CN109385475B - 一种用于评估***治疗婴幼儿血管瘤效果的产品 - Google Patents
一种用于评估***治疗婴幼儿血管瘤效果的产品 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医药领域,具体涉及一种用于评估***治疗婴幼儿血管瘤效果的产品。所述产品是试剂盒、设备、可操作***和/或它们的组合,所述产品包括:(1)用于测定对象的细胞中ID1及β‑actin表达丰度的试剂、仪器和/或***;(2)用于计算ID1相对表达量的模块和/或处理器;(3)用于根据ID1相对表达量评估***对对象的婴幼儿血管瘤治疗效果的模块和/或处理器。本发明为能够尽早发现婴幼儿血管瘤患者是否对***存在耐药性,有效评估***对婴幼儿血管瘤的治疗效果,提供了一种有效的评估方法,本发明评估方法可尽早发现患者是否对***具有耐药性,可及时对治疗方案进行调整,对患者的康复意义重大。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,具体涉及一种用于评估***治疗婴幼儿血管瘤效果的产品。
背景技术
婴幼儿血管瘤(Infantile Hemangiomas,IH)是一种常见的婴幼儿的血管性肿瘤,普通婴儿发病率高达5-10%,在早产儿中升至30%。其发病过程为产后数周内出现皮肤上点状红斑,进入快速增殖期,约一周岁后自发进入长达数年的消退期(Kilcline,C.,Frieden,I.J.(2008)Infantile hemangiomas:how common are they?A systematicreview of the medical literature.Pediatr Dermatol.25(2):168-173;Chang,L.C.,Haggstrom,A.N.,Drolet,B.A.,Baselga,E.,Chamlin,S.L.,Garzon,M.C.,Horii,K.A.,Lucky,A.W.,Mancini,A.J.,Metry,D.W.,Nopper,A.J.,Frieden,I.J.(2008)Growthcharacteristics of infantile hemangiomas:implications formanagement.Pediatrics.122(2):360-367)。IH好发于头颈部,严重影响患儿容貌、心理健康和病变器官的功能,临床上对于IH的治疗观点为尽早干预,但由于对其发病机制认识不足,缺乏科学的理论指导,致使治疗效果从整体上不尽人意(Neri,I.,Balestri,R.,Patrizi,A.(2012)Hemangiomas:new insight and medical treatment.DermatolTher.25(4):322-334),给患儿家庭带来了巨大的精神痛苦和经济负担。因此,对IH发病机制进行研究具有十分明显的社会意义和经济意义。近年来,口服***(Propranolol,PRO)被认为是一次治疗IH的突破,能够迅速抑制其快速发展,并得到了国内外专家的一致认可(Chen,Z.G.,Zheng,J.W.,Zhang,L.,Zhu,L.,Wang,Y.A.(2015)A survey on clinicaluse of propranolol for infantile hemangiomas in mainland China.Int J Clin ExpMed.8(2):2138-2146;Leaute-Labreze,C.,Voisard,J.J.,Moore,N.(2015)OralPropranolol for Infantile Hemangioma.N Engl J Med.373(3):284-285.)。但后续的临床研究发现,长期或过量用药会引发低血压、低血糖、心动过缓、心律失常等多种副作用,并非所有的IH患者均对其有效,甚至部分患儿在接受长期服药治疗后,最终仍需手术来纠正病变所带来的畸形(S.Causse,H.Aubert,M.Saint-Jean,E.Puzenat,A.C.Bursztejn,C.Eschard,E.Mahe,A.Maruani,J.Mazereeuw-Hautier,I.Dreyfus,J.Miquel,C.Chiaverini,O.Boccara,S.Hadj-Rabia,J.F.Stalder,and S.Barbarot.Propranolol-resistant infantile haemangiomas.Br J Dermatol.2013.169(1);125-129.
N.Shehata,J.Powell,J.Dubois,A.Hatami,E.Rousseau,S.Ondrejchak,andC.McCuaig.Late rebound of infantile hemangioma after cessation of oralpropranolol.Pediatr Dermatol.2013.30(5);587-591.
