FI72127C - Ett latex, biologiskt aktiv latexkonjugat och ett foerfarande foer deras framstaellning. - Google Patents

Description

1 72127

Lateksi, biologisesti aktiivinen lateksikonjugaatti ja menetelmä niiden valmistamiseksi

Keksintö koskee lateksia, jota käytetään konjugaat-5 tien valmistukseen biologisesti aktiivisten aineiden kanssa, biologisesti aktiivista lateksikonjugaattia ja menetelmää näiden valmistamiseksi. Biologisesti aktiiviset lateksikon-jugaatit ovat sopivia ennenkaikkea serologisia tai immunologisia määritysmenetelmiä varten.

10 On tunnettua lisätä tällaisten määritysmenetelmien herkkyyttä käyttämällä indikaattori- tai kantajaosasia, jotka on kuormitettu vastaavalla immunologisella reagens-silla. Biologisen kantajan, kuten punaisten verisolujen tai soluviljelyn solujen ohella, käytetään erikoisesti la-15 teksihiukkasia, joiden läpimitta on 0,C3 - 5 ,um. Lisääntyneestä käytöstään huolimatta on lateksitestimenetelmällä tähän asti ennen kaikkea haittoina, että kuormitetut latek-sihi.ukkaset reagoivat toistensa kanssa ei-spesifisesti, että immunolgoiset reagenssit kun ne joutuvat kosketukseen 20 lateksihiukkasten pinnan kanssa menettävät biologisen aktiivisuutensa tai että hiukkaset desorboivat ne.

On käynyt ilmi, että immunologisen reagenssin kemiallinen sitominen kantajaan on selvästi aikaisemmin käytettyä fysikaalista pinta-adsorptiota parempi.

25 Tähän asti on kantajan ja immunologisesti aktiivisen aineksen liittämiseksi toisaalta käytetty menetelmiä, jotka vaativat bifunktionaalisen kytkentäaineen, joka yhdistää proteiinin reaktiokykyiset ryhmät kantajahiukkaset reaktio-kyky isten ryhmien kanssa. Näiden menetelmien haittana on, 30 että sivureaktiona voi tapahtua ei-toivottu käytettyjen immunologisesti aktiivisten ainesten silloittuminen ja nämä tämän johdosta inaktivoituvat tai menevät hukkaan kytkentää varten kantajan kanssa.

Edelleen tunnetaan menetelmiä, joissa liittäminen ta-35 pahtuu mukaanpolymeroitujen pinnallisten epoksiryhmien avulla tai diatsotoituvien aromaattisten aminoyhdisteiden avulla. Yleisesti näillä menetelmillä on haittana, että nämä 2 72127 lateskin reaktiokykyiset ryhmät voivat reagoida immunologi-sesti aktiivisten aineisten lukuisten funktionaalisten ryhmien kanssa. Tämän vaikutuksesta voi syntyä ei-toivottuja sidoksia, jotka tuhoavat immunologisesti aktiivisen aineen 5 reaktiokykyisyyden steerisistä syistä tai ulkomuodon muutosten vaikutuksesta. Eräs haitta on edelleen, että nämä sitomiskykyiset ryhmät ovat epästabiileja, koska epoksidit hajoavat esimerkiksi hydrolyysin vaikutuksesta, niin että tällaiset aktiiviset lateksihiukkaset eivät säily pitempää 10 aikaa.

Syntyi siis tarve löytää kantaja, joka on yksinkertaisesti valmistettavissa ja joka voidaan kytkeä myös herkkien immunologisesti aktiivisten aineisten kanssa diagnostisesti käyttökelpoiseksi reagenssiksi. Sidotun aineksen reaktio-15 kykyisyyden tulee säilyä kauan. Reagenssin tulee reagoida spesifisesti ja herkästi.

