CN109321548B - 一种Cas9蛋白、CRISPR/Cas9***、蘑菇基因编辑的方法及应用 - Google Patents

一种Cas9蛋白、CRISPR/Cas9***、蘑菇基因编辑的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了Cas9蛋白、CRISPR/Cas9***、蘑菇基因编辑的方法及应用。本发明根据杏鲍菇基因组密码子使用的偏好性对人源Cas9蛋白的密码子进行了优化而得到编码Cas9的核苷酸序列，并筛选得到的作为转录sgRNA的4个能够高表达U6snRNA基因的启动子，建立了内源基因突变引起抗性改变作为选择标记的遗传转化体系。本发明的实验结果表明，本发明所建立的体系能够成功高效地对于杏鲍菇基因pyrG进行缺失、***和敲除等编辑。本发明的基因编辑技术可以应用推广到除杏鲍菇以外的其它蘑菇品种，在蘑菇品种改良和代谢途径调控的中得以应用。

Description

一种Cas9蛋白、CRISPR/Cas9***、蘑菇基因编辑的方法及 应用
技术领域
本发明涉及一种基因编辑技术，特别涉及基因编辑技术中一种Cas9蛋白、CRISPR/Cas9***、蘑菇基因编辑的方法及应用。
背景技术
食用菌是可供食用的、具有大型的肉质的子实体或菌核组织的高等真菌等的总称。食用菌具有巨大的生物学活性，能够产生各种不同的次级代谢产物，在药物研究方面尤其发现新的活性物质具有极大的潜质。另外，与化学药物相比，从食用菌中提取天然产物具有低毒性和低副作用的特点，因此食用菌是一种潜在的天然药物资源。杏鲍菇(Pleurotuseryngii)属担子菌亚门，层菌纲，担子菌亚纲，伞菌目，侧耳科，侧耳属，它具有很高的药用价值。随着基础理论和应用技术研究的不断深入，在杏鲍菇中开发出一套高效的基因编辑技术便显得十分迫切。
随着人类生活水平的提高，人们对于食用菌这种同时具有天然的药物和保健功效的资源的需求量是巨大的。开发用于杏鲍菇遗传改造的新技术，对于揭示杏鲍菇重要药用作用机理及性状的遗传改良具有重要意义。基因编辑技术，在基因组原位实现对基因的精确、定点、可遗传修饰，是杏鲍菇遗传改良和分子设计的理想途径。
作为一个新兴的第三代人工核酸酶技术，由RNA介导的CRISPR-Cas9***凭借其***构建简单方便、打靶精准度髙、构建成本低、能同时对设计的多个位点进行定点编辑的各项优势，成为目前国内外研究的热门技术，已经成功地应用到植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞中。本研究探索了利用CRISPR-Cas9***对杏鲍菇基因组实施定点编辑的技术，搭建了杏鲍菇等蘑菇类基因组高效定点编辑的技术平台。
成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat,CRISPR)是细菌和古细菌在进化进程中形成的一种获得性自我免疫防御体系。CRISPR-Cas9***是通过选取一段入侵序列作为新的间区序列***到CRISPR-Cas9的基因座中，这段间区序列存在原型间隔序列毗邻基序(protospacer-associatedmotif,PAM)，利用CRISPR RNA(CRISPR-derived RNA，crRNA)和反式作用RNA(trans-activating RNA，tracrRNA)特异性地识别靶标序列，并利用Cas9蛋白在PAM序列上游的第3-4bp处剪切形成平末端，发生非同源末端修复(Non-homologous end joining,NHEJ)和同源末端修复(homology-mediated end joining,HR)。
目前存在的技术问题包括以下两点：(1)缺乏有效的筛选标记，常用的外源潮霉素抗性基因(hph)不能稳定整合到杏鲍菇基因组中，转化子在传代之后hph片段出现丢失，从而导致无法获得基因编辑后的转化子。(2)杏鲍菇是双倍体担子菌，用传统的同源重组的方法对基因敲除通常不能得到纯合子，因此现有技术给基因敲除带来了很大困难。(3)目前国内外还未有建立的杏鲍菇的基因定点编辑技术。
发明内容
发明目的：本发明提供一种Cas9蛋白，该Cas9蛋白可用于CRISPR/Cas9***。本发明还提供了利用该Cas9蛋白组成的CRISPR/Cas9***编辑目标基因组。本发明还建立了对蘑菇基因编辑的方法以及可进行基因编辑的蘑菇细胞株，该细胞株为丧失乳清苷-5'-磷酸脱羧酶功能的杏鲍菇尿嘧啶营养缺陷型菌株。