)。为探究PRO治疗IH的作用机理并减少副作用的发生,国内外众多学者进行了相关研究:血管瘤内皮细胞(hemangioma endothelial cells,HemECs)是研究IH发病机理的首选细胞,并且已成功使用HemECs注射裸鼠体内建瘤(刘超,秦中平,魏奉才,范招纳,赵雯静,王玉敏,卓绍杨,陈健,刘景鹏,刘少华.细胞注射法和组织块移植法在构建血管瘤动物模型中的比较.山东大学学报(医学版).2012.50(5);46-50.);Ji等(Y.Ji,S.Chen,K.Li,X.Xiao,S.Zheng,and T.Xu.The role of beta-adrenergic receptor signaling in theproliferation of hemangioma-derived endothelial cells.Cell Div.2013.8(1);1.)发现PRO主要是作用于HemECs,通过阻断β2肾上腺素受体(β-adrenergic receptors,β2-AR)与异丙肾上腺素等激动剂的结合,影响细胞内信号传导,抑制HemECs增殖、血管生成等成瘤效应,进而导致IH的消退、吸收;Stiles等(J.Stiles,C.Amaya,R.Pham,R.K.Rowntree,M.Lacaze,A.Mulne,J.Bischoff,V.Kokta,L.E.Boucheron,D.C.Mitchell,andB.A.Bryan.Propranolol treatment of infantile hemangioma endothelial cells:Amolecular analysis.Exp Ther Med.2012.4(4);594-604.)认为PRO抑制HemECs增殖的作用并非单一作用于内皮细胞相关机制,而是多项机制交互作用的结果;Lee等(D.Lee,E.Boscolo,J.T.Durham,J.B.Mulliken,I.M.Herman,and J.Bischoff.Propranololtargets the contractility of infantile haemangioma-derived pericytes.Br JDermatol.2014.171(5);1129-1137.)进一步研究了PRO对IH非内皮细胞的影响,发现除HemECs外,PRO还能抑制血管瘤周细胞增殖,但对血管瘤干细胞的影响较小。综上所述,PRO的出现为IH发病机制的研究提供了一定的契机,但现阶段依然没有突破性的进展。
因此,提供一种可评估***治疗效果的方法,减少***过量使用而产生的各种副作用,是目前婴幼儿血管瘤患者极为渴求的。
发明内容
本发明发现不同血管瘤内皮细胞中ID1的表达量能够影响***对血管瘤内皮细胞的抑制作用,基于此,本发明提供一种用于评估***治疗婴幼儿血管瘤效果的产品,从而能够尽早发现婴幼儿血管瘤患者是否对***存在耐药性,有效评估***对婴幼儿血管瘤的治疗效果。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
本发明第一个方面,提供ID1表达丰度检测试剂在制备评估***治疗婴幼儿血管瘤效果产品中的应用。
进一步的,所述ID1表达丰度为血管瘤内皮细胞中ID1表达丰度。
本发明第二个方面,提供一种用于评估***治疗婴幼儿血管瘤效果的产品,所述产品是试剂盒、设备、可操作***和/或它们的组合,所述产品包括:
(1)用于测定对象的细胞中ID1及β-actin表达丰度的试剂、仪器和/或***;
(2)用于计算ID1相对表达量的模块和/或处理器;
(3)用于根据ID1相对表达量评估***对对象的婴幼儿血管瘤治疗效果的模块和/或处理器。
进一步的,步骤(1)所述细胞为血管瘤内皮细胞。
进一步的,步骤(1)中用于测定对象的细胞中ID1及β-actin表达丰度的试剂、仪器和/或***是用于RT-PCR的试剂、仪器和/或***。
进一步的,所述产品还包括选自下组的一种或多种:
(A)用于采集、分离、筛选和/或培养血管瘤内皮细胞的试剂和/或仪器;
(B)用于存储和/或处理ID1相对表达量的数据库、模块和/或处理器;
(C)用于将对象的ID1相对表达量与对照比较以评估***对对象的婴幼儿血管瘤治疗效果的模块和/或处理器;
(D)用于提供判断阈值的模块和/或处理器;
(E)用于提供评估报告的模块和/或处理器;
(F)说明书或使用指南,其中记载了以下应用和判断方式:
a)用于评估***对对象的婴幼儿血管瘤的治疗效果:当ID1相对表达量不大于阈值时,则提示***会对该对象的婴幼儿血管瘤具有较好的治疗效果。
