CN109337985A - 一种微卫星不稳定性基因突变检测的复合扩增体系和试剂盒 - Google Patents

一种微卫星不稳定性基因突变检测的复合扩增体系和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种微卫星不稳定性基因突变检测的复合扩增体系和试剂盒。本发明提供了一种微卫星不稳定性基因突变检测的复合扩增体系，复合扩增体系同时对单核苷酸微卫星基因位点和二核苷酸微卫星基因位点进行扩增；所述单核苷酸微卫星基因位点包括NR‑21、NR‑22、NR‑24、NR‑27、BAT‑25、BAT‑26和MONO‑27，所述二核苷酸微卫星基因位点包括D2S123、D17S250、D18S34和D5S346中的一个或多个。本发明中，将单核苷酸微卫星位点和二核苷酸微卫星位点相结合对MSI进行检测分析，能够有效提高检测准确性与灵敏度，可用于快速检测肿瘤的分型以指导治疗。

Description

一种微卫星不稳定性基因突变检测的复合扩增体系和试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种微卫星不稳定性基因突变检测的复合扩增体系和试剂盒。本申请要求2018年07月06日提交的中国专利(专利申请号为201810737101.5)的权益，在此将上述申请的全部内容引用并入本文。
背景技术
近年来大量研究表明，肿瘤发生与错配修复***密切相差，尤其是在结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌等。由于错配修复(mismatch repair,MMR)基因的突变及功能异常，使基因组的复制错误不能及时修复，复制错误频率发生不断积累，从而使细胞基因组DNA序列发生改变，或造成某些抑癌基因失活或癌基因激活而导致细胞的异常转化和恶性增生。检测错配修复***成为诊断这类肿瘤的方法之一。
在临床上用于肿瘤错配修复***的检测方法主要有以下两种：
第一种是错配修复基因的突变检测，该方法主要检测与错配修复高度相关的基因如hMSH2、hMLH1、hMLH6、PMS2等，先提取DNA进行PCR扩增，再对PCR产物进行测试，该方法需要检测多种基因，操作繁琐，检测周期长，且检测费用高。
第二种是免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)，由于MMR的改变，其蛋白产物会发生相应改变，可以使用免疫组化(IHC)的方法检测MMR蛋白产物，目前主要检测hMSH2、hMLH1、hMLH6、PMS2等基因的蛋白产物。但该方法容易忽略错义突变和截断突变，并且由于在肿瘤组织中存在染色不均一的现象，其灵敏性也会受到影响。
以上两种方法由于存在种种缺陷，没有得到广泛的应用。
近年来发现，错配修复基因的突变及功能异常，使基因组的复制错误不能得以及时修复，复制错误频率发生不断积累，会引起肿瘤发生，同时也会引起基因组微卫星DNA序列发生改变。即错配修复***失灵导致肿瘤发生的同时，也会在基因组的STR序列上造成影响，因此可以通过检测STR序列来分析错配修复***的情况，进而指示肿瘤的分型情况。
MMR是重要的DNA修复机制，能够准确地识别及修复在DNA复制或重组过程中产生的碱基错配，小范围的碱基缺失或***，对维持基因组稳定性，遗传后代的精确性有着重要的作用。dMMR是指MMR修复机制出现故障，参与MMR修复的基因发生了突变，导致基因功能缺陷，MMR修复能力下降或缺失。Lynch综合症是由于MMR修复缺陷引起。MS，微卫星，又称简单重复序列(SSR)，是一些短而重复的DNA序列，一般由1-6个核苷酸组成，串联重复排列，常见类型为双碱基CA/GA或单碱基A/T等，存在于内含子等非编码区，多态性分布于整个基因组，个体差异大。微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)，是指由于在DNA复制时***或缺失突变引起的MS序列长度改变的现象，常由MMR功能缺陷引起。MSI现象于1993年被Jacobs等人在结直肠癌中首次发现，现已发现与其他肿瘤发生也有相关，可用于肿瘤分型的检测。
根据肿瘤中MSI被检测出的频率可以将其分为三类，第一类为微卫星稳定(microsatellite stability，MSS)，无明显的MSI出现；第二类为微卫星低度不稳定(low-frequency MSI，MSI-L)，MSI出现频率低，一般低于30-40％；第三类是微卫星高度不稳定(high-frequency MSI，MSI-H)，MSI出现频率高，一般高于30-40％。
MSI常由MMR基因突变及功能缺失导致。因此，在检测癌细胞中MSI时，既可以直接检测MSI序列变化，也可以通过检测MMR基因缺失来确定是否发生MSI。一般，检测MMR基因缺失采用免疫组化，检测MSI序列变化采用分子手段。采用免疫组化检测MMR基因缺失可以直接鉴定出导致MSI发生的MMR缺陷基因，但是，约5％-11％的MSI发生并不会出现MMR蛋白的缺失,此外MMR基因错义突变导致MMR蛋白功能丧失时，免疫组化抗体检测呈阳性。而采用分子手段检测MSI序列变化准确度高。在所有结直肠癌史的病人中进行MSI检测发现，扩增结直肠癌患者的MSI检测准确度高。近15％的偶发结直肠癌及Lynch综合症结直肠癌患者含有MSI特征，通过MSI分子检测可以精准的检测结直肠癌中的MSI，对MSI-H患者的检测准确度尤高，准确度接近100％，并且，MSI检测简捷，效益比高。
Lynch综合症是家族遗传性疾病，结直肠癌患者具有MSI特征，后代患结直肠癌年龄较早，癌细胞内常会累积KRAS基因突变；Lynch综合症患者生殖细胞中积累MMR基因突变，包括MLH1、MSH2等，可遗传给后代。偶发性MSI结直肠癌中，常为MLH1基因启动子区域富含DNA甲基化，抑制其表达而造成MMR缺陷，导致MSI。
PD-1是免疫T细胞表面自我抑制性受体，通过特异地结合配体蛋白PD-L1或PD-L2抑制免疫T细胞活性。许多癌细胞通过高度表达PD-L1，抑制免疫T细胞的抗癌活性。PD-1单抗免疫治疗通过单克隆抗体特异地识别免疫T细胞上的PD-1受体，阻碍癌细胞PD-L1的识别，从而激活免疫T细胞活性，特异性地清除杀死带有多种异源抗原的癌细胞，实现对癌症的免疫治疗。利用特异性的单克隆抗体阻碍PD-1与PD-L1识别结合，可用于治疗癌症晚期的患者，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌，实现PD-1单抗免疫治疗。
DNA错配修复基因及MSI与遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)和散发性结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌等发生密切相关。MMR缺陷的肿瘤对PD-1阻断治疗敏感，可使用MSI检测***在肿瘤细胞中评估错配修复状态，以进一步评估是否对肿瘤细胞应用抗PD-1疗法。美国食品药品监督管理局(FDA)已于2017年5月批准把MSI作为抗PD-1疗法的用药指征，并加速审批了用于MSI-H或dMMR实体瘤临床治疗的药物pembrolizumab(Keytruda)的准入。
1997年美国国家肿瘤研究所(National Cancer Institute,NCI)举办会议颁布了Bethesda指导纲要，确定了用来检测MSI的参考Panel(NCI panel)，推荐应用5个微卫星位点来进行结直肠癌的检测，即单核苷酸重复位点BAT-25、BAT-26和二核苷酸重复位点D2S123、D5S346和D17S250，并对MSI做出了定义。比较肿瘤和匹配的正常DNA，5个位点中有2个或2个以上位点有重复序列长度变化者为MSI-H，若只有一个位点有长度变化者为低度MSI-L，无任何位点的变化称为MSS。Suraweera N等人的研究指出对于MSI-H患者，5个准单态性单核苷酸重复位点的Panel组(BAT-25、BAT-26、NR21、NR22及NR24)比其它微卫星标记更敏感。
在2002年NCI在第二次专题会议上，扩增之前采纳的NCI Panel来检测MSI进行了讨论，由于NCI Panel使用了2个单核苷酸重复位点及3个二核苷酸重复的位点，而二核苷酸重复的位点在检测存在错配修复缺陷的肿瘤时灵敏度较低，因而应用NCI Panel来评估肿瘤卫星不稳定状态时存在一定的局限性。尽管如此，二核苷酸位点仍然被认为有它的独特之处，这也是NCI Panel的意图及一直以来被广泛应用于MSI研究中的原因。因为二核苷酸位点会较少受到影响单核苷酸微卫星基因位点保真度的一些混杂因素的影响。理论上，基因组中单核苷酸和二核苷酸重复序列的保真度通过MMR和其他生物学过程的机制来维持，即简单重复序列中的长度变异也可能由MMR以外的某些生物学过程所驱动。而二核苷酸微卫星基因位点则较少受到MMR以外的这些生物学过程影响，MSI-L通常仅表现在二核苷酸位点的变化。
