CN109336773B - 一种荧光传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种荧光传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荧光传感器的制备方法及应用，该方法首先合成柱[5]芳烃，然后用来还原氯金酸并作为稳定剂合成金纳米粒子rPA5‑AuNPs；以柱[5]芳烃为超分子主体，罗丹明B为荧光指示剂，利用柱[5]芳烃制备的金纳米粒子分散液猝灭RhB荧光，然后通过加入胆固醇把RhB从超分子的空腔中挤出来，从而使荧光强度恢复；以RhB@rPA5‑AuNPs作为荧光传感平台，利用荧光“开‑关‑开”的方式来定量检测胆固醇；本发明方法克服了现有技术的胆固醇检测方法过于复杂、检测速度慢及对胆固醇识别性较低的缺陷；本发明方法简单、方便、快速、可控性高、高效，适于工业化生产及具有广阔的市场应用前景。

Description

一种荧光传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明属于荧光传感器领域，具体涉及了一种检测胆固醇的荧光传感器的制备方法及应用。
背景技术
胆固醇(3β-胆甾-5-烯-3-醇）是在人类和高等动物脂肪、血液和细胞中发现的蜡质类固醇代谢物质。它不仅是细胞膜的一个组成部分，而且是胆汁酸，维生素 D和类固醇激素合成的前体。作为健康饮食摄入脂肪的一部分，胆固醇在脑、神经和免疫中起着重要的作用，是几种疾病的重要生物标志。人血清中的胆固醇水平已经成为临床诊断和预防心血管疾病的重要指标。健康人血清胆固醇水平低于 5.17 mmol/L,研究表明高水平胆固醇会引起冠心病和外周动脉疾病、糖尿病、高血压、心脏骤停和贫血等；而低水平的胆固醇也可能引起一些疾病,如低脂蛋白血症、肥胖症、败血症和营养不良等。因此，胆固醇测量已成为临床实验室中最常进行的测试之一。
目前大多数胆固醇测试采用基于酶的生物传感器。然而，基于酶的测试是昂贵的并且需要维护酶的催化活性，也有一些其他方法检测胆固醇，如高效液相色谱、比色法、电化学法和电化学发光等。但是现有这些检测方法存在检测步骤复杂，检测速度慢及对胆固醇检出限较高的问题。
发明内容
本发明旨在解决现有胆固醇检测方法过于复杂、检测速度慢及对胆固醇识别性较低的问题，而提供一种检测胆固醇的荧光传感器的制备方法。
本发明首先合成柱[5]芳烃，然后用来还原氯金酸并作为稳定剂合成金纳米粒子，构建荧光传感 RhB@rPA5-AuNPs，利用荧光“on-off-on” 的方式来定量检测胆固醇。利用rPA5 为主体，荧光指示剂为 RhB，利用rPA5-AuNPs溶液猝灭RhB 荧光，然后通过加入胆固醇使 RhB 荧光强度恢复，根据荧光强度变化与胆固醇加入浓度的线性关系来定量检测胆固醇。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
本发明荧光传感器的制备方法如下：
（1）将氢醌二（2-羟基乙基）醚、三苯基膦、无水乙腈依次放入烧瓶中，用冰水浴冷却，搅拌混匀后，缓慢加入四溴化碳，室温下搅拌反应，待反应完全后向混合物中加入冷水淬灭反应，得到白色沉淀，过滤收集沉淀物，用甲醇水溶液洗涤3-4次，用甲醇重结晶，干燥后制得化合物1，其中氢醌二（2-羟基乙基）醚与三苯基膦的质量比为0.1-1:1，氢醌二（2-羟基乙基）醚与四溴化碳的质量比为0.1-0.5:1；
（2）将化合物 1、多聚甲醛、1,2-二氯乙烷加入到烧瓶中，并用冰水浴冷却，然后向其中加入三氟化硼***，室温下搅拌反应，反应完全后加水淬灭，最后用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩除去溶剂得到粗产物；粗产物通过柱层析纯化，得到化合物2，其中化合物 1与多聚甲醛的质量比为5-10:1，化合物 1与三氟化硼***的质量比为0.5-2:1；