技术方案：为了克服现有技术的缺陷，本发明第一方面提供了一种Cas9蛋白，适用于CRISPR/Cas9体系，所述Cas9蛋白的编码序列如SEQ ID NO.3所示。本发明中使用的Cas9蛋白为依据蘑菇基因组密码子偏好性而优化出具有密码子简并性特征的人源Cas9蛋白。
本发明第二方面提供了编码上述Cas9蛋白的多核苷酸，序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明第三方面提供了表达载体，该表达载体含有编码Cas9蛋白的多核苷酸。
本发明第四方面提供了一种DNA基因组片段的编辑工具，为CRISPR/Cas9***，所述CRISPR/Cas9***包括上述的Cas9蛋白、编码Cas9蛋白的多核苷酸、含有Cas9蛋白的多核苷酸的表达载体；为了实现对DNA基因组片段的编辑，所述CRISPR/Cas9***还包含针对目标DNA片段的一个或多个sgRNA。
本发明第五方面提供了一种用于蘑菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体，所述CRISPR/Cas9载体为将Cas9蛋白、U6启动子、sgRNA的核苷酸序列装载到质粒上，得到用于编辑蘑菇基因的重组载体；所述U6启动子的核苷酸序列选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.7。
为了提高转录效率和基因编辑后的目标细胞株鉴定工作，在重组载体中还包括GFP核苷酸序列以及目标基因的左右同源臂核苷酸序列。
本发明第六方面提供了一种应用CRISPR/Cas9载体的U6启动子，所述U6启动子的核苷酸序列选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7。本发明鉴定出4个转录sgRNA的杏鲍菇U6snRNA启动子，可以高效地启动sgRNA的转录。
本发明第七方面提供了一种蘑菇细胞株基因组片段的编辑方法，将上述CRISPR/Cas9载体转染蘑菇细胞株，对蘑菇细胞株的目的基因进行编辑。
为了提高蘑菇细胞株基因组片段的编辑成功率和本发明的基因编辑工具的普适性，对目标细胞株进行抗性筛选，所述蘑菇细胞株为CbxR抗性细胞株。
所述CbxR抗性细胞株为对编码琥珀酸脱氢酶-铁硫蛋白亚基的sdhB基因序列中编码第240位组氨基酸进行了定点突变，突变后的sdhB基因序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明第八方面提供了一种可用于基因编辑的蘑菇细胞株，所述蘑菇细胞株为CbxR抗性细胞株，野生型琥珀酸脱氢酶-铁硫蛋白亚基的sdhB基因如SEQ ID NO.1所示，对编码琥珀酸脱氢酶-铁硫蛋白亚基的sdhB基因序列中编码第240位组氨基酸进行了定点突变(His to Leu,CAC to CTC)，突变后的sdhB基因序列如SEQ ID NO.2所示。
将本发明的基因组编辑的工具，对杏鲍菇的pyrG基因进行编辑。
筛选与pyrG基因N端的外显子上特异的一段DNA序列碱基互补的DNA序列，其特征符合5’-GGN(17)GG、5’-GGN(17)CGG或者5’-G(17)GGNGG的排列顺序，作为目的基因的sgRNA，上述的pyrG-sgRNA靶序列位于外显子上，并且序列是唯一的，其核苷酸序列如SEQID NO.8所示。
本发明利用上述sgRNA制备重组质粒，所述重组质粒通过以下方法得到：将Cas9蛋白(序列如SEQ ID NO.3所示)、U6启动子(核苷酸序列选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQID NO.6或SEQ ID NO.7)、sgRNA、pyrG Donor DNA(GFP片段)、pyrG左右同源臂序列装载到
Figure BDA0001842883480000031
-Blunt Zero Cloning Kit质粒上，得到重组质粒，将重组质粒转染杏鲍菇细胞株，对杏鲍菇细胞株的pyrG基因编辑
上述杏鲍菇细胞株经过如下处理：收集杏鲍菇菌丝，用灭菌的ddH2O洗两遍。配置水解杏鲍菇细胞壁的溶壁酶酶解液，对杏鲍菇菌丝进行酶解，得到杏鲍菇的原生质体进行转染。
进一步地，克隆得到了编码杏鲍菇琥珀酸脱氢酶-铁硫蛋白亚基的基因序列，对琥珀酸脱氢酶-铁硫蛋白亚基编码区第240位的组氨基酸进行了定点突变，连入
Figure BDA0001842883480000032