查找高度灵敏性及特异性的用来检测MSI的准单态性位点是建立MSI检测体系的必需工作，已成为近年来研究MSI检测领域的热点，但是这一产品的开发并不容易，到目前为止只有Promega及其它几个公司具有能够检测单核苷酸微卫星基因位点的产品，开发更多种类位点以提高灵敏度及准确性的MSI检测***势在必行。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种微卫星不稳定性基因突变检测的复合扩增体系和试剂盒，用于现有微卫星不稳定性基因突变检测的准确度与灵敏度有待于提高的技术问题。
本发明的具体技术方案如下：
一种微卫星不稳定性基因突变检测的复合扩增体系，复合扩增体系同时对单核苷酸微卫星基因位点和二核苷酸微卫星基因位点进行扩增；
所述单核苷酸微卫星基因位点包括NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26和MONO-27，所述二核苷酸微卫星基因位点包括D2S123、D17S250、D18S34和D5S346中的一个或多个。
本发明中，微卫星不稳定性基因突变检测的复合扩增体系同时对单核苷酸微卫星基因位点和二核苷酸微卫星基因位点进行扩增，单核苷酸微卫星基因位点包括NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26和MONO-27，二核苷酸微卫星基因位点包括D2S123、D17S250、D18S34和D5S346中的一个或多个，将单核苷酸微卫星位点和二核苷酸微卫星位点相结合对MSI进行检测分析，能够有效提高检测准确性与灵敏度，可以快速检测肿瘤的分型以指导治疗。
优选的，所述复合扩增体系还同时对四核苷酸微卫星基因位点和性别决定基因位点进行扩增。
优选的，所述四核苷酸微卫星基因位点包括D13S317和D7S820；
所述性别决定基因位点包括Amelogenin(AMEL)。
本发明中，复合扩增体系还同时对四核苷酸微卫星基因位点D13S317、D7S820和性别决定基因位点AMEL进行扩增，可以协助样本鉴别，防止实验操作时因混淆样本而得出错误结果。
优选的，所述复合扩增体系包括：
用于扩增以下7个单核苷酸微卫星基因位点的特定区域的引物对：
NR-21的序列为SEQ ID NO:1的特定区域、NR-22的序列为SEQ ID NO:2的特定区域、NR-24的序列为SEQ ID NO:3的特定区域、NR-27的序列为SEQ ID NO:4的特定区域、BAT-25的序列为SEQ ID NO:5的特定区域、BAT-26的序列为SEQ ID NO:6的特定区域和MONO-27的序列为SEQ ID NO:7的特定区域；
用于扩增选自以下二核苷酸微卫星基因位点的一个或以上的特定区域的引物对：
D2S123的序列为SEQ ID NO:8的特定区域、D17S250的序列为SEQ ID NO:9的特定区域、D18S34的序列为SEQ ID NO:10的特定区域或D5S346的序列为SEQ ID NO:11的特定区域。
优选的，所述复合扩增体系还包括：
用于扩增以下2个四核苷酸微卫星基因位点的特定区域的引物对：D13S317的序列为SEQ ID NO:12的特定区域和D7S820的序列为SEQ ID NO:13的特定区域；
以及用于扩增性别决定基因位点AMEL的序列为SEQ ID NO:14的特定区域的引物对。
优选的，扩增NR-21的引物对选自序列SEQ ID NO:1的1-123位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:1的140-200位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增NR-22的引物对选自序列SEQ ID NO:2的1-130位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:2的150-250位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增NR-24的引物对选自序列SEQ ID NO:3的1-120位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:3的140-250位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增NR-27的引物对选自序列SEQ ID NO:4的1-138位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:4的158-260位的互补序列的18-25个连续碱基构成的引物的组合；
扩增BAT-25的引物对选自序列SEQ ID NO:5的1-132位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:5的152-300位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增BAT-26的引物对选自序列SEQ ID NO:6的1-117位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:6的145-270位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增MONO-27的引物对选自序列SEQ ID NO:7的1-116位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:7的143-290位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增D2S123的引物对选自序列SEQ ID NO:8的1-132位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:8的174-310位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增D17S250的引物对选自序列SEQ ID NO:9的1-104位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:9的141-280位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增D18S34的引物对选自序列SEQ ID NO:10的1-128位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:10的185-223位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增D5S346的引物对选自序列SEQ ID NO:11的1-154位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:11的193-300位的互补序列的18-25个连续碱基构成的引物的组合；
扩增D13S317的引物对选自序列SEQ ID NO:12的45-228位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:12的268-480位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增D7S820的引物对选自序列SEQ ID NO:13的45-216位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:13的69-460位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增AMEL的引物对选自序列SEQ ID NO:14的1-140位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:14的145-310位的互补序列的18-25个连续碱基构成的引物的组合。
优选的，扩增NR-21的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.15-17的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.18-20的引物；
扩增NR-22的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.21-23的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.24-26的引物；
扩增NR-24的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.27-29的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.30-32的引物；
扩增NR-27的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.33-35的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.36-38的引物；
