CN108245679B - Spag5作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明研究表明，在原发性BUC组织中经常检测到SPAG5的上调，上调和下调SPAG5的表达分别增强或抑制体外和体内BUC细胞的增殖，并分别抑制或促进体外和体内细胞凋亡。因此，SPAG5作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中的应用，进一步的可以是制备治疗膀胱癌分子标志物，也可以是制备预测膀胱癌复发分子标记物中的应用。机制研究表明，SPAG5主要通过激活AKT/mTOR信号通路至少部分上调Wnt3促进BUC增殖并抑制BUC凋亡。因此，SPAG5可用于制备靶向负向调控Wnt3表达制剂。同时，Wnt3也作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中应用。

Description

SPAG5作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及SPAG5作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中的应用。

背景技术

膀胱尿路上皮肿瘤(BUC)在男性中是第四常见的肿瘤并且也是女性第七常见的肿瘤，每年全球有40多万人深受其影响。根治性膀胱切除术(RC)，无论是否进行术前放疗都提供了最好的机会治愈肌层浸润性膀胱尿路上皮肿瘤，并且对治疗非肌层浸润性膀胱尿路上皮肿瘤也起了作用。虽然最近包括根治性膀胱切除术和放疗在内的治疗策略有所发展，但是由于疾病特征的异质性，大约50％的病人出现膀胱尿路上皮肿瘤复发。鉴于这种情况需要对根治性膀胱切除术后准确的预后和预测评估。这对于治疗的决策，患者的咨询以及最重要的是确定辅助化疗的适应症是十分重要的。因此，日益关注遗传学在行根治性膀胱切除术的膀胱尿路上皮肿瘤患者放疗反应所起的作用，和遗传学对个体患者放疗反应的预测能力。

迄今为止，膀胱尿路上皮肿瘤患者根治性膀胱切除术后，缺乏预测个体患者放疗反应的信息。所以，有些患者并没有获得预期的治疗效果反而受到高毒性药物的副作用。也许更重要的是，由于他们的身体状况恶化，一些不必要治疗的患者可能失去额外的治疗机会。通常认为传统的病理组织学参数例如肿瘤分期或分级是行根治性膀胱切除术患者的预后因素。然而即使肿瘤有相似的病理组织学特点，同样也可能有广泛不同的分子特征，属于独特的分子亚组，具有不同疾病的侵袭性。为了针对膀胱尿路上皮癌施行有效的精准药物治疗，需要发现膀胱尿路上皮癌亚组新的治疗靶点。同时也需要改善分层分子标志物的治疗效果，这些分子标志物可预测患者对特定的治疗反应性。从基因表达分析和其他增殖标志物(如Ki67)中鉴定的多基因分类方法可以预测根治性膀胱切除术后的复发和生存。然而全球最可靠的分子测试和它的可行性仍存在争议。因此迫切需要能预测膀胱尿路上皮的复发和预后的可靠标志物，以优化治疗策略和改善临床结局。

当哺乳动物细胞受生长因子和营养素刺激时，它们会发送有丝***的信号调控各种细胞过程。一个重要的有丝***的通路是AKT/mTOR通路。AKT激酶促进生长、存活、和运动并且抑制凋亡。mTOR激酶是这条通路上另一个重要的成员，控制蛋白的翻译，核糖体的合成和代谢。AKT/mTOR通路在生长、存活、凋亡过程起重要作用，使其成为肿瘤发生过程中频繁激活的主要致癌驱动因子。因此为了改善人类恶心肿瘤的病因、诊断、治疗，应确定这条通路的分子详细情况。

***相关抗原5(SPAG5)与有丝***的纺锤体有关，在细胞中期它集中于着丝粒，在有丝***的过程中，SPAG5和其他的一些蛋白质在着丝粒上形成分子开关，共同调节着丝粒－微管动力学，促进有丝***过程及其保真度。因此，SPAG5通过和许多蛋白质伴侣相互作用在有丝***调控网络中起重要作用。最近，已证实SPAG5在乳腺癌、肺癌、***中表达上调。此外，SPAG5与预后不良也相关，然而SPAG5在膀胱尿路上皮癌的生物学作用和临床意义尚不清楚，所以我们在本发明中研究了这些问题。BUC指膀胱癌。