-Blunt Zero Cloning Kit质粒中，得到重组质粒，转染杏鲍菇菌株，得到CbxR抗性菌株，在利用CbxR抗性的杏鲍菇细胞株进行pyrG基因编辑。
有益效果：(1)本发明提供了一种优化的Cas9蛋白，该蛋白具有杏鲍菇基因组密码子偏好性，用于蘑菇细胞株的基因组编辑；(2)本发明提供了4个转录sgRNA的U6启动子，可以高效地启动sgRNA的转录；(3)本发明提供了一种用内源基因突变引起抗性改变作为杏鲍菇选择标记来完成筛选的体系，克服了常用的外源潮霉素抗性基因(hph)不能稳定整合到杏鲍菇基因组中从而导致不能稳定获得基因编辑过的转化子的缺陷；(4)本发明中提供了一种可以特异性定位pyrG基因的sgRNA，可靶向敲除pyrG基因。
附图说明
图1为本发明中杏鲍菇琥珀酸脱氢酶-铁硫蛋白亚基(SdhB)的定点突变测序示意图；
图2为本发明中CbxR抗性菌株的点菌示意图，结果表明，编码铁硫蛋白亚基(SdhB)的基因定点突变后，可在含有萎锈灵抑菌剂的培养基上生长；
图3为本发明中U6启动子转录sgRNA的片段结构示意图；
图4为本发明中构建的用于敲除杏鲍菇pyrG基因的sgRNA、优化的Cas9蛋白编码基因、需要***的外源GFP片段的重组质粒图；
图5为本发明中成功破坏杏鲍菇pyrG基因功能的点菌示意图，显示转化子不能在基础培养基(MM)中生长，说明pyrG基因功能缺失；而WT和pyrG转化子在添加UU(嘧啶核苷酸)的培养基中是可以正常生长。
具体实施方式
实施例1：运用内源基因突变引起抗性改变作为选择标记的杏鲍菇遗传体系的构建
1.1克隆编码杏鲍菇琥珀酸脱氢酶-铁硫蛋白亚基(SdhB)的基因序列(包括启动子和终止子，3015bp)连入质粒中(
Figure BDA0001842883480000041
-Blunt Zero Cloning Kit)，如SEQ ID NO.1所示。
1.2设计一对包含突变位点的反向互补的引物，引物序列如下，其中引物序列如下，其中Mutant-F和Mutant-R分别代表正、反向引物：
Mutant-F：GTTCCGCTGCCTCACCATCT
Mutant-R：AGATGGTGAGGCAGCGGAAC
1.3PCR体系为：高保真酶25μl；引物各2μl；水18μl；plasmid模板3μl。
1.4PCR反应条件为预变性95℃，5min；变性95℃，15s；退火56℃，15s；延伸72℃，2min；共32个循环；最后延伸5min。
1.5PCR反应后，取10μl PCR反应液；DpnI 1μl；10xT Buffer 2μl；水7μl。在20μl反应液中，37℃温度下反应1小时，之后70℃热处理15min，可使酶失活。
1.6将上一步的反应液直接转化大肠杆菌感受态细胞，涂板过夜；挑取重组正确的单菌落，摇菌12-15h，提取质粒，测序得到CbxR抗性质粒
Figure BDA0001842883480000051
-Blunt-Zero-sdhB，测序结果见SEQ ID NO.2。
1.7测序及结果证明在铁硫蛋白亚基(SdhB)的240位的组氨酸保守位点确实发生了点突变，由密码子CAC突变成CTC，杏鲍菇琥珀酸脱氢酶-铁硫蛋白亚基(SdhB)的定点突变示意图见图1。
1.8将表达
Figure BDA0001842883480000052
-Blunt-Zero-sdhB的质粒进行PEG介导的原生质体转染的方法进行转染，用萎锈灵抑菌剂来进行转化子的筛选。
1.9挑取转化子，提取其DNA，测序发现转染
Figure BDA0001842883480000053
-Blunt-Zero-sdhB质粒成功的转化子菌株确实可以在抗性萎锈灵平板上生长出来，结果见图2，并且测序正确。证明上述所建立的杏鲍菇内源转化体系是对杏鲍菇基因编辑的重要的筛选标记。
1.10以铁硫蛋白亚基(SdhB)240位组氨酸点突变对萎锈灵产生抗性的特征构建的内源转化体系对于后期编辑杏鲍菇相关基因是至关重要的，可以用这个内源转化体系作为编辑杏鲍菇相关基因的基础。
实施例2：转录sgRNA及表达Cas9蛋白的质粒构建
2.1人源Cas9蛋白密码子偏好性的优化
根据杏鲍菇基因组的编码序列分析出64种密码子编码相应氨基酸的偏好性，对人源Cas9蛋白进行密码子的重新排列，最终优化出能够在杏鲍菇中稳定表达的Cas9蛋白的序列信息，如SEQ ID NO.3所示。
2.2杏鲍菇高表达启动子Pgpd启动子的克隆
引物为：
Pgpd-R:AGTCACAAGGGATGGGTGGT
Pgpd-F：GCGAACACTCAAAGCAAAG