进一步的,所述最佳阈值及对象的ID1相对表达量的计算方法:以RT-PCR方法测定的β-actin表达量为对照,采用2-△△Ct方法计算得到。
进一步的,a)中预先设定的最佳阈值为5。
本发明第三个方面,提供调控血管瘤内皮细胞中ID1表达丰度的试剂在制备治疗婴幼儿血管瘤中控制***用量药物制剂中的应用;采用调控血管瘤内皮细胞中ID1表达丰度的试剂调控血管瘤内皮细胞中ID1相对表达量不大于5后,服用***且无需增加***的用量,即可实现***对婴幼儿血管瘤的有效治疗;从而减轻或避免由于增加***用量而产生的副反应。
进一步的,所述调控血管瘤内皮细胞中ID1表达丰度的试剂可为针对ID1基因的RNAi。
本发明取得的有益效果:
本发明首次发现分离自不同婴幼儿血管瘤患者的血管瘤内皮细胞中ID1表达情况存在显著差异,其中IH009和IH012细胞中ID1表达量低;IH021和IH004中ID1表达量显著高于IH009和IH012细胞;IH002和IH011细胞中ID1表达量显著高于IH021和IH004。本发明对ID1表达情况差异显著的IH009、IH004和IH011细胞株分别给药同等剂量的***,发现ID1表达随着给药时间的变化分别呈现不同的变化,给药2h后IH009中ID1表达呈显著下降趋势;而IH004和IH011细胞中ID1表达下降趋势不明显。本发明通过给药不同浓度的***,发现***对IH009细胞存活率影响最为显著。
因此,以血管瘤内皮细胞株IH009细胞中ID1相对表达量(相对表达量为5)为标准,当血管瘤内皮细胞中ID1的相对表达量不大于5时,可预测***对该血管瘤内皮细胞有显著的抑制效果,从而进一步可评估普耐洛尔对该患者的治疗效果显著。本发明为能够尽早发现婴幼儿血管瘤患者是否对***存在耐药性,有效评估***对婴幼儿血管瘤的治疗效果,提供了一种有效的评估方法,本发明评估方法可尽早发现患者是否对***具有耐药性,可及时对治疗方案进行调整,对患者的康复意义重大。
本发明通过进一步实验发现:过表达ID1可逆转***对血管瘤内皮细胞的抑制作用;干扰ID1表达可促进***对血管瘤内皮细胞的抑制作用。临床研究发现,婴幼儿血管瘤患者过量使用***会引发低血压、低血糖、心动过缓、心律失常等多种副作用。而采用调控血管瘤内皮细胞中ID1表达丰度的试剂调控血管瘤内皮细胞中ID1相对表达量不大于5后,服用***且无需增加***的用量,即可实现***对婴幼儿血管瘤的有效治疗;从而可减轻或避免由于增加***用量而产生的副反应。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1.ID1表达与***对HECEC增殖的反应有关:
A.用IHC染色法分析血管瘤(IH)、静脉畸形(VM)、***畸形(LM)和动静脉畸形(AVM)患者的增殖、消退期和消退完成期的Id1表达模式;
B.流式细胞术分析HemECs:灰度直方图显示细胞与GLUT1一起孵育,黑线显示细胞与对照抗体孵育;
C.用免疫印迹法检测57例IH患者细胞株ID1蛋白表达水平,并进行定量分析:分析和显示低ID1(IH00 9和IH012)、中ID1(IH021和IH004)和高ID1(IH002和IH011)的蛋白和mRNA表达,P<0.05被认为有统计学差异,*与IH009比较,#与IH004比较,△与IH011比较;
D.用10μm***治疗IH009、IH004和IH011细胞,在0,1,2、4、8h定量ID1表达;
E.用***梯度浓度处理IH009、IH021、IH004和IH011细胞2天,通过细胞计数检测细胞存活率。
图2.ID1恢复***抑制HemECs增殖实验:在***治疗下HemECs的增殖用过表达或敲除ID1进行分析:*与OC转染的HemECs进行比较;#与LTEN-ID1转染的HemECs进行比较;
图3.ID1逆转***对IH血管形成的反应:
A.小鼠模型的肿瘤形态;
B和C.小鼠模型的肿瘤血管密度显示和量化,*与OC转染的IH004比较;#与Lenti-ID1转染的IH004比较;△与SC转染的IH004比较;◇与Si-ID1转染的IH004比较。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
针对背景技术中提出的问题,本发明提供一种用于评估***治疗婴幼儿血管瘤预后的产品。
为使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本发明公开的技术方案。
ID1的序列信息如下所示(SEQ ID NO:1):
