳米颗粒的制备：称取摩尔百分数为20％的丙烯酰胺-NITIHITDTNNK-酰胺、48％的异丙基丙烯酰胺，30％的甲基丙烯酸甲酯和2％的N,N-亚甲基双丙烯酰胺于100mL圆底烧瓶中，加入5mL超纯水，超声5min使其充分溶解。向溶解好的功能单体溶液(总物质的量为0.8125mmol)中加入10mg十二烷基磺酸钠，补加二次蒸馏水至25mL，继续超声5min使其充分溶解后加入磁力搅拌子，用橡胶塞密封圆底烧瓶。将圆底烧瓶置于磁力搅拌器上，以160r/min的速度进行搅拌。将一根长的连接氮气钢瓶的针头穿过橡胶塞***到溶液底部，另一根短的针头***橡胶塞置于圆底烧瓶顶部，持续通氮气30min，以将反应溶液中溶解的氧气驱除完全。然后用微量注射器穿过橡胶塞加入1mL过硫酸铵溶液(20 mg/mL)和25μL四甲基乙二胺，继续通氮气15min后拔出通气针头，用封口膜密封橡胶塞，在氮气氛围下于40℃反应6h。将反应后的聚合物纳米颗粒溶液转移至透析袋(14000KDa) 中，于3L超纯水中透析4天，每天早晚各换水一次。透析结束后，将聚合物纳米颗粒溶液转入具塞离心管中，置于4℃冰箱留待备用。取5mL聚合物纳米颗粒溶液冷冻干燥，测定并计算聚合物纳米颗粒的产率为58.75％，溶液中聚合物纳米颗粒的质量浓度为7.10 mg/mL。
实施例12
聚合物纳米颗粒的制备：称取摩尔百分数为30％的丙烯酰胺-NITIHITDTNNK-酰胺、 20％的丙烯酰胺，28％的异丙基丙烯酰胺，20％的甲基丙烯酸甲酯和2％的N,N-亚甲基双丙烯酰胺于100mL圆底烧瓶中，加入5mL超纯水，超声5min使其充分溶解。向溶解好的功能单体溶液(总物质的量为0.8125mmol)中加入10mg十二烷基磺酸钠，补加二次蒸馏水至25mL，继续超声5min使其充分溶解后加入磁力搅拌子，用橡胶塞密封圆底烧瓶。将圆底烧瓶置于磁力搅拌器上，以160r/min的速度进行搅拌。将一根长的连接氮气钢瓶的针头穿过橡胶塞***到溶液底部，另一根短的针头***橡胶塞置于圆底烧瓶顶部，持续通氮气 30min，以将反应溶液中溶解的氧气驱除完全。然后用微量注射器穿过橡胶塞加入1mL过硫酸铵溶液(30mg/mL)和15μL四甲基乙二胺，继续通氮气15min后拔出通气针头，用封口膜密封橡胶塞，在氮气氛围下于25℃反应12h。将反应后的聚合物纳米颗粒溶液转移至透析袋(14000KDa)中，于3L超纯水中透析4天，每天早晚各换水一次。透析结束后，将聚合物纳米颗粒溶液转入具塞离心管中，置于4℃冰箱留待备用。取5mL聚合物纳米颗粒溶液冷冻干燥，测定并计算聚合物纳米颗粒的产率为56.38％，溶液中聚合物纳米颗粒的质量浓度为9.11mg/mL。
实施例13
聚合物纳米颗粒的制备：称取摩尔百分数为98％的丙烯酰胺和2％的N,N-亚甲基双丙烯酰胺于100mL圆底烧瓶中，加入5mL超纯水，超声5min使其充分溶解。向溶解好的功能单体溶液(总物质的量为0.8125mmol)中加入10mg十二烷基磺酸钠，补加二次蒸馏水至25mL，继续超声5min使其充分溶解后加入磁力搅拌子，用橡胶塞密封圆底烧瓶。将圆底烧瓶置于磁力搅拌器上，以160r/min的速度进行搅拌。将一根长的连接氮气钢瓶的针头穿过橡胶塞***到溶液底部，另一根短的针头***橡胶塞置于圆底烧瓶顶部，持续通氮气30 min，以将反应溶液中溶解的氧气驱除完全。