Nyt keksittiin yllättäen, että mainittuun tarkoitukseen sopivia kantajia saadaan, kun vesipitoisessa väliaineessa esivalmistettuja lateksiytimiä paisutetaan vinyyli-20 monomeerien kanssa, jotka sisältävät happoamidiryhmien kautta sidottuja asetaaliryhmiä, ja nämä vinyylimonomeerit, joiden täytyy olla riittävästi veteen liukenemattomia, yhdessä lisämonomeerien kanssa, jotka voivat olla luonteeltaan hydrofiilisiä tai ionisia, kopolymeroidaan. Radikaali-25 ketjupolymeroinnin initiaattoreina voidaan käyttää sekä öljy- että myös vesiliukoisia radikaalinmuodostajia. Erityisen käyttökelpoisia hydrofiilisiä komonomeerejä ovat met-akryyli- tai akryylihappo tai metakryyli- tai akryyliamidi-johdannaiset.

30 Hydrofiilisten monomeerien käyttökelpoisuudella on erityinen merkitys sidottujen immunologisesti aktiivisten ainesten pysyvyydelle, koska herkät proteiinit esimerkiksi hydrofobisten pintojen vaikutuksesta voivat muuttua ulkomuodoltaan ja inaktivoitua. Hiukkasia, joilla on hydrofii-35 linen pinta, voidaan myös sen takia pitää parempina, koska niillä tapahtuu vähemmän ei-spesifisiä vuorovaikutuksia toisensa kanssa. Nämä ovat eräs olennainen syy vääriin testituloksiin .

3 72127

Keksinnön yhtenä kohteena on siis menetelmä biologisesti aktiivisten lateksikonjugaattien valmistamiseksi, jossa menetelmässä sidottavien aneiden aminoryhmiä pelkistävän aminoinnin periaatteen mukaisesti kytketään aldehydi-5 ryhmiin lateksihiukkasten pinnalla. Näitä aldehydiryhmiä voidaan valmistaa asetaaliryhmistä lyhyesti hapottamalla. Tällä on se etu, että aldehydiryhmiä kantavia lateksihiuk-kasia voidaan kuormittamattomina varastoida pysyvien ase-taalien muodossa ja ilman kytkentäainetta muuttaa sitomis-10 aktiiviseen muotoon. Edelleen tekee pelkistävä aminointi mahdolliseksi biologisesti aktiivisten aineiden erittäin säilyttävän sidoksen, koska selektiivisesti sitoutuvat vain niiden aminoryhmät, joita esimerkiksi proteiineissa on käytettävissä suuri lukumäärä ja tällä kytkentämenetelmällä 15 säilyttävät luontaisen varausmuotonsa. Muihin menetelmiin verrattuna tämä menetelmä on myös erittäin säästävä, koska kemiallinen sitoutuminen tapahtuu nopeasti ja fysiologisessa pH-arvossa.

Keksinnön kohteena tämän mukaisesti on uudenlainen 20 lateksi, jota käytetään konjugaattien valmistukseen biologisesti aktiivisten aineiden kanssa, ja jolle on tunnusomaista, että sen muodostaa tunnetusta lateksista koostuva sisus ja kahden tai useamman etyleenisesti tyydyttämättömän monomeerin, joista ainakin yksi on kaava I mukainen:

25 O

Il /OR

CH=C—C—N-(CH ) -CH ^ (I) |l I ^ n \ R. R0 H OR.

12 4 jossa n = 1-6, R^ = H, R2 = H, CH^ ja R^ ja R^ = ^2~Ce~ 30 alkyyliryhmä kopolymeeristä koostuva kuori.

Tällaisia latekseja voidaan valmistaa oksaskopoly-meroimalla tavallisille perinnäisille lateksihiukkasille, joita voidaan saada tunnetuilla menetelmillä monomeerien homo- tai kopolymeraatteina, jollaisia on kuvattu esimer-35 kiksi DE-hakemusjulkaisussa 29 07 794.

4 72127

Edullisia monomeerejä oksaskopolymerointia varten pintakerroksen valmistamiseksi lateksihiukkasille ovat seokset, joissa on yksi tai useampi ytimen valmistukseen käytetyistä monomeereistä ja lisäksi kopolymeroituvia ety-5 leenisesti tyydyttämättömiä yhdisteitä, joissa on päissä sijaitsevia asetaaliryhmiä. Nämä voivat olla kaavan I mukaisen metakryylihapon johdannaisia, mutta kuitenkin näyttävät myös muut asetaaliryhmiä sisältävät monomeerit sopivilta, niin kauan kuin ne ovat veteen riittävän liukenemat-10 tornia, sillä muuten tapahtuisi oksastumisen asemesta poly-styreenilateksille polymeroituminen vesipitoisessa faasissa.