（3）将乙醇、化合物2、2-(二甲基氨)乙醇加入到烧瓶中，回流反应24-72h，反应结束后冷却至室温，减压浓缩除去溶剂，残留固体溶于水中，过滤除去不溶物质，所得滤液真空旋蒸除去溶剂，最后将残余物用乙醇洗涤，真空干燥得到浅棕色固体柱[5]芳烃（rPA5），其中化合物2与2-(二甲基氨)乙醇的质量比为0.1-0.5:1；
Figure 349819DEST_PATH_IMAGE001
；
（4）在水中加入PBS缓冲液、氯金酸溶液、柱[5]芳烃溶液，搅拌混匀后将混合溶液置于80-120℃下反应0.5-1.5h，溶液变为酒红色后离心，沉淀用去离子水离心清洗3-4次，制得rPA5-AuNPs 荧光传感器，其中氯金酸与柱[5]芳烃的摩尔比为0.01-0.05:1，水与PBS缓冲液的体积比为6-8:1, PBS缓冲液与氯金酸溶液的体积比为5-6:1。
所述甲醇水溶液是甲醇和水按体积比3:2混合制得。
所述PBS缓冲液为0.1mol/L、pH=7.0的液体。
所述氯金酸溶液的浓度为0.01-0.02 mol/L，柱[5]芳烃溶液浓度为0.02-0.04mol/L。
本发明另一目的是将上述荧光传感器的制备方法制得的荧光传感器应用在胆固醇（Cho）检测中，利用荧光“on-off-on”的方式来定量检测胆固醇，以rPA5为主体，荧光指示剂为罗丹明B（RhB），利用rPA5-AuNPs 荧光传感器溶液猝灭RhB荧光，然后通过加入胆固醇使 RhB 荧光强度恢复，根据荧光强度变化与胆固醇加入浓度的线性关系来定量检测胆固醇。
本发明的胆固醇荧光传感器灵敏度高；利用金纳米粒子溶液猝灭RhB 荧光，然后通过加入胆固醇使RhB荧光强度恢复，根据荧光强度变化与胆固醇加入浓度的线性关系来定量检测胆固醇；这种基于RhB@rPA5-AuNPs的复合传感界面，比普通的复合传感界面，灵敏度更高、稳定性更好；本发明方法在常温常压下进行、简单、快速、可控性高，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为化合物1 的1H NMR（A）和13C NMR（B）；
图2为化合物2 的1H NMR（A）和13C NMR（B）；
图3为化合物rPA5 的1H NMR（A）和13C NMR（B）；
图4为基于RhB@rPA5-AuNPs金纳米粒子构建的荧光传感器检测胆固醇的示意图；
图5为rPA5和rPA5-AuNPs 的红外光谱图；
图6为本发明实施例4 rPA5-AuNPs猝灭RhB的荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度；
图7为本发明实施例5胆固醇对RhB@rPA5-AuNPs的荧光恢复光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度；
图8为RhB@rPA5-AuNPs体系荧光强度恢复的程度与胆固醇浓度的线性关系示意图；
图9为RhB与rPA5 的结合常数双倒数图，其中A图为荧光吸收曲线，B图为RhB 与rPA5 之间的结合常数；
图10为Cho与rPA5 的结合常数双倒数图，其中A图为荧光吸收曲线，B图为胆固醇与rPA5 之间的结合常数；
图11为RhB@rPA5-AuNPs传感器对Cho识别的抗干扰性能。
具体实施方式
为进一步公开而不是限制本发明，以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例中所使用的化学试剂和溶剂均为分析纯；所述搅拌采用磁力搅拌器搅拌方式。所述的荧光光谱测定条件均为发射波长530-700nm，激发波长为510nm，狭缝宽度为10nm。
实施例1：本荧光传感器的制备方法如下：