然后用微量注射器穿过橡胶塞加入1mL过硫酸铵溶液(30mg/mL)和15μL四甲基乙二胺，继续通氮气15min后拔出通气针头，用封口膜密封橡胶塞，在氮气氛围下于25℃反应12h。将反应后的聚合物纳米颗粒溶液转移至透析袋(14000KDa)中，于3L超纯水中透析4天，每天早晚各换水一次。透析结束后，将聚合物纳米颗粒溶液转入具塞离心管中，置于4℃冰箱留待备用。取5mL聚合物纳米颗粒溶液冷冻干燥，测定并计算聚合物纳米颗粒的产率为67.57％，溶液中聚合物纳米颗粒的质量浓度为1.53mg/mL。
实施例14
聚合物纳米颗粒的制备：称取摩尔百分数为98％的异丙基丙烯酰胺和2％的N,N-亚甲基双丙烯酰胺于100mL圆底烧瓶中，加入5mL超纯水，超声5min使其充分溶解。向溶解好的功能单体溶液(总物质的量为0.8125mmol)中加入10mg十二烷基磺酸钠，补加二次蒸馏水至25mL，继续超声5min使其充分溶解后加入磁力搅拌子，用橡胶塞密封圆底烧瓶。将圆底烧瓶置于磁力搅拌器上，以160r/min的速度进行搅拌。将一根长的连接氮气钢瓶的针头穿过橡胶塞***到溶液底部，另一根短的针头***橡胶塞置于圆底烧瓶顶部，持续通氮气30min，以将反应溶液中溶解的氧气驱除完全。然后用微量注射器穿过橡胶塞加入1mL 过硫酸铵溶液(30mg/mL)和15μL四甲基乙二胺，继续通氮气15min后拔出通气针头，用封口膜密封橡胶塞，在氮气氛围下于25℃反应12h。将反应后的聚合物纳米颗粒溶液转移至透析袋(14000KDa)中，于3L超纯水中透析4天，每天早晚各换水一次。透析结束后，将聚合物纳米颗粒溶液转入具塞离心管中，置于4℃冰箱留待备用。取5mL聚合物纳米颗粒溶液冷冻干燥，测定并计算聚合物纳米颗粒的产率为63.28％，溶液中聚合物纳米颗粒的质量浓度为2.28mg/mL。
实施例15
聚合物纳米颗粒的制备：称取摩尔百分数为98％的甲基丙烯酸甲酯和2％的N,N-亚甲基双丙烯酰胺于100mL圆底烧瓶中，加入5mL超纯水，超声5min使其充分溶解。向溶解好的功能单体溶液(总物质的量为0.8125mmol)中加入10mg十二烷基磺酸钠，补加二次蒸馏水至25mL，继续超声5min使其充分溶解后加入磁力搅拌子，用橡胶塞密封圆底烧瓶。将圆底烧瓶置于磁力搅拌器上，以160r/min的速度进行搅拌。将一根长的连接氮气钢瓶的针头穿过橡胶塞***到溶液底部，另一根短的针头***橡胶塞置于圆底烧瓶顶部，持续通氮气30min，以将反应溶液中溶解的氧气驱除完全。然后用微量注射器穿过橡胶塞加入1mL 过硫酸铵溶液(30mg/mL)和15μL四甲基乙二胺，继续通氮气15min后拔出通气针头，用封口膜密封橡胶塞，在氮气氛围下于25℃反应12h。将反应后的聚合物纳米颗粒溶液转移至透析袋(14000KDa)中，于3L超纯水中透析4天，每天早晚各换水一次。透析结束后，将聚合物纳米颗粒溶液转入具塞离心管中，置于4℃冰箱留待备用。取5mL聚合物纳米颗粒溶液冷冻干燥，测定并计算聚合物纳米颗粒的产率为61.24％，溶液中聚合物纳米颗粒的质量浓度为1.95mg/mL。
实施例16土壤Bt蛋白的提取分离
步骤1，提取：取0.5g土壤样品加入到10mL离心管中，加入8mL含0.5％(体积比)Tween-20的pH 8，10mM磷酸缓冲溶液，混合均匀，置于25℃恒温摇床中，以150r/min的转速恒温震荡30min。提取完成后，取出离心管于25℃，15000r/min离心8min。将上清液倒出至一支100KDa的超滤离心管中，于25℃，15000r/min超滤离心5min，以将没有完全离心下来的土壤胶体去除。