NCBI Reference Sequence:NM_002165.3
GenBank Graphics
>NM_002165.3:106-573 Homo sapiens inhibitor of DNA binding 1,HLHprotein(ID1),transcript variant 1,mRNA
ATGAAAGTCGCCAGTGGCAGCACCGCCACCGCCGCCGCGGGCCCCAGCTGCGCGCTGAAGGCCGGCAAGACAGCGAGCGGTGCGGGCGAGGTGGTGCGCTGTCTGTCTGAGCAGAGCGTGGCCATCTCGCGCTGCGCCGGGGGCGCCGGGGCGCGCCTGCCTGCCCTGCTGGACGAGCAGCAGGTAAACGTGCTGCTCTACGACATGAACGGCTGTTACTCACGCCTCAAGGAGCTGGTGCCCACCCTGCCCCAGAACCGCAAGGTGAGCAAGGTGGAGATTCTCCAGCACGTCATCGACTACATCAGGGACCTTCAGTTGGAGCTGAACTCGGAATCCGAAGTTGGAACCCCCGGGGGCCGAGGGCTGCCGGTCCGGGCTCCGCTCAGCACCCTCAACGGCGAGATCAGCGCCCTGACGGCCGAGGCGGCATGCGTTCCTGCGGACGATCGCATCTTGTGTCGCTGA
Id1基因正向引物序列(SEQ ID NO:2):5'-TCTACGACATGAACGGCTG-3';Id1基因反向引物序列(SEQ ID NO:3):5'-GGTCCCTGATGTAGTCGAT-3'。
β-actin基因正向引物序列(SEQ ID NO:4):5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3';β-actin基因反向引物序列(SEQ ID NO:5):5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'。
(一)实验方法:
(1)临床标本处理
对山东大学齐鲁医院2007年1月至2017年1月手术的57例IH患者进行血管瘤内皮细胞(Hemangioma endothelial cells,HemECs)培养及免疫组化(IHC)检测。收集数据,包括年龄、性别、类型、肿瘤大小、与其他疾病的组合、位置、症状和既往口服***治疗。山东大学齐鲁医院临床检验委员会批准。山东大学齐鲁医院病理区采用血管瘤特异性标记物GLUT1染色进行临床诊断。根据赫尔辛基宣言,提供了使用血管瘤(IH)标本的知情同意书。
(2)HemECs分离及培养
新鲜组织通过Liberase TM(Roche)消化产生单细胞悬浮液。采用小鼠抗人GLUT1抗体磁激活细胞分选(MACS)和绵羊抗小鼠IgG Dynabeads筛选细胞。在添加10%FBS、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的EBM2培养基中,在37℃含5%CO2的孵箱中培养原代HemECs。流式细胞术(FCM)测定HEMECs表达阳性率为95%(图1B)。
(3)组织化学检测
组织学标本用10%***固定,石蜡包埋。组织切片4μm厚切片,苏木精/伊红染色(HE)进行组织病理学检查。对于IHC染色,常规石蜡包埋块厚度为4μm的部分脱蜡脱水。样品浸渍在10毫米柠檬酸盐缓冲液(pH 6,98℃下30分钟)用于抗原回收。使用0.3%过氧化氢和甲醇的混合物阻断内源性过氧化物酶活性。用浓度为1:100的初级抗体在4℃下孵育18小时,用Envision检测试剂盒(DAB,兔/鼠Da)检测一抗。所有组织学检查分别在单个病例的3-5个切片和3个随机区域进行。通过Image Pro Plus软件计算积分光密度(IOD)与阳性区域(AOI)的比值,以评价阳性染色的强度。
(4)实时定量PCR
总RNA由Trizol Reagent分离。在ABI PRISM 7900仪器中使用SYBR Green试剂盒扩增了cDNA片段。使用的特异性引物如下:Id1基因正向引物序列(SEQ ID NO:2):5'-TCTACGACATGAACGGCTG-3';Id1基因反向引物序列(SEQ ID NO:3):5'-GGTCCCTGATGTAGTCGAT-3';β-actin基因正向引物序列(SEQ ID NO:4):5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3';β-actin基因反向引物序列(SEQ ID NO:5):5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3。
