CN109328197A - 用于治疗具有补体c5多态性的患者的抗c5抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明总体涉及抗C5抗体或其抗原结合片段,用于在具有补体C5蛋白多态性的患者中预防或治疗补体相关疾病或病症。
Description
技术领域
本发明涉及抗C5抗体或其抗原结合片段,用于在具有在补体C5蛋白内的多态性或突变的患者中预防或治疗补体相关疾病或病症。
背景技术
补体是先天免疫***的主要成分,对宿主防御很重要。补体起到预防感染、连接适应性免疫和先天性免疫、以及处理免疫复合物和炎性损伤产物的作用(Walport 2001)。补体***由超过25种血浆蛋白组成,这些血浆蛋白通过三种已知的激活途径起作用:经典途径(抗体复合物)、凝集素途径(凝集素复合物)和替代途径(可溶性补体蛋白C3的自发性水解)。
补体成分C5是主要在肝脏中作为单链前体分子合成的大约189kDa蛋白质(未考虑可能的糖基化)。已显示C5也由巨噬细胞和特定类型的上皮细胞和成纤维细胞合成,但不同组织对C5血清浓度的相对贡献是未知的。所有三种补体途径汇聚于C3激活。C3的主要激活产物C3b是C5转化酶的必需成分。已经提出,当补体激活水平高时,C3b分子与C3转化酶缔合形成C5转化酶。该缔合调节酶的活性,使其优先裂解补体成分C5而不是C3(M.Jore等人,Nature Structural&Molecular Biology[自然结构与分子生物学],2016Nature America[美国自然出版集团])。C5α链被在补体激活过程中形成的C5转化酶裂解,形成C5a和C5α'链。C5α'链和C5β链一起形成C5b。
人C5(Uniprot条目P01031)是一种分泌的多结构域糖蛋白,由通过二硫桥连接的α链(999个氨基酸)和β链(655个氨基酸)组成。α链内的Arg751与Leu752之间的肽键被C5转化酶裂解,产生小的74个氨基酸长的C5a片段和大的C5b片段(1580个氨基酸)。C5向C5b的转化涉及大的构象变化并导致随后的C6结合。
人C5已经被结晶(Discipio等人1998;Acta Crystallogr Sect D:BiolCrystallogr[晶体学报D辑:生物晶体学];54:643-646)。通过分辨率的蛋白质晶体学法对C5蛋白的三维结构的测定显示C5是多结构域蛋白质:C5含有8个MG结构域(MG1-MG8)、CUB结构域、C5d结构域、C5a结构域(也称为‘过敏毒素’)和堆积在MG1-MG2与MG4-MG6之间的延伸接头区(Fredslund等人;Nat Immunol[自然免疫学];9:753-760,2008)。
C5a是中性粒细胞趋化性、内皮细胞激活和促炎细胞因子释放中涉及的主要过敏毒素。C5a的这些功能需要与其受体C5aR结合。C5b以非酶促方式依次募集C6、C7、C8和C9以形成膜攻击复合物(MAC)。MAC在靶膜中形成裂解孔并杀死病原体。虽然C5a和C5b的功能有助于杀死病原体,但它们也可能导致产生过量的炎症应答,这可能损害宿主细胞。因此,C5功能通过与宿主中的其他蛋白质的相互作用而受到严格调控。调控蛋白可以是宿主产生的因子或是致病因子。
失调的补体激活可以导致疾病表型,这些疾病表型可统称为补体相关疾病或病症。例如,它们可以由失调的C3和/或C5激活,特别是通过过量的C5a和/或MAC依赖性活动触发。其中存在显著的C5补体失调成分的补体C5相关疾病或病症是特异性补体相关疾病或病症。
C5补体相关疾病的一个实例是阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)。PNH是一种具有高发病率、危及生命的疾病,该疾病影响血液,其中红细胞受损,然后比正常红细胞更快地受到破坏。目前的PNH治疗涉及C5阻断,从而使得保留上游成分的关键免疫保护和免疫调节功能,这些上游成分最终导致C3b介导的调理作用和免疫清除。依库珠单抗(Eculizumab)(亚力兄制药公司(Alexion Pharmaceuticals))是特异性结合末端补体蛋白C5从而抑制其被C5转化酶裂解成C5a和C5b的人源化单克隆抗体,显示出有效治疗PNH,并且是唯一被批准用于PNH的药物。
依库珠单抗还被批准用于非典型溶血性***综合征(aHUS)。aHUS是一种极为罕见、危及生命的进行性疾病,常常具有遗传成分。在大多数情况下,它是由补体***的慢性、不受控制的激活引起的。
在日本,在345名接受依库珠单抗的PNH患者中,11名患者具有不良应答。这些日本患者中的所有11名患者具有单个错义C5杂合突变c.2654G→A,该突变预示着多态性p.Arg885His。这种突变在PNH患者(3.2%)中的发生率与在健康日本人中的发生率(3.5%)相似。这种多态性也在中国的汉族人群中鉴定出。此外,对依库珠单抗具有不良应答的具有亚洲血统的阿根廷患者具有不同的突变c.2653C→T,该突变预示着多态性p.Arg885Cys。非突变型和突变型C5均在体外引起溶血,但只有非突变型C5与依库珠单抗结合并被依库珠单抗阻断。具有Arg885处突变的C5变体的功能能力以及它们经历依库珠单抗阻断的失败,揭示了携带这些突变的患者对该药剂的不良应答(Nishimura等人,New Engl J Med[新英格兰医学杂志]2014;370;7)。由于缺乏依库珠单抗治疗的替代方案,所以对依库珠单抗治疗无应答的患者无法得到治疗。因此,尽管目前有用于治疗与经典和/或替代成分途径相关的疾病和病症,特别是PNH的治疗选择,但仍需要找到适合于无应答患者群体的治疗方法。
发明内容
本发明涉及抗C5抗体或其抗原结合片段,用于在具有在补体C5蛋白的依库珠单抗表位内的突变或多态性的患者中预防或治疗补体相关疾病或病症,诸如C5补体相关疾病或病症,例如PNH或aHUS。
本文描述了本披露的各种(列举的)实施例。应认识到,每个实施例中指定的特征可以与其他指定特征组合以提供本公开的另外实施例。提供了抗C5抗体或抗原结合片段,例如结合不同于且任选地远离依库珠单抗表位的C5蛋白的表位的抗C5抗体或抗原结合片段,例如特斯多鲁单抗(tesidolumab)或其抗原结合片段,用于在下述方法中作为药物使用,该方法包括向具有在补体C5蛋白的依库珠单抗表位内的突变或多态性,例如p.Arg885多态性的患者给予有效量的能够抑制所述患者中的补体激活的抗C5抗体。
提供了抗C5抗体或抗原结合片段,用于在治疗具有在补体C5蛋白的依库珠单抗表位内的突变或多态性,例如在补体C5蛋白中的p.Arg885多态性的患者的方法中使用,其中该方法包括向所述患者给予有效量的抗C5抗体,并且其中所述抗C5抗体能够抑制所述患者中的补体激活。
提供了抗C5抗体或抗原结合片段,例如特斯多鲁单抗或其抗原结合片段,用于在治疗具有在补体C5蛋白的依库珠单抗表位内的突变或多态性,例如,p.Arg885多态性的患者的方法中作为药物使用,其中所述方法包括由获自患者的生物样品确定患者的C5补体蛋白是否包含在依库珠单抗表位内的突变或多态性的步骤,其中该生物样品是从所述患者分离的组织或流体。
提供了抗C5抗体或抗原结合片段,例如特斯多鲁单抗或其抗原结合片段,用于在治疗有需要的患者中的补体相关疾病或病症的方法中使用,该方法包括:
