CN105852135A - 一种食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品生物技术领域，具体涉及食药用菌蛋白肽‑亚铁螯合物的制备方法，包括：利用碱溶酸沉法或硫酸铵沉降法提取食药用菌中的蛋白质；采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶或复合蛋白酶对食药用菌蛋白进行限制性酶解后，灭酶，制备食药用菌蛋白酶解液；利用无机物氯化亚铁或硫酸亚铁中的亚铁与食药用菌蛋白肽螯合获得食药用菌蛋白肽‑亚铁螯合物。本发明通过碱溶酸沉法或硫酸铵沉降法可显著提高食药用菌蛋白的提取率；通过控制酶解时间可有效控制蛋白的降解程度；整个多肽‑亚铁螯合物制备工艺简单。本发明制备的亚铁‑肽螯合物具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、安全无毒、价格低、可同时补充氨基酸和亚铁，必将成为亚铁补充剂的首选；本发明为食药用菌的应用提供了一条新思路。
Description
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物的制备方法。
背景技术
亚铁是人体必需的微量元素之一，它是构成血红素必不可少的成分，在人体内起着输送氧气的作用，还参与细胞的增殖和分化，能量代谢、解毒等许多重要生理过程。根据世界卫生组织报道，全世界有30％的人口存在铁缺乏，缺铁性贫血是全球最为普遍的营养性疾病。我国营养性贫血患者中有95%以上为缺铁性贫血；7岁以下小儿缺铁性贫血患病率约20%-70%。目前，缺铁性贫血的防治主要通过摄入补铁剂来实现。常见的补铁剂有硫酸亚铁、氯化亚铁、葡萄糖酸亚铁、乳酸亚铁等，这些补铁剂虽然铁含量高，补铁效果较好，但是由于它们在体内的利用率较低，毒副作用大，并且有特殊的金属铁锈味。多肽螯合铁是蛋白质水解生成的多肽与二价铁离子螯合而生成的生物态铁，在体内不受碳酸盐、单宁酸和纤维素等干扰物质的影响，在体内始终处于可吸收的二价状态，可以直接被肠粘膜细胞吸收，无毒副作用，不产生任何消化道刺激症状，生物利用率高，是一种理想的补铁剂。
食药用菌是一大类有大型子实体的高等真菌，俗称蘑菇或蕈，含有人体所需要的多种营养成分，蛋白质含量非常高，如金针菇的蛋白质含量达20.9%，草菇中蛋白质含量达25.9%，大大超过我们常食的蔬菜和粮食食品，也超过畜禽品的蛋白质含量。食药用菌还富含各类氨基酸，如香菇、平菇、银耳等氨基酸总量平均为15.76%（干重），必需氨基酸总量平均为6.43% （干重）。因此，食药用菌中的蛋白水解产生的多肽与普通动植物蛋白相比具有更丰富的生物活性和更高的营养价值。
利用生物技术对食药用菌(香菇、黑木耳、平菇、蟹味菇、茶树菇、茯苓、桑黄、草菇、金针菇、杏鲍菇、银耳、竹荪、灵芝、灰树花和猴头菇等)进行蛋白质资源的深加工，进行生物活性肽的筛选和提取分离，然后利用氯化亚铁、硫酸亚铁等进行螯合，制备多肽-亚铁螯合物。这种食药用菌生物活性多肽-亚铁螯合物能显著提高铁元素的吸收率和利用率，而且还具有抗氧化、抗菌、免疫调节、降血脂和降血糖等活性，有很高的开发价值和应用前景，同时能提高食药用菌的附加值，为食药用菌资源的利用开辟了新的途径，具有广阔的市场前景。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物的制备方法，具有工艺操作简便、安全性高的优点。所制备的亚铁-肽螯合物具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、安全无毒、价格低、可同时补充氨基酸和亚铁。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）蛋白提取：利用碱溶酸沉法或硫酸铵沉降法提取食药用菌蛋白；
（2）酶解：采用蛋白酶对提取的食药用菌蛋白进行有限酶解，制得食药用菌蛋白肽复合物溶液；
（3）多肽-亚铁螯合物制备：利用固体高温混合法或者液体螯合法将食药用菌蛋白肽复合物溶液制成食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物；
（4）将食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物进行冷冻干燥。
所述食药用菌包括：香菇、黑木耳、平菇、蟹味菇、茶树菇、茯苓、桑黄、草菇 、金针菇、杏鲍菇、银耳、竹荪、灵芝、灰树花和猴头菇等中的一种。