PCR体系为：高保真酶25μl；引物各2μl；水18μl；WT模板3μl。
PCR反应条件为：预变性95℃，5min；变性95℃，15s；退火56℃，15s；延伸72℃，2min；共32个循环；最后延伸5min。
2.3构巢曲霉trpC终止子的克隆
引物为：
trpC-F:AAAGCCTTCGAGCGTCCCA
trpC-R:TCCTGCCCGTCACCGAGAT
PCR体系为：高保真酶25μl；引物各2μl；水18μl；plasmid模板3μl。
PCR反应条件为：预变性95℃，5min；变性95℃，15s；退火56℃，15s；延伸72℃，2min；共32个循环；最后延伸5min。
2.4融合PCR
将Pgpd启动子、优化过的杏鲍菇偏好性的人源Cas9蛋白、构巢曲霉trpC终止子三段融合，连入
Figure BDA0001842883480000061
-Blunt Zero Cloning Kit质粒中，形成重组质粒
Figure BDA0001842883480000062
-BluntZero-Pgpd-Cas9-trpC。
2.5 sgRNA靶点的选定
sgRNA在pyrG基因上的靶序列位于pyrG基因靠近N端的外显子上，如SEQ ID NO.8所示。
2.6 sgRNA启动子Pol III RNA聚合酶类启动子的鉴定
从杏鲍菇自身的基因组中鉴定出4个U6snRNA启动子(promoter)，序列如SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
2.7 sgRNA拼接片段(scaffold)的克隆。
从PX330质粒(plasmid)上扩增sgRNA scaffold。
sgRNA scaffold-F：GTTTTAGAGCTAGAAATAGC
sgRNA scaffold-R：AAAAAAGCACCGACTCGGTGCC
2.8根据U6启动子、sgRNA scaffold两个片段测定的浓度，将U6启动子、sgRNAscaffold等比例混合，融合PCR将两个片段连到一起组成U6-sgRNA-scaffold片段，如图3所示，在融合片段两端加上NotI酶切位点形成NotI-U6-sgRNA-scaffold-NotI片段。
2.9
Figure BDA0001842883480000063
-Blunt Zero-Pgpd-Cas9-trpC的NotI位点的单酶切。
2.10将
Figure BDA0001842883480000064
-Blunt Zero-Pgpd-Cas9-trpC的NotI位点的单酶切片段和2.9所述的NotI-U6-sgRNA-scaffold-NotI片段进行重组连接。
2.11重组体系如下：
4μl单酶切载体
Figure BDA0001842883480000065
-Blunt Zero-Pgpd-Cas9-trpC
1μl NotI-U6-sgRNA-scaffold-NotI片段
2μl 5xCE II Buffer
1μl
Figure BDA0001842883480000071
重组酶
补水至10μl，37℃孵育30min，直接转化大肠杆菌感受态细胞，涂板过夜；挑取重组成功的单菌落，摇菌12-15h，提取质粒
Figure BDA0001842883480000072
-Blunt Zero-Pgpd-Cas9-trpC-U6-sgRNA-Scaffold。
2.12克隆需要编辑基因(pyrG)位点的左右同源臂(Donor)DNA片段，左同源臂序列如SEQ ID NO.17所示，右同源臂序列如SEQ ID NO.18所示，需要编辑基因位点两端接入同源臂序列。
2.13融合PCR将pyrG左同源臂、GFP片段、pyrG右同源臂三段融合，序列为以pyrGDonor DNA(GFP片段)作为模板修复***的GFP片段，结果如图SEQ ID NO.19所示。左右臂分别带上speI接头形成speI-pyrG左臂-GFP-pyrG右臂-speI。
2.14质粒
Figure BDA0001842883480000073
-Blunt Zero-Pgpd-Cas9-trpC-U6-sgRNA-Scaffold的speI位点的单酶切。
2.15
Figure BDA0001842883480000074
-Blunt Zero-Pgpd-Cas9-trpC-U6-sgRNA-Scaffold的speI位点的单酶切片段和speI接头的上述2.13中pyrG左臂-GFP-pyrG右臂)的重组。
2.16重组体系如下：