a.从患者获取生物样品
b.筛选所述患者的编码C5的基因中的突变或多态性
c.确定患者是否具有在补体C5蛋白的依库珠单抗表位内的突变或多态性,例如,C5补体蛋白中的p.Arg885多态性,
d.向具有这种突变或多态性的患者给予有效量的能够抑制具有所述突变或多态性的患者中的C5补体激活的抗C5抗体,
其中生物样品是从患者分离的组织或流体。
此外,提供了能够在依库珠单抗表位之外结合C5补体蛋白的抗C5抗体或抗原结合片段,例如特斯多鲁单抗或其抗原结合片段,用于在治疗补体相关疾病或病症例如PNH或aHUS的方法中使用,该方法包括:
a.由获自患者的生物样品确定患者是否具有在补体C5蛋白的依库珠单抗表位内的突变或多态性,例如,C5补体蛋白中的p.Arg885多态性,
其中生物样品是从患者分离的组织或流体;并且
b.向所述患者给予有效量的所述抗C5抗体或抗原结合片段,例如,特斯多鲁单抗或其抗原结合片段。
还提供了抗C5抗体或抗原结合片段,例如结合不同于且任选地远离依库珠单抗表位的C5蛋白表位的抗C5抗体或抗原结合片段,例如特斯多鲁单抗或其抗原结合片段,用于在有需要的患者中预防或治疗补体相关疾病或病症,其中患者对依库珠单抗治疗无应答。
还提供了不同于且任选地远离依库珠单抗表位的C5蛋白表位的抗C5抗体或抗原结合片段,用于预防或治疗PNH或aHUS;和用于此类用途的具体给药方案。
此外,提供了特斯多鲁单抗、或其抗原结合片段,用于预防或治疗PNH或aHUS;和用于此类用途的具体给药方案。
附图说明
图1特斯多鲁单抗-C5交界面的特写视图。C5(灰色图示)的CUB和TED/C5d结构域分别为深灰色和浅灰色,其中肽伸长区促成虚线框中可见的表位。还指示出了特斯多鲁单抗Fab。
图2在第885位的C5多态性不影响由特斯多鲁单抗识别的表位。C5(灰色图示)与特斯多鲁单抗Fab(黑色图示)的复合物的全视图显示Arg885的位置相对于特斯多鲁单抗的表位位于C5的相反侧。
图3掺加到C5耗尽血清中的膜攻击复合物(MAC)形成C5(wt或突变型)。特斯多鲁单抗而非依库珠单抗抑制突变型C5的活性。
图4特斯多鲁单抗在C5变体和非变体PNH中显示出抗溶血作用。
图5对特斯多鲁单抗和依库珠单抗在C5变体和非变体PNH中抗溶血作用的比较。
具体实施方式
目前,可用于PNH的最有效治疗方法是抗C5抗体依库珠单抗。最近,已经发现具有补体C5蛋白中的Arg885处突变的某些患者亚群对用依库珠单抗的治疗应答不良。本发明人已鉴定出抗C5抗体或其抗原结合片段,其识别具有Arg885处突变的C5变体,并且适用于在具有补体C5蛋白中的p.Arg885多态性的患者中治疗C5补体相关疾病或病症。
在一个方面,本发明涉及抗C5抗体或其抗原结合片段,用于在具有补体C5蛋白中的p.Arg885多态性的患者中预防或治疗C5补体相关疾病或病症。
术语“补体C5蛋白”或“C5”或“C5蛋白”或“C5补体蛋白”可互换使用,并且还是指不同物种中的补体C5蛋白。例如,人C5具有如表1中SEQ ID NO:1中所示的序列并且猕猴C5具有如表1中SEQ ID NO:2(食蟹猴(Macaca fascicularis))中所示的序列。人C5可以获自Quidel公司(目录号A403)。人C5(Uniprot条目P01031)是一种分泌的多结构域糖蛋白,由通过二硫桥连接的α链(999个氨基酸)和β链(655个氨基酸)组成。α链的Arg751与Leu752之间的肽键被C5转化酶裂解,产生小的74个氨基酸长的C5a片段和大的C5b片段(1580个氨基酸)。C5向C5b的转化涉及大的构象变化并导致随后的C6结合。
已经发现人C5在第885位的两种遗传变体,即Arg885至His和Arg885至Cys变体。在日本和中国的汉族人群中已描述了单个错义C5杂合突变c.2654G→A(表1的SEQ ID NO:3),该突变预示着多态性p.Arg885His。
在具有亚洲血统的阿根廷人群中描述了另一种突变c.2653C→T(表1的SEQ IDNO:4),该突变预示着p.Arg885Cys。只有非突变型C5与依库珠单抗结合并被依库珠单抗阻断。已经在对依库珠单抗治疗显示出不良应答的PNH患者中观察到人C5在第885位的这两种遗传变体(Nishimura等人,新英格兰医学杂志2014;370;7)。这些C5变体是功能性的但不被依库珠单抗阻断。Arg885存在于C5的MG7结构域内,并且位于依库珠单抗表位中(或附近)。
因此,在一个实施例中,本发明涉及抗C5抗体或其抗原结合片段,用于在具有在补体C5蛋白的MG7结构域内或在补体C5蛋白的依库珠单抗表位内的突变或多态性,例如在补体C5蛋白中的p.Arg885多态性的患者中预防或治疗补体相关疾病或病症,例如C5补体相关疾病或病症,其中所述突变或多态性是p.Arg885多态性。在另一个实施例中,本发明涉及抗C5抗体或其抗原结合片段,用于在具有补体C5蛋白中的p.Arg885多态性的患者中预防或治疗补体相关疾病或病症,例如C5补体相关疾病或病症,其中所述p.Arg885是p.Arg885Cys多态性或p.Arg885His多态性。
如本文所用,术语“多态性”是指当基因组序列中的核苷酸被改变时发生的DNA序列变异。单核苷酸多态性(SNP)是当基因组序列中的单个核苷酸被改变时发生的DNA序列变异。如本文所用,术语“补体C5蛋白中的p.Arg885多态性”是指错义C5杂合突变,该杂合突变导致C5中Arg885被另一种氨基酸,例如p.Arg885His中的His、p.Arg885Cys中的Cys取代。
可以通过测定获自患者的样品来检测C5多态性。术语“测定”用于指鉴定、筛选、探测或确定的行为,该行为可以通过任何常规手段进行。例如,可以通过使用ELISA测定、RNA印迹、成像等检测样品中是否存在特定标记物来测定该样品中该标记物的存在。术语“测定”和“确定”涵盖物质的转化,例如,通过对样品进行物理测试,将生物样品(例如血液样品或其他组织样品)从一种状态转化为另一种状态。此外,如本文所用,术语“测定”和“确定”用于意指测试和/或测量。短语“测定来自患者的生物样品中......”等用于意指可以(直接或间接)测试样品中给定因子的存在或不存在或特定因子的水平。应当理解,在物质的存在表示一种可能性并且物质的不存在表示不同的可能性的情况下,可以使用这种物质的存在或不存在来指导治疗决策。
测定步骤包括选自下组的技术,该组由以下项组成:RNA印迹分析、聚合酶链反应(PCR)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、基于TaqMan的测定、直接测序、动态等位基因特异性杂交、高密度寡核苷酸SNP阵列、限制性片段长度多态性(RFLP)测定、引物延伸测定、寡核苷酸连接酶测定、单链构象多态性分析、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性高效液相色谱、高分辨率熔解曲线分析、DNA错配结合蛋白测定、毛细管电泳、DNA印迹、免疫测定、免疫组织化学、ELISA、流式细胞术、蛋白质印迹、HPLC和质谱。
