CN109385410A

CN109385410A - 海洋噬箘体Syn5的RNA聚合酶终止序列及其鉴定方法与应用

Info

Publication number: CN109385410A
Application number: CN201811067462.XA
Authority: CN
Inventors: 朱斌; 吴慧; 夏恒; 陆雪玲; 黄锋涛; 余兵兵; 闫艳; 成锐
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology; Shenzhen Huazhong University of Science and Technology Research Institute
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology; Shenzhen Huazhong University of Science and Technology Research Institute
Priority date: 2018-09-13
Filing date: 2018-09-13
Publication date: 2019-02-26

Abstract

本发明公开了海洋噬箘体Syn5的RNA聚合酶终止序列及其鉴定方法与应用，属于微生物核酸代谢酶技术领域。所述终止序列含有至少一个ATCTGT序列单元。鉴定方法为将外源基因***载体的多克隆位点处，并将所述载体中的启动子序列替换为Syn5启动子序列，获得重组载体；将该重组载体进行体外转录，回收全长转录的RNA以外的RNA产物并进行3’RACE测序，对应的终止序列均含有至少一个ATCTGT序列单元，即得到噬菌体Syn5RNA聚合酶转录终止序列含有至少一个ATCTGT序列单元。所述转录终止序列可应用于RNA合成生物学。本发明鉴定了海洋噬菌体Syn5的单亚基RNA聚合酶转录终止子，弥补了当前对Syn5RNA聚合酶转录特性研究的不足，鉴定了一个当前最简化造成聚合酶体外转录终止的序列单元。

Description

海洋噬箘体Syn5的RNA聚合酶终止序列及其鉴定方法与应用

技术领域

本发明属于微生物核酸代谢酶技术领域，具体涉及海洋噬箘体Syn5的RNA聚合酶终止子及其鉴定方法与应用。

背景技术

RNA(核糖核酸)聚合酶是以RNA或DNA(脱氧核糖核酸)为模板利用三磷酸核苷作为底物合成RNA的酶，是RNA的合成工具。RNA是遗传信息传递的载体，广泛存在于真核生物、原核生物、部分病毒及类病毒中，具有许多种类和功能。除以往熟知的三大类RNA：mRNA、rRNA以及tRNA外，近年来研究发现一些新颖的RNA如microRNA(miRNA)(Mohr and Mott.,2015)、long non-coding RNA(lncRNA)(Dey et al.,2014)、Circular RNAs(circRNA)(Memczaket al.,2013)等都在不同生理过程中发挥着关键作用。随着RNA相关研究的不断深入，RNA在疾病治疗方面的应用价值也日益彰显。通过设计mRNA序列进行体外合成后递送到细胞内可以翻译为任意目的蛋白质，并且mRNA翻译快速，会在体内自动降解，相较于DNA的优势在于不会整合到宿主基因组，且起效更快。除了用作疫苗，mRNA药物也可作为蛋白质药物补充或替代疗法，治疗其它多种疾病。当前，mRNA修饰和制剂等技术也取得了巨大突破，解决了mRNA的稳定性和递送问题，这使得mRNA药物成为一种非常理想的药物形式，mRNA制药行业也日渐成熟，Moderna、BioNTech和CureVac等制药公司都已形成丰富的mRNA药物产品线。除mRNA外，利用双链RNA对目的基因进行RNA干扰(RNAi)以及利用gRNA指导的基因编辑(CRISPR gRNA)技术等都在疾病治疗中有着较好的前景。