发明内容

本发明旨在提供一种可以用于制备治疗膀胱癌药物的新靶点。

本发明研究表明，在原发性BUC组织中经常检测到SPAG5的上调，并且在接受根治性膀胱切除术(RC)的112名患者中存在显著更差的生存率。上调和下调SPAG5的表达分别增强或抑制体外和体内BUC细胞的增殖，并分别抑制或促进体外和体内细胞凋亡。此外，SPAG5增加了BUC细胞对化疗诱导的细胞凋亡的抗性。机制研究表明，SPAG5主要通过激活AKT/mTOR信号通路至少部分上调Wnt3促进BUC增殖并抑制BUC凋亡。我们通过接受根治性膀胱(RC)的人类膀胱癌(BUC)标本队列的免疫组织化学分析证实了BUC细胞模型中SPAG5/AKT-mTOR/Wnt3轴的重要性。总的来说，我们的数据表明高水平的SPAG5表达与接受RC的BUC患者的低生存率有关。此外，以SPAG5为靶点可能是一种新的改善BUC患者治疗和生存的策略。

在本发明的研究中，在癌和非肿瘤人膀胱组织中检查SPAG5表达。结果清楚地显示，所检查的大部分BUC组织具有高水平的SPAG5。随后，利用免疫组织化学技术研究SPAG5的表达动力学，结果显示SPAG5在BUC组织中频繁高表达，与肿瘤大小和肿瘤多样性显著相关，提示BUC中SPAG5表达上调可能与肿瘤生长有关和致瘤性。重要的是，我们还观察到，BUC中高水平的SPAG5是一个独立和预测生存期较短的强有力指标。因此，用免疫组织化学技术分析SPAG5水平提出另一种鉴别BUC患者肿瘤高复发风险的方法。这些发现提示了SPAG5在BUC潜在的生物学机制中起重要作用。

本发明使用体外和体内试验来研究SPAG5在调节BUC细胞增殖和凋亡中的作用。结果显示，在T24和RT4细胞中shRNA介导的SPAG5敲低降低了体内和体外BUC细胞的增殖并增加了细胞凋亡。相比之下，BIU87细胞中异位过表达SPAG5显著促进了体外和体内细胞的增殖并抑制细胞的凋亡。这些数据支持了SPAG5是BUC细胞生长和凋亡的重要促成者的假说。

为了研究与SPAG5相关影响下游BUC生长和凋亡的分子事件，我们使用DNA微阵列比较了BIU87-SPAG5细胞和BIU87-载体细胞之间的整体mRNA表达谱。在与细胞周期和细胞凋亡有关的基因中，20个差异表达2倍或更多。使用蛋白质印迹验证BIU87-SPAG5细胞中Wnt3在蛋白质水平的上调。相反，通过shRNA敲低SPAG5降低了T24和RT4细胞中Wnt3的蛋白质水平。此外，在这组BUC队列组织中观察到高水平的SPAG5和Wnt3之间显著的正相关。总之，结果表明，在BUC细胞中，SPAG5通过调节Wnt3调节细胞生长和凋亡。

在本研究中，我们观察到Wnt3蛋白的高表达与BUC患者的低生存率密切相关且与SPAG5表达呈正相关。为了确定Wnt3是否是参与SPAG5诱导的BUC细胞生长和抑制细胞凋亡的下游靶标，我们使用shRNA在BIU87-SPAG5细胞中沉默了WNT3。当WNT3被敲除时，显著抑制了SPAG5介导的促进细胞生长和抑制凋亡。这些数据表明Wnt3是SPAG5的关键下游靶标，介导BUC细胞中SPAG5诱导的细胞生长和抑制细胞凋亡。

然而，SPAG5调控Wnt3表达的机制仍有待阐明。在本研究中，当在BIU87-SPAG5细胞中使用AKT抑制剂(MK2206)或mTOR抑制剂(雷帕霉素)抑制AKT/mTOR信号传导时，我们观察到抑制了SPAG5所介导的Wnt3上调，促进增殖，和抑制细胞凋亡。相比之下，过度表达SPAG5促进异种移植肿瘤中的AKT，mTOR和Wnt3磷酸化。相反，SPAG5敲低降低异种移植肿瘤中的AKT/mTOR信号传导和Wnt3。这些结果进一步支持了由AKT/mTOR信号通路激活诱导的Wnt3的上调可能是SPAG5促进BUC细胞增殖并抑制BUC细胞凋亡的一个机制。我们的结果也清楚地表明，p-AKT，p-mTOR和Wnt3的水平与SPAG5水平正相关。此外，高p-AKT和p-mTOR水平与BUC患者存活率差相关。总之，这些结果表明高水平的SPAG5可通过增强AKT/mTOR信号传导可能导致Wnt3表达上调，依次促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，并增加细胞对化疗剂诱导的细胞凋亡抵抗，至少部分有利于肿瘤生长和致瘤性。因此，本研究提示对SPAG5表达及其下游功能靶点的检测可作为预测BUC患者复发和转归的有效方法，以指导临床决策。显然，需要进一步的研究来阐明SPAG5对细胞存活和凋亡的调控机制。