步骤（1）中，所述碱溶酸沉法的具体步骤如下：首先将食药用菌超微粉碎，将粉碎后的食药用菌与蒸馏水以1 g:20-60 mL的比例混合，利用0.5wt%-2wt%的NaOH或KOH溶液调节pH至9.0-11.0，先超声提取10-50 min，再在50-100℃水浴提取60-120 min，提取后过滤，取滤液，滤液为碱提的食药用菌蛋白溶液，用盐酸调节碱提的食药用菌蛋白溶液pH至2.5-4.0进行蛋白沉淀，3000-5000 r/min离心5-10 min得沉淀蛋白，水洗至中性再次离心，将沉淀冷冻干燥即得食药用菌蛋白。
步骤（1）中，所述硫酸铵沉降法的具体步骤如下：首先将食药用菌超微粉碎，将粉碎后的食药用菌与蒸馏水以1 g:20-60 mL 的比例混合，逐步加入固体硫酸铵使硫酸铵的饱和度达40-60wt%，3000-5000 r/min离心5-10 min得食药用菌蛋白沉淀，利用透析法脱盐后冷冻干燥得食药用菌蛋白。
步骤（2）中，所述有限酶解的具体步骤如下：将食药用菌蛋白溶解在水中使蛋白质量浓度达1.0-5.0%，调节pH至7.0-11.0，温度保持在40-60 ℃，加入质量浓度1.0-5.0%的蛋白酶，水解30-90 min，灭酶，得到食药用菌蛋白多肽复合物溶液。
步骤（3）中，所述固体高温混合法的具体步骤如下：将食药用菌蛋白多肽复合物溶液干燥制得冻干粉；将氯化亚铁或硫酸亚铁粉末和冻干粉按照质量比1:6-5:6混合，300-500℃加热1-3h制备食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物。
步骤（3）中，所述液体螯合法的具体步骤如下：将食药用菌蛋白多肽复合物溶液与0.5-2 mol/L氯化亚铁或硫酸亚铁溶液混合，搅拌均匀，调节pH为3.0-9.0，在30-80 ℃条件下持续反应1.0-2.0 h，反应后冷却，离心分离去除杂质，加入离心液3-5倍体积的75-95%（v/v）的乙醇，沉淀静置12-24h，离心去除上清液，获得食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物；其中，氯化亚铁或硫酸亚铁溶液与食药用菌蛋白多肽复合物溶液的体积比为1:6-5:6。
本发明所述蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶或复合蛋白酶。
一种如上所述的制备方法制得的食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
1）本发明利用碱溶酸沉法或硫酸铵沉降法提取食药用菌中的蛋白，提取率高；
2）本发明通过控制食药用菌蛋白酶解时间，得到具有高亚铁螯合活性的生物活性肽；
3）通过与无机物氯化亚铁或硫酸亚铁中的亚铁进行螯合，制备有机的生物活性肽-亚铁螯合物具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、安全无毒、价格低、可同时补充氨基酸和亚铁离子；为食药用菌的应用提供了一条新思路，为开发有机亚铁营养补充剂与功能性食品提供理论依据和技术支持。
具体实施方式
为充分公开本发明的制备方法，以下结合实施实例加以说明。但本发明不限于以下实施例。
实施例1
一种杏鲍菇蛋白肽-亚铁螯合物的制备方法，具体步骤为：
第一步：将杏鲍菇超微粉碎，将粉碎后的杏鲍菇与蒸馏水以1 g:20mL的比例混合，利用2wt%NaOH调节pH至9.0，超声提取10 min，水浴提取60 min，温度60 ℃，提取后用纱布过滤，滤液为碱提的杏鲍菇蛋白溶液，用盐酸调节碱提的杏鲍菇蛋白溶液pH至3.0进行蛋白沉淀，4000 r/min离心5 min得沉淀蛋白，水洗至中性再次离心，将沉淀冷冻干燥即得杏鲍菇蛋白，其提取率达74.16%；
第二步：将杏鲍菇蛋白溶解在水中使蛋白质量浓度达3.0%，用NaOH溶液将杏鲍菇蛋白溶液pH调节到10.0，温度保持在50 ℃，加入3.0%碱性蛋白酶，水解90 min，灭酶，得到杏鲍菇蛋白多肽复合物溶液；
第三步：将杏鲍菇蛋白多肽复合物溶液按氯化亚铁溶液与多肽复合物溶液的体积比为1:6比例与0.5mol/L氯化亚铁溶液混合，搅拌均匀，调节pH6.0，在60 ℃条件下持续反应1.0h，反应后冷却，离心分离去除杂质，加入离心液4倍体积的 75%（v/v）的乙醇，沉淀静置12h，离心去除上清液，获得杏鲍菇蛋白肽-亚铁螯合物；
第四步：冷冻干燥。
铁螯合率的测定：邻菲罗啉比色法