步骤2，吸附：将实施例2合成的聚合物纳米颗粒溶液用pH 8，10mM的磷酸缓冲溶液稀释成2mg/mL的溶液。向步骤1所得的土壤提取液中加入300μL上述配制的聚合物纳米颗粒溶液，调节并控制pH为8。混合均匀后，将离心管置于25℃恒温摇床中，以150r/min的转速恒温震荡30min。吸附完成后，取出离心管于25℃，15000r/min离心5min，上清液转移至一支新的离心管中。
步骤3，解吸：向步骤2离心下来的聚合物纳米颗粒中加入500μL pH 10，10mM的磷酸缓冲溶液，反复振荡使聚合物纳米颗粒均匀分散于解吸液中。混合均匀后，将离心管置于25℃恒温摇床中，以150r/min的转速恒温震荡30min。解吸完成后，取出离心管于25℃，15000r/min离心5min，收集上清液。
实施例2-15的原料种类、配比及反应条件见下表1。
表1实施例2-15的原料种类、配比及反应条件
试验例1聚合物纳米颗粒对Bt Cry1Ac蛋白的吸附容量和吸附平衡时间
吸附容量分析方法：将1mg/mL的Bt Cry1Ac蛋白母液用pH 8，10mM的磷酸缓冲溶液稀释至浓度分别为130，160，200，230，240，250和280μg/mL。将实施例2-15合成的聚合物纳米颗粒溶液用pH 8，10mM的磷酸缓冲溶液稀释至浓度均为0.2mg/mL。分别取250 μL不同浓度的Bt Cry1Ac蛋白溶液加入到2mL离心管中，然后加入250μL 0.2mg/mL的聚合物纳米颗粒溶液，充分混匀，置于25℃恒温摇床中以150r/min的转速恒温震荡2h。为了提高分析方法的准确度，同时做三组空白对照实验。其中，空白对照1为500μL pH 8，10mM 的磷酸缓冲溶液，空白对照2为250μL不同浓度的Bt Cry1Ac蛋白溶液加上250μL pH 8，10 mM的磷酸缓冲溶液，空白对照3为250μL pH 8，10mM的磷酸缓冲溶液加上250μL 0.2 mg/mL的聚合物纳米颗粒溶液。三组空白对照与聚合物纳米颗粒吸附实验在相同条件下进行。吸附完成后，于25℃，15000r/min离心5min，取上清液用BCA法检测Bt Cry1Ac蛋白浓度，检测波长为595nm。
蛋白质的吸附量Q(mg/g)按如下公式计算：
其中C0(μg/mL)为吸附体系中Bt Cry1Ac蛋白的初始浓度，计算其浓度时需要从空白对照2中扣除空白对照1的背景吸光度值。C(μg/mL)为聚合物纳米颗粒吸附后溶液中剩余的Bt Cry1Ac蛋白浓度，计算其浓度时需要将空白对照3测得的背景吸光度值扣除。V (mL)为吸附体系的总体积，m(mg)为溶液中聚合物纳米颗粒的质量，即聚合物纳米颗粒的浓度乘以吸附体系的总体积。
采用Langmuir拟合方程对上述等温吸附数据进行拟合，得到聚合物纳米颗粒对BtCry1Ac蛋白的最大理论吸附容量。
Langmuir拟合方程为：
其中，Ce(μg/mL)表示吸附平衡后Bt Cry1Ac的浓度，Q(mg/g)表示纳米颗粒对 BtCry1Ac的吸附量，Qmax(mg/g)表示最大吸附量，K(μg/mL)为吸附平衡常数。