4μl单酶切载体
Figure BDA0001842883480000075
-Blunt Zero-Pgpd-Cas9-trpC-U6-gRNA-Scaffold
1μl长同源臂pyrG Donor DNA(GFP片段)
2μl 5xCE II Buffer
1μl
Figure BDA0001842883480000076
重组酶
补水至10μl，37℃孵育30min，直接转化大肠杆菌感受态细胞，涂板过夜；挑取重组成功的单菌落，摇菌12-15h，提取质粒
Figure BDA0001842883480000077
-Blunt Zero-Pgpd-Cas9-trpC-U6-sgRNA-Scaffold-pyrG-Donor-DNA(GFP片段)，构建的重组质粒图见图4。
实施例3：杏鲍菇pyrG基因敲除的营养突变型菌株的获取
实施例2中
Figure BDA0001842883480000078
-Blunt-Zero-Pgpd-Cas9-trpC-U6-gRNA-scaffold-pyrG-Donor-DNA(GFP片段)的质粒进行PEG介导的原生质体转染的方法进行转染。
3.1 PEG介导的原生质体转染的方法如下：
3.1.1收集杏鲍菇菌丝，用灭菌的ddH2O洗两遍。
3.1.2配置水解杏鲍菇细胞壁的溶壁酶酶解液，并且过滤除菌，将收集的菌丝转入酶解液中，在摇床里以28℃，80rpm转速酶解3.5h左右。
3.1.3酶解结束后，将产物转入50ml离心管中，加入10ml Trapping Buffer，5000rpm，4℃离心15min。
3.1.4离心后将白色的原生质体层，用移液枪将其轻轻吸至另一个50ml离心管中，加入同等体积的STC Buffer，5000rpm，4℃离心10min。
3.1.5除去上清液，加入1ml STC Buffer混匀原生质体，放入冰箱备用。
3.1.6用移液枪将体积为100μl的原生质体和真空浓缩后的质粒
Figure BDA0001842883480000082
-Blunt-Zero-Pgpd-Cas9-trpC-U6-gRNA-scaffold-pyrG-Donor-DNA(GFP片段)轻轻混匀，在冰上放置50min，加入1.25ml PEG溶液，室温放置25min，加入10ml转化上层培养基，倒入提前倒好的下层培养基，28℃培养15天。
3.2挑选pyrG被编辑的转化子，在基础培养基上(MM)进行点菌，点菌结果见图5所示，表明转化子不能在基础培养基(MM)中生长，说明pyrG基因功能缺失；而WT和pyrG被编辑的转化子在添加UU(嘧啶核苷酸)的培养基中是可以正常生长的。
3.3对转化子进行提取DNA测序分析，对目的基因的编辑位点进行分析，分析结果见表1。
表1定点编辑杏鲍菇pyrG基因发生非同源末端修复的营养缺陷型菌株的测序结果
Figure BDA0001842883480000081
Figure BDA0001842883480000091
根据表1的测序结果发现：杏鲍菇pyrG基因编码的乳清苷-5'-磷酸脱羧酶(OMPDC)能够把培养基中含有的乳清酸转变为嘧啶核苷酸，所以损坏pyrG基因功能的杏鲍菇不能够在基础培养基(MM)上正常地生长。一共挑选30个转化子，转化子测序结果证明了pyrG基因确实在预期的编辑靶点完成了***和缺失等不同类型的编辑，如SEQ ID NO.9-16所示，在Cas9蛋白的切割位点CGCTGTA，检测到25个引起移码突变的突变子(非同源末端修复的突变子有10个，同源末端修复***GFP序列的突变子有15个)，突变率为83.3％，其中部分转化子的测序结果如表1所示，表明靶基因pyrG在sgRNA靶向的序列位置出现了***和缺失，导致pyrG基因发生了移码突变，说明基因敲除是成功的。
本发明中针对靶向识别序列互补配对的DNA序列为SEQ ID NO.8，由此招募而来的Cas9蛋白序列为SEQ ID NO.3，依据杏鲍菇基因组密码子偏好性而优化的Cas9蛋白在设计的靶标位点进行定点精准编辑。说明优化的U6-Cas9体系可以高效编辑杏鲍菇pyrG等一系列基因，并且编辑效率非常高。
序列表
<110> 南京师范大学
<120> 一种Cas9蛋白、CRISPR/Cas9***、蘑菇基因编辑的方法及应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3015
<212> DNA
<213> 杏鲍菇sdhB基因(Pleurotus eryngii-sdhB gene)
<400> 1