Muina lisäaineina voidaan käyttää hydrofiilisiä mono-meerejä (esim. hydroksietyyliakryyliamidia ja muita hydrok-syyliryhmiä sisältäviä monomeerejä). Erityisen edullista 15 on pienten määrien ionisia komonomeerejä, kuten esimerkiksi akryylihapon, metakryylihapon tai akryyliamidopropaanisulfo-nihapon käyttö anionisina monomeereinä tai 4-vinyylipyri-diinin tai met.akryylianidopropyylitrimetyyliammoniumklo-ridin käyttö kationisina monomeereinä. Nämä myötävaikutta-20 vat huomattavassa määrässä lateksin stabilointiin.

Muuttamalla yksinkertaisesti oksastettavien monomee-rien sekoitussuhdetta voidaan oksaskerros tähdätysti sovittaa olosuhteille kulloinkin käytetyn immunologisesti aktiivisen aineen optimaalista sitomista ja pysyvyyttä varten.

25 Oksaskerroksen rakentelua ja kantaja-reagenssisidok- sen pysyvyyttä varten on suuri merkitys sillä, että poly-meroiva vinyyliryhmä on kytketty molekyyliin kulloisenkin funktionaalisen pään kanssa happoamidisidoksen kautta.

Tosin voidaan kuvatunlainen päälleoksastus suorittaa mono-30 meereillä, jotka sisältävät esterisidoksia happoamidisidos-ten asemesta, esimerkiksi (met)akryylihappoetyyliesteridi-n-pentyyliasetaatilla tai hydroksietyyli(met)akrylaatilla. Esteriryhmä voi kuitenkin kaikissa pH-arvoissa, jotka ovat pienempiä tai suurempia kuin pH 7, jollaisia voi esiintyä 35 lateksien aktivoinnissa, kytkemisessä tai varastoinnissa, lohjeta hydrolyyttisesti olennaisesti helpommin pois kuin vastaava akryyliamidi- tai metakryyliamidijohdannainen.

it.

72127

Keksinnön mukaisen modifioidun polystyreenilateksin valmistamiseksi sekoitetaan yleensä esivalmistettu poly-styreenilateksi, jolla on mielivaltainen hiukkaskoko, n. 40-70 %:n kanssa emulgaattorin määrästä, joka olisi tarpeen 5 sen pinnan maksimaalisesti peittämiseksi, senjälkeen lisätään oksasmonomeerien seos, lateksi paisutetaan ja polyme-roidaan.

Keksinnön mukaisen lateksikonjugaatin valmistamiseksi saatetaan edellä kuvattujen oksaspolymeroitujen lateksihiuk-10 kasten suspensio happoa lisäämällä pH-arvoon alle 2, inku-boidaan ja neutraloinnin jälkeen inkuboidaan suspensio sidottavan immunologisesti aktiivisen aineksen kanssa sopivan pelkistimen läsnäollessa. Edullisesti käytetään pelkistykseen natriumsyaaniboorihydridin liuosta neutraalissa pusku-15 rissa.

Sitomisreaktion jälkeen saattaa olla tarkoituksenmukaista "sinetöidä" ylimääräisiä aldehydiryhmiä lisäämällä yhdiste, jossa on vapaita aminoryhmiä, edullisesti puskurissa .

20 Monia käyttötarkoituksia varten on mahdollisesti si toutumattoman immunologisesti aktiivisen aineksen tai muiden epäpuhtauksien erottaminen reaktiopanoksesta linkoamalla tai pesemällä sopivilla membraaneilla paikallaan.

Näitä lateksikonjugaatteja voidaan käyttää erilaisis-25 sa diagnostisissa menetelmissä, esimerkiksi aineiden kvalitatiivisissa tai puolikvantitatiivisissa määrityksissä la-teksiagglutinaatiotestien avulla, esimerkiksi lasikantajilia, hivenproteiinien nefelometriseen tai turbidimetriseen määritykseen suorassa tai kilpailevassa agglutinaatiotes-30 tissä tai lateksiestotestissä.