总之，本发明描述了BUC中改变SPAG5的表达模型，并证明了SPAG5在肿瘤发生中的潜在作用。此外，SPAG5的功能研究表明SPAG5通过激活AKT/mTOR信号通路上调Wnt3在细胞增殖和凋亡中发挥重要作用。我们的研究结果支持这样的概念：高水平的SPAG5可能是疾病复发的新型预测因子，是BUC患者的独立预后因子，使临床医生能够确定需要更强化治疗的高危患者。因此，靶向SPAG5途径可能成为改善BUC或其他癌症患者的治疗和存活的新的治疗策略。

本发明研究表明，在原发性BUC组织中经常检测到SPAG5的上调，上调和下调SPAG5的表达分别增强或抑制体外和体内BUC细胞的增殖，并分别抑制或促进体外和体内细胞凋亡。因此，SPAG5作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中的应用，进一步的可以是制备治疗膀胱癌分子标志物，也可以是制备预测膀胱癌复发分子标记物中的应用。机制研究表明，SPAG5主要通过激活AKT/mTOR信号通路至少部分上调Wnt3促进BUC增殖并抑制BUC凋亡。因此，SPAG5可用于制备靶向负向调控Wnt3表达制剂。同时，Wnt3也作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中应用。

附图说明

图1：在BUC中SPAG5上调。(A)通过蛋白质印迹法测定，BUC细胞系的SPAG5蛋白质水平由标准化的β-肌动蛋白为标准所示(B和C)对每个原发BUC患者的标本和同一患者的相邻非肿瘤组织中进行qRT-PCR和western印迹分析其SPAG5mRNA和蛋白质。H：高级别肿瘤；L：低级别肿瘤。(D)IHC分析BUC组织中表达的SPAG5(SP，×200)。(E)根据BUC患者的SPAG5表达水平绘制的存活曲线，Kaplan-Meier生存曲线：比较低和高SPAG5表达水平的BUC患者的累积总生存率。

图2：下调和上调SPAG5表达分别抑制或增强BUC细胞体外增殖，并分别抑制或促进体外G1-S期转化。(A)通过免疫印迹确认敲低T24和RT4BUC细胞中SPAG5；使用β-肌动蛋白作为载量的对照。(B)MTT分析显示在SPAG5沉默的T24和RT4的BUC细胞中生长速率降低；*P<0.05，**P<0.01。(C)集落形成试验显示SPAG5沉默的T24和RT4的BUC细胞的生长比率下降；**P<0.01。(D)Western印迹显示SPAG5-过表达BIU87的BUC细胞系中SPAG5蛋白的水平；使用β-肌动蛋白作为载量对照。(E)MTT分析显示在SPAG5过量表达BIU87的BUC细胞中生长速率增加；*P<0.05，**P<0.01(F)集落形成试验显示SPAG5过度表达BIU87的BUC细胞中的生长速率增加；**P<0.01。(G)流式细胞术分析显示SPAG5沉默细胞和shNC的细胞在不同阶段的细胞周期百分比。(H)流式细胞术分析显示SPAG5过表达细胞和载体细胞在不同阶段的细胞周期百分比。

图3：SPAG5在DDP处理过程中调节细胞活力并在体外增加细胞抗凋亡。(A和B)MTT分析用于证实在DDP处理后，敲低SPAG5对T24和RT4细胞存活力的影响。(C)MTT分析用于证实在DDP处理后，SPAG5过表达对BIU87细胞存活力的影响。(D和E)内源性SPAG5表达的下调降低了T24和RT4细胞对细胞凋亡的抵抗。上：细胞用或不用指定剂量的顺铂处理72小时，然后用膜联蛋白V/PI染色并通过流式细胞术分析。下：不同组别细胞凋亡率的定量总结；*P<0.05，**P<0.01。(F)过度表达SPAG5的BUC细胞对顺铂诱导的细胞凋亡较不敏感。上：细胞用或不用顺序剂量的顺铂处理72小时，然后用膜联蛋白V/PI染色并用流式细胞仪分析。下：不同组别细胞总凋亡率的量；*P<0.05，**P<0.01。