tggctccctt agtcacatac tgtcaaggct cttttagaga acttttctca agcagcgtga 60
aagcctagtt ggtatcgacg aaagcggaaa gataccaaga tatcacggca ttcgtagctt 120
cgccgaggga atgacatagg cgggtataac ctcctttgag ttgagacgaa agtgtggctt 180
caaactcacg tcctcaataa gcgctcgcga catcgcggat tcacatcaca ccactctcca 240
agaatctctc gttcaaaggt atcctgtatt tgtaagtcaa gccaacgttt attccatgat 300
acaaggctgg ccacattcat ggtattctct ccgtaaatag ccatttacca cccatgacac 360
gacatattcg gattcctgcc gcttgtgaac caaccgttca actgtgcaaa cgctaataca 420
tggcttctga gactcccaac gttgtttgga gaaaaattct caaaaacggc tgccgaagac 480
ctaagccagt gttgctccta cattttctca acactcgata gaagctgcaa ctaggtcaac 540
aaagttggca ttccatcgcc tttgactaca aattgattcg gggggttcga cgatggacac 600
catgagcgag ctttgtccgt tacgacgaga acatccgaag tcccatcctc tcctgaactc 660
ttcaagacca ccattcaagg gaatttcgag gtctcggagc gccgttgaac ccaggttttc 720
gggtgacacc tcaattgctt tccccctttt ctgaccagag tccccgaggt acagcccggg 780
tacggcacat attctacctt gtaaacctca ctcataacgt tccgaggaga gtggcatcac 840
acagcgcgct ggcctaatag tggtgtcaag ttggaaggga agcgagtcgg ggtcattggg 900
actggggcca gcgccgagtt cagatcatcc aagaagcagg caaattggca caagggctcg 960
tggtattcca gcgtacaccg aatctgacat tccgcttgcg acaacccacg caagccaaag 1020
tgtcagaagt tgtcgaaatg caatggaatc atgttcacga agaggccttg ggtagtgacc 1080
ctatcaggta aacaagtatc gtcgatttct tgacacttct agctgctccg tccacgtgta 1140
taccttcgac tcaccattga agagcatgat gggcgcaaag attacgttct atcgctcttc 1200
tctctttact ttgataatcg aaagctgcac tactcagcgc cgcaattata catgtttttc 1260
taaaaatcta ccgactcacc gctgacgcgc tgacggccgg taagcttcaa gtaacctgca 1320
gttccaatcg ggcaatttca aagtgtgccg gcatttaccg aagagtaaca tgcgccctct 1380
gattggttcg gatcgcgagg gctcctttcc cgctccgaat tcacgcgacg ggatcccgcc 1440
gcatctctcc tcttcaccgt cgtcgttgac gtccccgaaa cacagaaatc accgaatcat 1500
gcaggcgctc acctccaggt cgttggctcg ctcaccccgc tcgattcgtt ctttctccac 1560
ttcgtgtgga aggtggcagg ctgagctcct ccagaagccc gttctccaga aagaattcaa 1620