Esimerkki 1

Metakryyliamidiasetaldehydidi-n-pentyyliasetaalin (1) valmistus

Aminoasetaattialdehydidi-n-pentyyliasetaalia valmiste-35 taan trans-asetatoimalla aminoasetaldehydidimetyyliasetaa-lia pentanolilla Juret'in ja Chin'in julkaisussa J. Am.

Chem. Soc. §3 (1961) 1560 esittämän yleisen ohjeen mukaisesti seuraavasti.

6 72127

Monomeeri (I) valmistetaan saattamalla metakryylihap-pokloridi ja aminoasetaldehydidi-n-pentyyliasetaali reagoimaan vedettömässä liuoksessa.

Tätä varten pannaan 7,2 g aminoasetaldehydidi-n-pen- _9 5 tyyliasetaalia (3,3 x 10 " moolia) ja 9,1 g K CO, (6,6 x -2 2. i 10 moolia) typpiatmosfäärissä 20 ml:aan vedetöntä kloroformia ja jäähdytetään 0°C:seen. Tähän lisätään sekoittaen ja tiputtaen 30 minuutin aikana 3,4 g metakryylihappoklori-_2 dia (3,3 x 10 moolia), liuotettuna 20 ml:aan kloroformia. 10 Yhteensä 90 minuutin kuluttua seoksen annetaan hitaasti lämmetä huoneen lämpötilaan.

Reaktioseokseen lisätään vettä, kloroformifaasi erotetaan, kuivataan ja huoneen lämpötilassa tuote (I) vapautetaan tyhjössä liuottimesta. Tällöin on kysymyksessä 6,0 g 15 kellertävää, viskoosista öljyä (saalis 64 %), jota ei voida tislata, koske se korotetussa lämpötilassa nopeasti poly-meroituu.

Esimerkki 2 a) (1):n oksaskopolymerointi polystyreenilateksille 20 veteen liukenemattoman radikaalin muodostajan kanssa 47 ml saippuasta vapaata polystyreenilateksia (vastaa 4 g:n kuiva-ainepitoisuutta), jonka keskimääräinen osas-läpimitta on 196 nm, tuodaan yhdessä 0,0486 g:n natriumdo-dekyylisulfaattia, 33 ml:n I^O, 0,66 g:n metakryyliamido-25 asetaldehydidi-n-pentyyliasetaalia, 0,33 g:n metakryylihap-poa ja 0,01 g:n atso-bis-isobutyronitriiliä kanssa reaktio-astiaan. Seoksesta poistetaan useampaan kertaan varovasti kaasu ja huuhdellaan typellä. Tämän seoksen annetaan sekoi-tuksenalaisena emulgoitua huoneen lämpötilassa yksi tunti 30 ja polymeroidaan senjälkeen 5 tuntia 70°C:ssa.

Jäähdytetty lateksi puhdistetaan ultrasuodattamalla. Karboksyyliryhmien pitoisuus (potentiometrisellä titrauk-sella) on 0,23 mval COOH/g polymeeriä, aldehydiryhmien pitoisuus (asetaalien happolohkaisun ja titrauksen jälkeen 35 hydroksyyliamiinilla) on 0,13 mval aldehydiä/g polymeeriä.

7 72127 b) (1):n oksaskopolymerointi polystyreenilateksille vesiliukoisen radikaalin muodostajan kanssa 47 ml saippuasta vapaata polystyreenilateksia (vastaten 4 g:n kuiva-ainepitoisuutta), joka keskimääräinen osas-5 läpimitta on 196 nm, pannaan yhdessä 0,0486 g:n natriumdode-kyylisulfaattia, 32 ml:n I^O, 0,4 g:n metakryyliamidoaset-aldehydidi-n-pentyyliasetaalia, 0,4 g:n styreeniä ja 0,2 g:n metakryylihappoa kanssa reaktioastiaan. Seoksesta poistetaan varovasti kaasu useampaan kertaan ja huuhdellaan typellä.