扩增BAT-25的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.39-41的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.42-44的引物；
扩增BAT-26的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.45-47的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.48-50的引物；
扩增MONO-27的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.51-53的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.54-56的引物；
扩增D2S123的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.57-59的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.60-62的引物；
扩增D17S250的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.63-65的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.66-68的引物；
扩增D18S34的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.69-71的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.72-73的引物；
扩增D5S346的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.74-76的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.77-79的引物；
扩增D13S317的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.80-81的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.82-83的引物；
扩增D7S820的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.84-85的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.86-87的引物；
扩增AMEL的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.88-89的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.90-91的引物。
本发明中，用于扩增7个单核苷酸微卫星基因位点的引物对在PCR的延伸阶段能产生均一长度的片段，用于扩增二核苷酸微卫星基因位点的引物对在PCR的延伸阶段能产生均一长度的片段，用于扩增四核苷酸微卫星基因位点和性别决定基因位点的引物对在PCR的延伸阶段能产生均一长度的片段。
本发明中，复合扩增体系包括用于扩增二核苷酸微卫星基因位点D2S123、D17S250、D18S34和D5S346中的一个或多个的引物对，扩增二核苷酸微卫星基因位点的种类和数量根据不同组织及不同肿瘤进行确定，需要说明的是，二核苷酸微卫星基因位点不限于D2S123、D17S250、D18S34和D5S346四种。
优选的，所述引物对中，一个引物的5’末端带有荧光标记。
优选的，所述引物对分为三组，分别带有三种不同颜色的荧光标记：第一组引物对是扩增NR-21、NR-24、D13S317、D5S346、D17S250；第二组引物对是扩增NR-27、BAT-25、MONO-27、D18S34、D2S123；第三组引物对是扩增BAT-26、NR-22、D7S820、AMEL。
本发明中，荧光标记选自FAM、荧光素、HEX、VIC、JOE、TMR或NED。
优选的，第一组引物对的荧光标记为FAM或荧光素，第二组引物对的荧光标记为HEX、VIC或JOE，第三组引物对的荧光标记为TMR或NED。
本发明还提供了上述技术方案所述复合扩增体系在肿瘤细胞及组织分型的MSI基因突变检测中的应用。
本发明复合扩增体系多重荧光PCR技术为基础，应用于结直肠癌、子宫内膜癌、胃癌和肝癌等肿瘤细胞及组织分型的MSI基因突变检测，将单核苷酸微卫星位点和二核苷酸微卫星位点相结合对MSI进行检测分析，检测结果更为准确，能够有效提高检测准确性与灵敏度；增加了性别决定位点AMEL，可进一步防止实验操作员混淆样本而得出错误结果，比如患者为男性，而检测出来的性别位点结果却为女性，提示操作实验过程中很可能取错了样本或错误标记；增加2个四核苷酸位点(D13S317、D7S820)，可结合性别决定位点AMEL来区别不同个体的样本，进一步避免样本之间混淆而得出错误结果。
本发明还提供了一种微卫星不稳定性检测的方法，采用上述技术方案所述复合扩增体系对待检样品进行PCR扩增。
优选的，还包括：对PCR扩增得到的PCR产物进行毛细管电泳。
本发明还提供一种用于微卫星不稳定性基因突变检测的试剂盒，包括上述技术方案所述复合扩增体系。本发明试剂盒操作简单、可以批量生产，使用条件可以模式化，使用过程可全部采用自动化设备，不依赖于人的操作经验，检测时，PCR扩增2小时，毛细管电泳1.0～1.5小时，数据分析约1小时，所需时间短，整个检测时间只需要4～5小时，便于大规模推广。
本发明中，复合扩增体系的总体积为10μl，其中Multiplex PCR Mix(5x)2μl，引物混合物(5x)2μl，无核酸酶去离子水4μl，加入的模板量(0.5ng/μl～5ng/μl)为2μl。需要说明的是，复合扩增体系的总体积为20μl和10μl的效果相当。
引物混合物中的引物对浓度分别为：
引物对 浓度/μM
NR-21 0.04～0.2
NR-22 0.04～0.2
NR-24 0.04～0.2
NR-27 0.04～0.2
BAT-25 0.04～0.2
BAT-26 0.04～0.2
MONO-27 0.04～0.2
D2S123 0.04～0.2
D17S250 0.04～0.2
D18S34 0.04～0.2
D5S346 0.04～0.2
D13S317 0.04～0.2
D7S820 0.04～0.2
AMEL 0.04～0.2
本发明中，复合扩增体系的扩增条件为：95℃变性，1～10min；28～32个循环94℃10～30sec，58℃10～30sec，72℃20～60sec；最后60℃20～40min。
本发明中，各引物对的Tm值在(60±2)℃的范围内，扩增效率类似并且各引物对的扩增产物大小相差15bp以上，不产生非特异产物或二聚体，并且在同一扩增条件下所有引物对均能出现明亮且单一的目的条带。
Taq酶是扩增的重要组分，多种Taq酶都能应用于本发明复合扩增体系。本发明试剂盒采用本公司的HsTaq热启动酶。
本发明试剂盒中，Mg2+的浓度优选为1.0mM～2.0mM，退火温度优选为58℃～60℃，60℃延伸时，延伸时间20min～60min均可使Taq酶加A完全。
综上所述，本发明提供了一种微卫星不稳定性基因突变检测的复合扩增体系，复合扩增体系同时对单核苷酸微卫星基因位点和二核苷酸微卫星基因位点进行扩增；所述单核苷酸微卫星基因位点包括NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26和MONO-27，所述二核苷酸微卫星基因位点包括D2S123、D17S250、D18S34和D5S346中的一个或多个。本发明中，微卫星不稳定性基因突变检测的复合扩增体系同时对单核苷酸微卫星基因位点和二核苷酸微卫星基因位点进行扩增，单核苷酸微卫星基因位点包括NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26和MONO-27，二核苷酸微卫星基因位点包括D2S123、D17S250、D18S34和D5S346中的一个或多个，将单核苷酸微卫星位点和二核苷酸微卫星位点相结合对MSI进行检测分析，检测灵敏度为1～2ng，准确度接近100％，能够有效提高检测准确性与灵敏度，可用于快速检测肿瘤的分型以指导治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1中采用本发明复合扩增体系检测结肠癌组织和正常组织得到的分型图谱；
图2为本发明实施例2中采用本发明复合扩增体系检测结肠癌组织和正常组织得到的分型图谱；
图3为本发明实施例3中采用免疫组化检测癌旁组织和癌组织的结果图；
图4为本发明实施例3中采用本发明复合扩增体系检测癌旁组织得到的分型图谱；
图5为本发明实施例3中采用本发明复合扩增体系检测癌组织得到的分型图谱；
图6为本发明实施例4中采用免疫组化检测癌旁组织和癌组织的结果图；