术语“表位”意指能够特异性结合抗体和/或直接参与这种结合的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团(诸如氨基酸或糖侧链)组成,并且通常具有特定三维结构特征,以及特定电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于:在变性溶剂存在下,失去与前者的结合,但不失去与后者的结合。根据本发明,“表位”涵盖构象表位和非构象表位。
术语“依库珠单抗表位”是指能够被依库珠单抗结合、和/或直接参与这种结合的C5蛋白的部分,例如其氨基酸,其中依库珠单抗结合诱导C5激活失调。依库珠单抗表位含有存在于C5的MG7结构域内的第885位氨基酸Arg(Arg885)。
如本文所用,术语“抗体”包括全抗体及其任何抗原结合片段(即,“抗原结合部分”)或单链。天然存在的“抗体”是包含由二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(在本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域,即CH1、CH2以及CH3组成。每个轻链由轻链可变区(在本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步细分为高变区,称为互补决定区(CDR),它们散布着称为框架区(FR)的较保守的区。每个VH和VL由从氨基末端排到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫***的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体***的第一成分(C1q))的结合。
如本文所用,术语抗体的“抗原结合部分”是指保留特异结合给定抗原(例如,C5)的能力的抗体的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可以由抗体的片段来执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括Fab片段,一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;F(ab)2片段,一种包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段;和由VH和CH1结构域组成的Fd片段;由抗体的单一臂的VL和VH结构域组成的Fv片段;由VH结构域组成的单结构域抗体(dAb)片段(Ward等人,(1989)Nature[自然]341:544-546);以及分离的互补决定区(CDR)。
此外,虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的,但是可以使用重组方法将这两个结构域通过能够使它们形成为单条蛋白质链的人工肽接头来接合,其中VL区和VH区组配对形成单价分子(被称为单链Fv(scFv);参见例如,Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426;和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.[美国科学院院刊]85:5879-5883)。此类单链抗体包含抗体的一个或多个“抗原结合部分”。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段,并且可以对片段进行筛选以与完整抗体相同的方式使用。
抗原结合部分还可以掺入到单结构域抗体、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和bis-scFv中(参见,例如,Hollinger和Hudson,(2005)Nature Biotechnology[自然生物技术]23(9):1126-1136)。可以基于多肽诸如III型纤连蛋白(Fn3)将抗体的抗原结合部分移植到支架中(参见美国专利号6,703,199,该专利描述了纤连蛋白多肽单体)。
本发明提供了能够通过特异性结合C5蛋白(例如人和/或猕猴C5)来抑制补体激活的C5成分的抗体。此类抗C5抗体可以通过各种功能测定来表征。例如,它们可以通过以下方面进行表征:它们在溶血测定中抑制红细胞裂解的能力、它们对C5蛋白(例如人和/或猕猴C5)的亲和力、它们的表位分级(epitope binning)、它们对蛋白水解的抗性、以及它们阻断补体激活的能力,例如它们抑制MAC形成的能力。
在一个实施例中,本发明的抗C5抗体靶向补体C5蛋白的表位,该靶向不受补体C5蛋白的MG7结构域内或其依库珠单抗表位内的突变或多态性的影响。例如,本发明的抗C5抗体靶向补体C5蛋白的表位(例如与该表位结合),该靶向不受p.Arg885多态性,例如p.Arg885His或p.Arg885Cys的影响。
在另一个实施例中,本发明的抗体通过其有效结合C5蛋白的能力,同时与C5蛋白的这种结合不受补体C5蛋白的MG7结构域内或依库珠单抗表位内的突变或多态性的影响来定义。例如,本发明的抗C5抗体能够有效结合含有p.Arg885多态性,例如,p.Arg885His或p.Arg885Cys的C5蛋白。
根据本发明的抗C5抗体可以靶向补体C5蛋白内的表位,该表位位于远离C5蛋白的MG7结构域、依库珠单抗表位(包括构象表位)或Arg885的位置。
在另一个实施例中,本发明的抗C5抗体靶向C5蛋白内的表位,该表位不包括任何已知的N连接糖基化位点。
在一个实施例中,本发明的抗C5抗体在蛋白质的CUB结构域处或附近,例如在C5蛋白的CUB和TED/C5d结构域的交界面处结合C5蛋白。
在一个实施例中,有待给予的抗C5抗体是特斯多鲁单抗,特斯多鲁单抗描述于国际专利申请号WO 2010/015608,“Compositions and Methods for Antibodies TargetingComplement Protein C5[靶向补体蛋白C5的抗体的组合物和方法]”和美国专利号8,241,628中,这些专利通过引用并入。特斯多鲁单抗的CDR序列在本文中包括在表1中:HCDR1序列(SEQ ID NO 5)、HCDR2序列(SEQ ID NO.6)、HCDR3序列(SEQ ID NO.7)、LCDR1序列SEQ IDNO.8)、LCDR2序列(SEQ ID NO.9)和LCDR3序列(SEQ ID NO.10),如在Kabat定义下所定义的。
在另一个实施例中,有待给予的抗C5抗体是具有特斯多鲁单抗的CDR序列(如SEQID NO.5-10中所述)的任何抗体。在另一个实施例中,有待给予的抗C5抗体特异性结合与特斯多鲁单抗相同的表位。
因此,可以基于在C5结合测定,例如竞争结合试验中与本文披露的其他抗体交叉竞争(例如,以统计学上显著的方式竞争性抑制这些其他抗体的结合)的能力来鉴定另外的抗体。测试抗体抑制本发明的抗体与C5蛋白(例如人和/或猕猴C5)结合的能力证明测试抗体可以与该抗体竞争结合C5;根据非限制性理论,这种抗体可以和与其竞争的抗体结合C5蛋白上的相同或相关(例如,结构上相似或空间上接近)的表位。在某个实施例中,与本发明抗体结合C5上相同表位的抗体是人单克隆抗体。可如本文所述那样制备和分离此类人单克隆抗体。