吸附平衡时间分析方法：将1mg/mL的Bt Cry1Ac蛋白母液用pH 8，10mM的磷酸缓冲溶液稀释至浓度为160μg/mL。将实施例2-15合成的聚合物纳米颗粒溶液用pH 8，10mM 的磷酸缓冲溶液稀释至浓度均为0.2mg/mL。取250μL 160μg/mL的Bt Cry1Ac蛋白溶液分别加入到9支不同的离心管中(2mL)，然后在每支离心管中加入250μL 0.2mg/mL的实施例2-12合成的聚合物纳米颗粒溶液，充分混匀，置于25℃恒温摇床中恒温震荡，转速为150 r/min。恒温孵育1，2，4，7，10，20，40，75和120min后，各取出一支离心管，于25℃， 15000r/min离心5min，取上清液采用BCA法检测Bt Cry1Ac蛋白浓度，检测波长为595nm。为了提高分析方法的准确度，同时做三组空白对照实验。其中，空白对照1为500μL pH 8， 10mM的磷酸缓冲溶液，空白对照2为250μL不同浓度的Bt Cry1Ac蛋白溶液加上250μL pH 8，10mM的磷酸缓冲溶液，空白对照3为250μL pH 8，10mM的磷酸缓冲溶液加上250μL 0.2 mg/mL的聚合物纳米颗粒溶液。三组空白对照与聚合物纳米颗粒吸附实验在相同条件下进行。以吸附时间为横坐标，吸附量为纵坐标作图，得到Bt Cry1Ac蛋白在实施例2-15合成的聚合物纳米颗粒表面的动力学吸附曲线。从动力学吸附曲线上可以得出达到吸附平衡所需要的时间。
表2为上述实施例2-15合成的聚合物纳米颗粒对Bt Cry1Ac蛋白的吸附容量和吸附平衡时间。从表中可以看出，当合成的聚合物纳米颗粒侧链结构中不含有NITIHITDTNNK时(实施例13-15)，其对Bt Cry1Ac蛋白的亲和力非常低，最大吸附容量只有16～20mg/mL，而当反应体系中加入一定摩尔百分比(5～50％)的丙烯酰胺-NITIHITDTNNK-酰胺单体时(实施例2-12)，得到的聚合物纳米颗粒对Bt Cry1Ac蛋白的吸附容量显著增强(385～1095mg/g)，其最大吸附容量是没有丙烯酰胺-NITIHITDTNNK-酰胺单体时的19～68倍。同样地，由表可知，当反应体系中不含NITIHITDTNNK时(实施例13-15)，合成的聚合物纳米颗粒对BtCry1Ac蛋白的亲和速率比较慢，达到吸附平衡的时间需要30～40min，而当合成的聚合物纳米颗粒侧链结构中引入一定含量的NITIHITDTNNK时(实施例2-12)，其亲和速率明显加快，大约2min即可达到吸附平衡。以上结果表明利用本发明的技术方案得到的聚合物纳米颗粒对Bt Cry1Ac蛋白吸附容量高、吸附速率快，聚合物纳米颗粒侧链结构中引入的NITIHITDTNNK是使其具有非常高的吸附容量、极快的亲和速率的决定性因素。该类聚合物纳米颗粒具有昆虫受体钙粘蛋白Bt-R1的仿生特点，即以368RRPFNIGINNQQ379抗原决定簇为作用靶标，来实现对Bt Cry1Ac蛋白的特异性识别。
表2聚合物纳米颗粒对Bt Cry1Ac蛋白的吸附容量和吸附平衡时间
| 实施例 | 吸附容量mg/g | 吸附平衡时间min |
| 实施例2 | 1095 | 1.5 |
| 实施例3 | 385 | 2.1 |
| 实施例4 | 847 | 1.8 |
| 实施例5 | 435 | 1.9 |
| 实施例6 | 865 | 2.0 |
| 实施例7 | 887 | 1.7 |