图4：SPAG5表达对体内肿瘤生长的影响。(A和B)由SPAG5沉默细胞形成的肿瘤小于由RNAi载体处理的细胞形成的肿瘤。上图：在指定日期测量的肿瘤体积。数据点以平均肿瘤体积±SD表示。中图：每组中所有小鼠的肿瘤代表性图像。下图：每组所有小鼠的肿瘤重量；*P<0.05，**P<0.01。(C)由SPAG5转导的细胞形成的肿瘤大于用载体对照转导的细胞形成的肿瘤。上图：在指定日期测量的肿瘤体积。数据点以平均肿瘤体积±SD表示。中图：每组中所有小鼠的肿瘤的代表性图像。下图：每组所有小鼠的肿瘤重量；*P<0.05，**P<0.01。(D和E)沉默SPAG5的T24和RT4异种移植肿瘤中，SPAG5和Ki67水平降低和TUNEL染色的细胞增加；**P<0.01。(F)在过度表达SPAG5的异种移植的BIU87SPAG5和Ki67水平增加而TUNEL染色的细胞降低；**P<0.01。

图5：SPAG5调节BUC细胞和组织中的Wnt3表达。(A)DNA微阵列实验：与对照BIU87-Vector细胞相比，BIU87-SPAG5细胞差异表达的基因(>2倍，P<0.001),根据这些基因的功能分类。基因数量按类别显示。(B)与BIU87-Vector细胞相比较，BIU87-SPAG5A细胞差异表达大于两倍的mRNA中有20个基因与细胞凋亡和细胞周期相关：CCNE1，CDKN1A，DAPK1，DIRAS3，TP53，WNT3，WNT11，BCL10，CASP1，CASP10，CD40，CDKN2A，CDKN2B，HERC5，TNF，TNFSF10，TNFRSF11B，TNFRSF14，TNFRSF25和PYCARD(C)蛋白质印迹分析显示shRNA沉默SPAG5的T24和RT4细胞中Wnt3和PYCARD表达下调。用pcDNA-SPAG5处理使SPAG5过度表达的BIU87细胞中Wnt3和PYCARD表达显著上调。(D)IHC代表性的图像，显示在代表性BUC组织中高表达的SPAG5和Wnt3高表达。SPAG5和Wnt3的表达呈正相关(P＝0.001)。(E)Wnt3的上调与BUC患者的较差存活显著相关。

图6：在抑制AKT/mTOR信号传导和Wnt3后，部分抑制SPAG5介导的BUC BIU87细胞增殖和凋亡。(A)用表达Wnt3shRNA1-1，shRNA1-2，shRNA1-3和shRNA-4的慢病毒或对照shRNA感染BIU87细胞；通过western印迹测量的Wnt3蛋白质水平。(B)抑制AKT/mTOR信号传导和Wnt3消除过表达SPAG5诱导的AKT/mTOR信号传导和Wnt3的激活。用SPAG5或载体对照转染BIU87细胞，然后分别用AKT和mTOR抑制剂MK2206(1μM)，雷帕霉素(100nM)和shWnt3处理。通过免疫印迹分析它们对AKT/mTOR信号传导和Wnt3的作用。(C)集落形成测定显示AKT抑制剂MK2206(1μM)和mTOR抑制剂雷帕霉素(100nM)或shWnt3抑制SPAG5-BIU87细胞增殖能力增强*P<0.05，**P<0.01。(D)通过流式细胞术分析使用AKT抑制剂MK2206(1μM)和mTOR抑制剂雷帕霉素(100nM)或shWnt3使SPAG5-BIU87细胞中G0/G1期细胞百分比降低和S期细胞百分比增加。(E)膜联蛋白V/PI测定显示，AKT抑制剂MK2206(1μM)和mTOR抑制剂雷帕霉素(100nM)或shWnt3消除了SPAG5-BIU87细胞中凋亡的减少；*P<0.05，**P<0.01。

图7：SPAG5，p-AKT，p-mTOR和Wnt3在人BUC中的临床相关性。(A)典型IHC图像显示SPAG5水平高(SP，×200)的样品中p-AKT水平较高。SPAG5和p-AKT的水平呈正相关(P＝0.025)。(B)典型IHC图像显示SPAG5水平高(SP，×200)的样品中p-mTOR的较高表达。SPAG5和p-mTOR的水平呈正相关(P<0.001)。(C)10个新鲜收集的人BUC样品中SPAG5表达和Wnt3mRNA表达之间以及p-AKT，p-mTOR，Wnt3蛋白表达之间的表达分析。使用β-肌动蛋白作为对照。(D-F)10个新鲜制备的人BUC样品中SPAG5，p-AKT，p-mTOR和Wnt3水平的相关性分析。