（1）铁标准溶液的配制(10 μg/mL)：准确称取0．0498 g硫酸亚铁(FeSO4·7H2O) 溶于100 mL水中，加入5 mL浓H2SO4，微热溶解后滴加2.0wt％的KMnO4溶液，至最后一滴红色不褪为止，用水稀释至1000mL，摇匀；
（2）标准曲线的绘制：吸取10 μg/mL铁的标准溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，加入l mol/L的HCl溶液1 mL，10 wt％的盐酸羟胺l mL，0.12 wt％邻菲罗啉1 mL，然后加入10 wt％醋酸钠5 mL，用水稀释至刻度，摇匀；以不加铁的试剂空白溶液作参比液，在510 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线；
（3）样品测定：准确称取0.05 g的样品置于l00 mL烧杯中，加入2 mL浓盐酸，待样品完全溶解后，用蒸馏水定容至l00 mL容量瓶中。准确吸取5 mL样品液于50 mL容量瓶中，按照标准曲线的操作步骤测定吸光度。
式中C：从标准曲线上查得样品试液相应的铁含量（μg）；
M：样品的质量（g）；
V1：测定时所取样品试液的体积(mL)；
Vo：样品处理后的定容体积(mL)。
铁螫合率的测定：
式中M1：螯合物中铁的量(mg)；
M0：加入反应体系中铁的总量(mg)。
最终测定制备的杏鲍菇蛋白肽-亚铁螯合物的螯合率为83.17%。
实施例2
一种草菇蛋白肽-亚铁螯合物的制备方法，具体步骤为：
第一步：将草菇超微粉碎，将粉碎后的草菇与蒸馏水以1 g:60 mL的比例混合，利用1wt% NaOH调节pH至11.0，超声提取50 min，水浴提取120 min，温度100 ℃，提取后用纱布过滤，滤液为碱提的草菇蛋白溶液，用盐酸调节碱提的草菇蛋白溶液pH至3.0进行蛋白沉淀，离心得沉淀蛋白，水洗至中性再次离心，将沉淀冷冻干燥即得食药用菌蛋白，其提取率达83.72%；
第二步：将草菇蛋白溶解在水中使蛋白质量浓度达3.0%，调节pH至11.0，温度保持在40℃，加入3.0 %碱性蛋白酶，水解60 min，灭酶，得到草菇蛋白多肽复合物溶液；
第三步：将草菇蛋白多肽复合物溶液按氯化亚铁溶液与多肽复合物溶液的体积比为1:2比例与0.5mol/L氯化亚铁溶液混合，搅拌均匀，调节pH6.0，在60℃条件下持续反应1.0 h，反应后冷却，离心分离去除杂质，加入离心液5倍体积的95%（v/v）乙醇，沉淀静置12 h，离心去除上清液，获得草菇蛋白肽-亚铁螯合物；
第四步：冷冻干燥。
铁螯合率的测定：邻菲罗啉比色法
（1）铁标准溶液的配制(10 μg/mL)：准确称取0．0498 g硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)溶于100 mL水中，加入5 mL浓H2SO4，微热溶解后滴加2.0wt％的KMnO4溶液，至最后一滴红色不褪为止，用水稀释至1000 mL，摇匀；
（2）标准曲线的绘制：吸取10 μg/mL铁的标准溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，加入l mol/L的HCl溶液1 mL，10wt％的盐酸羟胺l mL，0.12wt％邻菲罗啉1 mL，然后加入10wt％醋酸钠5 mL，用水稀释至刻度，摇匀；以不加铁的试剂空白溶液作参比液，在510 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线；
（3）样品测定：准确称取0.05 g的样品置于l00 mL烧杯中，加入2 mL浓盐酸，待样品完全溶解后，用蒸馏水定容至l00 mL容量瓶中；准确吸取5 mL样品液于50 mL容量瓶中，按照标准曲线的操作步骤测定吸光度；
式中C：从标准曲线上查得样品试液相应的铁含量（μg）；
M：样品的质量（g）；
V1：测定时所取样品试液的体积(mL)；
Vo：样品处理后的定容体积(mL)。
铁螫合率的测定：
式中M1：螯合物中铁的量(mg)；
M0：加入反应体系中铁的总量(mg)。
最终测定制备的草菇蛋白肽-亚铁螯合物的螯合率为87.8%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (9)
1.一种食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）蛋白提取：利用碱溶酸沉法或硫酸铵沉降法提取食药用菌蛋白；