（1）将10g氢醌二（2-羟基乙基）醚、31.5g三苯基膦、250mL无水乙腈依次放入圆底烧瓶中，用冰水浴冷却，搅拌混匀后，加入39.8g四溴化碳，室温下搅拌反应4h，待反应完全后向混合物中加入200mL冷水淬灭反应，得到白色沉淀，过滤收集沉淀物，用甲醇水溶液（体积比3:2）洗涤3次，用甲醇重结晶，干燥后白色晶体14.5 g，化合物1的1H NMR和13C NMR（图1）；
（2）将3.37g化合物 1、0.349 g多聚甲醛、50mL 1,2-二氯乙烷加入到圆底烧瓶中，并用冰水浴冷却，然后向其中加入3.26g三氟化硼***，室温下搅拌反应1h，反应完全后加50mL水淬灭，最后用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩除去溶剂得到粗产物；粗产物通过硅胶柱层析纯化，石油醚-乙酸乙酯（体积比100:1）洗脱，收集洗脱液，真空冷冻干燥得到化合物2，化合物2的1H NMR和13C NMR（图2）；
（3）将30mL乙醇、0.2g化合物2、0.85g 2-(二甲基氨)乙醇加入到圆底烧瓶中，回流反应48h，反应结束后冷却至室温，减压浓缩除去溶剂，残留固体溶于5mL水中，过滤除去不溶物质，所得滤液真空旋蒸除去溶剂，最后将残余物用乙醇洗涤，真空干燥得到浅棕色固体柱[5]芳烃0.22g，rPA5的1H NMR（A）和13C NMR（B）（图3）；
（4）在35mL水中加入5mLPBS缓冲液（0.1 mol/L、pH 7.0）、1mL氯金酸溶液（0.01mol/L）、10mL柱[5]芳烃溶液（0.02mol/L），搅拌混匀后将混合溶液置于100℃下反应1h，溶液变为酒红色后离心，沉淀用去离子水离心清洗3次，制得rPA5-AuNPs荧光传感器。
实施例2：本荧光传感器的制备方法如下：
（1）将10g氢醌二（2-羟基乙基）醚、12.5g三苯基膦、无水乙腈依次放入烧瓶中，用冰水浴冷却，搅拌混匀后，加入25g四溴化碳，室温下搅拌反应5h，待反应完全后向混合物中加入冷水淬灭反应，得到白色沉淀，过滤收集沉淀物，用甲醇水溶液（体积比3:2）洗涤4次，用甲醇重结晶，干燥后制得化合物1；
（2）将3.0g化合物 1、0.43g多聚甲醛、50mL 1，2-二氯乙烷加入到圆底烧瓶中，并用冰水浴冷却，然后向其中加入2.0g三氟化硼***，室温下搅拌反应1h，反应完全后加50mL水淬灭，最后用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩除去溶剂得到粗产物；粗产物通过硅胶柱层析纯化，石油醚-乙酸乙酯（体积比100:1）洗脱，收集洗脱液，真空冷冻干燥得到化合物2；
（3）将30mL乙醇、0.2g化合物2、0.5g 2-(二甲基氨)乙醇加入到圆底烧瓶中，回流反应48h，反应结束后冷却至室温，减压浓缩除去溶剂，残留固体溶于5mL水中，过滤除去不溶物质，所得滤液真空旋蒸除去溶剂，最后将残余物用乙醇洗涤，真空干燥得到浅棕色固体柱[5]芳烃，图5红外光谱说明，rPA5 的特征峰有 3015.03 cm-1，2953.69 cm-1，1613.34 cm-1，1500.28 cm-1，1478.91 cm-1，1403.87 cm-1。 其中 3015.03 cm-1为苯环上不饱和 C-H的伸缩振动峰； 2953.69 cm-1为饱和 C-H 的伸缩振动峰；1613.34 cm-1，1500.28 cm-1，1478.91 cm-1 为苯环骨架振动吸收峰；1403.87 cm-1为 C-H 弯曲振动吸收峰。
