CN109355340A - 一种具有高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法 - Google Patents

一种具有高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109355340A
CN109355340A CN201811406460.9A CN201811406460A CN109355340A CN 109355340 A CN109355340 A CN 109355340A CN 201811406460 A CN201811406460 A CN 201811406460A CN 109355340 A CN109355340 A CN 109355340A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sea cucumber
peptide
thermal stability
preparation
high thermal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811406460.9A
Other languages
English (en)
Inventor
施蓬
曾红亮
胡正红
王锦锋
张怡
郑宝东
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHENGTIAN (FUQING) FOOD CO Ltd
Original Assignee
SHENGTIAN (FUQING) FOOD CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHENGTIAN (FUQING) FOOD CO Ltd filed Critical SHENGTIAN (FUQING) FOOD CO Ltd
Priority to CN201811406460.9A priority Critical patent/CN109355340A/zh
Publication of CN109355340A publication Critical patent/CN109355340A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/54—Improvements relating to the production of bulk chemicals using solvents, e.g. supercritical solvents or ionic liquids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及多肽领域，具体涉及一种具有高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法。将海参蛋白和多糖形成的复合物依次经水解酶酶解、金属离子螯合得到海参抗氧化螯合肽。其中，复合物由海参蛋白与多糖发生美拉德反应而成。海参蛋白与多糖在超临界CO2下进行美拉德反应。反应条件为：压力40～60MPa，温度140～160℃，反应时间15～25min。本发明制备的海参抗氧化螯合肽具有高热稳定性和高的抗氧化活性。

Description

一种具有高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽领域，具体涉及一种具有高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法。
背景技术
海参是重要的海洋无脊椎动物，其生存已有5000多万年的历史，主要分布于世界温带区和热带区，以印度洋、西太平洋区域内种类最多、资源量最大。全世界有1100多种海参，我国约有140种，全世界可食用海参有40多种，我国约有20种，分别隶属于3个目、4个科，我国可食用海参的类群，以梅花参、刺参、绿刺参和花刺参等为主，其中产自渤海、黄海海域的刺参(Stichopus japonicus)营养价值最高，是世界上最名贵的海参，被誉为“参中之冠”。自古以来，海参就是营养保健食品，在《中药大辞典》中刺参属中药补阳药，主治经血亏损、虚弱劳却、阳痿、梦遗、小便频数、肠燥便艰、神经衰弱、肺结核等。而现代科学研究证实，海参体内含有50余种有益于人体生理活动的营养成分，其中蛋白质的含量极高。海参肽是由2-12个氨基酸组成的小肽或者是分子量更大的多肽，具有降血压、抗氧化、抗肿瘤及抗疲劳等多种功能。