（2）酶解：采用蛋白酶对提取的食药用菌蛋白进行有限酶解，制得食药用菌蛋白肽复合物溶液；
（3）多肽-亚铁螯合物制备：利用固体高温混合法或者液体螯合法将食药用菌蛋白肽复合物溶液制成食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物；
（4）将食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物进行冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的一种食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物的制备方法，其特征在于：所述食药用菌包括：香菇、黑木耳、平菇、蟹味菇、茶树菇、茯苓、桑黄、草菇 、金针菇、杏鲍菇、银耳、竹荪、灵芝、灰树花和猴头菇等食药用菌中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述碱溶酸沉法的具体步骤如下：首先将食药用菌超微粉碎，将粉碎后的食药用菌与蒸馏水以1 g:20-60 mL的比例混合，利用0.5wt%-2wt%的NaOH或KOH溶液调节pH至9.0-11.0，先超声提取10-50 min，再在50-100℃水浴提取60-120 min，提取后过滤，取滤液，滤液为碱提的食药用菌蛋白溶液，用盐酸调节碱提的食药用菌蛋白溶液pH至2.5-4.0进行蛋白沉淀，3000-5000 r/min离心5-10 min得沉淀蛋白，水洗至中性再次离心，将沉淀冷冻干燥即得食药用菌蛋白。
4.根据权利要求1所述的一种食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述硫酸铵沉降法的具体步骤如下：首先将食药用菌超微粉碎，将粉碎后的食药用菌与蒸馏水以1 g:20-60 mL的比例混合，逐步加入固体硫酸铵使硫酸铵的饱和度达40-60wt%，3000-5000 r/min离心5-10 min得食药用菌蛋白沉淀，利用透析法脱盐后冷冻干燥得食药用菌蛋白。
5.根据权利要求1所述的一种食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述有限酶解的具体步骤如下：将食药用菌蛋白溶解在水中使蛋白质量浓度达1.0-5.0%，调节pH至7.0-11.0，温度保持在40-60 ℃，加入1.0-5.0 wt%的蛋白酶，水解30-90 min，灭酶，得到食药用菌蛋白多肽复合物溶液。
6.根据权利要求1所述的一种食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述固体高温混合法的具体步骤如下：将食药用菌蛋白多肽复合物溶液干燥制得冻干粉；将氯化亚铁或硫酸亚铁粉末和冻干粉按照质量比1:6-5:6混合，300-500℃加热1-3h制备食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物。
7.根据权利要求1所述的一种食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述液体螯合法的具体步骤如下：将食药用菌蛋白多肽复合物溶液与0.5-2mol/L氯化亚铁或硫酸亚铁溶液混合，搅拌均匀，调节pH为3.0-9.0，在30-80 ℃条件下持续反应1.0-2.0 h，反应后冷却，离心分离去除杂质，加入离心液3-5倍体积的75-95%（v/v）的乙醇，沉淀静置12-24 h，离心去除上清液，获得食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物；其中，氯化亚铁或硫酸亚铁溶液与食药用菌蛋白多肽复合物溶液的体积比为1:6-5:6。
8.根据权利要求1或5所述的一种食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物的制备方法，其特征在于：所述蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶或复合蛋白酶。
9.一种如权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的食药用菌蛋白肽-亚铁螯合物。
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