CN108220219B - 一套植物乳杆菌食品级表达***及其在异源蛋白表达中的应用 - Google Patents

一套植物乳杆菌食品级表达***及其在异源蛋白表达中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一套植物乳杆菌食品级表达***及其在异源蛋白表达中的应用。所述植物乳杆菌食品级表达***包含食品级宿主植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）NZ5333、食品级表达载体pSIP497、培养基MRS‑Y和培养基MRS+N；所述食品级宿主植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）NZ5333是采用Cre‑loxP技术敲除植物乳杆菌WCFS1基因组上的glmS基因而获得，丧失合成葡萄糖胺‑6‑磷酸合成酶的能力。所述表达***在异源蛋白表达中应用，表达效果好。所述表达***为食品级表达***，其DNA元件来自于公认安全的微生物，不含抗生素抗性筛选标记。

Description

一套植物乳杆菌食品级表达***及其在异源蛋白表达中的 应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一套植物乳杆菌食品级表达***及其在异源蛋白表达中的应用。
背景技术
随着科学技术的发展，越来越多的研究表明，乳酸菌在免疫调节、维持肠道内菌群平衡、促进营养物质吸收、缓解乳糖不耐症、抑制致病菌和降低血清胆固醇含量及预防心血管疾病等方面有显著影响。由于乳酸菌具有公认的生物安全性(generally recognized assafe，GRAS)，开发利用其作为基因工程载体菌株则在食品开发、营养健康及医疗卫生领域中具有相当大的潜力和价值。目前，已经有使用乳酸菌基因工程载体生产功能性蛋白、研制口服疫苗以及开发新药等研究的报道。值得注意的是，乳酸菌中对乳酸杆菌的研究尤其是研究的热点，一方面具有显著益生功能的乳杆菌的报道层出不穷，如嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及罗伊氏乳杆菌等，另一方面由于乳杆菌来源广泛，发酵性能佳，也是工业上尤其是食品工业上的重要菌种，如德氏乳杆菌等。
传统的乳酸菌表达载体都带有一个或多个编码特定抗生素(如红霉素、氯霉素)抗性的基因，虽然抗性标记保证了转化子筛选的有效进行，但抗性标记的可转移性和潜在威胁显著降低了分子遗传修饰的乳酸菌在食品和医学领域的实用价值，因而，迫切需要开发食品级筛选标记，建立在异源蛋白中表达的食品级表达***。
现有技术中关于食品级筛选标记分为两大类，即显性筛选标记和互补筛选标记。显性筛选标记通常是利用宿主菌的特性比如细菌素抗性、热敏性、糖类利用率等来达到筛选目的，如开发较为成熟目前应用最为广泛的来源于乳酸乳球菌乳链菌素Nisin筛选标记；互补筛选标记，一般利用了细菌某些基因如持家基因的缺失或突变引起细菌生长变化来达到筛选目的，如乳酸乳球菌胸苷酸合成酶基因thyA基因筛选标记、植物乳杆菌丙酮酸消旋酶alr筛选标记和干酪乳杆菌Q-5/pQJ5筛选***。目前已开发应用的乳酸菌食品级筛选标记很少，不能满足很多目的蛋白食品级表达的需求，更多新的筛选标记尚待开发。本发明公开了以植物乳杆菌glmS基因作为筛选标记的表达***，是乳酸菌异源表达中的新的筛选标记。葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(Glucosamine-6-phosphate synthase,GlmS)能够促使6-磷酸果糖和L-谷氨酰胺转化成6-磷酸氨基葡萄糖，是葡萄糖代谢途径己糖胺通路和细胞壁合成反应的限速酶。葡萄糖胺-6-磷酸合成酶在HBP催化的产物是N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和氨基葡糖(GlcN)，这两种葡萄糖胺对生物体生命活动具有重要意义，许多生物细胞的多糖如壳多糖和黏多糖都是通过N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)最终合成的，N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)也是合成双岐因子的重要前体。glmS是葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的编码基因，研究表明没有glmS编码基因，菌株在不含氨基葡糖或N-乙酰葡萄糖胺的培养基中均无法正常生长，细胞会快速裂解死亡。此外，由于葡萄糖胺-6-磷酸合成酶是食品级分子，因此选择glmS基因作为筛选标记，开发其为植物乳杆菌的食品级表达***，为乳酸菌在食品及医学领域的应用研究提供了一种有效安全的手段。
发明内容