生物体内存在大量的自由基，在机体内不断地产生，也不断地被清除，处于动态平衡之中，始终维持在正常的生理水平上。如果机体内的自由基过剩，就会损伤蛋白质、核酸和生物膜等，从而引发各种疾病。若摄入一定量的抗氧化剂则可帮助机体清除体内过剩的自由基，保护其免受氧化损害。目前，国内外研究发现从海洋动物蛋白水解液中分离得到的多肽具有较强的抗氧化活性。AliBougatef等研究发现从沙丁鱼中分离制备的三肽具有显著的清除自由基的能力；王勇刚从鱼精中分离出的二肽不但能够显著的清除羟自由基还能有效的降低胚肺细胞内的自由基含量；刘成梅等从罗非鱼鱼皮中分离出的多肽具有清除DPPH自由基的作用；Chi等通过Acalase和胰蛋白酶双酶酶解大黄鱼肌肉，并通过Deae-52、SephadexG-15和RP-HCLP纯化出三种生物活性肽，均表现出较强的自由基清除和抑制脂质过氧化活性。
多肽由于其结构特性，在加热的条件下容易发生变性，丧失其活性，如抗氧化活性等，因此提高多肽的热稳定性极为重要。发明专利“一种海参抗氧化多肽”(公开号为CN104356201A)公开了一种以海参肉或海参内脏蛋白为原料，通过对酸性蛋白酶的酶解，分离纯化得到特异性海参抗氧化多肽，该发明提供了一种海参抗氧化肽的制备方法并研究其抗氧化活性，但并未确定其热稳定性，可认为其与传统方法制备的多肽相同热稳定性低。发明专利“一种章鱼钙螯合蛋白肽及其制备方法”(公开号为CN105273059B)公开了一种以章鱼蛋白为原料，通过碱性蛋白酶及风味蛋白酶酶解，再经过分离纯化得到纯化的特异性金属Ca螯合肽，该发明仅提供了一种螯合钙蛋白肽的制备方法，但并未研究其抗氧化活性和热稳定性。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种具有高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
一种高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法，其包括以下步骤：将海参蛋白和多糖形成的复合物依次经水解酶酶解、金属离子螯合得到海参抗氧化螯合肽。
本技术方案将海参蛋白和多糖形成的复合物水解酶酶解，形成热稳定性强的海参抗氧化肽-多糖复合物，海参抗氧化肽-多糖复合物再与金属离子螯合制备得到热稳定性强的海参抗氧化螯合肽。海参蛋白可以是由海参的任何部位制备形成，如海参内脏、海参皮、海参肉。本技术方案适用用于海参内脏中抗氧化螯合肽的提取，可进一步实现海参内脏作为废脚料的变废为宝，拓宽海参内脏蛋白的应用领域。
本发明方法的改进，复合物由海参蛋白与多糖发生美拉德反应而成。本发明先将海参蛋白与糖类物质发生美拉德反应，美拉德反应制备的蛋白质-糖共价复合物可以增强蛋白质的功能特性，包括溶解性、凝胶型、乳化性、起泡性、热稳定性、抗氧化性等，还可以构建传递***运送活性物质。在改善海参内脏蛋白理化性质的同时，可提高所制备的海参抗氧化螯合肽的热稳定性；海参蛋白与多糖发生美拉德反应制成的海参抗氧化肽-多糖复合物也可通过其他种方法制备而成。多糖优选为木糖，研究表明，多糖的种类、结构、分子量、链长也会影响美拉德反应的速率，而在众多的糖类化合物中，木糖与海参蛋白的接枝程度最高。
本发明方法的改进，海参蛋白与多糖在超临界CO2条件下进行美拉德反应。
本技术方案中，在超临界CO2条件下，可减少海参内脏蛋白在美拉德反应中的损失，改善其理化性质，提高海参内脏蛋白的热稳定性，进而提高后续海参抗氧化螯合肽的热稳定性。
本发明方法的改进，超临界CO2下进行美拉德反应条件为：压力40～60MPa，温度140～160℃，反应时间15～25min。
本技术方案中，在上述压力、温度和时间下，经实验表明，最终制备的海参抗氧化螯合肽的热稳定性高于现有技术中的海参抗氧化肽。
本发明方法的改进，由海参蛋白粉调配成浓度为0.1mol/L的海参蛋白溶液与0.1mol/L的多糖溶液，按体积比为1:1～1:3混合后发生美拉德反应。
本发明方法的改进，所述水解酶为固定化的酸性水解酶，酸性水解酶的固定化具体为：将复合凝胶以液滴形式滴入CaCl2溶液中，并在2～4℃下放置2.5～3h固化后得到复合凝胶载体颗粒，将复合凝胶载体颗粒加入pH3.5～4.5、酶添加量为2200U/mL的酸性水解酶酶液中吸附0.5～1h后，取出复合凝胶载体颗粒，缓冲液清洗，得到固定化酸性水解酶；所述复合凝胶包含质量比为5:1～7:1的海藻酸钠与黄原胶。其中，酸性水解酶为酸性蛋白酶，酸性蛋白酶是指具有较低最适PH的蛋白酶，其最适PH值在2.5～5.0之间。本发明所选择得酸性蛋白酶为食品级酸性蛋白酶。
本技术方案采用的是吸附法固定酸性水解酶，其中，将海藻酸钠与黄原胶制成的复合凝胶载体颗粒作为吸附剂，使酸性水解酶固定化，应用于海参蛋白和多糖形成的复合物的酶解制成高热稳定性的海参抗氧化螯合肽，可提高酸性水解酶与复合物的结合点，提高酶解效率，提高所制成的海参抗氧化螯合肽的热稳定性和抗氧化活性。