（4）在36mL水中加入6mLPBS缓冲液（0.1 mol/L、pH 7.0）、1mL氯金酸溶液（0.01mol/L）、25mL柱[5]芳烃溶液（0.02 mol/L），搅拌混匀后将混合溶液置于90℃下反应1.5h，溶液变为酒红色后离心，沉淀用去离子水离心清洗4次，制得rPA5-AuNPs荧光传感器（图4为rPA5-AuNPs 荧光传感器的制备及使用原理），图5中rPA5-AuNPs红外光谱说明rPA5-AuNPs 的特征峰有 3454.85 cm-1，3016.04 cm-1，2946.21 cm-1，1739.28 cm-1，1437.19 cm-1，1365.84 cm-1。 3454.85 cm-1为 rPA5 所含-OH 的伸缩振动峰；3016.04 cm-1为苯环上不饱和 C-H 的伸缩振动峰；2946.21 cm-1 为饱和 C-H 的伸缩振动峰；1437.19 cm-1，1365.84 cm-1 为 C-H 弯曲振动吸收峰；比较两谱图的差异，以上数据说明 rPA5-AuNPs 成功制备。
实施例3：罗丹明B与柱[5]芳烃、胆固醇与柱[5]芳烃的结合常数的实验
向2mL 10μmol/L RhB溶液中分次加入1μmol/L的rPA5溶液，每次添加10μl，得到一组荧光吸收曲线，根据曲线作出相应的相关线性关系（图9A），从而计算出 RhB 与rPA5 之间的结合常数Ka1（图9B）。同样的方法向2mL 10μmol/L rPA5溶液中分次加入1μmol/L胆固醇溶液，每次添加10μl，得到一组荧光吸收曲线（图10A），同样根据曲线作出相应的线性关系，计算出rPA5与Cho之间的结合常数 Ka2（图10B）；rPA5 与 Cho 之间的结合常数 Ka2大于RhB与rPA5之间的结合常数Ka1；以上主客体之间的不同竞争关系为Cho将RhB 从rPA5的空腔中挤出来奠定了实验基础。
实施例4：rPA5-AuNPs 荧光传感器对RhB 荧光的淬灭
用超纯水配制浓度为 800μmol/L RhB 作为储备液待用，在10mL 的试管中，加入RhB 储备液和超纯水混匀，配制得2mL 10μmol/L的RhB溶液，测定其荧光强度；然后向该溶液中加入10μl、5 mg/mL rPA5-AuNPs荧光传感器液体，测定其荧光强度，由于rPA5-AuNPs溶液能猝灭物质的荧光，因此RhB溶液的荧光强度降低；继续加入rPA5-AuNPs荧光传感器液体，直至荧光强度猝灭达到饱和（图6）。
实施例5：胆固醇对RhB@rPA5-AuNPs的荧光恢复
用乙醇将胆固醇配制成500μmol/L的液体，向实施例4溶液中每次加10μl、2μmol/L胆固醇溶液，且每次加入胆固醇溶液后静止3min 使其与实施例4溶液中RhB@rPA5-AuNPs充分反应，测定其荧光强度，随着胆固醇浓度的增加，实施例4溶液的荧光强度逐渐恢复（图7），并获得荧光强度与胆固醇浓度的线性关系（图8），用于后期测定样品中的胆固醇的含量；在本实施例中检测胆固醇的线性范围为 0.01-0.5μM 和 0.5-16μM，检出限为6.5 nM，线性回归方程为：F/F0 = 0.3488 C(μM) + 1.0131 和 F/F0 = 0.0088 C(μM) + 1.1728，相关系数为0.935、0.991。
实施例6：RhB@rPA5-AuNPs传感器对Cho识别的抗干扰性能
选取胆固醇类似物β-***（β-Estradiol）、***酮（Estrone）进行干扰试验，同时也选取一些常规干扰物进行干扰试验，如 MgCl2、NaCl、KCl、葡萄糖（Glucose）、蔗糖（Sucrose）、Tween-20、溶解酵素（Lysozyme）、多巴胺 （DA）、甘氨酸（Glycine）、L-酪氨酸（L-Tyrosine）。分别把这些干扰物加到 rPA5-AuNPs溶液猝灭 RhB 荧光达到饱和的混合溶液（实施例4的荧光强度猝灭达到饱和的溶液）中，测定其荧光恢复程度，作出其相对应的荧光强度（F-F0）/F0的图像，见图11，从图中可以看出RhB@rPA5-AuNPs传感器对Cho识别具有良好的抗干扰性能。