图7为本发明实施例4中采用本发明复合扩增体系检测癌旁组织得到的分型图谱；
图8为本发明实施例4中采用本发明复合扩增体系检测癌组织得到的分型图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种微卫星不稳定性基因突变检测的复合扩增体系和试剂盒，用于现有微卫星不稳定性基因突变检测的准确度与灵敏度有待于提高的技术问题。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例采用本发明复合扩增体系进行结肠癌组织和正常组织微卫星不稳定性检测，结肠癌组织和正常组织为第一批样本，检测步骤如下：
1.DNA提取
采用组织DNA提取试剂盒(OMEGA)分别对患者的癌组织和癌旁组织(正常组织)进行基因组DNA提取，按照试剂盒说明书进行，基因组DNA提取完毕后使用紫外分光光度计定量，并稀释终浓度为1ng/μl，用于下一步的PCR反应模板。
2.PCR
2.1将Multiplex PCR Mix(5x)2μl，MSI位点引物混合物(5x)2μl，无核酸酶去离子水4μl，
加入的模板量(0.5ng/μl～5ng/μl)为2μl，总反应体积为10μl。
2.2PCR反应程序：
第1步：95℃变性10分钟，第2步：94℃变性30秒，第3步：58℃退火30秒，第4步：72℃延伸40秒，重复第2步到第4步32个循环，第5步：60℃延伸30秒。运行结束后PCR扩增产物置于冰箱4℃保存。
3.毛细管电泳检测
3.1取上一步得到的PCR扩增产物1.0-2.0μl点样于1.5-2.0琼脂糖凝胶上，140V电压电泳20分钟，在凝胶成像仪或紫外灯下观察结果，若在60-300bp处出现明亮的阶梯条带则可上机检测。
3.2使用试剂盒提供的内标(ROX500)和甲酰胺按10：1000混合，取9.5-9.0μl混合物加到96孔板里，再取PCR扩增产物0.5-1.0μl，混合并短暂离心后放入ABI 3100,ABI 3130系列，ABI 3500等测试仪上，准备检测。
3.3打开ABI 3100,ABI 3130系列，ABI 3500等测试仪的数据采集软件，编辑上机检测的板标，导入检测程序。
3.4点击运行，即开始检测。不同仪器检测时间不一样。
3.5检测完毕后，将数据拷贝至光盘。
4.数据分析
4.1导入原始数据，在主页面的File菜单选择Add sample to project,找到样品文件，选中文件夹，点击add to list，点击add，样品文件即显示在Project窗口。
4.2选择分析参数，定义analysis method、panel和size standard。浏览样本电泳的原始数据，命名一样的文件名，在“sample”菜单下选择“raw data”。移动追踪线，使光标停在引物峰右侧(第一个红色的内标峰之前)，以此时窗口左下角X轴上显示的数值作为analysis mehtod分析参数中的起始点。
4.3点击绿色分析按钮，出现save project对话框，命名后保存，软件即开始处理数据，分析完成后左下角显示analysis completed。
4.4采用GeneMapper软件分析得到的数据并生成图谱。
结果请参阅图1，为本发明实施例1中采用本发明复合扩增体系检测结肠癌组织和正常组织得到的分型图谱。结果表明，采用本发明复合扩增体系进行微卫星不稳定性检测，结肠癌细组织出现的等位基因位点偏移(红色箭头所示)并不存在于正常组织中，表明结肠癌组织产生了微卫星不稳定(MSI)。
实施例2
本实施例采用本发明复合扩增体系进行结肠癌组织和正常组织微卫星不稳定性检测，结肠癌组织和正常组织为第二批样本，检测步骤同实施例1。
结果请参阅图2，为本发明实施例2中采用本发明复合扩增体系检测结肠癌组织和正常组织得到的分型图谱。结果表明，采用本发明复合扩增体系进行微卫星不稳定性检测，结肠癌细组织8个位点中有2个出现了等位基因位点偏移(红色箭头所示)，表明该结肠癌组织产生了微卫星不稳定(MSI)，这两个位点的偏移在5位点检测中可能会因检测不到而误诊，说明本发明复合扩增体系提高了微卫星不稳定性检测的灵敏度。
实施例3
本实施例分别采用免疫组化和本发明复合扩增体系对癌旁组织和癌组织进行检测，本发明复合扩增体系进行结肠癌组织和正常组织微卫星不稳定性检测，癌旁组织和癌组织为第三批样本，本实施例中，采用本发明复合扩增体系的检测步骤同实施例1。
结果请参阅图3至图5，图3表明采用免疫组化检测，癌旁组织中MLH1、PMS2、MSH2和MSH6为阳性，癌组织中MLH1和PMS2为阴性，癌组织中MSH2和MSH6为阳性；图4和图5表明采用本发明复合扩增体系进行微卫星不稳定性检测，癌细组织出现的等位基因位点偏移(红色箭头所示)并不存在于癌旁组织中，表明结肠癌组织产生了微卫星不稳定(MSI)，结果表明采用免疫组化检测和采用本发明复合扩增体系检测的结果一致。
实施例4
本实施例分别采用免疫组化和本发明复合扩增体系对癌旁组织和癌组织进行检测，本发明复合扩增体系进行结肠癌组织和正常组织微卫星不稳定性检测，癌旁组织和癌组织为第三批样本，本实施例中，采用本发明复合扩增体系的检测步骤同实施例1。
结果请参阅图6至图8，图6表明采用免疫组化检测，癌旁组织中MLH1、PMS2、MSH2和MSH6为阳性，癌组织中MLH1、PMS2、MSH2和MSH6为阳性；图7和图8表明采用本发明复合扩增体系进行微卫星不稳定性检测，癌细组织没有等位基因位点偏移，表明癌组织没有产生了微卫星不稳定(MSI)，结果表明采用免疫组化检测和采用本发明复合扩增体系检测的结果一致。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广州复能基因有限公司
<120> 一种微卫星不稳定性基因突变检测的复合扩增体系和试剂盒
<150> 201810737101.5
<151> 2018-07-06
<160> 91
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 200
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
aggaaccact gctactctct aaaaaaggca agcagataaa agagaacacg aaaaatattc 60
ctactccgca ttcacacttt ctggtcactc gcgtttacaa acaagaaaag tgttgctaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aggccagggg agacatacat ttaaatataa aaatagaact 180
gtgccagcga ctccggctgg 200
<210> 2
<211> 250
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
taaatattaa actgacatct ttatgttgca ggtaaaggac ctggataatc gaggcttgtc 60
aaggacataa atgtcacgtc cagctctgat atgcttcgca ctgagcacat cacatttagg 120
acgttgaaga tttttttttt tttttttttt taatatgcag tttgtaagaa caaaactgga 180
tggcatcaga attgtctgga agttttgtct tgggcagtat gggctgggcc aaatgaaatg 240
atttttataa 250
<210> 3
<211> 250
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ctccctattt agtgaaaaat tatctgaata tttaaggtct gccttaacgt gatccccatt 60
gctgaatttt acctcctgac tccaaaaact cttctcttcc ctgggcccag tccttttttt 120
tttttttttt ttttttttgt gagacagagt ctcactctgt cacccaggtt ggaatgcaat 180
ggcacaatct ccgctcactg caagctccgc ctcccgggtt cacgccattc tcctgcctca 240
gcctcccgaa 250
<210> 4
<211> 260
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
cctttgaggg aaataattgt tggtaatgag atgtgatgtt tctcctgcca cctggaaaca 60
aagcattgaa gtctgcagtt gaaaagccca acgtctgtga gatccaggaa accatgcttg 120
caaaccactg gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaagc cacagtgact tgcttattgg 180