已知的竞争结合测定可用于评估C5结合抗体与参考C5结合抗体关于结合C5蛋白的竞争。这些测定法包括,例如固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹层竞争测定(Stahli等人,(1983)Methods in Enzymology[酶学方法]9:242-253);固相直接生物素-亲和素EIA(Kirkland等人,(1986)J.Immunol.[免疫学杂志]137:3614-3619);固相直接标记测定、固相直接标记夹层测定;使用I-125标记的固相直接标记RIA(Morel等人,(1988)Molec.Immunol.[分子免疫学]25:7-15);固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung等人,(1990)Virology[病毒学]176:546-552);以及直接标记的RIA(Moldenhauer等人,(1990)Scand.J.Immunol.[斯堪的纳维亚免疫学杂志]32:77-82)。典型地,这种测定涉及使用结合固体表面或细胞的纯化抗原,该固体表面或细胞携带这些未标记的测试C5结合抗体和标记的参考抗体中的任何一种。通过确定在测试抗体存在下结合固体表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常,测试抗体过量存在。通过竞争测定(即,竞争抗体)鉴定的抗体包括与参考抗体结合相同表位的抗体和结合邻近表位的抗体,该邻近表位与参考抗体所结合的表位足够接近以发生位阻。
为了确定所选择的C5结合单克隆抗体是否结合唯一的表位,可以使用可商购获得的试剂(例如来自美国伊利诺伊州罗克福德的皮尔斯公司(Pierce,Rockford,IL USA))将每种抗体生物素化。可以使用C5多肽包被的ELISA平板来进行使用未标记单克隆抗体和生物素化单克隆抗体的竞争研究。可以用链霉亲和素-碱性磷酸酯酶探针检测生物素化单克隆抗体结合。为了确定纯化的C5结合抗体的同种型,可进行同种型ELISA。例如,可用1μg/ml抗人IgG在4℃下过夜包被微量滴定板的孔。在用1%BSA封闭之后,将板与1μg/ml或更少的单克隆C5结合抗体或纯化的同种型对照在环境温度下反应1至2个小时。这些孔然后可以与人IgG或人IgM特异性碱性磷酸酯酶缀合的探针反应。然后将板显色,并对其进行分析,以便确定纯化抗体的同种型。
为了证明单克隆C5结合抗体与表达C5多肽的肝细胞的结合,可以使用流式细胞术。简而言之,可以将表达C5的细胞系(在标准生长条件下生长)与含0.1%BSA和10%胎牛血清的PBS中各种浓度的C5结合抗体混合,并在37℃下温育1小时。洗涤后,细胞与荧光素标记的抗人IgG抗体在与一级抗体染色相同的条件下反应。可通过FACScan(美国圣何塞的BD生物科学公司(BD Biosciences,San Jose,USA))使用光和侧向散射特性门控单个细胞来分析样品。(除了或者替代)流式细胞术测定,还可使用利用荧光显微术的备选测定法。可将细胞如上所述那样染色并且通过荧光显微术检查。该方法允许可视化单个细胞,但可以根据抗原的密度具有降低的灵敏度。
通过蛋白质印迹,可以进一步测试本发明的C5结合抗体与C5多肽或抗原片段的反应性。简而言之,可以制备纯化的C5多肽或融合蛋白,或来自表达C5的细胞的细胞提取物,并且进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳之后,将分离的抗原转移至硝酸纤维素膜,用10%胎牛血清进行封闭,并且用有待测试的单克隆抗体进行探测。可以使用抗人IgG碱性磷酸酯酶检测人IgG结合,并且用BCIP/NBT底物片剂(美国密苏里州圣路易斯的西格玛化学公司(Sigma Chem.Co.,St.Louis,MO USA)进行显色。
本发明提供了抗C5抗体,该抗C5抗体能够抑制具有在C5蛋白的MG7结构域内的突变或多态性,例如,依库珠单抗表位内的突变或多态性,例如p.Arg885多态性的患者中的补体激活。在一个实施例中,本发明涉及抗C5抗体或其抗原结合片段,用于在具有补体C5蛋白中的p.Arg885多态性的患者中治疗补体相关疾病或病症,例如C5补体相关疾病或病症,其中所述抗C5抗体能够抑制所述具有p.Arg885多态性的患者中的补体途径。
可以用诸如溶血测定或结合亲和力测定的测定法来测试抗C5抗体用于在具有在C5蛋白的MG7结构域内的突变或多态性,例如在依库珠单抗表位内的突变或多态性,例如在补体C5蛋白中的p.Arg885多态性的患者中治疗补体相关疾病或病症,例如C5补体相关疾病或病症的适用性。例如,为了确定对抗C5抗体的药效动力学应答,可以测量患者血清在人血清-补体溶血测定中裂解抗体致敏的鸡红细胞的能力(Hillmen等人,(2004)N Engl J Med.[新英格兰医学杂志]350:552-9)。根据Nishimura,在该测定***中,小于20%的残余溶血表明溶血完全阻断(Nishimura等人,(2014)新英格兰医学杂志370:7)。可以使用结合亲和力测定检测抗C5抗体与C5和C5的不同变体的结合。表面等离子体共振分析(Biacore 3000)可用于使用Nishimura等人,同上中所述的抗人IgG(Fc)捕获方法评估抗C5抗体与C5的结合,该文献通过引用并入本文。
在一个实施例中,能够抑制具有在C5蛋白的MG7结构域内或在依库珠单抗表位内的突变或多态性,例如p.Arg885多态性的患者中的补体途径的抗C5抗体是人抗C5抗体。如本文所用,术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体,其中框架区和CDR区两者均源自人来源的序列。此外,如果抗体含有恒定区,则恒定区还源自此类人序列,例如人种系序列或突变形式的人种系序列。本发明的人抗体可以包括不是由人序列编码的氨基酸残基(例如,通过在体外随机诱变或位点特异性诱变或通过在体内体细胞突变来引入的突变)。在某些实施例中,所述抗体是靶向C5的完全人Fc沉默IgG1/λ单克隆抗体,诸如特斯多鲁单抗。在优选的实施例中,本发明涉及抗C5抗体特斯多鲁单抗,用于在具有在C5蛋白的MG7结构域内或在依库珠单抗表位内的突变或多态性,例如,在补体C5蛋白中的p.Arg885多态性的患者中预防或治疗C5补体相关疾病或病症,例如PNH或aHUS。
在一个实施例中,本发明涉及具有在C5蛋白的MG7结构域之外或远离该MG7结构域的结合表位的抗C5抗体。在另一个实施例中,本发明涉及具有远离Arg885或不与Arg885位置重叠的结合表位的抗C5抗体。所述抗C5抗体的C5中和不受在依库珠单抗非应答者中观察到的Arg885多态性的影响,因此所述抗体适用于本发明。具有远离Arg885的结合表位的抗C5抗体的实例包括特斯多鲁单抗或N19-8。在优选的实施例中,本发明涉及特斯多鲁单抗。