gatctaccgt tgggtgagct gagacgcttg tgtatccaga tgtgttgctc acattgtggc 1680
acagaatccg gatgaaccag ccaagaagcc tcatctccaa tcgtacacca ttgacttgaa 1740
ccagacgggc cccatggtac gtacaattcc aaggcgattg tctctatgct cacgggctcg 1800
tagattctgg acgctcttat caagatcaag aacgaaatcg atcctacgct cacattccgt 1860
cgttcgtgta gagaagggat ttgcggctcg tgcgcgatga atattgacgg acagaacacg 1920
ttggcttgcc tgtgccgaat tgaccgtaac gccagcaagg acagcaagat ctaccctttg 1980
ccgcacagta tgacatgtct tttggttcct aatagcattg actgacggtc agttacagtg 2040
tacatcgtga aagacctcgt acccgacctc acacttttct acaagcagta caagtccatc 2100
aagccttacc tgcagaacga caatgtcccc gagagggagc acctccagtc gccagaggac 2160
cgcaagaagc tggacgggat gtatgaatgc atcctgtgcg cgtgctgcag cacatcgtgt 2220
cccagctatt ggtggaacca agatgagtat ttggaccggc tgctttgatg gccgcgtata 2280
ggtggattgc ggactcacga gtgcgttatg ttgccgtcga tacatgctct cattcatagt 2340
ctaacatttc gcaggatacg tatggcgcac aacgcaagga acatttccag aatgagatga 2400
gtttgttccg ctgcctcacc atcttcaatt gtacgtcgct ttcgccttga tatggattgg 2460
ctgttaatca tatcccttct caaggctctc gcacttgtcc aaagggcctc aaccctgcga 2520
aagccattgc agagatcaag ctcgcgctcg ctactgagta aaccctagtc aacagccacg 2580
gatcaaaagc attaagtcag aggcagattt ctttcctgta gcagttcgca gttcttttca 2640
cttcatcgta tggtgtccat tgcagacatc taatcatatt cattctatca catccacttg 2700
ttcttgagcc actcttaagg taggcatacc ctcggtctca cttgcggtgc tgtacgaaac 2760
aagaacggat acatattcta tattctatgg gacatctaac gactcaggca attcatagtc 2820
tactaggctc aacatcgaga gcgaagaagg gatacgacgt gtagccgtcg gagtccacgc 2880
tgccaggtct gtagtaatcc tttctatcac ctttttccac ttgccaatca ttcttcagtc 2940
gcagcggcaa atcgggctat cgtccagcac tcgaactcag ccaacacctc tcctcaggac 3000
gaaggaaggc ttacg 3015
<210> 2
<211> 3015
<212> DNA
<213> 杏鲍菇sdhB基因(Pleurotus eryngii-sdhB gene)
<400> 2
tggctccctt agtcacatac tgtcaaggct cttttagaga acttttctca agcagcgtga 60
aagcctagtt ggtatcgacg aaagcggaaa gataccaaga tatcacggca ttcgtagctt 120
cgccgaggga atgacatagg cgggtataac ctcctttgag ttgagacgaa agtgtggctt 180