| 实施例8 | 940 | 1.8 |
| 实施例9 | 675 | 1.6 |
| 实施例10 | 560 | 2.0 |
| 实施例11 | 585 | 1.8 |
| 实施例12 | 993 | 1.9 |
| 实施例13 | 20 | 40 |
| 实施例14 | 18 | 35 |
| 实施例15 | 16 | 30 |
试验例2聚合物纳米颗粒对Bt Cry1Ac蛋白的选择性吸附能力
选择性吸附实验方法：用pH 8，10mM的磷酸缓冲溶液对不同种类的Bt Cry族蛋白和常规模式蛋白母液进行稀释，得到浓度均为240μg/mL的Bt Cry1Ac、Bt Cry1Ab、BtCry1C、Bt Cry1F、Bt Cry2A、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶(Try)、细胞色素C(Cyt C)和溶菌酶(Lys)工作溶液。将上述实施例2，7和8合成的聚合物纳米颗粒用pH 8，10mM的磷酸缓冲溶液配制成0.2mg/mL的溶液。分别将250μL 0.2mg/mL的聚合物纳米颗粒溶液与250μL 240μg/mL的蛋白工作液加入到2mL离心管中，混合均匀，置于25℃恒温摇床中，以150r/min的转速恒温震荡2h。同时做三组空白对照实验，空白对照 1为500μL pH8，10mM的磷酸缓冲溶液，空白对照2为250μL不同浓度的蛋白溶液加上250 μL pH 8，10mM的磷酸缓冲溶液，空白对照3为250μL pH 8，10mM的磷酸缓冲溶液加上 250μL 0.2mg/mL的聚合物纳米颗粒溶液。空白对照实验与聚合物纳米颗粒吸附实验在相同条件下进行。吸附完成后，于25℃，15000r/min离心5min，取上清液用BCA法检测蛋白浓度，检测波长为595nm。蛋白吸附量的计算方法同试验例1。
图1为上述实施例2，7和8合成的聚合物纳米颗粒对Bt Cry1Ac与其它Bt Cry族蛋白，如 Cry1Ab、Cry1C、Cry1F和Cry2A选择性吸附能力的比较。从图中可知，本发明合成的三种聚合物纳米颗粒对Bt Cry1Ac，Bt Cry1Ab，Bt Cry1C，Bt Cry1F和Bt Cry2A蛋白的吸附容量均很高，其吸附量为645～993mg/g。这主要是因为这些Bt Cry族蛋白具有非常高的同源性，其分子量、等电点、氨基酸序列和晶体结构均非常类似，而合成的聚合物纳米颗粒中引入的NITIHITDTNNK被证明是昆虫中肠受体钙粘蛋白Bt-R1与Bt Cry1Ac等蛋白特异性结合位点上的一段多肽。
图2比较了上述实施例2，7和8合成的聚合物纳米颗粒对Bt Cry1Ac与其他常规模式蛋白，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、胰蛋白酶、细胞色素C和溶菌酶的吸附能力。从图中可知，本发明得到的聚合物纳米颗粒对Bt Cry1Ac蛋白的吸附量远远高于人血清白蛋白、牛血清白蛋白、胰蛋白酶、细胞色素C和溶菌酶等模式蛋白。