图8：通过蛋白质印迹评估SPAG5在异种移植肿瘤中正调节AKT/mTOR信号传导和Wnt3。(A和B)通过Western印迹评估，敲低SPAG5抑制异种移植肿瘤中的AKT/mTOR信号传导和Wnt3。使用western印迹分析源自表达shSPAG5或携带shNC的T24和RT4细胞的异种移植肿瘤的p-AKT，p-mTOR和Wnt3的水平。(C)通过western印迹评估，SPAG5的过表达促进异种移植肿瘤中的AKT/mTOR信号传导和Wnt3。使用Western印迹分析来源于表达异位SPAG5或携带对照载体的BIU87细胞的异种移植肿瘤的p-AKT，p-mTOR和Wnt3的水平。

图9：通过IHC评估，SPAG5在异种移植肿瘤中正调节AKT/mTOR信号传导和Wnt3。(A和B)通过IHC评估，敲低SPAG5抑制异种移植肿瘤中的AKT/mTOR信号传导和Wnt3。通过IHC分析源自表达shSPAG5或携带shNC的T24和RT4细胞的异种移植肿瘤中的p-AKT，p-mTOR和Wnt3的水平。上图代表性IHC图像显示SPAG5水平和p-AKT，p-mTOR和Wnt3水平。下图显示了IHC染色结果的量化。数据代表平均值±SD(n＝3)；**P<0.01。(C)通过IHC评估，SPAG5的过表达促进异种移植肿瘤中的AKT/mTOR信号传导和Wnt3。来自BIU87细胞异位表达SPAG5或携带对照载体的异种移植肿瘤，通过IHC分析p-AKT，p-mTOR和Wnt3的水平。上图代表性IHC图像显示SPAG5水平和p-AKT，p-mTOR和Wnt3的表达。下图显示了IHC染色结果的量化。数据代表平均值±SD(n＝3)；**P<0.01。

图10：BUC患者根据p-AKT和p-mTOR表达水平绘制的生存曲线。(A)在BUC患者中，p-AKT的上调与总体生存率较差显著相关。(B)p-mTOR的上调与BUC患者的总生存率较差显著相关。

图11：GEPIA分析SPAG5和WNT3mRNA的表达。(A)BUC中SPAG5水平与WNT3的表达正相关。(B)SPAG5水平与黑素瘤中WNT3的表达正相关。(C)SPAG5水平与结直肠癌中WNT3的表达正相关。

表1:单变量回归分析112例膀胱癌(BUC)患者的生存。

表2：多变量回归分析112例膀胱癌(BUC)患者的生存。

表3：与细胞凋亡和细胞周期相关差异表达的基因(倍数大于2倍，P<0.001)20个基因与细胞周期，细胞凋亡相关，7个基因表达上调，13个基因表达下调。

表4:BUC中SPAG5和Wnt3，p-AKT，p-mTOR和PYCARD的表达之间的关系。

具体实施方式

下面结合附图和实验数据对本发明做进一步的解释和说明

1、材料及方法

细胞系和药物治疗，qRT-PCR分析，蛋白质印迹分析，免疫组化测定，MTT测定，集落形成测定，凋亡分析细胞，细胞周期分析，以上方法均是现有方法，在此不再累述。

2、患者组织标本

本研究采用来自中南大学湘雅三医院和中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院

年的112例病理组织学诊断为膀胱癌(BUC)并行根治性膀胱切除术(RC)患者的石蜡包埋标本(表1)。将30个根治性膀胱切除术(RC)的BUC组织标本和相应的相邻非肿瘤组织标本立即储存在-80℃，并用于qRT-PCR和/蛋白质印迹。

3、质粒，病毒产生和靶细胞感染

使用PCR扩增人SPAG5的cDNA，并将其克隆到载体中pMSCV-puro-retro载体(Clontech)。由Sigma-Aldrich公司商业合成的pLKO-puro载体4种抗SPAG5和4种针对Wnt3的shRNA)。将荧光素酶cDNA进行PCR扩增并克隆到pMSCV-neo-retro载体(Clontech)中。接种293FT细胞(2×10⁵)，用逆转录病毒感染pMSCVpuro-SPAG5，pLKO-puro-SPAG5-shRNA或pLKO-puro-Wnt3-shRNA3天。所有这些细胞进一步用pMSCV-neo-luci质粒转染。使用0.5μg/mL嘌呤霉素和250μg/mL G418处理稳定表达SPAG5-luci，SPAG5-shRNA-luci和Wnt3-shRNA-luci的细胞系10天。