针对现有技术问题，本发明的目的在于提供一套植物乳杆菌食品级表达***及其在异源蛋白表达中的应用，该套植物乳杆菌食品级表达***表达效果好，***中所有DNA原件来自于公认安全的微生物，不含抗生素抗性筛选标记。
一套植物乳杆菌食品级表达***，包含食品级宿主植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)NZ5333、食品级表达载体pSIP497、培养基MRS-Y和培养基MRS+N；所述食品级宿主植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NZ5333是采用Cre-loxP技术敲除植物乳杆菌WCFS1基因组上的glmS基因而获得，丧失合成葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的能力。
所述食品级宿主植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NZ5333，于2017年12月08日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15039。
所述食品级表达载体pSIP497的构建方法，在乳酸菌表达载体pSIP409的基础上，敲除编码红霉素抗性基因的碱基序列，***来源于植物乳杆菌WCFS1的glmS基因，***来源于植物乳杆菌WCFS1菌株的PldhL启动子。
所述植物乳杆菌WCFS1的glmS基因是食品级宿主植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)NZ5333和食品级表达载体pSIP497完成互补筛选的食品级标记。
上述植物乳杆菌食品级表达***在异源蛋白表达中的应用。
上述植物乳杆菌食品级表达***在异源蛋白表达中的应用，包括以下步骤：采用PCR扩增报告基因红色荧光蛋白基因mCherry，***食品级表达载体pSIP497多克隆位点，采用电转化法将构建好的载体转入植物乳杆菌NZ5333中，利用SppIP诱导肽诱导表达，检测红色荧光蛋白在植物乳杆菌NZ5333细胞中的表达，表达过程不添加抗生素。
检测红色荧光蛋白的表达的方法：运用酶标仪测定其荧光强度值或利用倒置荧光显微镜观测红荧光。
有益效果：
本发明一套植物乳杆菌食品级表达***，该***具备食品级宿主植物乳杆菌NZ5333和食品级表达载体pSIP497，且宿主和载体具有可以完成互补筛选的食品级标记，在报告基因的异源表达过程中无需添加抗生素，避免了因抗性因子转移带来的生物安全性的潜在危害。
附图说明
图1为敲除质粒pNZ5326的验证结果，其中，M-DNA分子量标准，1-5’同源重组臂，长度1064bp，2-3’同源重组臂，长度1001bp；
图2为glmS基因敲除PCR验证结果，其中，M-DNA分子量标准，3-glmS基因，长度1818bp，4-上游外侧扩增产物，长度1194bp；5-下游外侧扩增产物，长度1283bp；
图3为WCFS1基因组上氯霉素基因去除后PCR验证结果，其中，M-DNA分子量标准，6-外侧扩增产物，长度2183bp；
图4为ldhL启动子和glmS基因扩增结果，其中，M-DNA分子量标准，7-PldhL扩增产物，长度500bp，8-glmS基因扩增产物，长度1818bp；
图5为食品级载体pSIP497红霉素去除验证结果，其中，M-DNA分子量标准，9-PldhL-glmS基因，长度2318bp；10-红霉素基因，长度602bp；
图6为本发明的食品级表达载体pSIP497的构建流程图；
图7为mCherry基因导入宿主菌PCR验证结果，其中，M-DNA分子量标准，11-mCherry基因，长度711bp；
图8为mCherry表达菌株荧光强度与生长曲线图；
图9为利用本发明的食品级表达***表达红色荧光蛋白的效果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细介绍。
实施例1
本发明实验中使用和涉及到的细菌菌株、质粒、主要材料及试剂：
植物乳杆菌WCFS1购自广东环凯微生物科技有限公司；
食品级宿主植物乳杆菌NZ5333；
大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；
质粒pNZ5319、pNZ5348由荷兰乳品研究所Jolanda M.Lambert赠送；
质粒pSIP409购自BioVector NTCC质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心；
glmS基因敲除的E.coli K12ΔglmS感受态细胞由实验室前期构建保存；
细菌基因组提取试剂盒；
SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒；
离子交换型质粒提取试剂盒；
N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)；