其中，复合凝胶载体颗粒的制备具体为：将海藻酸钠与黄原胶按质量比为5:1～7:1在60℃以下的热水中溶解，混合均匀，超声波下快速消泡至无气泡得到复合凝胶；使用10mL注射器以0.03～0.10ml/s的速率将复合凝胶滴到质量浓度为5.0g/100mL的CaCl2溶液中，在在2～4℃冰箱中固化2.5～3h成颗粒物，用纱布滤出颗粒物，并用缓冲液(缓冲液可以为磷酸盐)冲洗3次除去颗粒物表面的CaCl2，用滤纸吸干表面水分，得到复合凝胶载体颗粒。
其中，固定化酶的步骤为，将所得到的复合凝胶载体颗粒放入pH3.5～4.5、酶添加量为2200U/mL的酸性水解酶酶液中进行吸附，吸附0.5h后用纱布滤出复合凝胶载体颗粒，用缓冲液(缓冲液可以为磷酸盐)清洗，并用滤纸吸干复合凝胶载体颗粒表面的水分，所得到的球状颗粒，即固定化酶。
本发明方法的改进，所述水解酶酶解具体为：复合物在在脉冲电场处理下，加入水解酶酶解。
本技术方案中，优选在开启脉冲电场的同时，加入水解酶酶解，有助于蛋白质酶切位点的展开，提高固定化酶酶解效率，又可防止脉冲电场的过度处理使蛋白质的过度变性。
本发明方法的改进，所述脉冲电场处理条件为，电场强度25～40kv·cm-1，处理时间30～300μs；水解酶的加入量为复合物质量的1.0％～3.0％，酶解条件为：温度40～48℃，pH7～7.8，酶解时间1.5～3h。
本技术方案中，复合物与水按质量比1:2～1:5混合均匀后，再加入水解酶。
本发明方法的改进，酶解得到的酶解液，逐步通过截留分子量为3000Da、1500Da、和500Da的三种不同规格的超滤设备，截留分子量为500～1500Da的组分；得到海参抗氧化肽-多糖复合物。
本发明方法的改进，海参蛋白采用以下方法制备，清洗后的海参与酒精按重量比为1:3～1:6进行浸提，浸提1.5～3h后，10000×g～30000×g离心15～25分钟，收集上清液，经冷冻干燥得到海参蛋白。
本技术方案中，收集到的上清液后，经过滤、浓缩后再经冷冻干燥得到的粉末即为海参蛋白。
本发明方法的改进，金属离子螯合：将酶解后的酶解物经纯化后得到的海参抗氧化肽-多糖复合物与氯化钙按质量比0.5:1～0.5:4混合均匀，调节pH值为5～9，在温度为30～70℃下静置进行螯合20～70min，得到海参抗氧化螯合肽。
上述所得到的海参抗氧化螯合肽即为海参抗氧化螯合肽-多糖复合物；金属离子优选为Ca2+，海参抗氧化肽-多糖复合物羧基端连接了Ca2+，使其结构更稳定，在热的条件下多肽不易发生变性，且其抗氧化能力强于海参抗氧化肽。多肽具备与金属离子螯合的作用位点，能够与其形成稳定的化合物，且多肽-金属螯合物具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、可同时补充氨基酸和金属。多肽鳌合钙既有利于钙离子以鳌合物形式被完整地转运吸收，又能在需要时有效地释放钙离子。
为表述方便，本发明中海参蛋白质-木糖复合物指的是海参蛋白质与多糖形成的通过糖氨基连接的复合物。海参抗氧化肽-多糖复合物指的是海参抗氧化肽与多糖形成的通过糖氨基连接的复合物。海参抗氧化螯合肽-多糖复合物指的是海参抗氧化螯合肽与多糖形成的通过糖氨基连接的复合物。
(三)有益效果
1.本发明由海参蛋白和多糖形成的复合物进行酶解，并金属螯合后制成抗氧化活性强且热稳定性高的海参抗氧化螯合肽。
2.本发明采用脉冲电场技术结合固定化酶酶解技术进行酶解，固定化后的酶与反应***易于分离，简化了纯化过程，可重复使用，降低成本，催化反应更容易控制，具有减少污染的生态效应；且在酶解过程中添加了脉冲电场，有利于蛋白质结构的打开，加快酶解速率，提高生产效率。
附图说明
图1实施例1-3螯合肽清除DPPH自由基的IC50值；
图2实施例1-3螯合肽清除羟基自由基的IC50值；
图3实施例1-3螯合肽清除ABTS自由基的IC50值；
图4实施例1-3螯合肽清除超氧阴离子自由基的IC50值。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
本发明酸性水解酶为酸性蛋白酶，酸性蛋白酶是指具有较低最适PH的蛋白酶，其最适PH值在2.5～5.0之间。本发明所选择得酸性蛋白酶为食品级酸性蛋白酶，食品级酸性蛋白酶。以下实施例中的酸性水解酶，为选购自苏柯汉生物工程有限公司，其酶活力为100000U/g。
实施例1：
一种高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法，包括以下步骤：