4、TUNEL分析使用Tunel测定法(Roche)检测凋亡的肿瘤细胞。

5、结果

5.1分析SPAG5在膀胱尿路上皮癌细胞系和冷冻膀胱尿路上皮组织中表达水平

我们通过蛋白质印迹分析了五个膀胱尿路上皮癌细胞系中SPAG5蛋白水平，正如图1A三个细胞系(T24，EJ和RT4)中的SPAG5水平高。相比之下，BIU87和5637细胞显示较低水平的SPAG5。我们还使用实时定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)和western印迹评估了30对冷冻膀胱尿道上皮组织中的SPAG5表达水平。如图1B所示，SPAG5在肿瘤组织中的mRNA表达大多高于配对的相邻正常样品。一致的是，BUC组织中SPAG5的蛋白质水平显着高于匹配的正常组织(图1C)。

5.2免疫组织化学(IHC)分析BUC患者组织SPAG5蛋白水平及其与临床病理特征的相关性

为了研究SPAG5在BUC中的表达动力学，我们对112例行根治性膀胱切除术后患者石蜡包埋的膀胱癌标本进行了SPAG5的免疫组化染色。图1D显示了IHC免疫组化的代表性结果，表明SPAG5定位于细胞质中。根据所述标准，在55.4％(62/112)的原发膀胱癌中发现高SPAG5水平。我们还研究了SPAG5水平与膀胱癌的临床病理特征之间的相关性。对112份膀胱癌样本的分析表明，SPAG5水平与肿瘤大小(P<0.001)和肿瘤多重性(P＝0.028)相关；尽管在患者年龄，性别，肿瘤分级，pT状态和pN状态之间没有关系。

5.3分层生存分析得出SPAG5表达增高与所有BUC队列和一些亚组中不良预后相关

在Kaplan-Meier分析中，SPAG5水平低的患者的存活时间比SPAG5水平高的患者更长(P＝0.003，图1E)。之后，我们使用Cox比例风险模型检测生存情况，以确定SPAG5水平是否是一个独立的预测因子。对年龄，性别，肿瘤大小，肿瘤多样性，肿瘤分级，pT状态，pN状态和SPAG5水平等因素进行单变量Cox回归分析(表1)，以研究其对BUC患者生存的影响。单变量分析显示的显著变量通过多变量分析进一步分析。多变量分析显示，主要的独立预测因素是SPAG5水平(风险比[HR]1.952；95％可信区间[CI]1.036-3.713；P＝0.038)，pT分期(HR，1.495,95％CI 0.997-2.241；P＝0.045)和pN阶段(HR，2.735；95％CI 1.432-5.224；P＝0.002)(表2)。

5.4 SPAG5促进体外BUC细胞增殖

为了探索SPAG5在BUC中的生物学作用，通过将短发夹RNA(shRNA)或阴性对照RNA(shNC)转染到细胞中来产生几种稳定的细胞系。在测试的四种SPAG5shRNA中，shRNA-3在T24和RT4细胞中显示出最一致的敲低结果，并被选择用于随后的实验(图2A)。沉默SPAG5培养T24和RT4细胞6天后，与shNC对照相比，细胞数量减少了两倍以上。表明敲低内源性SPAG5的表达显著抑制T24和RT4细胞增殖，(图2B)。这表明内源性SPAG5的敲低降低了BUC细胞的增殖能力。

集落形成实验显示了类似的结果(图2C)。建立稳定过度表达异位SPAG5的BIU87细胞(图2D)。与培养6天后的载体对照细胞相比，MTT测定表明SPAG5过表达细胞的数量增加了大约两倍(图2E)。这与集落形成测定的结果一致(图2F)。流式细胞术分析也显示，沉默SPAG5增加细胞在G0/G1期的比例，并降低S期细胞的百分比(图2G)；SPAG5的过度表达引起相反的效应(图2H)。总之，我们的研究结果表明SPAG5在体外BUC细胞增殖中起重要作用。

5.5体外顺铂(DDP)处理BUC细胞期间SPAG5调节细胞生存能力

首先采用MTT法观察SPAG5对BUC细胞化疗敏感性的影响，DDP是用于BUC化疗的主要药物。在图3A-C中显示超过72小时SPAG5敲低，SPAG5过表达和对照细胞中的DDP 50％抑制浓度(IC 50)。如图3A和B所示，在DDP处理后，SPAG5的敲低引起T24和RT4细胞存活的时间依赖性降低，这表明敲低SPAG5使T24和RT4细胞以剂量和时间依赖性的方式致敏DDP。此外，BIU87细胞与阴性对照相比，不同浓度的DDP孵育72小时SPAG5抑制细胞显示生存能力显著增加。表明过度表达SPAG5赋予BIU87细胞以时间和剂量依赖性方式产生对DDP的抵抗(图 3C)。