红霉素、氯霉素、氨苄青霉素、琼脂糖、4S核酸染料等均购自上海生工生物工程有限公司；Ex taq及rtaq等聚合酶、Ex taq、PrimeSTAR Max Premix(2×)、限制性内切酶，连接酶，pMD19-T载体，DNA Marker，DNA凝胶回收试剂盒由北京宝日医生物技术有限公司提供；其他主要试剂为国产分析纯产品；
乳酸菌专用MRS培养基；突变菌株用MRS+N培养基：蛋白胨10g，牛肉粉8g，酵母粉4g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二胺2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.04g，吐温80 1g，N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)22.121g；大肠杆菌用LB培养基。
本发明中重组乳酸菌筛选培养基MRS-Y培养基：蛋白胨10g，牛肉粉8g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二胺2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.04g，吐温80 1g。
本发明中重组大肠杆菌筛选培养基MT(M9加1％蛋白胨)培养基。
实施例2
1、食品级宿主植物乳杆菌NZ5333的构建。
(1)植物乳杆菌WCFS1全基因组DNA提取
采用细菌基因组提取试剂盒参照说明书提取。
(2)glmS基因5’端同源臂和3’端同源臂的PCR扩增及***性质粒pNZ5326的构建ⅰ.引物设计与合成
以NCBI Lactobacillus plantarum WCFS1genome(GenBank:AL935263.2)为模板，分别设计glmS基因的5’端同源臂和3’端同源臂，
glmS基因5’端同源臂引物：
A:5’-GGGCTCGAGCAGGATACAGTCGTCACAACG-3’
B:5’-GGGATTTAAATCCACACATAAATTAATCTTCC-3’
glmS基因3’端同源臂引物：
C:5’-CCCGAGCTCGTAAGTGTGTGGGCACCAAG-3’
D:5’-GGGAGATCTGATTGCCACAAGTAGCCAC-3’
ⅱ.glmS基因5’同源臂及3’同源臂的扩增、克隆和测序
(ⅰ)PCR反应体系如下：
Figure BDA0001573877920000051
(ⅱ)PCR反应条件如下：
95℃预变性5min；(解链95℃，45s；退火60℃，45s；延伸72℃，1min)×30个循环；72℃，10min；4℃保存
(ⅲ)TA克隆测序
5’同源臂的PCR产物及3’同源臂的PCR产物分别与pMD19-T simple载体16℃连接1h，后转化E.coli DH5α化学感受态细胞，后涂布于LB/Amp(100μg/mL)平板，37℃培养至单克隆形成。挑取单克隆于3mL对应培养基中，37℃，220rpm振荡培养。将获取的克隆子经质粒提取，分别用XhoI-SwaI和Ecl136II-BglII酶切验证，将验证正确的质粒以M13ForwardPrimer和M13Reverse Primer引物送往上海生工生物有限公司测序。
(3)同源重组的敲除质粒pNZ5326的构建
利用XhoI-SwaI和Ecl136II-BglII分别大量酶切测序正确的T克隆上下游同源臂质粒，经1％琼脂糖凝胶分离，紫外灯下割取DNA片段，用胶回收试剂盒分离纯化洗脱。pNZ5319经离子交换柱试剂盒大量回收，质粒浓度约5μg/μL，先进行Ecl136II和BglII双酶切回收大片段载体，与3’端同源臂回收产物用T4连接酶16℃连接过夜。连接产物转化E.coli DH5α化学感受态细胞，涂布于LB平板(含10μg/mL氯霉素和250μg/mL红霉素)，37℃培养。将经液体培养的克隆子提取质粒，酶切验证。验证正确的克隆子大量提取质粒，经XhoI-SwaI双酶切处理，与5’端同源臂回收产物连接过夜(16℃)，转化大肠杆菌化学感受态细胞，涂布于含氯霉素和红霉素的LB固体培养基，培养后提取质粒。用XhoI-SwaI和Ecl136II-BglII分别双酶切验证5’同源臂及3’同源臂，结果见图1，获得用于同源重组的敲除质粒pNZ5326。所用的DNA分子量标准从上到下分子量依次为2000、1000、750、500、250、100bp。
(4)使用***性质粒pNZ5326和pNZ5348无痕敲除WCFS1的glmS基因
ⅰ.植物乳杆菌WCFS1感受态细胞的制备
从MRS平板上挑WCFS1单克隆接种50mL MRS培养基中，30℃厌氧培养过夜后，将培养液于4℃条件下，1000g离心10分钟沉淀细胞；用等体积预冷的0.5M蔗糖(含10％甘油)轻柔悬浮细胞，相同条件下沉淀细胞，倾去上清，再洗涤一次。用100μL含10％甘油的0.5M蔗糖溶液悬浮细胞，按40μL体积分装两管。