S1：海参蛋白粉制备：将海参内脏清洗7次，使用酒精浸提2h，浸提pH6.8，提取温度为65℃，海参内脏与酒精的重量比为1:5；浸提后，10000×g离心15分钟，收集上清液，经过滤、浓缩和冷冻干燥后得到海参蛋白粉。
S2：海参蛋白质-木糖复合物制备：将S1中得到的的海参蛋白粉调配成浓度为0.10mol/L的海参内脏蛋白溶液，将海参内脏蛋白溶液与0.10mol/L的木糖溶液按体积比为1:3混合，装入超临界CO2装置的反应室，进行美拉德反应，反应条件为：压力50MPa，温度140℃，反应时间25min；反应后采用30％冷乙醇，-3℃的冷乙醇将反应室冷却到室温终止反应，得到海参蛋白质-木糖复合物。
S3：酸性水解酶的固定化：
(1)复合凝胶准备：将海藻酸钠与黄原胶按质量比为5:1在60℃以下的热水中溶解，混合均匀，超声波下快速消泡至无气泡得到复合凝胶；使用10mL注射器以0.10ml/s的速率将复合凝胶滴到质量浓度为5.0g/100mL的CaCl2溶液中，在在3℃冰箱中固化2.5h成颗粒物，用纱布滤出颗粒物，并用缓冲液(缓冲液可以为磷酸盐)冲洗3次除去颗粒物表面的CaCl2，用滤纸吸干表面水分，得到复合凝胶载体颗粒。
(2)酶固定化，将(1)所得到的复合凝胶载体颗粒放入pH4.5、酶添加量为2200U/mL的酸性水解酶酶液中进行吸附，吸附0.5h后用纱布滤出复合凝胶载体颗粒，用缓冲液(缓冲液可以为磷酸盐)清洗，并用滤纸吸干复合凝胶载体颗粒表面的水分，所得到的球状颗粒，即固定化酶。
S4：将S2得到的海参蛋白质-木糖复合物加入蒸馏水使海参蛋白质-木糖复合物与水的质量比1:5；并在脉冲电场作用的同时，加入固定化后的酸性水解酶酶解，其中，脉冲电场强度40kv·cm-1，处理时间100μs；水解酶的加入量为海参蛋白质-木糖复合物质量的1.0％，酶解条件为：温度40℃，pH7.8，酶解时间2h，酶解后得到酶解液。
S5：将S4得到的酶解液，逐步通过截留分子量为3000Da、1500Da、和500Da的三种不同规格的超滤设备，截留分子量为500～1500Da的组分；得到小分子的海参抗氧化肽-木糖复合物。
S6：金属离子螯合：将S5得到的海参抗氧化肽-木糖复合物按质量比为0.5:4加入氯化钙混合均匀，调节pH值为7，在温度为30℃下静置进行螯合反应70min，得到具有高热稳定性的海参抗氧化螯合肽。
实施例2：
一种高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法，包括以下步骤：
S1：海参蛋白粉制备：将海参内脏清洗3次，使用酒精浸提3h，浸提pH7.0，提取温度为50℃，海参内脏与酒精的重量比为1:6；浸提后，20000×g离心20分钟，收集上清液，经过滤、浓缩和冷冻干燥后得到海参蛋白粉。
S2：海参蛋白质-木糖复合物制备：将S1中得到的的海参蛋白粉调配成浓度为0.08mol/L的海参内脏蛋白溶液，将海参内脏蛋白溶液与0.08mol/L的木糖溶液按体积比为1:1混合，装入超临界CO2装置的反应室，进行美拉德反应，反应条件为：压力60MPa，温度150℃，反应时间15min；反应后采用30％冷乙醇，-3℃的冷乙醇将反应室冷却到室温终止反应，得到海参蛋白质-木糖复合物。
S3：酸性水解酶的固定化：(1)复合凝胶准备：将海藻酸钠与黄原胶按质量比为6:1在60℃以下的热水中溶解，混合均匀，超声波下快速消泡至无气泡得到复合凝胶；使用10mL注射器以0.03ml/s的速率将复合凝胶滴到质量浓度为5.0g/100mL的CaCl2溶液中，在在4℃冰箱中固化2.8h成颗粒物，用纱布滤出颗粒物，并用缓冲液(缓冲液可以为磷酸盐)冲洗3次除去颗粒物表面的CaCl2，用滤纸吸干表面水分，得到复合凝胶载体颗粒。
(2)酶固定化，将(1)所得到的复合凝胶载体颗粒放入pH3.5、酶添加量为2200U/mL的酸性水解酶酶液中进行吸附，吸附0.5h后用纱布滤出复合凝胶载体颗粒，用缓冲液(缓冲液可以为磷酸盐)清洗，并用滤纸吸干复合凝胶载体颗粒表面的水分，所得到的球状颗粒，即固定化酶。
S4：将S2得到的海参蛋白质-木糖复合物加入蒸馏水使海参蛋白质-木糖复合物与水的质量比1:2；并在脉冲电场作用的同时，加入固定化后的酸性水解酶酶解，其中，脉冲电场强度25kv·cm-1，处理时间300μs；水解酶的加入量为海参蛋白质-木糖复合物质量的2％，酶解条件为：温度48℃，pH7.5，酶解时间3h，酶解后得到酶解液。
S5：将S4得到的酶解液，逐步通过截留分子量为3000Da、1500Da、和500Da的三种不同规格的超滤设备，截留分子量为500～1500Da的组分；得到小分子海参抗氧化肽-木糖复合物。
S6：金属离子螯合：将S5得到的海参抗氧化肽-木糖复合物按质量比为0.5:1加入氯化钙混合均匀，调节pH值为9，在温度为40℃下静置反应20min，得到具有高热稳定性的海参抗氧化螯合肽。
实施例3：