RNA相关研究和应用的开展对RNA体外制备提出了很高的挑战，而传统化学合成方法仅限于合成几十个核苷酸以下的长度，当长度增加成本也急剧上升。然而设计用来编码蛋白质的mRNA通常达到几千个核苷酸，显然这一方法不再适用，只能依靠RNA聚合酶进行体外转录来合成RNA。虽然RNA聚合酶种类繁多，但大多数生物体的RNA聚合酶都具有复杂的亚基组成和调控机制，不适合用作RNA的体外合成机器。上世纪70年代科学家们发现一种来自大肠杆菌T7噬菌体的单亚基RNA聚合酶，其结构简单具有专一性转录(识别特异的启动子)和转录效率高等特点，在1984年被一次克隆后就广泛用于RNA的体外合成、重组蛋白的表达(细菌高表达***)等(Davanloo et al.,1984)，成为体外合成长链RNA的唯一方法，在生物化学研究和RNA合成领域有着广泛的应用。后续发现的噬菌体T3RNA聚合酶以及SP6 RNA聚合酶都与T7 RNA聚合酶亲缘关系较近且具有相似的性质，随着RNA体外合成应用的不断发展和深入，这类单亚基RNA聚合酶都显现出许多不可忽视的缺点，包括产物末端不均一、对起始碱基有较强的偏好性、掺入修饰核苷酸效率低，转录富含高级结构RNA会产生许多中断产物等等(Lyakhov et al.,1998；Chamberlin and Ring,1973)，导致很多情况下合成的RNA无法满足后续研究和应用的要求。

虽然科学家们后续围绕T7 RNA聚合酶进行了很多的改造，但其主要缺点并没有得到改善，逐渐成为了限制RNA这一热门领域研究和发展的因素。事实证明，由于早期鉴定的噬菌体种类有限，这类酶并不是最理想的RNA体外合成工具酶。随着近年来分子生物学研究和测序技术的蓬勃发展，揭示出海洋微生物数量及种类十分庞大，越来越多新颖的噬菌体被发现，其中就可能蕴藏着许多新颖的酶工具。本专利的主要发明人之一朱斌博士在哈佛大学医学院工作期间对海洋噬菌体Syn5进行了研究，其宿主为海洋里数量最多的蓝细菌。通过杀死海洋里20％的生物质，噬菌体Syn5在维持海洋环境能量平衡中发挥重要作用(Pope et al.,2007)。通过与T7RNA聚合酶基因进行相似性比对、蛋白纯化及酶学性质分析等方法，朱斌博士鉴定了一个全新的来自海洋噬菌体Syn5的单亚基RNA聚合酶(Zhu etal.,2013)。相比较于T7 RNA聚合酶，这种来自海洋的酶能够在一个更大范围的温度和盐浓度条件下催化RNA的合成，转录延伸能力也大大提高，对启动子后起始碱基也没有十分严格的限制。Syn5 RNA聚合酶最大的优点就是可以进行精确的全长转录并保持产物末端的均一性(Zhu et al.,2014；Zhu et al.,2015；US patent WO2015024017)。Syn5 RNA聚合酶攻克了T7 RNA聚合酶在生物合成领域所遇到的瓶颈，哈佛大学已为Syn5 RNA聚合酶申请两项国际专利。当前，Syn5 RNA聚合酶在合成生物学应用中展现出非常大的前景。

虽然Syn5 RNA聚合酶转录启动子序列和转录延伸性能等已经被研究的十分清楚，但是其转录终止特性还不为人所知。转录终止同转录起始和转录延伸一样也是转录***的重要组分，在应用中对控制转录产物的产量和长度十分重要。在不清楚转录终止序列的情况下，可能对Syn5 RNA聚合酶体外合成应用产生一些负面影响。在蛋白表达***中，不能有效的转录终止不仅会很大程度降低目的基因的转录效率外，还会影响下游元件的表达水平，如抗生素抗性基因，质粒拷贝数控制元件或是降低本底表达水平的抑制蛋白(Mairhofer et al.,2015)。迄今为止，尚没有对噬菌体Syn5的RNA聚合酶的终止性能相关研究报道。

发明内容

本发明针对现有技术中尚未有噬菌体Syn5的RNA聚合酶的终止序列，提供了噬菌体Syn5 RNA聚合酶转录终止序列及其鉴定方法与应用。

按照本发明的第一方面，提供了一种海洋噬菌体Syn5 RNA聚合酶转录终止序列，所述终止序列含有至少一个ATCTGT序列单元。

按照本发明的另一方面，提供了所述海洋噬菌体Syn5 RNA聚合酶转录终止序列的鉴定方法，含有以下步骤：

(1)将外源基因***载体的多克隆位点处，并将所述载体中的启动子序列替换为海洋噬菌体Syn5启动子序列，获得重组载体；利用限制性内切酶将所述重组载体进行酶切，得到线性化的重组载体；