本发明可用于治疗患有补体相关疾病或病症,例如C5补体相关的疾病或病症的人类患者。术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”可互换用于指作为治疗、观察和/或实验的对象的动物。通常,这种个体、宿主、受试者或患者是人,但是其他哺乳动物也在本发明的范围内。
术语“治疗”包括给予组合物或抗体以预防或延迟疾病的症状、并发症、或生化指征的发作、缓解症状或阻止或抑制疾病、病状或病症的进一步发展。治疗可以是预防性的(以预防或延迟疾病的发作,或以防止其临床或亚临床症状的显现)或在疾病显现后对症状的治疗性抑制或缓解。
如本文所用,术语“C5补体相关疾病或病症”是指这样的疾病或病症,其中未调控的C5功能可能例如由于失调的C5激活,例如增加的C5激活而导致疾病表型。
已知的补体相关疾病或病症的实例包括:神经障碍、多发性硬化、中风、格-巴二氏综合征(Guillain Barre Syndrome)、外伤性脑损伤、帕金森病、阿尔茨海默病、不恰当或不想要补体激活的病症、血液透析并发症、IL-2疗法过程中白介素2诱导的毒性、炎性病症、自身免疫病炎症、克隆氏病(Crohn's disease)、成人呼吸窘迫综合征、热损伤包括烧伤或冻伤、局部缺血后再灌注病状、巴拉克尔-西蒙斯综合征(Barraquer-Simons Syndrome)、心肌梗塞、气囊血管成形术、心肺转流术或肾脏转流术中的泵后综合征、血液透析、肾缺血、表面重建后肠系膜动脉再灌注、传染病或败血症、免疫复合物病症和自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、***性红斑狼疮(SLE)、SLE肾炎、增殖性肾炎、溶血性贫血、以及重症肌无力。此外,其他已知补体相关疾病是肺部疾病和病症,诸如呼吸困难、咯血、ARDS、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺气肿、肺栓塞和梗塞、肺炎、致纤维化粉尘疾病、惰性粉尘和矿物质(例如,硅、煤尘、铍和石棉)、肺纤维化、有机粉尘疾病、化学损伤(由于刺激性气体和化学物质,例如氯、光气、二氧化硫、硫化氢、二氧化氮、氨气和盐酸)、烟雾损伤、热损伤(例如,烧伤、冻伤)、过敏症、支气管收缩、过敏性肺炎、寄生虫病、肺出血肾炎综合征、肺血管炎、免疫复合物相关炎症、aHUS、肾小球肾炎、大疱性类天疱疮和II型膜增生性肾小球肾炎(MPGN II)、地图样萎缩(GA)、视神经脊髓炎(NMO)以及重症肌无力(MG)。
在一个特定实施例中,已知的C5补体相关疾病或病症的实例包括地图样萎缩(GA)、格-巴二氏综合征、重症肌无力、SLE肾炎、增殖性肾炎、哮喘、类风湿性关节炎、败血症:阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)和年龄相关性黄斑变性(AMD)。
PNH是一种危及生命的血液疾病并且特征尤其在于异常的造血作用、补体介导的血管内溶血和血栓形成倾向。PNH是由于造血干细胞的克隆性扩增而产生的,这些造血干细胞在编码磷脂酰肌醇聚糖锚生物合成A类(PIGA)的基因中获得体细胞突变,该基因编码糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚生物合成初始步骤所必需的酶。所得的造血细胞缺乏糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白,包括补体调控蛋白CD55和CD59;这解释了为PNH的主要临床表现的血管内溶血。很多情况下PNH的发展与涉及骨髓衰竭的病症,特别是再生障碍性贫血相关联。血栓形成是PNH相关发病率和死亡率的主要原因。
与PNH相关联的病症的实例包括贫血、血栓栓塞事件、平滑肌张力障碍、慢性肾病、***功能障碍、肺动脉高压以及疲劳。
aHUS是一种极为罕见、危及生命的进行性疾病,常常具有遗传成分。它是与补体介导的血栓性微血管病(TMA)的慢性风险和危及生命的后果相关联的疾病。aHUS被定义为表现出TMA临床特征(血小板减少症、微血管病性溶血和器官功能障碍症状)的疾病,并且它影响成人和儿童。
年龄相关性黄斑变性(AMD)是一种主要存在于老年人中的医学病症,在老年人中称为视网膜黄斑区域的眼睛内层中心遭受变薄、萎缩,并且在一些情况下,出血。这可导致中心视力丧失,进而使得不能看见微小细节、阅读或识别面孔。对新脉络膜脉管形成的发病机理还了解的不充分,但认为诸如炎症、局部缺血和血管原性因子的局部产生等因素是重要的。该疾病的晚期形式在“湿性”(新生血管)形式与“干性”(地图样萎缩)形式之间划分。
地图样萎缩(GA)是干性AMD的晚期萎缩形式。GA的特征在于黄斑内光感受器、视网膜色素上皮细胞(RPE)和脉络膜毛细血管层的丧失。
在优选的实施例中,C5补体相关疾病或病症是PNH。
在一个方面,本发明涉及抗C5抗体或抗原结合片段,用于在下述方法中作为药物使用,该方法包括向具有在C5蛋白的MG7结构域内或在依库珠单抗表位内的突变或多态性,例如p.Arg885多态性的患者给予有效量的能够抑制所述患者中的补体途径的抗C5抗体。
在另一方面,本发明涉及抗C5抗体或抗原结合片段,用于在预防或治疗具有在C5蛋白的MG7结构域内或在依库珠单抗表位内的突变或多态性,例如在补体C5蛋白中的p.Arg885多态性的患者中的补体相关疾病或病症,例如C5补体相关疾病或病症的方法中使用,其中该方法包括给予有效量的能够抑制所述患者中的补体激活的抗C5抗体。特别地,本发明涉及抗C5抗体或抗原结合片段,用于在预防或治疗具有补体C5蛋白中的p.Arg885多态性的患者中的C5补体相关疾病或病症的方法中使用,其中该方法包括给予有效量的能够抑制所述患者中的补体激活的所述抗C5抗体。
在又另一方面,本发明涉及预防或治疗有需要的患者中的补体相关疾病或病症,例如C5补体相关疾病或病症的方法,其中这种患者具有在C5蛋白的MG7结构域内或在依库珠单抗表位内的突变或多态性,例如p.Arg885多态性,该方法包括向所述患者给予有效量的能够抑制补体激活的抗C5抗体或抗原结合片段。
术语“给予”涵盖将本发明的抗C5抗体或抗原结合片段,优选特斯多鲁单抗,例如在眼科疾病中作为多个玻璃体内剂量给予。术语“给予”还涵盖将本发明的抗C5抗体或抗原结合片段,优选特斯多鲁单抗,在C5相关疾病(诸如PNH或aHUS)中以多个玻璃体内(IV)剂量给予。术语抗C5抗体或其抗原结合片段的“有效量”或“治疗有效量”是指本披露的抗C5抗体或抗原结合片段将引发受试者的生物学或医学应答,例如,减少或抑制蛋白质活性、或改善症状、缓解病状、减缓或延迟疾病进展、或预防疾病等的量。术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中定义为是指足以提供相对于所治疗病状的基线临床可观察体征和症状可观察到的改善的量。
在一个实施例中,本发明涉及抗C5抗体或其抗原结合片段,优选特斯多鲁单抗,用于在预防或治疗PNH或aHUS的方法中使用。
根据本发明,有待给予的抗C5抗体或抗原结合片段(例如特斯多鲁单抗)的剂量是在10mg/kg与30mg/kg之间,例如15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg。