一种高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法，包括以下步骤：
S1：海参蛋白粉制备：将海参内脏清洗5次，使用酒精浸提1.5h，浸提pH7.3，提取温度为60℃，海参内脏与酒精的重量比为1:4；浸提后，30000×g离心25分钟，收集上清液，经过滤、浓缩和冷冻干燥后得到海参蛋白粉。
S2：海参蛋白质-木糖复合物制备：将S1中得到的的海参蛋白粉调配成浓度为0.12mol/L的海参内脏蛋白溶液，将海参内脏蛋白溶液与0.12mol/L的木糖溶液按体积比为1:2混合，装入超临界CO2装置的反应室，进行美拉德反应，反应条件为：压力40MPa，温度160℃，反应时间20min；反应后采用30％冷乙醇，-3℃的冷乙醇将反应室冷却到室温终止反应，得到海参蛋白质-木糖复合物。
S3：酸性水解酶的固定化：(1)复合凝胶准备：将海藻酸钠与黄原胶按质量比为7:1在60℃以下的热水中溶解，混合均匀，超声波下快速消泡至无气泡得到复合凝胶；使用10mL注射器以0.05ml/s的速率将复合凝胶滴到质量浓度为5.0g/100mL的CaCl2溶液中，在在2℃冰箱中固化3h成颗粒物，用纱布滤出颗粒物，并用缓冲液(缓冲液可以为磷酸盐)冲洗3次除去颗粒物表面的CaCl2，用滤纸吸干表面水分，得到复合凝胶载体颗粒。
(2)酶固定化，将(1)所得到的复合凝胶载体颗粒放入pH4、酶添加量为2200U/mL的酸性水解酶酶液中进行吸附，吸附0.5h后用纱布滤出复合凝胶载体颗粒，用缓冲液(缓冲液可以为磷酸盐)清洗，并用滤纸吸干复合凝胶载体颗粒表面的水分，所得到的球状颗粒，即固定化酶。
S4：将S2得到的海参蛋白质-木糖复合物加入蒸馏水使海参蛋白质-木糖复合物与水的质量比1:3；并在脉冲电场作用的同时，加入固定化后的酸性水解酶酶解；其中，脉冲电场强度30kv·cm-1，处理时间30μs；水解酶的加入量为海参蛋白质-木糖复合物质量的3.0％，酶解条件为：温度45℃，pH7，酶解时间3h，酶解后得到酶解液。
S5：将S4得到的酶解液，逐步通过截留分子量为3000Da、1500Da、和500Da的三种不同规格的超滤设备，截留分子量为500～1500Da的组分；得到小分子海参抗氧化肽-木糖复合物。
S6：金属离子螯合：将S5得到的海参抗氧化肽-木糖复合物按质量比为2:1加入氯化钙混合均匀，调节pH值为5，在温度为70℃下静置反应40min，得到具有高热稳定性的海参抗氧化螯合肽。
本发明实施例1-3方法制备的海参抗氧化螯合肽实际为金属钙-海参多肽-糖复合物。
实验数据：
将本发明将实施例1、实施例2和实施例3制备的钙-海参多肽-糖复合物分别作为样品1、样品2和样品3测定热稳定性和抗氧化活性，并以相同质量的海参抗氧化肽、海参多肽-钙螯合物，在相同条件下测定作为对照。其中，热稳定性通过测定肽的变性温度、退化温度以及温度退化之后多肽的损失质量作为指标测定。抗氧化活性，通过测定样品1、样品2和样品3清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基、ABTS自由基的IC50值。
多肽热稳定性的测定结果如表1所示：
从表1可知，本发明实施例1、实施例2和实施例3制备的钙-海参多肽-糖复合物相对于海参抗氧化肽、海参多肽-钙螯合物，其变形温度最高，且损失最少，退化的温度最高，说明本发明实施例1、实施例2和实施例3制备的钙-海参多肽-糖复合物相对于海参抗氧化肽、海参多肽-钙螯合物，具有更强的热稳定性，而各实施例的热稳定性强度为实施例1＞实施例3＞实施例2。
表1多肽热稳定性
抗氧化活性的测定结果如图1-4所示：
由图1-4可知，各对照样品清除DPPH自由基、清除DPPH自由基、ABTS自由基、超氧阴离子自由基的IC50值依次为：海参抗氧化肽＞海参多肽-钙螯合物＞实施例2＞实施例3＞实施例1；IC50代表被测量的拮抗剂的半抑制浓度，由此可知，各样品的抗氧化活性依次为：海参抗氧化肽＜海参多肽-钙螯合物＜实施例2＜实施例3＜实施例1，因此本发明实施例1、实施例2和实施例3制备的钙-海参多肽-糖，其抗氧化活性相对于海参抗氧化肽、海参多肽-钙螯合物活性更高，且实施例3制备的钙-海参多肽-糖的抗氧化活性最高。

Claims (10)

1.一种具有高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：将海参蛋白和多糖形成的复合物依次经水解酶酶解、金属离子螯合得到海参抗氧化螯合肽。
2.如权利要求1所述的具有高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法，其特征在于：所述复合物由海参蛋白与多糖发生美拉德反应而成。