图1，图2的研究结果表明，采用本发明得到的聚合物纳米颗粒对Bt Cry族，如BtCry1Ac，Bt Cry1Ab，Bt Cry1C，Bt Cry1F和Bt Cry2A蛋白具有很强的特异性。这个特性对水、土壤以及生物介质中Bt Cry族蛋白的提取、分离、纯化以及检测均具有非常重要的意义。比如，市场上存在的基于生物抗体制备的酶联免疫试剂盒，一次只能检测出一至两种Bt蛋白。而 Bt蛋白的种类非常多，目前已经成功转入水稻和棉花等农作物的就有好几种。因此，在实际样品分析时，要验证一个样品是否含有Bt蛋白，需要选择不同的酶联免疫试剂盒分别进行检测，才能给出明确的检验结果。这不仅会增加检测工作的强度，而且容易导致检测成本的大幅提高。而本发明得到的聚合物纳米颗粒对多种Bt Cry族蛋白均具有很强的识别能力，因此如果以其作为仿生抗体来生产酶联免疫试剂盒，则有望取代商用试剂盒用于水、土壤和转基因作物中Bt蛋白的检测。同样，以本发明合成的聚合物纳米颗粒为吸附剂材料，可以实现水和土壤等环境介质中痕量Bt蛋白的提取、分离和富集，以减少检测过程中出现的“假阴性”结果。
试验例3Bt Cry1Ac蛋白在聚合物纳米颗粒表面的pH敏感型吸附和解吸行为
pH敏感型吸附-解吸实验：用pH 8，10mM的磷酸缓冲溶液配制浓度为200μg/mL的BtCry1Ac蛋白溶液。将上述实施例2合成的聚合物纳米颗粒用相同的缓冲溶液配制成浓度为0.2mg/mL的聚合物纳米颗粒溶液。取2个2mL离心管(编号A、B)，分别加入250μL 0.2 mg/mL的聚合物纳米颗粒溶液和250μL 200μg/mL的Bt Cry1Ac蛋白溶液，置于25℃恒温摇床中震荡30min，转速为150r/min。吸附完成后，于25℃，15000r/min离心5min，吸附了 Bt Cry1Ac蛋白的聚合物纳米颗粒沉降在A、B离心管的底部。将上清液完全倒出至另外两个2mL离心管中(编号2、4)。同时，做空白实验(编号C)。空白对照溶液为250μL 200μg/mL 的Bt Cry1Ac蛋白溶液加上250μL pH 8，10mM的磷酸缓冲溶液。其操作方法与A和B相同，吸附完成后，离心得到上清液，将上清液倒出至另外一个2mL离心管中(编号1)。向A、 B两管中分别加入500μL的超纯水，洗去纳米颗粒表面物理吸附的Bt Cry1Ac蛋白溶液，离心后收集上清。然后向A、B两管中加入500μL pH分别为10和11的10mM磷酸缓冲溶液，反复振荡使聚合物纳米颗粒均匀分散。将离心管置于25℃摇床中恒温震荡30min，转速为 150r/min，使吸附的Bt Cry1Ac蛋白从聚合物纳米颗粒上解吸下来。解吸完成后，取出离心管于25℃，15000r/min离心5min，将上清液完全倒出至另外两个2mL离心管中(编号3、5)。分别从1、2、3、4、5号离心管中取出20μL样品，加入上样缓冲液，煮沸后进行SDS-PAGE 凝胶电泳分析。
图3为原始蛋白溶液、吸附后上清液以及洗脱后上清液的SDS-PAGE凝胶电泳分析结果。其中，条带1为吸附前的原始Bt Cry1Ac蛋白(空白实验)，条带2和4为pH 8吸附后上清液中剩余的Bt Cry1Ac蛋白，条带3和5为pH 10和11解吸后上清液中洗脱出的 Bt Cry1Ac蛋白。与条带1相比，条带2和4明显变窄，且颜色变浅，说明大部分Bt Cry1Ac 蛋白被吸附到聚合物纳米颗粒上。而条带3和5颜色变化不大，其宽度也与条带1相当，说明Bt Cry1Ac蛋白解吸完全。图3的研究结果表明，本发明得到的聚合物纳米颗粒是一种良好的pH敏感型材料，其对Bt Cry1Ac蛋白的吸附和解吸可以通过调节pH值轻易实现，为复杂水、土壤、重组蛋白以及生物介质中Bt Cry1Ac蛋白的提取、分离和纯化打下了良好的基础。