(2)构建体外转录反应体系，所述体外转录反应体系以步骤(1)所述线性化的重组载体作为模板，以噬菌体Syn5 RNA聚合酶作为RNA聚合酶，以ATP、GTP、CTP和UTP四种核苷三磷酸作为原料，使所述线性化的重组载体发生体外转录反应；加入DNA酶以消除作为模板的线性化的重组载体，然后纯化转录得到的RNA产物；

(3)将步骤(2)得到的RNA产物进行凝胶电泳，回收全长转录的RNA以外的RNA产物并进行3’RACE测序，所述全长转录的RNA以外的RNA产物对应的终止位点均含有至少一个ATCTGT序列单元，即得到海洋噬菌体Syn5 RNA聚合酶转录终止序列含有至少一个ATCTGT序列单元。

优选地，步骤(1)所述载体为pET28b，步骤(1)所述限制性内切酶为限制性内切酶BglII。

优选地，步骤(2)所述体外转录反应的时间为1h-2h。

优选地，步骤(2)所述噬菌体Syn5 RNA聚合酶在体外转录反应体系中的浓度为1μΜ-2μΜ。

优选地，步骤(2)所述线性化的重组载体在体外转录反应体系中的浓度为20ng/ul-40ng/ul。

优选地，步骤(2)所述体外转录反应体系中还包括RNA酶抑制剂。

优选地，步骤(2)所述体外转录反应体系中还包括Tris-HCl缓冲液、MgCl₂、亚精胺、二硫苏糖醇和焦磷酸酶。

按照本发明的另一方面，提供了所述海洋噬菌体Syn5 RNA聚合酶转录终止序列在RNA合成生物学中的应用。

优选地，所述应用为在转录模板中***所述噬菌体Syn5 RNA聚合酶转录终止序列以终止转录反应，或所述应用为在转录模板中将所述噬菌体Syn5 RNA聚合酶转录终止序列进行同义突变以继续进行转录反应。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的有益效果：

(1)本发明对来自海洋噬菌体Syn5的单亚基RNA聚合酶进行了表达及纯化，目的是对其转录终止序列进行鉴定，获得高效的转录终止元件。本发明鉴定了海洋噬菌体Syn5的单亚基RNA聚合酶转录终止子，弥补了当前对Syn5 RNA聚合酶转录特性研究的不足，鉴定了一个当前最简化造成聚合酶体外转录终止的序列单元。

(2)将鉴定的Syn5 RNA聚合酶转录终止序列应用到体外转录过程中，不仅可以高效的用于精准转录的终止；而且另一方面，在转录模板中将所述噬菌体Syn5 RNA聚合酶转录终止序列进行同义突变以继续进行转录反应。

(3)本发明所述Syn5 RNA聚合酶转录终止序列是序列特异性终止子，而非是结构依赖型的终止子，因此可灵活地应用为转录的终止或者是转录反应的继续。

附图说明

图1所示为实施例1中SDS-PAGE电泳检测Syn5 RNA聚合酶的纯化效果图，其中M代表蛋白Marker。

图2所示为实施例2中利用T7 RNA聚合酶和Syn5 RNA聚合酶进行体外转录得到的终止结果图；最上方为全长转录的RNA产物，下方为提前终止的RNA产物。

图3(a)为实施例3中将Syn5 RNA聚合酶转录终止子序列应用到体外转录中的结果图；图3(b)所示对应图3(a)中泳道2-泳道6的转录终止效率。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。在不脱离本发明上述技术思想和所公开精神的情况下，根据本领域普通技术知识与惯用手段，做出各种等效、替换、修改或变更，都落入本发明保护的范围。