5.6 SPAG5抑制体外BUC细胞凋亡

为了确定SPAG5是否对BUC细胞具有抗凋亡作用，进行膜联蛋白V/PI染色测定细胞凋亡。结果显示消耗SPAG5促进T24和RT4细胞凋亡(图3D和E)。相比之下，与正常条件下的载体转染的对照细胞相比，SPAG5显著抑制BIU87-SPAG5细胞中肿瘤细胞的凋亡(图3F)。此外，我们研究了相同细胞系SPAG5对化疗诱导的细胞凋亡的影响。在指定浓度下，耗尽SPAG5的增加暴露于DDP细胞的24小时细胞凋亡率(图3D和E)。相反，与阴性对照相比，用指定浓度DDP处理细胞24小时后，增强SPAG5的表达显著降低细胞凋亡率(图3F)。

5.7 SPAG5抑制体内BUC细胞对DDP的敏感性

为了检测SPAG5对体内BUC细胞DDP化学敏感性的影响，皮下注射BUC细胞到裸鼠中，当肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠随机分成两组，腹腔内注射100μL二甲基亚砜(DMSO)或DDP。结果显示DDP治疗后shNC控制细胞或耗尽内源性SPAG5的细胞形成的肿瘤生长显著减少(如通过肿瘤体积和重量评估)(图4A和B)。然而，DDP处理对BIU87-SPAG5细胞系形成肿瘤的重量和体积没有显著影响(图4C)。这些结果强烈提示升高SPAG5抑制BUC细胞的DDP敏感性。

5.8 SPAG5促进体内BUC细胞增殖并抑制BUC细胞凋亡

进一步检测SPAG5是否能够促进体内BUC细胞的致瘤性。植入裸鼠沉默SPAG5细胞和shNC对照细胞36天后，与shNC对照细胞形成的肿瘤相比，沉默SPAG5细胞形成的肿瘤生长更小更慢。转导SPAG5细胞和shNC对照细胞第36天后，与shNC对照细胞形成的肿瘤相比，SPAG5细胞衍生的肿瘤生长得更快更大(图4C)。重要的是，免疫组化法测定强SPAG5信号的区域显示Ki67染色，而低水平表达的SPAG5区域显示更低的Ki67染色信号(图4D-F)，进一步支持了SPAG5有助于BUC细胞的增殖和致瘤性的观点。这些结果意味着SPAG5具有很强的促进BUC细胞生长的能力。TUNEL测试测定SPAG5对肿瘤细胞凋亡的影响。沉默SPAG5显著增加皮下T24和RT4癌细胞凋亡(图4D和E)。相反，过度表达SPAG5显著降低了皮下BIU87癌细胞凋亡(图4F)。总之，这些结果表明SPAG5抑制BUC细胞的凋亡。

5.9 SPAG5上调Wnt3表达

由于SPAG5促进细胞生长并抑制BUC中的细胞凋亡，我们探索了其作用的分子机制。使用DNA微阵列，我们比较了SPAG5转染的BIU87细胞与用载体对照转染那些细胞的全部基因表达谱，发现189个大于2倍的差异表达基因(P<0.001，图5A)，其中20个与细胞凋亡和细胞周期有关：其中7个上调(CCNE1，CDKN1A，DAPK1，DIRAS3，TP53，WNT3，WNT11)13个下调(BCL10，CASP1，CASP10，CD40，CDKN2A，CDKN2B，HERC5，TNF，TNFSF10，TNFRSF11B，TNFRSF14，TNFRSF25，PYCARD)。(图5B，表3)。shSPAG5转染敲低SPAG5，转染72小时后蛋白质印迹分析显示BUC(T24和RT4)细胞中Wnt3和PYCARD水平显著下调(图5C)。一致地，pcDNA-SPAG5转染BIU87细胞过表达SPAG5，Wnt3和PYCARD水平显著上调(图5C)。此外，112例BUC标本SPAG5，Wnt3和PYCARD的免疫组化染色结果显示SPAG5的水平与这个队列BUC组织中的细胞凋亡，细胞周期和Wnt3水平呈正相关(P＝0.001，图5D，补充表S3)。但是，低表达组SPAG5与高表达组SPAG5之间PYCARD水平没有重大的的差异(P＝0.624，补充表S4)。为了确定是否改变Wnt3的表达会对SPAG5促进BUC生长和抑制细胞凋亡起作用，在SPAG5-过度表达的BIU87细胞中使用shRNA敲除WNT3(图6A和B)。重要的是，在BIU87细胞中沉默WNT3降低了SPAG5转导的BUC细胞促进生长(图6C和D)和抑制凋亡(图6E)的能力。此外，更高的Wnt3水平与BUC队列存活率差有关(P＝0.005，图5E)，这与BUC标本中更高的SPAG5水平一致。这些结果表明Wnt3在SPAG5促进BUC细胞的生长和抑制细胞的凋亡方面具有核心作用。