RT-PCR体系如下表所示:
RT-PCR反应程序如下:
ID1相对表达量的计算方法:以β-actin表达量为对照,采用2-△△Ct方法计算得到。
(5)免疫印迹
用裂解缓冲液溶解样品,用SDS-PAGE对裂解液进行溶解,转移至PDVF膜。将膜与一抗抗体在TBST(20mM Tris、135mM NaCl和0.05%Tween 20)中稀释,然后与HRP偶联。二次抗体孵育后,ECL显影。
(6)RNA干扰
人源ID1(NM_002165.3)的mRNA序列来自国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)。利用基因化学技术合成了表达人ID1(Lenti-ID1)、过表达对照组(OC)、人Si-ID1siRNA和沉默对照组(SC)的重组慢病毒。HemECs接种于2x105细胞/6孔板上的密度。以50%的MOI多次转染30%的HemEC,培养3天进行实验。具体设计如下:
1)对照组:感染不含ID1过表达载体(OC组),感染细胞株分别为IH009、IH004;感染不含RNAi序列的病毒载体(SC组),感染细胞株分别为IH004、IH011;
2)ID1过表达组:感染含ID1的过表达载体(Lenti-ID1组),感染细胞株分别为IH009、IH004;
3)ID1表达干扰组:感染含RNAi序列的病毒载体,感染细胞株分别为IH004、IH011。
所述过表达载体为GV358,所述RNAi慢病毒载体为GV248,慢病毒为LV-ID1-RNAi(48187-1),以上载体跟病毒均购于吉凯基因。
所用siRNA核苷酸序列为:CATGAACGGCTGTTACTCA(SEQ ID NO:6)
(7)动物实验
Matrigel植入实验:实验由山东大学齐鲁医院动物护理和使用委员会批准。2x106HemEC在冰上用200μL Matrigel(BD)混合。将200μL混合液皮下注射于28±3.2天雄性BALB/c裸鼠背部。***(10μm)或载体,每天进行瘤内注射。每个实验条件用四只小鼠进行。异种移植后1周取出植入物,固定于10%***,之后HE/IHC相关实验。
微管密度分析。微血管通过检测从植入物中部的HE染色切片检测。每个部分的完整面积进行了评价。微血管被识别和计数为红细胞填充腔。通过图像分析估计每个区段的面积。通过将充满红细胞的微血管总数除以每个截面的面积(表示为血管/mm2)来计算微血管密度。每个实验条件报告的值对应于从四个个体动物获得的平均值。
(8)统计分析
所有实验至少独立进行三次。采用SPSS 19软件对资料进行t检验和单因素方差分析。采用S-N-K方法对各组进行多重比较。用卡方检验和Fisher检验对ID1的表达与临床病理特征进行相关性分析。P<0.05被认为有统计学差异。
(二)实验结果与分析
(1)ID1表达与PRO的治疗密切相关
用IHC染色法分析57例IH患者的ID1表达情况。ID1在HemEC的细胞核和细胞质中明显染色。如图1A所示,ID1在增殖期的HemECs中高表达。当IH处于消退阶段时,可在减少的HemEC中检测到ID1,ID1表达均低于增殖期。血管畸形(VM)、***畸形(LM)、动静脉畸形(AVM)内皮细胞ID1表达低于IH(P<0.05)。
流式细胞仪检测细胞GLUT1的表达。如图1B所示,HemECs的纯度大于95%的GLUT1阳性表达。通过免疫印迹法检测57例IH患者细胞系ID1蛋白的表达,并进行半定量分析,如图1C左图所示。蛋白表达分为低表达(≤0.3)、中表达(>0.3、≤0.6)和高表达(>0.6)组。结果显示ID1mRNA和蛋白在IH009和IH012中表达较低,在IH021和IH004中表达中等,在IH002和IH011细胞系中表达较高。
根据上述分类标准,本发明分析了57例IH患者ID1表达与特征之间的关系,发现ID1表达与先前口服***治疗密切相关(P<0.05)。ID1表达与其他特征无显著性差异。根据图1C和表1的结果,***可能与HemECs中的ID1表达有关。
表1不同IH患者ID1的表达情况
注:Low,ID1相对表达量不大于5;Mediate,ID1相对表达量为5~16;High,ID1相对表达量为大于16。
为了评估***对IH患者ID1表达的影响,本发明测定了***(10μM)治疗对血管内皮细胞(IH009、IH004和IH011)中ID1mRNA和蛋白表达的影响。***在IH00 9(ID1低表达)2h治疗后,可呈时间依赖性降低Id1表达。这种变化在IH00 4(ID1中表达)和IH011(高ID1表达)中是不显著的。这一结果表明,较高的ID1表达HEMEC能够抵抗***降低ID1表达。