10 Tämän seoksen annetaan emlugloitua huoneen lämpötilassa 1 tunti, lämmitetään senjälkeen 70°C:seen, ja vielä 15 minuutin sekoittamisen jälkeen kopolymerointi aloitetaan ruiskuttamalla seokseen 0,016 g kaliumperoksidisulfaattia, liuotettuna 1 ml:aan vettä. Polymeroituminen tapahtuu 5 tuntia 15 70°C:ssa. Jäähdytetty lateksi puhdistetaan uitrasuodattantal la. Karboksyyliryhmien pitoisuus on C,1 mval/g, aldehydi-ryhmien pitoisuus on samoin 0,1 mval/g, uusi keskimääräinen osasläpimitta on 207 nm.

Esimerkki 3 20 Kilpaileva lasernefelometrinen testi /*SP1-glykopro- teiinin osoittamiseksi a) /^SP1 - lateksikonjugaatin valmistus Lateksiaktivointia varten inkuboidaan 3 ml 5-%:sta lateksisuspensiota esimerkistä 2b 300 /jl:n kanssa 20-%:sta 25 Tween ' 20-liuosta 1 tunti huoneen lämpötilassa. Sitten pH asetetaan 6,5:een lisäämällä 250 yul 1 n NaOH ja kyllästettyä dinatriumvetyfosfaattiliuosta. Tällä inkuboidaan 1,5 ml 1 mg/ml /*SP1 -glykoproteiiniliuosta ja 1 mg/ml ihmisen seerumialbumiinia fysiologisessa keittosuolaliuoksessa (PBS) 30 sekä 1,5 ml natriumsyaaniboorihydridin 0,5-%:sta liuosta fosfaattipuskuroidussa keittosuolaliuoksessa yli yön +4°C:ssa. Ylimääräisten aldehydiryhmien sinetöimiseksi lisätään 1,2 ml 0,5-moolista etanoliamiinihydrokloridiliuosta (pH 8,5) ja 0,3 ml 2,5-%:sta natriumboorihydridiliuosta ja 35 panosta inkuboidaan 1 tunti +4°C:ssa. Tämän jälkeen /3SP1- lateksikonjugaatti lingotaan eroon ja sakka kootaan 3 ml:aan (R) PBS, jossa on 0,2 % Tween 20.

8 721 27 b) Testin suorittaminen

Seeruminäytteitä esilaimennetaan 1:5:een PBSrllä, jos-(R) sa on 1,7 % Tween 20. Standardina käytetään /’SPI-glyko-proteiinia (Behringwerke AG), laimennettuna 1:5:een PBS:llä, 5 jossa on 1,7 % Tween 20 sekä 20 % ihmisseerumia miespuolisilta verenluovuttajilta. Mittausta varten sekoitetaan ky-vettiin 100 /il laimennettua näytettä tai standardia, 100 Pekani in in antiseerumia ihmis-^SP1-glykoproteiinia (1:3200 0,1 moolisessa glysiinipuskurissa pH 8,2 laimennttuna 10 1 %:sella NaCl:lla) vastaan ja 200 /ui PBSillä, jossa on (R) 1,7 % Tween 20, 1:100:aan laimennettua lateksireagenssia.

Panosta inkuboidaan 3 tuntia huoneen lämpötilassa ja mitataan senjälkeen lasernefelometrissä (Behringwerke AG). Tuntemattomille näytteille mitatut hajavalosignaalit ana-15 lysoidaan vertailukäyrän perusteella, joka on valmistettu standardilaimennusten avulla. Mittausalue ulottuu n. 2,5 /ig/ml:sta 50 ng/ml:aan pSP1-glykoproteiinia.

Esimerkki 4

Tetanustoksoidispesifisten vasta-aineiden suora nefe-20 lometrinen määritys

Tetanustoksoidilateksikojugaattien valmistus suoritetaan yhdenmukaisesti esimerkin 3 kanssa lähtien 3 ml:sta 5-%:sta lateksisuspensiota ja 1,5 ml:sta tetanustoksoidi-liuosta, jossa on n. 3000 Lf/ml. Tällä tavalla saadaan 3 ml 25 tetanustoksoidilateksikonjugaattia. Standardina käytetään ihmisen gammaglobuliini-yhdistelmänäytettä (160 mg/ml), jolla on n. 20 IE/ml:n tetanustoksoidispesifinen vasta-ai- (R) ne-aktiivisuus (Beringlobin , Behringwerke AG) laimennuksissa 1:80 - 1:5120 0,1-moolisessa glysiinipuskurissa, pH 30 8,2, jossa on 1 % keittosuolaa.