在某些实施例中,本发明的抗C5抗体,例如特斯多鲁单抗,在治疗期间给予1、2、3、4、5、6次或更多次。例如,将它给予1至3次、1至4次、2至4次、2至5次、2至6次、3至6次、4至6次、6至8次、或更多次。
在一些实施例中,本发明的抗C5抗体,例如特斯多鲁单抗,至少每周给予一次、至少每两周给予一次、至少每月给予一次。
本发明的抗C5抗体,例如特斯多鲁单抗,可以在至少6周、至少9周、至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少1年、终身的时间段内进行给予。
在一个实施例中,提供了抗C5抗体或其抗原结合片段,例如特斯多鲁单抗,用于预防或治疗PNH或aHUS,其中所述抗C5抗体每周一次或每两周一次地以至少20mg/kg的剂量给予,持续至少一周,例如,至少一个月,例如至少6周,例如3个月、例如6个月、例如9个月、例如1年、例如终身的时间段。所述抗体可以以至少20mg/kg的剂量并且以两次给予之间不超过一个月,例如为2周的间隔重复给予。所述抗体可以在至少3个月,例如6个月、例如9个月、例如1年、例如终身的期间进行给予。
在另一实施例中,本发明的抗C5抗体或抗原结合片段,例如特斯多鲁单抗,用于治疗PNH,其中所述抗C5抗体每周一次地以至少20mg/kg的剂量给予,持续至少6周至6个月,然后每两周一次地以至少20mg/kg的剂量给予,持续至少3个月、6个月、9个月、1年、终身。
在另一个实施例中,提供了抗C5抗体或其抗原结合片段,例如特斯多鲁单抗,用于预防或治疗aHUS,其中所述抗C5抗体每周一次或每两周一次地以至少20mg/kg,例如每周一次或每两周一次地以至少30mg/kg的剂量给予。给予可以持续至少一个月,例如至少6周、例如3个月、例如6个月、例如9个月、例如1年,例如终身的时间段。
本发明的抗C5抗体,例如特斯多鲁单抗,可以以至少20mg/kg,例如30mg/kg的剂量、以两次给予之间不超过一个月,例如2周的间隔重复给予。抗C5抗体,例如特斯多鲁单抗,可以给予持续至少3个月,例如6个月、例如9个月、例如1年、例如终身。
在一个实施例中,向患者给予本发明的抗C5抗体或其抗原片段,例如特斯多鲁单抗,其中患者是初治患者,例如所述患者先前未进行任何抗C5抗体或其抗原片段治疗,特别是未进行依库珠单抗治疗(依库珠单抗初治患者)。依库珠单抗初治患者群体涵盖三个不同的群组:(a)新近诊断的病例;(b)诊断为无法获得依库珠单抗的患者和(c)疾病严重程度不能批准开始治疗的早期疾病,例如,没有血栓形成事件的患者。
在又另一实施例中,向患者给予本发明的抗C5抗体或其抗原片段,例如特斯多鲁单抗,其中患者先前被给予抗C5抗体或其抗原片段,特别是依库珠单抗。在另一个实施例中,向患者给予本发明的抗C5抗体或其抗原片段,例如特斯多鲁单抗,其中患者先前被给予抗C5抗体或其抗原片段,特别是依库珠单抗,并且其中患者对所述先前治疗,例如依库珠单抗治疗无应答,特别是其中患者具有补体C5蛋白中的p.Arg885多态性。
在一个方面,本发明涉及抗C5抗体或其抗原结合片段,例如特斯多鲁单抗,用于制造用于在具有补体C5蛋白中的p.Arg885多态性的患者中预防或治疗补体相关疾病或病症,例如C5补体相关疾病或病症,例如PNH或aHUS的药物的用途。在一个实施例中,本发明涉及抗C5抗体或其抗原结合片段用于制造用于在具有在C5蛋白的MG7结构域内或在依库珠单抗表位内的突变或多态性,在补体C5蛋白中的p.Arg885多态性的患者中治疗C5补体相关疾病或病症的药物的用途,其中所述抗C5抗体能够抑制所述患者中的补体激活,例如为特斯多鲁单抗。例如,提供了特斯多鲁单抗或其抗原结合片段用于制造用于在具有补体C5蛋白中的p.Arg885多态性的患者中预防或治疗C5补体相关疾病或病症,例如PNH或aHUS的药物的用途。
在一个实施例中,预防或治疗补体相关疾病或病症,例如C5补体相关疾病或病症的方法进一步包括由获自患者的生物样品确定患者的C5补体蛋白是否包含在C5蛋白的MG7结构域内或在依库珠单抗表位内的突变或多态性,例如p.Arg885多态性的步骤,其中生物样品是从患者分离的组织或流体。
如本文所用,术语“生物样品”是指通过取样获取的生物样本,以代表取自样本来源的任何其他样本。在一个实施例中,生物样品是从患者分离的组织或流体。
在一个方面,本发明涉及抗C5抗体或其抗原结合片段,用于在治疗有需要的患者中的补体相关疾病或病症,例如C5补体相关疾病或病症的方法中使用,该方法包括:(a)从患者获取生物样品;(b)筛选所述患者的编码C5的基因中的突变或多态性;(c)确定患者是否具有在补体C5蛋白的MG7结构域内、在依库珠单抗表位内的突变或多态性或是否具有C5补体蛋白中的p.Arg885多态性;(d)给予有效量的能够抑制至少具有根据步骤(c)检测到的突变或多态性的患者中的补体激活的抗C5抗体,其中所述生物样品是从患者分离的组织或流体。在优选的实施例中,所述抗C5抗体是特斯多鲁单抗。在另一个实施例中,C5蛋白中的突变或多态性是p.Arg885多态性,例如p.Arg885His或p.Arg885Cys。
在另一个方面,本发明涉及抗C5抗体或其抗原结合片段,用于在治疗PNH或aHUS的方法中使用,该方法包括:(a)由获自患者的生物样品确定患者是否具有在C5蛋白的MG7结构域内、在依库珠单抗表位内的突变或多态性或在C5补体蛋白中的p.Arg885多态性,其中生物样品是从患者分离的组织或流体;并且(b)向所述患者给予有效量的抗C5抗体或其抗原结合片段,例如,特斯多鲁单抗或其抗原结合片段。
表1:序列
以下实例示出上文所述的本发明,然而不旨在以任何方式限制本发明的范围。同样,相关领域中的技术人员已知的其他测试模型也可以确定所要求保护的发明的有益效果。
实例
实例1:与人C5复合的特斯多鲁单抗Fab的结晶。
特斯多鲁单抗是以皮摩尔亲和力结合人和猕猴(食蟹猴)补体C5的人单克隆抗体,从而防止C5激活以及C5a和C5b的释放。进行了对与人C5复合的特斯多鲁单抗的详细分析。
方法:
特斯多鲁单抗Fab的表达和纯化
在TG1F-大肠杆菌细胞(ACE25090)中克隆并表达了特斯多鲁单抗Fab。将冷冻的细胞沉淀物悬浮于150ml裂解缓冲液中并均化(裂解缓冲液:20mM NaH2PO4,10mM咪唑,500mMNaCl pH 7.4,每50ml缓冲液具有1片不含EDTA的cOmpleteTM蛋白酶抑制剂混合物(罗氏公司(Roche)),450μl 1.0M MgCl2和15μl全能核酸酶(诺华公司(Novagen)))。离心(在16,000g,4℃下30min)后,将上清液无菌过滤(0.2μm Stericup过滤器)并加载(2.5ml/min)于用裂解缓冲液平衡的5ml HisTrap HP柱(GE医疗集团(GE Healthcare),17-5247-01)上。在以20mM,然后50mM咪唑进行两次洗涤步骤后,从50mM至500mM咪唑通过100ml梯度洗脱Fab。将洗脱液以5ml级分收集,并且使用10%Bis-Tris凝胶(NuPage,英杰公司(Invitrogen))通过SDS-PAGE分析。将所选择的级分合并,通过超滤(Amicon Ultra-15 3k浓缩器)在4℃下浓缩至5ml,并且加载于用10mM Tris-HCl pH 7.5,25mM NaCl平衡的Superdex75柱上。将收集的级分依旧通过SDS-PAGE分析、合并并通过超滤浓缩。然后在用50mM Tris-HCl pH 8.0平衡的MonoQ HR 10/10阳离子交换柱上进一步纯化Fab,使用0.0-1.0M NaCl梯度洗脱。将合并的级分浓缩并再次以多次运行加载于Superdex75 300GL柱上,在10mM Tris-HCl pH 7.5,25mM NaCl中等度洗脱。