***可促进HEMEC细胞凋亡。为了探讨ID1表达在***诱导血管内皮细胞凋亡中的作用,本发明检测了***浓度梯度下血管内皮细胞的存活率。结果表明,IH011的IC50高于其他组,IH009的IC50最低。提示ID1高表达能抑制***诱导的细胞凋亡。
为了研究ID1在***作用下是否参与HemECs的增殖,用Lenti-ID1(OC为对照)转染IH009和IH004,用Si-ID1(SC为对照)转染IH011和IH004,敲除ID1。如图2所示,ID1的过表达和敲除都不影响HECEC的增殖。***抑制HEMECs增殖,ID1表达对***抑制HEMECs增殖的抑制程度不同。图2显示高ID1表达能在***治疗下恢复抑制HECECs增殖。
(2)ID1对***治疗的IH小鼠模型的影响
为观察ID1对***治疗的IH小鼠模型HemECs血管形成的影响,本发明用不同的ID1表达干扰植入HemECs。在本实验中,每天注射10μm***。移植后,所有这些植入物在宏观视图和HE染色在微观视图中示出在图3A和B。在宏观视图中的植入物被表示为红色(高血管密度)或苍白(低血管密度)。GLUT1在植入的HECEC和新形成的血管中阳性表达。结果表明,***可抑制HemECs血管形成,但ID1过度表达可逆转其作用。
通常认为IH需要针对精确机制的治疗策略。尽管许多研究已经检查了IH治疗的各种靶点,但大多数实验只在少数细胞系或主观临床特征上进行。本发明研究了ID1在57个HEMECs细胞系中的表达情况并且进一步探究了经***治疗后细胞中ID1的表达情况。上述实验分析表明,ID1表达与口服***治疗效果呈负相关。因此,阐明ID1对评估***治疗IH的作用具有重要价值。
本发明通过检测57例IH患者细胞株ID1表达情况发现,不同的细胞株ID1表达差异显著,其中IH009和IH012细胞中ID1表达量低;IH021和IH004中ID1表达量显著高于IH009和IH012细胞;IH002和IH011细胞中ID1表达量显著高于IH021和IH004。与此同时,口服***并非对所有的婴幼儿血管瘤患者均有效,因此,如何判断***对患者的治疗效果,对患者康复影响深远。
本发明对ID1表达情况差异显著的IH009、IH004和IH011细胞株分别给药同等剂量的***,发现ID1表达随着给药时间的变化分别呈现不同的变化,给药2h后IH009中ID1表达呈显著下降趋势;而IH004和IH011细胞中ID1表达下降趋势不明显。本发明通过给药不同浓度的***,发现***对IH009细胞存活率影响最为显著。因此,以血管瘤内皮细胞株IH009细胞中ID1相对表达量(相对表达量为5)为标准,当血管瘤内皮细胞中ID1的相对表达量不大于5时,可预测***对该血管瘤内皮细胞有显著的抑制效果,从而进一步可评估普耐洛尔对该患者的治疗效果显著;同理,当血管瘤内皮细胞中ID1相对表达量高于IH004细胞相对表达量(相对表达量为16),则可预测***对该血管瘤内皮细胞抑制效果不显著,从而进一步可评估普耐洛尔对该患者的治疗效果不显著。本发明为能够尽早发现婴幼儿血管瘤患者是否对***存在耐药性,有效评估***对婴幼儿血管瘤的治疗效果,提供了一种有效的评估方法,本发明评估方法可尽早发现患者是否对***具有耐药性,可及时对治疗方案进行调整,对患者的康复意义重大。
为了进一步研究ID1的表达量与***对婴幼儿血管瘤治疗效果之间的关系,本发明进行了以下试验设置:
(1)对照组:感染不含ID1的过表达载体(OC组),感染细胞株分别为IH009、IH004;感染不含RNAi序列的病毒载体(SC组),感染细胞株分别为IH004、IH011;
(2)ID1过表达组:感染含ID1的过表达载体(Lenti-ID1组),感染细胞株分别为IH009、IH004;
(3)ID1表达干扰组:感染含RNAi序列的病毒载体,感染细胞株分别为IH004、IH011。
对上述三组细胞分别进行***给药作为试验组,以未给药处理的三组细胞作为对照。由图2可知,过表达ID1可逆转***对血管瘤内皮细胞的抑制作用;干扰ID1表达可促进***对血管瘤内皮细胞的抑制作用。
由图3可知,本发明从动物模型水平进一步验证了过表达ID1可逆转***对血管瘤内皮细胞的抑制作用,促进血管瘤的形成;干扰ID1表达可促进***对血管瘤内皮细胞的抑制作用,抑制血管瘤的形成。