3.如权利要求2所述的具有高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法，其特征在于：所述海参蛋白与多糖在超临界CO2下进行美拉德反应。
4.如权利要求3所述的具有高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法，其特征在于，超临界CO2下进行美拉德反应条件为：压力40～60MPa，温度140～160℃，反应时间15～25min。
5.如权利要求2-4任意一项所述的具有高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法，其特征在于：由海参蛋白粉调配成浓度为0.08～0.12mol/L的海参蛋白溶液与0.08～0.12mol/L的多糖溶液，按体积比为1:1～1:3混合后发生美拉德反应。
6.如权利要求1所述的具有高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法，其特征在于：所述水解酶为固定化的酸性水解酶，酸性水解酶的固定化具体为：将复合凝胶以液滴形式滴入CaCl2溶液中，并在2～4℃下放置2.5～3h固化后得到复合凝胶载体颗粒，将复合凝胶载体颗粒加入pH3.5～4.5、酶添加量为2200U/mL的酸性水解酶酶液中吸附0.5～1h后，取出复合凝胶载体颗粒，缓冲液清洗，得到固定化酸性水解酶；所述复合凝胶包含质量比为5:1～7:1的海藻酸钠与黄原胶。
7.如权利要求1所述的具有高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法，其特征在于：所述复合物在在脉冲电场处理下，加入水解酶酶解。
8.如权利要求7所述的具有高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法，其特征在于：所述脉冲电场处理条件为，电场强度25～40kv·cm-1，处理时间30～300μs；水解酶的加入量为复合物质量的1.0％～3.0％，酶解条件为：温度40～48℃，pH7～7.8，酶解时间1.5～3h。
9.如权利要求1所述的具有高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法，其特征在于：海参蛋白采用以下方法制备，清洗后的海参与酒精按重量比为1:3～1:6进行浸提，浸提1.5～3h后，10000×g～30000×g离心15～25分钟，收集上清液，经冷冻干燥得到海参蛋白。
10.如权利要求1所述的具有高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法，其特征在于，金属离子螯合具体为：将酶解后的酶解物经纯化后得到的海参抗氧化肽-多糖复合物与氯化钙按质量比0.5:1～0.5:4混合均匀，调节pH值为5～9，在温度为30～70℃下静置进行螯合20～70min，得到海参抗氧化螯合肽。
CN201811406460.9A 2018-11-23 2018-11-23 一种具有高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法 Pending CN109355340A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811406460.9A CN109355340A (zh) 2018-11-23 2018-11-23 一种具有高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811406460.9A CN109355340A (zh) 2018-11-23 2018-11-23 一种具有高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109355340A true CN109355340A (zh) 2019-02-19

Family

ID=65338469

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811406460.9A Pending CN109355340A (zh) 2018-11-23 2018-11-23 一种具有高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109355340A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108741100A (zh) * 2018-04-25 2018-11-06 山东东阿古胶阿胶系列产品有限公司 一种螯合铁阿胶糖肽的制备方法及应用