tcattgctag tattatcgac tcagaacctc tttactaatg gctagtaaat cataattgag 240
aaattctgaa ttttgacaag 260
<210> 5
<211> 300
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
gccatcatgg aggatgacga gttggcccta gacttagaag acttgctgag cttttcttac 60
caggtggcaa agggcatggc tttcctcgcc tccaagaatg taagtgggag tgattctcta 120
aagagttttg tgttttgttt ttttgatttt tttttttttt tttttttttt tgagaacaga 180
gcattttaga gccatagtta aaatgcagaa tgtcattttg aagtgtggta accaaaagca 240
gaggaaattt agtttcttca tgttccaact gctgtctctt tggaattcct gttctaattt 300
<210> 6
<211> 270
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
tttagaactc ttatcagatg attccaactt tggacagttt gaactgacta cttttgactt 60
cagccagtat atgaaattgg atattgcagc agtcagagcc cttaaccttt ttcaggtaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaagggtta aaaatgttga atggttaaaa aatgttttca 180
ttgacatata ctgaagaagc ttataaagga gctaaaatat tttgaaatat tattatactt 240
ggattagata actagcttta aatggctgta 270
<210> 7
<211> 290
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
agctactcgg gagactgagg caggagaatg gcatgaaccc gggaggcgga gcttgcagtg 60
agcagagatc gttccactgc actccagcct gagtgacaga gctagactct gtctcaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagagtgaag cccaaaataa atctgaagcc atccaggatc 180
tgcaattcat aggtggttca cataacaatg aaattgaagc atacagctga tataaaaatt 240
tgttttaatt tctaatatgg taaataccaa tagctataaa ttatataaat 290
<210> 8
<211> 310
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
aacatcatac tcaataatga atgaccaaaa gcatttctct tatgataatg gacaaaaaca 60
ggatgcctgc ctttaacact gctattcaac attgctggaa gttctggcca gagaaattag 120
acacagtgat acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acatatttta 180
tagatagata gatggtatcc aagtcagaaa gggagaagta aaactatccc tattgtagat 240
gacacagtcc cataggtgga aagtcccctc caattcaaaa gagctcctaa ggctaaaaaa 300
tgaattcagc 310
<210> 9
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
aactcctgac ctcaggtgat ccacccacct cagcctccga aagtgctggg attacaggca 60
tgagccactc agccggccat atatatattt aaaccatttg aaagtgtgtg tgtgtgtgtg 120
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tttgaaacca tttgaaagtt tatgtatgtg tatatatata 180
tataaacaca cacatatttt tattgtctat ttgattcttc ctttttatgc ttactttttt 240
cttctctctt ctttttgatc aattactttt catcacttca 280
<210> 10
<211> 223
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
agctcagtat gaaagagaag cagcaaaatt accatttcat caaatgcaaa aaaatcagtg 60
caattctttt aatgaaactc ccaagacttc agaaaattct ctctggctat ttttcattat 120
ttctttagac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 180
acacattctt gccaggaaca tgagtgaggg ttgaagaaga gct 223
<210> 11
<211> 300
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
aagaagacta aatcaacatg tttctccgct ttgaagataa aaccagaaat ggtttccatt 60
gtagcatctt gacaatagac aaatatgtaa agtttatagc agataagaca gtattactag 120
tttttcaggg aattgagagt tacaggttac tctgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 180
tgtgtgtgtg tgtaaatttc ccgatttatc actagagtga gtaactaact aactaactgc 240
tttataaagc tatcctggta ttcatatgcc atatactacg gaaacaacca ggccaatctc 300
<210> 12
<211> 480
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
gtattgcaag cacttagtta catttctagc atataacaca tgatcaataa atattttgac 60
atgaacaaat ggtaattctg cctacagcca atgtgaatat tgggatgggt tgctggacat 120
ggtatcacag aagtctggga tgtggaggag agttcatttc tttagtgggc atccgtgact 180
ctctggactc tgacccatct aacgcctatc tgtatttaca aatacattat ctatctatct 240
atctatctat ctatctatct atctatctat caatcaatca tctatctatc tttctgtctg 300
tctttttggg ctgcctatgg ctcaacccaa gttgaaggag gagatttgac caacaattca 360
agctctctga atatgttttg aaaataatgt atattaatga atgtacaaat ttccccactt 420
gtactttcag actgttatct gtgagttaaa actcctccac tctttttcct acccaaataa 480
<210> 13
<211> 460
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
actgcaacct ccgcttcttg ggtcaagtgg ttctcctgcc ccagcctcct gagtagctgg 60
gactacaggc atgtgctact gcatccagct aatttttgta ttttttttag agacggggtt 120
tcaccatgtt ggtcaggctg actatggagt tattttaagg ttaatatata taaagggtat 180