实施例1：Syn5 RNA聚合酶基因扩增及蛋白表达纯化

(1)扩增Syn5 RNA聚合酶基因及蛋白表达

PCR扩增获得Syn5 RNA聚合酶基因，将基因序列克隆到原核表达载体pET-24a的酶切位点NdeI和NotI之间，在基因5’末端融合33个碱基长度的DNA片段，该DNA片段编码所述如序列表中SEQ ID NO:1所示的组氨酸标签以及标签与Syn5 RNA聚合酶之间保持柔性的连接肽段，连接肽段序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Gly。根据已有研究显示Syn5 RNA聚合酶基因序列区域含有其转录识别的特异启动子序列，因而将该碱基序列进行同义突变(不改变编码氨基酸)，最终***载体pET-24a中的基因序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，将构建好的重组载体转化E.coli BL21(DE3)表达菌株，挑菌扩大培养，将菌置于含有50ug/ml卡那的LB培养基中37℃摇床培养至OD₆₀₀值接近1.2，加入0.5mM终浓度的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)于28℃摇床诱导表达3h。

(2)纯化Syn5 RNA聚合酶

细菌裂解：加入IPTG诱导蛋白表达3h后，4℃，5000rpm离心20min，去掉上清收集菌体沉淀，将菌体充分重悬于含有20mM Tris-HCl(pH7.5)、2M Nacl、0.5mg/ml溶菌酶、0.5mMDTT的裂解液中，然后将蛋白裂解液冷冻于-80℃，待凝固后置于冰上融化1h，接着在置于-80℃反复冻融两次。将蛋白液置于冷冻高速离心机中4℃、35000rpm离心1h，离心后分离上清，将分离出的上清液通过0.45μm孔径的滤膜过滤，以进一步去除杂质，过滤后的蛋白液可进行后续的镍柱纯化或4℃短暂保存。

镍柱纯化：配制含有20mM Tris-HCl(pH7.5)、2M NaCl的洗脱缓冲液，另配置20mM、50mM、100mM三种浓度的咪唑溶液备用。使用10倍镍柱填料体积的洗脱缓冲液平衡镍柱，然后将之前过滤后的蛋白裂解液加入镍柱中，靠重力作用使镍柱中的液体流出，下一步按照由低浓度到高浓度的顺序逐步加入20mM、50mM、100mM的咪唑溶液过柱，洗脱非特异性结合的杂蛋白并最终将与镍柱结合的蛋白竞争性的洗脱下来。每一浓度洗脱下来的蛋白液需用若干干净的冻存管保存，最后将所有洗脱下来的蛋白液通过SDS-PAGE电泳进行检测，选择较高纯度的Syn5 RNA聚合酶于4℃保存。

磷酸纤维素柱层析：将蛋白加入到磷酸纤维素柱中，配制含有20mM磷酸二氢钾(pH7.5)、1mM DTT、1mM EDTA、10％glycerol、20mM KCl的起始缓冲液以及含有20mM磷酸二氢钾(pH7.5)、1mM DTT、1mM EDTA、10％glycerol、1M KCl的洗脱缓冲液备用，用起始缓冲液平衡5-10个柱体积，以连续洗脱的方式不断提高盐离子浓度(由0.02M KCl到1M KCl)进行洗脱，将所有洗脱下来的液体进行考马斯亮蓝检测，颜色变蓝的蛋白液通过SDS-PAGE电泳进行检测，Syn5 RNA聚合酶约在700mM的高盐浓度时被洗脱出来，收集蛋白。

凝胶过滤层析(分子筛)：将上一步得到的蛋白用超滤管(Millipore)浓缩到1ml以内，然后使用200ml的凝胶过滤预装柱Superdex 200进行凝胶过滤层析，提前配制好含有20mM Tris-HCl(pH 7.5)、2M NaCl、0.5mM DTT、0.5mM EDTA的洗脱缓冲液，用该缓冲液平衡分子筛2个柱体积后，将蛋白加入柱中，待蛋白液全部进入填料后开始用洗脱液进行洗脱，使用蠕动泵洗脱的流速控制在1ml/min，用自动收集器收集洗脱蛋白，将所有洗脱下来的液体进行考马斯亮蓝检测，颜色变蓝的蛋白液通过SDS-PAGE电泳进行检测，收集得到的纯度较高的蛋白液。