试验例4土壤Bt蛋白提取分离方法的建立
土壤标样的制备：向不含Bt Cry1Ac蛋白的土壤中添加一定浓度的Bt Cry1Ac蛋白溶液，混合均匀，放在4℃的冰箱中孵育一段时间，使土壤中Bt Cry1Ac蛋白的掺杂浓度分别为 0.0936，0.1196，0.2392，0.3588和0.4484μg/g。
土壤标样中Bt蛋白的提取分离：
步骤1，提取：取0.5g上述不同Bt Cry1Ac蛋白掺杂水平的土壤标样加入到10mL离心管中，分别加入8mL含0.5％(体积比)Tween-20的pH 8，10mM磷酸缓冲溶液，混合均匀，置于25℃恒温摇床中，以150r/min的转速恒温震荡30min。提取完成后，取出离心管于25 ℃，15000r/min离心8min。将上清液倒出至一支100KDa的超滤离心管中，于25℃，15000 r/min超滤离心5min，以将没有完全离心下来的土壤胶体去除。得到的土壤提取液用ELISA 法(检测波长为450nm)检测Bt Cry1Ac蛋白含量。
步骤2，吸附：将实施例2合成的聚合物纳米颗粒溶液用pH 8，10mM的磷酸缓冲溶液稀释成2mg/mL的溶液。向步骤1所得的土壤提取液中加入300μL上述配制的聚合物纳米颗粒溶液，调节并控制pH为8。混合均匀后，将离心管置于25℃恒温摇床中，以150r/min的转速恒温震荡30min。吸附完成后，取出离心管于25℃，15000r/min离心5min，上清液转移至一支新的离心管中。上清液中Bt Cry1Ac蛋白的含量采用ELISA法(检测波长为450nm) 进行检测，其检测结果即为土壤提取液中剩余的Bt Cry1Ac蛋白。
步骤3，解吸：向步骤2离心下来的聚合物纳米颗粒中加入500μL pH10，10mM的磷酸缓冲溶液，反复振荡使聚合物纳米颗粒均匀分散于解吸液中。混合均匀后，将离心管置于25℃恒温摇床中，以150r/min的转速恒温震荡30min。解吸完成后，取出离心管于25℃，15000r/min离心5min，收集上清液。上清液中Bt Cry1Ac蛋白的含量采用ELISA法(检测波长为450nm)进行检测，其检测结果即为聚合物纳米颗粒上解吸下来的Bt Cry1Ac蛋白。
表3列出了土壤标样中Bt Cry1Ac蛋白的提取、分离和富集结果。从表中可知，土壤标样中掺杂Bt Cry1Ac蛋白的原始浓度为0.0936-0.4484μg/g。采用步骤1方法对土壤样品进行提取后，土壤提取液中Bt Cry1Ac蛋白的浓度为0.2376-1.890ng/mL，其含量均低于酶联免疫分析法的最低检测限2ng/mL。土壤中Bt Cry1Ac蛋白的提取率只有4.0-7.5％，这也是导致土壤中Bt蛋白“假阴性”结果的主要原因。利用实施例2合成的聚合物纳米颗粒对土壤提取液进行一轮简单的吸附和解吸过程以后，Bt Cry1Ac蛋白得到富集和浓缩，其浓度从原来的0.2376-1.890ng/mL提高到3.024-17.03ng/mL，富集倍数达到9-12.7倍，完全能够满足酶联免疫分析的浓度要求。以土壤中掺杂的Bt Cry1Ac蛋白浓度为横坐标，聚合物纳米颗粒上解吸下来的Bt Cry1Ac蛋白浓度为纵坐标作图，对其进行线性拟合，得到的标准曲线的线性相关系数约为0.9476。以上结果表明，本发明建立的土壤Bt蛋白提取、分离和富集方法具有高的灵敏度和良好的线性，能够满足实际土壤样品中Bt蛋白的检测要求。