基于上述发现,采用调控血管瘤内皮细胞中ID1表达丰度的试剂调控血管瘤内皮细胞中ID1相对表达量低于5后(或沉默ID1基因表达),服用***且无需增加***的用量,即可实现***对婴幼儿血管瘤的有效治疗;从而可减轻或避免由于增加***用量而产生的副反应。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学齐鲁医院
<120> 一种用于评估***治疗婴幼儿血管瘤效果的产品
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 468
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaaagtcg ccagtggcag caccgccacc gccgccgcgg gccccagctg cgcgctgaag 60
gccggcaaga cagcgagcgg tgcgggcgag gtggtgcgct gtctgtctga gcagagcgtg 120
gccatctcgc gctgcgccgg gggcgccggg gcgcgcctgc ctgccctgct ggacgagcag 180
caggtaaacg tgctgctcta cgacatgaac ggctgttact cacgcctcaa ggagctggtg 240
cccaccctgc cccagaaccg caaggtgagc aaggtggaga ttctccagca cgtcatcgac 300
tacatcaggg accttcagtt ggagctgaac tcggaatccg aagttggaac ccccgggggc 360
cgagggctgc cggtccgggc tccgctcagc accctcaacg gcgagatcag cgccctgacg 420
gccgaggcgg catgcgttcc tgcggacgat cgcatcttgt gtcgctga 468
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tctacgacat gaacggctg 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggtccctgat gtagtcgat 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agcgagcatc ccccaaagtt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gggcacgaag gctcatcatt 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
catgaacggc tgttactca 19
Claims (4)
1.ID1基因表达丰度检测试剂在制备评估***治疗婴幼儿血管瘤效果产品中的应用,其特征在于,所述ID1基因表达丰度为以RT-PCR方法测定的β-actin表达量为对照,采用2-△△Ct方法计算得到的ID1基因相对表达量,当ID1基因相对表达量不大于阈值5时,则提示***会对该对象的婴幼儿血管瘤具有较好的治疗效果,其中,所述ID1基因表达丰度为血管瘤内皮细胞中ID1基因表达丰度。
2.一种用于评估***治疗婴幼儿血管瘤效果的产品,所述产品是试剂盒、设备、可操作***和/或它们的组合,所述产品包括:
(1)用于测定对象的细胞中ID1基因及β-actin表达丰度的试剂、仪器和/或***,所述细胞为血管瘤内皮细胞;
(2)用于计算ID1基因相对表达量的模块和/或处理器,ID1基因相对表达量的计算方法为:以RT-PCR方法测定的β-actin表达量为对照,采用2-△△Ct方法计算得到;
(3)用于根据ID1基因相对表达量评估***对对象的婴幼儿血管瘤治疗效果的模块和/或处理器,评估标准为:当ID1基因相对表达量不大于阈值5时,则提示***会对该对象的婴幼儿血管瘤具有较好的治疗效果。
3.根据权利要求2所述的产品,其特征在于,步骤(1)中用于测定对象的细胞中ID1基因及β-actin表达丰度的试剂、仪器和/或***是用于RT-PCR的试剂、仪器和/或***。
4.根据权利要求2所述的产品,其特征在于,所述产品还包括选自下组的一种或多种:
(A)用于采集、分离、筛选和/或培养血管瘤内皮细胞的试剂和/或仪器;
(B)用于存储和/或处理ID1基因相对表达量的数据库、模块和/或处理器;
(C)用于提供评估报告的模块和/或处理器;
(D)说明书或使用指南。
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