蛋白透析：将凝胶过滤层析得到的蛋白液进行超滤浓缩到适宜体积后进行透析，将蛋白加入透析袋中然后塑料夹封口，将透析袋置于1L含有100mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.1mM DTT、0.1mM EDTA、50％甘油的透析液中，置于磁力搅拌器上利用磁珠搅拌促进溶液交换，透析3h以上更换干净透析液，然后继续透析3h以上，最后再次更换透析液透析过夜，收集透析后蛋白置于-20℃保存。

(3)SDS-PAGE电泳检测Syn5 RNA聚合酶纯化效果

透析后进行SDS-PAGE电泳，然后利用考马斯亮蓝染色对透析后的Syn5 RNA聚合酶的纯度进行检测，结果如图1所示，可以看出透析后蛋白条带比较单一，说明Syn5 RNA聚合酶经过以上纯化步骤后得到的纯度较高。

实施例2：利用T7 RNA聚合酶和Syn5 RNA聚合酶进行体外转录

(1)转录反应模板的获取及纯化

PCR扩增NrsPOL基因，克隆到载体pET28b的多克隆位点中以增加载体的长度，获得重组载体后，将载体中的T7启动子序列替换成Syn5启动子序列，最终构建成两个含有不同转录启动子的重组载体，然后利用靠近启动子前面的限制性内切酶BglII进行线性化，使用纯化试剂盒DNA Clean&Concentrator^TM-5(购自ZYMO RESEARCH生物科技公司)对线性化DNA产物进行纯化。

(2)体外转录反应

除RNA聚合酶及转录模板，体外转录反应体系中其它成分一致，包括40mM Tris-HCl(pH7.9)，6mM MgCl₂，2mM亚精胺，10mM DTT，200μΜATP、GTP、CTP、UTP，0.3ul RNA酶抑制剂，0.2ul焦磷酸酶，补DEPC水至10ul。含有T7启动子和Syn5启动子的模板分别加入终浓度1μΜT7RNA聚合酶及2μΜ Syn5 RNA聚合酶，线性化转录模板终浓度为20ng/ul。将T7转录体系和Syn5转录体系分别置于37℃和30℃反应2h。随后在反应体系中加入2ul RQ1RNase-free DNase(Promega)于37℃反应1h，消除线性化模板，最后用RNA Clean&Concentrator^TM-5(ZYMO RESEARCH)纯化RNA产物。配置2％琼脂糖胶对RNA产物进行电泳，利用EB染色，结果如图2所示。由图2可知，利用T7RNA聚合酶进行转录除获得在T7转录终止序列终止的RNA产物外，还存在明显的全长转录产物。利用Syn5RNA聚合酶进行转录得到两处终止的位点，位于T7终止序列后pET28b载体上，Syn5 RNA聚合酶在具有茎环结构的T7转录终止序列处未发生转录终止，另外同样存在部分全长转录的RNA。对Syn5 RNA聚合酶在pET28b载体上产生的两处终止位点T1和T2进行3’RACE测序，对终止位点T1测序得到的序列如SEQ ID NO：3-7所示，对终止位点T2测序得到的序列如SEQ ID NO：8-12所示，经序列比对最终发现导致Syn5RNA聚合酶发生终止的关键核心序列为ATCTGT。

实施例3：将Syn5 RNA聚合酶转录终止序列应用于体外转录

(1)转录反应模板的获取及纯化

在pUC19载体序列422位置处将Syn5 RNA聚合酶启动子序列***，获得重组载体后，另外在该载体基础上在序列1500位置处分别***CATCTGTTTTTTTT、CATCTGTTTTTTTTX2、CATCTGTTTTTTTT X3、ATCTGT X3、ATCTGT X6碱基序列(已有研究结果表明终止子后面加T对终止效率有提高作用)，共得到6种重组载体，使用限制性内切酶NdeI对质粒模板进行线性化，线性化产物用纯化试剂盒DNA Clean&Concentrator^TM-5(ZYMO RESEARCH)进行纯化。