CN110564800A (zh) * 2019-09-25 2019-12-13 浙江海洋大学 一种具有抗氧化活性的鱿鱼皮蛋白美拉德肽液的制备方法
CN113603799A (zh) * 2021-06-30 2021-11-05 南昌大学 一种高抗氧化性的米糠多糖-肽复合物及其制备方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1951402A (zh) * 2006-10-13 2007-04-25 黄世宽 一种海参活性多肽钙、锌蛋白的生产方法
CN102578589A (zh) * 2012-03-08 2012-07-18 宁波大学 一种海参多肽螯合活性钙的制备方法及应用
CN103230020A (zh) * 2013-04-15 2013-08-07 武汉工业学院 一种蛋白质短肽螯合钙的制备方法
CN104920782A (zh) * 2015-06-03 2015-09-23 四川大学 一种多肽螯合钙制剂及其制备方法
CN105624246A (zh) * 2016-02-25 2016-06-01 大连工业大学 一种高抗氧化性刺参肠寡肽衍生物的制备方法
CN105671114A (zh) * 2016-02-25 2016-06-15 大连工业大学 一种海参卵肽钙螯合物的制备方法
CN106387920A (zh) * 2016-09-18 2017-02-15 天津北洋百川生物技术有限公司 一种大豆多肽螯合钙的制备方法
CN108208305A (zh) * 2017-11-30 2018-06-29 浦江县昂宝生物技术有限公司 利用海参活性多肽制备复配物的方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1951402A (zh) * 2006-10-13 2007-04-25 黄世宽 一种海参活性多肽钙、锌蛋白的生产方法
CN102578589A (zh) * 2012-03-08 2012-07-18 宁波大学 一种海参多肽螯合活性钙的制备方法及应用
CN103230020A (zh) * 2013-04-15 2013-08-07 武汉工业学院 一种蛋白质短肽螯合钙的制备方法
CN104920782A (zh) * 2015-06-03 2015-09-23 四川大学 一种多肽螯合钙制剂及其制备方法
CN105624246A (zh) * 2016-02-25 2016-06-01 大连工业大学 一种高抗氧化性刺参肠寡肽衍生物的制备方法
CN105671114A (zh) * 2016-02-25 2016-06-15 大连工业大学 一种海参卵肽钙螯合物的制备方法
CN106387920A (zh) * 2016-09-18 2017-02-15 天津北洋百川生物技术有限公司 一种大豆多肽螯合钙的制备方法
CN108208305A (zh) * 2017-11-30 2018-06-29 浦江县昂宝生物技术有限公司 利用海参活性多肽制备复配物的方法

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FRANCÜOIS CHEVALIER等: "Scavenging of Free Radicals, Antimicrobial, and Cytotoxic Activities of the Maillard Reaction Products of â-Lactoglobulin Glycated with Several Sugars", 《J. AGRIC. FOOD CHEM》 *
JIA-RUN HAN等: "Kinetics of antioxidant-producing Maillard reaction in the mixture of ribose and sea cucumber (Stichopus japonicus) gut hydrolysates", 《JOURNAL OF AQUATIC FOOD PRODUCT TECHNOLOGY》 *
TAKAYOSHI AOKI等: "Improvement of heat stability and emulsifying activity of ovalbumin by conjugation with glucuronic acid through the Maillard reaction", 《FOOD RESEARCH INTERNATIONAL》 *
万素英等: "美拉德反应产物的抗氧化性能研究", 《中国食品添加剂》 *
宋渊主编: "《发酵工程》", 31 May 2017 *