ⅱ.电转敲除质粒于感受态细胞
使用离子交换柱式质粒提取试剂盒大量提取pNZ5326，在40μL植物乳杆菌感受态细胞中加入5μL质粒pNZ5326，混匀后转移入预冷的2mm电转杯(eppendorf)中，于1800V电压下电击(eppendorf AG电转仪)。电击结束后，立即用1mL MRS培养基(含10mMGlcNAc)悬浮细菌，转入2mL eppendorf管，置30℃孵育3h后涂布于MRS+N平板(含10μg/mL氯霉素)，30℃培养。长出的单克隆经相应液体培养基培养后提取全基因组，用glmS外侧引物进行glmS基因的鉴定，如图2所示。
(5)氯霉素抗性标记的移除
第一步敲除去除了glmS基因，以氯霉素为筛选标记，获得氯霉素抗性菌株。将该菌株制备成感受态细胞(制备方法与WCFS1感受态制备一致)，1800V电击转化入3μL离子交换柱提取的pNZ5348。立即用1mL MRS培养基(含10mM GlcNAc)悬浮菌体，30℃孵育3h后，涂布MRS+N固体培养基，37℃培养2天。目标克隆经PCR验证(如图3)，确认氯霉素基因被成功移除，获得的突变菌株命名为NZ5333。
实施例3glmS标记的食品级表达载体pSIP497的构建
1.PldhL和glmS基因片段的连接克隆
ⅰ.分别扩增ldhL启动子基因和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶编码基因glmS
采用细菌基因组提取试剂盒提取植物乳杆菌WCFS1全基因组，参照植物乳杆菌WCFS1公布的全基因组序列(GenBank:AL935263.2)，检索获得glmS基因序列，设计引物，通过PCR分别扩增glmS基因(1818bp)和PldhL片段(500bp)，见图4，引物序列、反应体系及反应条件如下：
(ⅰ)引物序列：
Pldhl-F:5’-AGATCTAATCTTCTCACCGTCTTG-3’
Pldhl-R:5’-CACCAACAATTCCACACATTCCTACGAGAGGATGACTTATT-3’
glmSF:5’-AATAAGTCATCCTCTCGTAGGAATGTGTGGAATTGTTGGTG-3’
glmSR:5’-GGGCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCAACGGTCACACTCTTG-3’
(ⅱ)反应体系：
Figure BDA0001573877920000071
(ⅲ)反应条件：95℃预变性5min；(解链95℃，60s；退火60℃，90s；延伸72℃，3min)×30个循环；72℃，10min；4℃保存。
ⅱ.ldhL启动子基因和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶编码基因glmS连接后的overlap-PCR扩增
扩增出的PldhL和glmS基因片段分别用胶回收试剂盒进行纯化，以纯化的两片段为模板，使用引物对Pldhl-F和glmSR连接扩增PldhL-glmS片段，PCR体系及反应条件如下。
(ⅰ)反应体系：
Figure BDA0001573877920000072
Figure BDA0001573877920000081
(ⅱ)反应条件：95℃预变性5min；(解链95℃，60s；退火60℃，90s；延伸72℃，3min)×30个循环；72℃，10min；4℃保存
扩增产物进行纯化后，与T载体连接(16℃)，转化DH5α感受态细胞，涂布于含100μg/mL Amp的LB固体培养基上，37℃培养。挑单克隆培养后提取质粒DNA，进行双酶切验证，验证正确质粒经测序比对筛取阳性克隆。
ⅱ.利用overlap PldhL-glmS片段去除pSIP409载体红霉素标记
BglII-XhoI酶切处理T克隆载体回收PldhL-glmS片段，继而以BamHI和SalI双酶切pSIP409载体，纯化回收线性载体片段。PldhL-glmS片段与该载体进行连接处理，16℃过夜。次日转化E.coli K12ΔglmS化学感受态细胞，混合冰浴热激后，用1mL MT培养基孵育1h，于无抗MT筛选平板上培养，37℃过夜。挑取单克隆培养，提取质粒，利用引物对Pldhl-F-glmSR和EryintF-EryintR进行PCR验证，EryintF-EryintR引物序列、PCR反应体系及反应条件如下，结果见图5，成功构建了食品级表达载体pSIP497。
2、利用本发明所构建的植物乳杆菌食品级表达***异源表达mCherry荧光蛋白上述植物乳杆菌食品级表达***在异源蛋白表达中的应用，包括以下步骤：采用PCR扩增报告基因红色荧光蛋白基因mCherry，***食品级表达载体pSIP497多克隆位点，采用电转化法将构建好的载体转入植物乳杆菌NZ5333中，利用SppIP诱导肽诱导表达，检测红色荧光蛋白在植物乳杆菌NZ5333细胞中的表达，表达过程不添加抗生素。结果如图7所示，红色荧光蛋白在植物乳杆菌NZ5333细胞中表达良好。