(2)体外转录反应

体外转录反应的体系为：40mM Tris-HCl(pH7.9)，6mM MgCl₂，2mM亚精胺，10mMDTT，200μΜATP、GTP、CTP、UTP，0.3ul RNA酶抑制剂，0.2ul焦磷酸酶，2μΜ Syn5 RNA聚合酶，20ng/ul转录模板，补DEPC水至10ul。将反应体系混合好后置于30℃转录2h后取1ul转录产物加入甲酰胺和EDTA配置的上样缓冲液后进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，使用VisionWorks软件统计条带灰度值及根据RNA产物大小计算得到每个泳道反应的终止效率。图3(a)为实施例3中将Syn5 RNA聚合酶转录终止子序列应用到体外转录中的结果图；泳道1为仅***Syn5 RNA聚合酶启动子序列的pUC19载体转录结果，泳道2至泳道6分别为在载体1500碱基处另外***CATCTGTTTTTTTT X1、CATCTGTTTTTTTT X2、CATCTGTTTTTTTT X3、ATCTGT X3、ATCTGT X6碱基序列得到的转录结果；最上方条带为DNA模版，下方条带为RNA产物；图3(b)所示对应图3(a)中泳道2-泳道6的转录终止效率。由图3可以得知，泳道6在***ATCTGT X6 36个碱基序列时，Syn5 RNA聚合酶转录终止效率最高，达到了近95％的终止效率，相比***的CATCTGTTTTTTTT X3及其它碱基序列，终止效率显著提高，说明仅通过提高***ATCTGT的重复次数可以在引入更少碱基数量的情况下进一步提高终止效率。

<110> 华中科技大学

深圳华中科技大学研究院

<120> 海洋噬箘体Syn5的RNA聚合酶终止序列及其鉴定方法与应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

His His His His His His Gly Gly Gly Gly Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 2370

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catcaccatc accatcacgg cggaggtgga ggctccttcg atctcatcgc tcgccagctt 60