gatagaacac ttgtcatagt ttagaacgaa ctaacgatag atagatagat agatagatag 240
atagatagat agatagatag atagatagac agattgatag ttttttttaa tctcactaaa 300
tagtctatag taaacattta attaccaata tttggtgcaa ttctgtcaat gaggataaat 360
gtggaatcgt tataattctt aagaatatat attccctctg agtttttgat acctcagatt 420
ttaagacctc acaattatct cataaggctt aaaatcaatc 460
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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gctaccacct catcctgggc accctggtta tatcaacttc agctatgagg taatttttct 60
ctttactaat tttgaccatt gtttgcgtta acaatgccct gggctctgta aagaatagtg 120
tgttgattct ttatcccaga tgtttctcaa gtggtcctga ttttacagtt cctaccacca 180
gcttcccagt ttaagctctg atggttggcc tcaagcctgt gtcgtcccag cagcctcccg 240
cctggccact ctgactcagt ctgtcctcct aaatatggcc gtaagcttac ccatcatgaa 300
ccactactca 310
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctactccgca ttcacacttt ct 22
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtcactcgcg tttacaaaca 20
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cacgaaaaat attcctactc cgca 24
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgtcgctggc acagttctat t 21
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctatttttat atttaaatgt atgtct 26
<210> 20
<211> 0
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggtaaaggac ctggataatc ga 22
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atactgccca agacaaaact tcca 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gttttgttct tacaaactgc atat 24
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgctctgata tgcttcgcac t 21
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gagcacatca catttaggac gtt 23
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
catttcattt ggcccagccc ata 23
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aattatctga atatttaagg tct 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgccattgc attccaacct 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gactccaaaa actcttctct tccctg 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gggtgacaga gtgagactct gt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcggagcttg cagtgagcgg ag 22
<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtctgcagtt gaaaagccca acgt 24
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gcaatgacca ataagcaagt ca 22
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tccaggaaac catgcttgca aac 23
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tgtgagatcc aggaaaccat gct 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaggttctga gtcgataata cta 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttatgattta ctagccatta gtaaa 25
<210> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agggcatggc tttcctcgcc tcc 23
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acacttcaaa atgacattct gcat 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ctatggctct aaaatgctct gtt 23
<210> 42
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tggagtgatt ctctaaagag ttttgtgt 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
aactaaattt cctctgcttt tggt 24
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caagaatgta agtgggagtg at 22
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gatattgcag cagtcagagc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tgaaaacatt ttttaaccat tcaaca 26
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
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aagcttcttc agtatatgtc aatga 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gccagtatat gaaattggat attgca 26
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gcagcagtca gagcccttaa cct 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gcagtcagag cccttaacct t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
<212> DNA
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gttccactgc actccagcct 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtcattgtta tgtgaaccac ctatga 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcttcaattt cattgttatg tgaa 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gttatgtgaa ccacctatga attgca 26