特斯多鲁单抗Fab与人C5的复合物的制备和纯化
人补体蛋白C5购自Complement Technology公司(目录号A120批号16a)并且不经进一步纯化即使用。将2.5倍摩尔过量的特斯多鲁单抗Fab添加到人C5中,并且使用用10mMTris pH 7.4,25mM NaCl平衡的S300Sephacryl 16/60柱通过尺寸排阻色谱法纯化复合物。
特斯多鲁单抗Fab与人C5的复合物的结晶
将在10mM Tris pH 7.4,25mM NaCl中的特斯多鲁单抗Fab与人C5的复合物通过超滤浓缩至17.8mg/ml,并且在20℃下进行结晶筛选。最初通过在96孔Innovadyne SD2板(CHBS_19814_G12_1)中的沉滴式蒸气扩散来鉴定结晶条件。然后使用24孔VDX板(HamptonResearch)通过悬滴中蒸气扩散技术在2μl液滴中生长更大的晶体(CHBS_20088_B3_1)。
特斯多鲁单抗Fab与人C5的复合物的X射线数据和结构确定
从特斯多鲁单抗Fab复合物的晶体收集两个衍射数据组。将两个数据组依旧用XDS和XSCALE(Kabsch 1993)处理。将第二数据组随后用2012年7月4日的XSCALE版本进行重新处理,以便在精修过程中包括超出分辨率的仍然具有显著比例的相关统计CC*的弱衍射数据,(Karplus和Diederichs 2012)。
将数据组1在瑞士光源(瑞士保罗谢尔研究所(Paul Scherrer Institute))的光束线X06DA(PXIII)上收集,该瑞士光源配备有MAR CCD 225mm检测器,并且使用波长的X射线。将该实验中使用的晶体直接快速冷却成液氮。总计,在晶体与检测器距离为380mm处记录了180个1.0°振荡图像。该衍射数据组达的分辨率。
将数据组2在瑞士光源(瑞士保罗谢尔研究所)的光束线X10SA(PXII)上收集,该瑞士光源配备有Pilatus像素检测器,并且使用波长的X射线。在快速冷却成液氮之前,将本实验中使用的晶体短暂浸泡在补充有10μM CdCl2的母液中。总计,在晶体与检测器距离为600mm处记录了720个0.25°振荡图像。该衍射数据组达的分辨率。
使用多次Phaser运行通过分子置换解析该结构(McCoy等人2007)。当使用全长人C5(PDB条目3CU7,链A;Fredslund等人2008)作为搜索模型时,未发现分子置换解。使用没有C345C结构域的全长C5的第二次Phaser运行也是不成功的。形成鲜明对比的是,当将C5β链用作搜索模型时,很容易发现空间群P43中的清楚分子置换解(TFZ得分=8.2)。在固定C5β链的解的情况下,然后对于没有C345C结构域的α链没有发现清楚的分子置换解(TFZ得分=22.8)。从随后的Phaser运行获得C345C结构域的清楚解(TFZ得分=13.5)。然后,使用特斯多鲁单抗Fab的可变结构域和恒定结构域(以分辨率从晶体形式2精修的结构)作为搜索模型。VL/VH片段得到非常清楚的分子置换解(TFZ得分=23.5)。虽然CL/CH1结构域给出较弱的信号(TFZ得分=6.6),但是很容易找到有意义的解(如根据与先前定位的VL/VH结构域的连通性判断的)。分子置换计算首先用衍射数据组进行,然后在数据可用时进行重复,得到相同的整体解。
将完整的分子置换模型在COOT(Emsley等人2010)中检查,并且用Buster 2.11.2(Bricogne等人2011)对于所有衍射数据进行精修至分辨率。由于数据的分辨率有限,在精修过程中施加了局部结构相似性约束(LSSR;Smart等人2012)。在使用自动NCS限制和由Fredslund等人(2008)最初定义的TLS组进行Buster精修之后,用于LSSR的目标结构是以分辨率精修的特斯多鲁单抗Fab结构和源自PDB条目3CU7(链A)的游离C5结构。与原始PDB条目相比,该精修步骤改进了最终模型的拉曼(Ramachandran)统计值(在拉曼图的核心区、允许区和勉强允许区中的残基分别为79.5%、18.6%和1.1%,相对于原始PDB条目的74.9%、23.0%和1.5%)。最终的晶体学模型的Rwork和Rfree值分别为23.3%和29.3%,键长的rmsd为并且键角的rmsd为1.24°。
结构分析
使用Coot(Emsley等人2010)或PyMOL(分子图形***;DeLano Scientific公司:加利福尼亚州的帕罗奥图(Palo Alto,CA))程序进行结构覆盖。使用Coot和PROCHECK v3.3(Laskowski等人1992)程序评估最终精修模型的质量。通过CCP4程序套件(协同计算计划(Collaborative Computational Project),第4期,1994)的程序AREAIMOL鉴定在特斯多鲁单抗抗体结合后变得溶剂难以接近的人C5的残基。
结果:
整体结构:
人C5包含总共13个结构域。β链(前原C5的残基19至673,Uniprot条目P01031)由六个α-巨球蛋白样结构域(MG1-6)和一个接头结构域组成。α链(残基678至1676)包含C5a(过敏毒素)结构域、两个α-巨球蛋白样结构域(MG7、MG8)、一个CUB(“补体C1r/C1s、Uegf、Bmp1”)结构域、硫酯样TED/C5d结构域以及羧基末端C345C结构域。α链也贡献于MG6结构域并且通过该结构域内的二硫桥共价连接到β链上。
特斯多鲁单抗Fab结合C5α链,与CUB和TED/C5d结构域两者形成接触(图1)。CUB结构域具有β夹层折叠,并且大的α螺旋TED/C5d结构域***在CUB结构域的链β3与β4之间。连接TED/C5d结构域的最后α螺旋与CUB结构域的β4链的肽区段延伸穿过特斯多鲁单抗抗体的抗原结合位点,并且因此构成特斯多鲁单抗表位的一个关键成分。
人C5上的特斯多鲁单抗表位:
特斯多鲁单抗Fab与人C5形成1:1复合物,并且识别靶蛋白抗原上的不连续或“构象”表位,该表位总共包含6个肽区段(图1)。连接TED/C5d结构域的最后α螺旋(α12)与CUB结构域的β4链(残基1305-1310)的环在C5上的特斯多鲁单抗表位中起主要作用。此外,来自CUB结构域的三个其他肽区段贡献于表位:β1'-β2(残基947-950)、β5-β6(残基1327-1331)和β7-β8(残基1353-1354)环。TED/C5d结构域还为表位贡献两个以上的结构元件,即α2-α3环(残基1029-1033)和螺旋α11的氨基末端(残基1264-1265和1268)。
C5是具有在第741、911、1115和1630位的四个带注释的N连接糖基化位点的糖蛋白。通过X射线晶体学在第741和911位观察到这些糖基化位点中的两个(Fredslund等人2008)。所有四个位置都远离该表位,并且因此,预期C5抗原的糖基化状态不会影响特斯多鲁单抗结合。