cagcgtgaga ccgaggccgc ggagctggcc cgcaagcgtc tacaagacgc ccgacgcgag 120

gccaatgaac gctcctatgc ctcaagcaac atcgagagcc gcaaggccat cgcgacgttc 180

ctggatccca tcgcccaacg catcggcgaa cgcctgttca cgctacggcg tggtactggt 240

gcagttgatg ccgccgaggt ctacaagcat ctgaagaacg ccgatcacca tcatctggcg 300

ctcatcacga tgaagacagc cctggacgtc ctgggcaaag atcccgagcc acagatccaa 360

cagctgacca cagccattgg ccgcaacatc cagctggagc tccgcctcac gtactacgcc 420

gaggaaaacc cggagctcta caaacaggcc tcccgcttct tccacgcagg cactggcacc 480

cgccagaaag ccacggtgat caaactcaag ttcaaccgcg agggcattga gtgggaccaa 540

tggtcccgcg tcacctgtca caaggttggc caatggctca tgttggctat ggccgacgtc 600

accggctgga ttgaacgggc aaccgaccga accagtggag gacgcaaaac caagacccgc 660

atctgctact cccgcgagtt cttgcagcat cgggacacaa tcctcgcagc agctgagcag 720

ttggccttct gccagtggcc catgctttgc cctcccattg agtggtccaa cgaccacaac 780

ggtgggtacc tgagcgaaca gatccggcgg gtcaatccgc tgattcgtaa aacgggtcca 840

ttgggcaccc gtaagcaagg agacataccc cttgcgatgc tcaacaacct gcagggtcag 900

gcctacaagg tcaaccctga agttctcgac atagcgaacc actgctacga gtccaacgtg 960

accgtaggca agttcatacg ccacgctccc ctacctgttc caccatcacc cggtgaggac 1020

tgtacagagg accagctcac agcctataaa cgggcacgac gtgaggccga ggacttcaac 1080

gcacagatca gtcagaagaa ctggcgcacg accgaggtca tgtatgtggc ccgcaagtac 1140

gccgacgagg cctccttctg gatgcccgcc agcttcgact atcgcggccg tgtttacttt 1200

ctgaacactg ccctcaaccc gcaggggact gacttcgaca aggcgctcct ttacttcgct 1260

gaggagggtc cggtcaacga atggtggcta tccttccacg tcgcgaccac ctacggcctc 1320

gacaaggaga ccatggtcaa ccgggtccaa tgggctcggg acaaccacga gctcatcgat 1380

cgcatcgcct ctgaccccgt ccgccatacc gagtggcacg acgctgacga gccctggtgc 1440

ttcctggctg cctgcctcga gtacaaggcc tgcgtgatcg atggcaccaa acagaccagc 1500

ggcctcccta tcgggatcga cgccacctgt tcaggcctgc agcacctcgc tgctatgacc 1560

cgctgcggac gcacagccgc cctggtcaac gtgacaccga ccgacaagcc ggccgatgct 1620

tacaagaccg tggcgcaagc atccctcaag catctcccca aggagcagca cgagtggatc 1680

acccgcaagg tcaccaaaag gcccgtcatg tgcacaccct acggggtgac catgtcatcg 1740

gcccgcggct acatccgcga tcagctggtg aaggacggcc acaaggagga cctccgatct 1800

cctggcgtgc tcaacggcat cgtcaaggcg atctttaatg aggccatccc tgaggtcatc 1860

cccggccccg tgcaggtcat ggcctggctc aagcgttcag ctggtcagat catcgaccgg 1920

ggtgattcca ccatcacgtg gaccacgccc tcaggcttcg aggttgttca agacctcaaa 1980

aagtccaaga cctacgaggt caagacccgc atcatgggcg gagcacggat caagctccaa 2040

gtgggcgacg ggttcaccga cgagcccgac cgtgaccacc acaaaagcgc actggctccc 2100

aacgtggtgc acagcaacga tgcgtctctc ctccacctga ccttcgcctt ctgggacaag 2160

cccttcacgg tcatccatga ctgtgtcctg ggccgttcct gcgacatgga tcagatgggc 2220

tccgacatcc ggcttcattt cgccgagatg tacaaggccg acgtgatgca agactgggcc 2280

gaccaggtgg gcgttgagct ccctgtcgac ctgatcaaaa acacgctcga catcgacagc 2340

gtcaaccagt ccctttactt cttctcctga 2370

<210> 3

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atctgtaaca tcat 14

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atctgtaaca tcat 14

<210> 5

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atctgtaaca tcat 14

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atctgtaaca tcattgaac 19

<210> 7

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atctgtaaca tcat 14

<210> 8

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atctgtgcgg tattt 15

<210> 9

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atctgtgcgg tattt 15

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atctgtgcgg tattttt 17

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<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atctgtgcgg tattcc 16

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atctgtgcgg tattttgc 18

Claims

1.海洋噬菌体Syn5 RNA聚合酶转录终止序列，其特征在于，所述终止序列含有至少一个ATCTGT序列单元。

2.如权利要求1所述海洋噬菌体Syn5 RNA聚合酶转录终止序列的鉴定方法，其特征在于，含有以下步骤：

3.如权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)所述载体为pET28b，步骤(1)所述限制性内切酶为限制性内切酶BglII。

4.如权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)所述体外转录反应的时间为1h-2h。

5.如权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)所述噬菌体Syn5 RNA聚合酶在体外转录反应体系中的浓度为1μΜ-2μΜ。

6.如权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)所述线性化的重组载体在体外转录反应体系中的浓度为20ng/ul-40ng/ul。

7.如权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)所述体外转录反应体系中还包括RNA酶抑制剂。

8.如权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)所述体外转录反应体系中还包括Tris-HCl缓冲液、MgCl₂、亚精胺、二硫苏糖醇和焦磷酸酶。

9.如权利要求1所述海洋噬菌体Syn5 RNA聚合酶转录终止序列在RNA合成生物学中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用为在转录模板中***所述噬菌体Syn5 RNA聚合酶转录终止序列以终止转录反应，或所述应用为在转录模板中将所述噬菌体Syn5 RNA聚合酶转录终止序列进行同义突变以继续进行转录反应。