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actgctattc aacattgctg gaa 23
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ggactttcca cctatgggac 20
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ttctggccag agaaattaga ca 22
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aaacaggatg cctgccttta 20
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gactgtgtca tctacaatag ggatagt 27
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ccgcaacttt gctgaattca t 21
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<212> DNA
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agccactcag ccggccatat atata 25
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aaagtgctgg gattacaggc at 22
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ccacccacct cagcctccga aa 22
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ggaagaatca aatagacaat 20
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atttagcttc caaactagta gag 23
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cagccactaa aagatgagaa 20
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ttaatgaaac tcccaagact tc 22
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gctcttcttc aaccctcact ca 22
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tcactcatgt tcctggcaag aa 22
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agctcagtat gaaagagaag ca 22
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cagtatgaaa gagaagcagc a 21
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gtttccattg tagcatcttg aca 23
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ccgctttgaa gataaaacca gaa 23
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agcagttagt tagttagtta ct 22
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actcactcta gtgataaatc g 21
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cagggaattg agagttacag gtta 24
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tggcatatga ataccaggat agct 24
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atccgtgact ctctggactc tga 23
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ggcagcccaa aaagacaga 19
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tgagttcatt tctttagtgg gcat 24
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gcccaaaaag acagacagaa aga 23
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ttgtcatagt ttagaacgaa ctaacga 27
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attgacagaa ttgcaccaaa tatt 24
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aagaatagtg tgttgattct tt 22
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ccctgggctc tgtaaagaa 19
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ggccaaccat cagagcttaa act 23

Claims (10)

1.一种微卫星不稳定性基因突变检测的复合扩增体系，其特征在于，复合扩增体系同时对单核苷酸微卫星基因位点和二核苷酸微卫星基因位点进行扩增；
所述单核苷酸微卫星基因位点包括NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26和MONO-27，所述二核苷酸微卫星基因位点包括D2S123、D17S250、D18S34和D5S346中的一个或多个。
2.根据权利要求1所述的复合扩增体系，其特征在于，所述复合扩增体系还同时对四核苷酸微卫星基因位点和性别决定基因位点进行扩增。
3.根据权利要求2所述的复合扩增体系，其特征在于，所述四核苷酸微卫星基因位点包括D13S317和D7S820；
所述性别决定基因位点包括AMEL。
4.根据权利要求1所述的复合扩增体系，其特征在于，所述复合扩增体系包括：
用于扩增以下7个单核苷酸微卫星基因位点的特定区域的引物对：
NR-21的序列为SEQ ID NO:1的特定区域、NR-22的序列为SEQ ID NO:2的特定区域、NR-24的序列为SEQ ID NO:3的特定区域、NR-27的序列为SEQ ID NO:4的特定区域、BAT-25的序列为SEQ ID NO:5的特定区域、BAT-26的序列为SEQ ID NO:6的特定区域和MONO-27的序列为SEQ ID NO:7的特定区域；
用于扩增选自以下二核苷酸微卫星基因位点的一个或以上的特定区域的引物对：
D2S123的序列为SEQ ID NO:8的特定区域、D17S250的序列为SEQ ID NO:9的特定区域、D18S34的序列为SEQ ID NO:10的特定区域或D5S346的序列为SEQ ID NO:11的特定区域。
5.根据权利要求4所述的复合扩增体系，其特征在于，所述复合扩增体系还包括：
用于扩增以下2个四核苷酸微卫星基因位点的特定区域的引物对：D13S317的序列为SEQ ID NO:12的特定区域和D7S820的序列为SEQ ID NO:13的特定区域，
以及用于扩增性别决定基因位点AMEL的序列为SEQ ID NO:14的特定区域的引物对。