5.10 SPAG5诱导的AKT-mTOR信号转导途径促进细胞生长并抑制细胞凋亡

鉴于Wnt3在AKT/mTOR信号通路中发挥关键作用^25,26，研究了SPAG5在激活AKT/mTOR信号转导中的作用。出乎意料的是，SPAG5过表达导致BIU87细胞中AKT，mTOR，S6和Wnt3的磷酸化增加(图6B)，这表明AKT/mTOR信号传导的激活。而且，SPAG5敲低降低异种移植肿瘤中的AKT，mTOR和Wnt3磷酸化(图8A和B，图9A和B)。相反，过度表达SPAG5促进异种移植肿瘤的AKT/mTOR信号转导(图8C和2C)。

相反，MK2206和雷帕霉素分别对AKT和mTOR的药理学抑制消除了由SPAG5过表达引起的增殖增加(图6C)。类似地，药理学抑制AKT和mTOR消除了SPAG5过表达的G0/G1期细胞百分比的降低，S期细胞百分比增加(图6D)。另外，AKT和mTOR的抑制逆转了SPAG5过表达导致的细胞凋亡下降(图6E)。这些结果进一步证实了SPAG5通过激活AKT/mTOR信号转导途径促进细胞生长并抑制细胞凋亡。

5.11 BUC中SPAG5上调介导的AKT/mTOR激活的临床相关性

最后，检验BUC中SPAG5上调介导AKT/mTOR的活化是否具有临床相关性。在112个BUC标本中的相关性研究显示，SPAG5水平与p-AKT和p-mTOR水平呈正相关(P＝0.025，P<0.001；图7A和B，表4)。另外，如图7C所示，新收集的10个BUC样品中的SPAG5水平也与p-AKT(r＝0.834，P＝0.003；图7D)，p-mTOR(r＝0.814，P＝0.004；7E)和Wnt3(r＝0.016，P＝0.732；图7F)水平正相关。重要的是，BUC队列中较高的p-AKT(P＝0.022，图10A)和p-mTOR(P＝0.002，图10B)水平与存活较低相关。此外，GEPIA(http://gepia.cancerpku.cn)根据标准加工流程分析TCGA中23种癌症和正常样本的RNA序列表达数据^27,28，SPAG5水平在BUC中(r＝0.14，P＝0.0042)，黑色素瘤(r＝0.58，P＝1.8e-08)和结直肠癌(r＝0.4，P＝9.6e-05)Wnt3表达显著相关(图11)。总之，我们的研究结果显示SPAG5上调激活AKT/mTOR信号传导，从而促进生长，抑制细胞凋亡，以及不良BUC临床结果。

表1:单变量回归分析112例膀胱癌(BUC)患者的生存

Supplementary Table S1.Univariate Cox regression analysis ofsurvivalof 112

patients with BUC

^amedian age；^bmedian size；HR,hazard ratio；CI,confidence interval；BUC,bladder urothelial carcinoma；Significant associations are shown in bold facein thep-value column(p-value<0.05).

表2：多变量回归分析112例膀胱癌(BUC)患者的生存

Supplementary Table S2.Multivariate Cox regression analysis ofthesurvival of 112patients with BUC

表3：与细胞凋亡和细胞周期相关差异表达的基因(倍数大于2倍，P<0.001)20个基因与细胞周期，细胞凋亡相关，7个基因表达上调，13个基因表达下调。

Supplementary Table S3.Differentially expressed genes related to cellapoptosis and the cell cycle(Fold change>2,P<0.001)

表4:BUC中SPAG5和Wnt3，p-AKT，p-mTOR和PYCARD的表达之间的关系

Supplementary Table S4.The association between the expression ofSPAG5and Wnt3,p-AKT,p-mTOR,and PYCARD in BUC

^aFisher’s exact test；BUC,bladder urothelial carcinom.

Claims (2)

1.SPAG5的抑制剂在制备治疗膀胱癌药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述膀胱癌是指BUC。

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