人C5的TED/C5d与CUB结构域之间的连接在特斯多鲁单抗结合中起主要作用:
TED/C5d与CUB结构域之间的连接沿着特斯多鲁单抗的抗原结合位点的中心区大致平行于VH/VL交界面延伸。该肽区段的氨基酸序列是1305-Lys-Gln-Leu-Arg-Leu-Ser-1310。Lys1305和Arg1308的侧链指向抗体的互补决定区(CDR),并且最有可能促成强烈的静电相互作用。特别地,Arg1308潜入到抗原结合位点的中央腔,由抗体的L-CDR1、L-CDR3和H-CDR3高变环包绕。因此,该结构强烈表明Arg1308在特斯多鲁单抗识别和人C5结合中起主要作用,并且该残基是该蛋白质-蛋白质交界面的热点。
第885位的C5多态性不影响特斯多鲁单抗表位:
依库珠单抗是一种人源化抗人C5治疗性抗体,用于预防与PNH相关联的补体介导的溶血(Rother等2007)。已经在对依库珠单抗治疗显示出不良应答的患者中观察到人C5在第885位的两种遗传变体,即Arg885至His和Arg885至Cys变体(Nishimura等人2014)。这些C5变体是功能性的但不被依库珠单抗阻断。Arg885发现于C5的MG7结构域内。对特斯多鲁单抗Fab复合物的X射线结构的检查显示Arg885的位置远离特斯多鲁单抗表位(图2)。因此,特斯多鲁单抗的C5中和不受依库珠单抗无应答者中观察到的Arg885多态性的影响。
实例2:MAC形成C5证明特斯多鲁单抗而非依库珠单抗抑制突变型C5。
使用掺加有7ug/ml wt C5(Arg885)或突变型体C5(His885)的C5耗尽血清在Wieslab测定中测试特斯多鲁单抗和依库珠单抗。
结果显示,特斯多鲁单抗阻断,但依库珠单抗不阻断掺加有突变型C5的C5耗尽血清中的膜攻击复合物(MAC)形成。两种抗体在掺加有wt C5的血清中同样有效地抑制MAC形成。特斯多鲁单抗在掺加有正常或突变型C5的血清中同样有效。相反,依库珠单抗在掺加有突变型C5的血清中没有活性(图3)。
实例3:特斯多鲁单抗在C5变体和非变体PNH中显示出抗溶血作用。
已经进行了开放标记、单臂研究以测试C5变体和非变体PNH患者中的特斯多鲁单抗(20mg/kg静脉内,一周两次)。
方法:
为了确定对特斯多鲁单抗的药效动力学应答,可以测量患者血清在人血清-补体溶血测定中裂解抗体致敏的鸡红细胞的能力(Hillmen等人,新英格兰医学杂志2004;350:552-9)。在该测定***中,小于20%的残余溶血表明溶血完全阻断(Nishimura等人,新英格兰医学杂志2014;370;7)。
结果:
在平均治疗持续8.5周后,对5名患者(两名C5变体)进行分析。没有鉴定出重大安全问题(没有停止治疗、没有治疗相关的安全性不良事件)。在C5变体和非变体患者中均看到PNH中的抗溶血作用,如通过LDH从基线减少74%-91%所证明的(图4和5)。
Claims (19)
1.一种抗C5抗体或其抗原结合片段,用于在患者中预防或治疗补体相关疾病或病症,该患者具有在C5蛋白的MG7结构域内或在依库珠单抗表位内的突变或多态性,例如,补体C5蛋白中的p.Arg885多态性。
2.用于根据权利要求1所述使用的抗C5抗体或其抗原结合片段,其中所述抗C5抗体能够抑制具有p.Arg885多态性的患者中的补体激活。
3.用于根据前述权利要求中任一项所述使用的抗C5抗体或其抗原结合片段,其中所述抗C5抗体是人抗C5抗体。
4.用于根据权利要求3所述使用的抗C5抗体或其抗原结合片段,其中所述抗C5抗体是特斯多鲁单抗或其抗原结合片段。
5.用于根据前述权利要求中任一项所述使用的抗C5抗体或其抗原结合片段,其中所述患者具有p.Arg885His多态性。
6.用于根据权利要求1至4中任一项所述使用的抗C5抗体或其抗原结合片段,其中所述患者具有p.Arg885Cys多态性。
7.用于根据前述权利要求中任一项所述使用的抗C5抗体或其抗原结合片段,其中所述C5补体相关疾病是aHUS、PNH、骨髓衰竭、再生障碍性贫血或血栓形成,例如PNH。
8.一种抗C5抗体或抗原结合片段,用于在下述方法中作为药物使用,该方法包括向具有在C5蛋白的MG7结构域内或在依库珠单抗表位内的突变或多态性,例如p.Arg885多态性的患者给予有效量的能够抑制所述患者中的补体激活的抗C5抗体。
9.一种抗C5抗体或抗原结合片段,用于在治疗具有在C5蛋白的MG7结构域内或在依库珠单抗表位内的突变或多态性,例如在补体C5蛋白中的p.Arg885多态性的患者中的补体相关疾病或病症的方法中使用,其中该方法包括向所述患者给予有效量的抗C5抗体,并且其中所述抗C5抗体能够抑制所述患者中的补体激活。
10.抗C5抗体或抗原结合片段,用于在如权利要求8或9所述的方法中作为药物使用,其中所述方法包括由获自该患者的生物样品确定该患者的C5补体蛋白是否包含在该C5蛋白的MG7结构域内、在依库珠单抗表位内的突变或多态性、或p.Arg885多态性的步骤,其中该生物样品是从该患者分离的组织或流体。
11.一种抗C5抗体或抗原结合片段,用于在治疗有需要的患者中的补体相关疾病或病症的方法中使用,该方法包括:
a.从该患者获取生物样品
b.筛选所述患者的编码C5的基因中的突变或多态性
c.确定该患者是否具有在C5蛋白的MG7结构域内、在依库珠单抗表位内的突变或多态性、或在该C5补体蛋白中的p.Arg885多态性,
d.给予有效量的能够抑制至少具有如步骤c)中所定义的突变或多态性的患者中的补体激活的抗C5抗体,
其中该生物样品是从该患者分离的组织或流体。
12.抗C5抗体或抗原结合片段,用于在如权利要求9至11中所述的方法中使用,其中所述补体相关疾病或病症是C5补体相关疾病或病症,例如PNH或aHUS。
13.抗C5抗体或抗原结合片段,用于在如权利要求8至12所述的方法中使用,其中所述抗C5抗体是特斯多鲁单抗或其抗原结合片段。
14.一种抗C5抗体或抗原结合片段,用于在治疗PNH或aHUS的方法中使用,该方法包括:
a.由获自患者的生物样品确定该患者是否具有在C5蛋白的MG7结构域内、在依库珠单抗表位内的突变或多态性、或在该C5补体蛋白中的p.Arg885多态性,其中该生物样品是从该患者分离的组织或流体;并且
b.向所述患者给予有效量的特斯多鲁单抗或其抗原结合片段。
15.一种抗C5抗体或抗原结合片段,用于在有需要的患者中预防或治疗补体相关疾病或病症,例如PNH或aHUS,其中该患者对依库珠单抗治疗无应答。
16.用于根据权利要求14或15所述使用的抗C5抗体或抗原结合片段,其中该患者具有补体C5蛋白中的p.Arg885多态性。
17.特斯多鲁单抗或其抗原结合片段,用于预防或治疗PNH或aHUS。
18.抗C5抗体或其抗原结合片段用于制造用于在具有补体C5蛋白中的p.Arg885多态性的患者中预防或治疗补体相关疾病或病症,例如PNH或aHUS的药物的用途。
19.根据权利要求18所述的用途,其中该抗C5抗体是特斯多鲁单抗或其抗原结合片段。
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