Ennen mittausta potilasseerumeja laimennetaan 1:100:aan tai 1:20:een 0,1-mooliseen glysiinipuskuriin pH

8,2, jossa on 1 % NaCl. Testipanokseksi sekoitetaan kyvet-tiin 100 /il laimennettua näytettä tai standardia 200 /ui:ään 35 PBS:llä, jossa on 0,2 % Tween 20, 1:25:een laimennettua lateksikon jugaattisuspensiota. 2 tunnin kuluttua määritetään 9 72127 hajovalosignaali laserfotometrillä ja arvostelu suoritetaan standardilaimennuksia varten valmistetun vertailukäyrän perusteella.

Esimerkki 5 5 Hapteenin osoitus lateksiagglutinaatioestolla

Epsilon-dinitrofenyyli-L-lysiinilateksikonjugaattien valmistus suoritetaan yhdenmukaisesti esimerkin 3 kanssa lähtien 3 ml:sta 5-%:sta lateksisuspensiota ja 1,5 mlrsta epsilon- dinitrofenyyli-L-lysiinin 0,66-%:sta liuosta (DNP-Lys) 10 firmasta SERVA, Heidelberg. Ylimääräisten aldehydiryhmien salpaamisen jälkeen hapteenilateksikonjugaatti (DNP-lateksi) lingottiin eroon, suspendoitiin uudelleen 10 ml:aan PBS, {R) jossa oli 0,2 % Tween 20 ja koottiin toistetun linkoami- (R) sen jälkeen 3 ml:aan PBS, jossa oli 0,2 % Tween 15 DNP-lateksisuspensio sekoitetaan vuohesta saadun vas- taseerumin kanssa dinitrofenyylitähdettä vastaan (firma Paesel, Frankfurt) lateksitestilevyjen (firma Behringswerke AG) reaktioalueilla ja saadaan sopivassa laimennuksessa agglutinaatio, jonka reaktiovoimakkuus tavallisten arvoste-20 luperusteiden mukaan silmämäärisesti voidaan arvioida 4+:ksi. Kuten taulukossa 1 esitetään voidaan agglutinaatio-reaktio estää lisäämällä hapteenia (DNP). Tätä voidaan käyttää hapteenin osoittamisen näytenesteessä.

Taulukko 1 25 DNP-Lys'in väkevyys lisätyssä näytenesteessä (PBS) μg/ml:ssa 0 0,5 1 2 10 30 Agglutinaatio-reaktion voimakkuus 4+ 2-3+ 1-2+0 0

Claims (5)

10 72127

1. Lateksi, jota käytetään konjugaattien valmistukseen biologisesti aktiivisten aineiden kanssa, tunnet-5 t u siitä, että sen muodostaa tunnetusta lateksista koostuva sisus ja kahden tai useamman etyleenisesti tyydyttämättömän monomeerin, joista ainakin yksi on kaava I mukainen : 0 ^OR. , Λ II / 3

10 CH=C-C-N-(CH0) -CH (I) III 2 n \ R1 R2 H 0R4 jossa n = 1-6, R1 = H, R2 = H, CH3 ja R3 ja R4 = C2~C6~ alkyyliryhmä kopolymeeristä koostuva kuori.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen lateksi, tun nettu siitä, että sisus koostuu polystyreenistä ja kuori metakryyliamidoasetaldehydidi-n-pentyyliasetaalin, metakryylihapon ja mahdollisesti muiden etyleenisesti tyydyttämättömien monomeerien kopolymeraatista.

3. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen lateksin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että tunnettu lateksi sekoitetaan kaavan I mukaisen monomeerin ja yhden tai useamman etyleenisesti tyydyttämättömän monomeerin ja pinta-aktiivisen aineen kanssa ja polymeroituminen pannaan alkuun 25 lisäämällä radikaalinmuodostajaa.

4. Lateksikonjugaatti, tunnettu siitä, että biologisesti aktiivinen aine on kovalenttisesti sidottu patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaiseen lateksiin.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukaisen lateksikonjugaatin 30 käyttö antigeenin, vasta-aineen tai hapteenin diagnostisesta osoittamiseksi. Il