6.根据权利要求5所述的复合扩增体系，其特征在于，扩增NR-21的引物对选自序列SEQID NO:1的1-123位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:1的140-200位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增NR-22的引物对选自序列SEQ ID NO:2的1-130位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:2的150-250位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增NR-24的引物对选自序列SEQ ID NO:3的1-120位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:3的140-250位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增NR-27的引物对选自序列SEQ ID NO:4的1-138位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:4的158-260位的互补序列的18-25个连续碱基构成的引物的组合；
扩增BAT-25的引物对选自序列SEQ ID NO:5的1-132位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:5的152-300位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增BAT-26的引物对选自序列SEQ ID NO:6的1-117位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:6的145-270位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增MONO-27的引物对选自序列SEQ ID NO:7的1-116位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:7的143-290位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增D2S123的引物对选自序列SEQ ID NO:8的1-132位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:8的174-310位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增D17S250的引物对选自序列SEQ ID NO:9的1-104位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:9的141-280位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增D18S34的引物对选自序列SEQ ID NO:10的1-128位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:10的185-223位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增D5S346的引物对选自序列SEQ ID NO:11的1-154位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:11的193-300位的互补序列的18-25个连续碱基构成的引物的组合；
扩增D13S317的引物对选自序列SEQ ID NO:12的45-228位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:12的268-480位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增D7S820的引物对选自序列SEQ ID NO:13的45-216位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:13的69-460位的互补序列的18-26个连续碱基构成的引物的组合；
扩增AMEL的引物对选自序列SEQ ID NO:14的1-140位的18-26个连续碱基构成的引物，以及选自序列SEQ ID NO:14的145-310位的互补序列的18-25个连续碱基构成的引物的组合。
7.根据权利要求6所述的复合扩增体系，其特征在于，扩增NR-21的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.15-17的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.18-20的引物；
扩增NR-22的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.21-23的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.24-26的引物；
扩增NR-24的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.27-29的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.30-32的引物；
扩增NR-27的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.33-35的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.36-38的引物；
扩增BAT-25的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.39-41的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.42-44的引物；
扩增BAT-26的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.45-47的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.48-50的引物；
扩增MONO-27的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.51-53的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.54-56的引物；
扩增D2S123的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.57-59的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.60-62的引物；
扩增D17S250的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.63-65的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.66-68的引物；
扩增D18S34的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.69-71的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.72-73的引物；
扩增D5S346的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.74-76的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.77-79的引物；
扩增D13S317的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.80-81的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.82-83的引物；
扩增D7S820的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.84-85的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.86-87的引物；
扩增AMEL的引物对中，正向引物选自序列为SEQ ID No.88-89的引物，反向引物选自序列为SEQ ID No.90-91的引物。
8.根据权利要求5所述的复合扩增体系，其特征在于，所述引物对中，一个引物的5’末端带有荧光标记。
9.根据权利要求8所述的复合扩增体系，其特征在于，所述引物对分为三组，分别带有三种不同颜色的荧光标记：第一组引物对是扩增NR-21、NR-24、D13S317、D5S346、D17S250；第二组引物对是扩增NR-27、BAT-25、MONO-27、D18S34、D2S123；第三组引物对是扩增BAT-26、NR-22、D7S820、AMEL。
10.一种用于微卫星不稳定性基因突变检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至权利要求9任意一项所述复合扩增体系。
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