采用实施例16的步骤对某水稻田采集的三个土壤样品进行提取、分离和富集，然后采用ELISA法对解吸后离心分离得到的上清液进行检测，与上述建立的土壤Bt蛋白浓度-解吸后上清液浓度标准曲线进行对照，均未检测出Bt蛋白。
表3土壤中Bt Cry1Ac蛋白的提取、分离和富集结果
提取率a)(％)＝(提取液浓度×8)/(土壤浓度×1000×0.5)×100
提取率b)(％)＝(土壤提取液浓度×8-吸附后上清液浓度×8)/(土壤提取液浓度×8)×100
解吸率c)(％)＝(解吸后上清液浓度×8)/(土壤提取液浓度×8-吸附后上清液浓度×8)×100
富集倍数d)＝(解吸后上清液浓度×8)/(土壤提取液浓度×8)。
<110> 华中农业大学
<120> 一种Bt蛋白仿生亲和材料及其制备方法和应用
<160> 1
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
Asn Ile Thr Ile His Ile Thr Asp Thr Asn Asn Lys
1 5 10
Claims (10)
1.一种Bt蛋白仿生亲和材料，它是模拟Bt Cry1Ac蛋白与烟草天蛾中肠刷状缘膜囊受体钙粘蛋白Bt-R1之间的分子识别机制，以人工合成的丙烯酰胺-多肽单体与其它共存单体反应后得到的聚合物纳米颗粒，所述多肽的氨基酸序列为NITIHITDTNNK，所述共存单体为丙烯酰胺类和/或丙烯酸酯类化合物。
2.一种制备Bt蛋白仿生亲和材料的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)人工合成丙烯酰胺-多肽单体，所述多肽的氨基酸序列为NITIHITDTNNK；
2)以过硫酸铵为引发剂、四甲基乙二胺为催化剂，将丙烯酰胺-多肽单体与其它共存单体反应得到聚合物纳米颗粒，所述共存单体为丙烯酰胺类和/或丙烯酸酯类化合物。
3.如权利要求2所述的制备Bt蛋白仿生亲和材料的方法，其特征在于：所述聚合反应在氮气保护氛围下，于4～40℃条件下进行。
4.如权利要求2所述的制备Bt蛋白仿生亲和材料的方法，其特征在于：所述丙烯酰胺-多肽单体与其它共存单体的摩尔比为5～50：95～50。
5.如权利要求2所述的制备Bt蛋白仿生亲和材料的方法，其特征在于：所述过硫酸铵在反应体系中的浓度为6～120mg/25ml。
6.如权利要求2所述的制备Bt蛋白仿生亲和材料的方法，其特征在于：所述四甲基乙二胺在反应体系中的浓度为5～25μl/25ml。
7.如权利要求2所述的制备Bt蛋白仿生亲和材料的方法，其特征在于：所述反应体系中含有0～30mg/25ml的表面活性剂，所述表面活性剂为十二烷基磺酸钠。
8.一种土壤Bt蛋白的提取分离方法，其特征在于：首先对土壤中的Bt蛋白进行提取，然后向提取液中加入权利要求1所述的Bt蛋白仿生亲和材料为吸附剂，调节吸附pH为6～9，对提取液中的Bt蛋白进行吸附，最后在解吸pH为10～13的条件下使吸附剂上的Bt蛋白解吸。
9.如权利要求8所述的土壤Bt蛋白的提取分离方法，其特征在于：所述吸附pH为8。
10.如权利要求8所述的土壤Bt蛋白的提取分离方法，其特征在于：所述解吸pH为10。
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