张和平主编: "《现代乳品工业手册》", 31 August 2005, 中国轻工业出版社 *
杨锋等: "美拉德反应对醋蛋多肽抗氧化活性的影响", 《食品科学》 *
董学艳等: "响应面分析法在大麦蛋白-葡萄糖Maillard反应物热稳定性研究中的应用", 《中国食品添加剂》 *
董学艳等: "美拉德反应对大麦蛋白热稳定性的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科学I辑》 *
陈贵堂等: "采用美拉德反应提高灰树花多肽的抗氧化活性", 《食品科学》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108741100A (zh) * 2018-04-25 2018-11-06 山东东阿古胶阿胶系列产品有限公司 一种螯合铁阿胶糖肽的制备方法及应用
CN108741100B (zh) * 2018-04-25 2021-10-01 山东东阿古胶阿胶系列产品有限公司 一种螯合铁阿胶糖肽的制备方法及应用
CN110564800A (zh) * 2019-09-25 2019-12-13 浙江海洋大学 一种具有抗氧化活性的鱿鱼皮蛋白美拉德肽液的制备方法
CN110564800B (zh) * 2019-09-25 2023-06-06 浙江海洋大学 一种具有抗氧化活性的鱿鱼皮蛋白美拉德肽液的制备方法
CN113603799A (zh) * 2021-06-30 2021-11-05 南昌大学 一种高抗氧化性的米糠多糖-肽复合物及其制备方法
CN113603799B (zh) * 2021-06-30 2023-01-03 南昌大学 一种高抗氧化性的米糠多糖-肽复合物及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10455849B2 (en) Method for the preparation of a protein peptide, a protein peptide and use thereof
CN111235203B (zh) 一种蛤蜊活性肽的生产方法
CN109355340A (zh) 一种具有高热稳定性海参抗氧化螯合肽的制备方法
AU666531B2 (en) Processes for the preparation of amylase inhibitor
CN103882083B (zh) 一种抗氧化胶原肽的制备方法
JP2009510234A (ja) あわび多糖類抽出方法
CN105852135A (zh) 一种食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物的制备方法
CN101979652A (zh) 一种具有抗氧化活性的四角蛤蜊蛋白多肽及其制备方法和应用
CN104877035B (zh) 一种具有降糖作用的黑木耳多糖的制备方法
CN109468357A (zh) 一种脾氨肽的制备方法
CN107177656A (zh) 一种泥鳅鱼蛋白多肽及其应用
CN105341933A (zh) 一种海参牡蛎酶解口服液及其制备方法
CN102086466A (zh) 一种杏仁功能性混合肽及其制备方法
CN107523602A (zh) 一种乌鸡活性肽的提取方法
CN104531663A (zh) 鱿鱼碎肉制备高f值寡肽固定化酶水解方法
KR101021645B1 (ko) 미백화된 오징어 콜라겐 유래 펩타이드의 제조방법
CN107496465A (zh) 基于球藻提取物的复配物及其制备方法
CN103689113A (zh) 一种有机豆腐的制备方法
JP4406032B2 (ja) 帆立貝多糖類抽出方法
CN104509659A (zh) 一种火龙果果脯的制备方法
US3258407A (en) Processes for the extraction of proteins and other useful constituents contained in vegetable tissues
CN114231585A (zh) 一种斑点叉尾鮰魚鳔胶原蛋白肽的制备工艺
JPH1075750A (ja) にんにく系健康飲料
CN106636267A (zh) 一种小分子参蚝多肽的提取方法
CN106260497A (zh) 一种大鲵滋补蛋白粉生产技术

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190219

RJ01 Rejection of invention patent application after publication