实施例7：rPA5-AuNPs传感器的使用
以人工血清为实际样品，采用加标回收的方式进行实际样品中胆固醇含量的检测；取稀释50 倍的血清样品500μL，在血清样品中分别各加入500μL，1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L 的胆固醇溶液，配制得到加标量分别为0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L的待测样品，将待测样品中加入到2mL、50mg/mL RhB@rPA5-AuNPs混合液中，测定每个样品的荧光吸收值，每个样品平行测定3次，将每个样品的荧光吸收值代入实施例5获得的荧光强度恢复与胆固醇浓度的线性关系中，计算出每个样品的实际测量浓度，并进一步计算回收率及标准偏差，见表1，实验结果显示回收率在95.3%-103.5%之间，相对标准偏差为2.8-4.5%之间，说明本发明感器可用于检测实际血清样品中的胆固醇含量，在生物医学和临床检测中有着很大的应用潜力。
表1血清实际样品中胆固醇加标回收实验结果
Figure 939064DEST_PATH_IMAGE002
。

Claims (5)

1.一种荧光传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将氢醌二（2-羟基乙基）醚、三苯基膦、无水乙腈依次放入烧瓶中，用冰水浴冷却，搅拌混匀后，加入四溴化碳，室温下搅拌反应，待反应完全后向混合物中加入冷水淬灭反应，得到白色沉淀，过滤收集沉淀物，用甲醇水溶液洗涤3-4次，用甲醇重结晶，干燥后制得化合物1，其中氢醌二（2-羟基乙基）醚与三苯基膦的质量比为0.1-1:1，氢醌二（2-羟基乙基）醚与四溴化碳的质量比为0.1-0.5:1；
（2）将化合物 1、多聚甲醛、1，2-二氯乙烷加入到烧瓶中，并用冰水浴冷却，然后向其中加入三氟化硼***，室温下搅拌反应，反应完全后加水淬灭，最后用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩除去溶剂得到粗产物；粗产物通过柱层析纯化，得到化合物2，其中化合物 1与多聚甲醛的质量比为5-10:1，化合物 1与三氟化硼***的质量比为0.5-2:1；
（3）将乙醇、化合物2、2-(二甲基氨)乙醇加入到烧瓶中，回流反应24-72h，反应结束后冷却至室温，减压浓缩除去溶剂，残留固体溶于水中，过滤除去不溶物质，所得滤液真空旋蒸除去溶剂，最后将残余物用乙醇洗涤，真空干燥得到浅棕色固体柱[5]芳烃，其中化合物2与2-(二甲基氨)乙醇的质量比为0.1-0.5:1；
Figure DEST_PATH_IMAGE002
（4）在水中加入PBS缓冲液、氯金酸溶液、柱[5]芳烃溶液，搅拌混匀后将混合溶液置于80-120℃下反应0.5-1.5h，溶液变为酒红色后离心，沉淀用去离子水离心清洗3-4次，制得rPA5-AuNPs荧光传感器，其中氯金酸与柱[5]芳烃的摩尔比为0.01-0.05:1，水与PBS缓冲液的体积比为6-8:1，PBS缓冲液与氯金酸溶液的体积比为5-6:1。
2.根据权利要求1所述的荧光传感器的制备方法，其特征在于：甲醇水溶液是甲醇和水按体积比3:2混合制得。
3.根据权利要求1所述的荧光传感器的制备方法，其特征在于：PBS缓冲液为0.1mol/L、pH=7.0的液体。
4.根据权利要求1所述的荧光传感器的制备方法，其特征在于：氯金酸溶液的浓度为0.01-0.02 mol/L，柱[5]芳烃溶液浓度为0.02-0.04 mol/L。
5.权利要求1所述的荧光传感器的制备方法制得的荧光传感器在胆固醇检测中的应用。
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