另外，本发明不限于上述实施方式，只要在不超出本发明的范围内，可以采取各种方式实施本发明。
序列表
<110> 南京师范大学
<120> 一套植物乳杆菌食品级表达***及其在异源蛋白表达中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggctcgagc aggatacagt cgtcacaacg 30
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggatttaaa tccacacata aattaatctt cc 32
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccgagctcg taagtgtgtg ggcaccaag 29
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggagatctg attgccacaa gtagccac 28
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agatctaatc ttctcaccgt cttg 24
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caccaacaat tccacacatt cctacgagag gatgacttat t 41
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aataagtcat cctctcgtag gaatgtgtgg aattgttggt g 41
<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gggctcgagt cagtggtggt ggtggtggtg ttcaacggtc acactcttg 49

Claims (2)

1.一套植物乳杆菌食品级表达***，其特征在于，包含食品级宿主植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum） NZ5333、食品级表达载体pSIP497、培养基MRS-Y和培养基MRS+N；所述食品级宿主植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum ）NZ5333是采用Cre-loxP技术敲除植物乳杆菌WCFS1基因组上的glmS基因而获得，丧失合成葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的能力，所述的食品级宿主植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum） NZ5333，于2017年12月08日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15039；所述食品级表达载体pSIP497的构建方法为：在乳酸菌表达载体pSIP409的基础上，敲除编码红霉素抗性基因的碱基序列，***来源于植物乳杆菌WCFS1的glmS基因，***来源于植物乳杆菌WCFS1菌株的P ldhL 启动子，所述glmS基因是参照植物乳杆菌WCFS1的全基因序列GenBank:AL935263.2，使用引物glmSF和引物glmSR扩增得到的，
所述引物glmSF的序列为：
5’-AATAAGTCATCCTCTCGTAGGAATGTGTGGAATTGTTGGTG-3’，
所述引物glmSR的序列为：
5’-GGGCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCAACGGTCACACTCTTG-3’，
所述的MRS+N培养基：蛋白胨10g，牛肉粉8g，酵母粉4g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.04g，吐温80 1g，N-乙酰-D-氨基葡萄糖22.121g；所述的MRS-Y培养基：蛋白胨10g，牛肉粉8g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.04g，吐温80 1g。
2.权利要求1所述的一套植物乳杆菌食品级表达***在异源蛋白表达中的应用，其特征在于，包括以下步骤：采用PCR扩增报告基因红色荧光蛋白基因mCherry，***食品级表达载体pSIP497的多克隆位点，采用电转化法将构建好的载体转入植物乳杆菌NZ5333中，利用SppIP诱导肽诱导表达，检测红色荧光蛋白在植物乳杆菌NZ5333细胞中的表达，表达过程不添加抗生素，其中，检测红色荧光蛋白的表达的方法：运用酶标仪测定其荧光强度值或利用倒置荧光显微镜观测红荧光。
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