caaactcacg tcctcaataa gcgctcgcga catcgcggat tcacatcaca ccactctcca 240
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acaaggctgg ccacattcat ggtattctct ccgtaaatag ccatttacca cccatgacac 360
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tggcttctga gactcccaac gttgtttgga gaaaaattct caaaaacggc tgccgaagac 480
ctaagccagt gttgctccta cattttctca acactcgata gaagctgcaa ctaggtcaac 540
aaagttggca ttccatcgcc tttgactaca aattgattcg gggggttcga cgatggacac 600
catgagcgag ctttgtccgt tacgacgaga acatccgaag tcccatcctc tcctgaactc 660
ttcaagacca ccattcaagg gaatttcgag gtctcggagc gccgttgaac ccaggttttc 720
gggtgacacc tcaattgctt tccccctttt ctgaccagag tccccgaggt acagcccggg 780
tacggcacat attctacctt gtaaacctca ctcataacgt tccgaggaga gtggcatcac 840
acagcgcgct ggcctaatag tggtgtcaag ttggaaggga agcgagtcgg ggtcattggg 900
actggggcca gcgccgagtt cagatcatcc aagaagcagg caaattggca caagggctcg 960
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tgtcagaagt tgtcgaaatg caatggaatc atgttcacga agaggccttg ggtagtgacc 1080
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taccttcgac tcaccattga agagcatgat gggcgcaaag attacgttct atcgctcttc 1200
tctctttact ttgataatcg aaagctgcac tactcagcgc cgcaattata catgtttttc 1260
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ctaacatttc gcaggatacg tatggcgcac aacgcaagga acatttccag aatgagatga 2400
gtttgttccg ctgcctcacc atcttcaatt gtacgtcgct ttcgccttga tatggattgg 2460
ctgttaatca tatcccttct caaggctctc gcacttgtcc aaagggcctc aaccctgcga 2520
aagccattgc agagatcaag ctcgcgctcg ctactgagta aaccctagtc aacagccacg 2580
gatcaaaagc attaagtcag aggcagattt ctttcctgta gcagttcgca gttcttttca 2640
cttcatcgta tggtgtccat tgcagacatc taatcatatt cattctatca catccacttg 2700
ttcttgagcc actcttaagg taggcatacc ctcggtctca cttgcggtgc tgtacgaaac 2760
aagaacggat acatattcta tattctatgg gacatctaac gactcaggca attcatagtc 2820
tactaggctc aacatcgaga gcgaagaagg gatacgacgt gtagccgtcg gagtccacgc 2880
tgccaggtct gtagtaatcc tttctatcac ctttttccac ttgccaatca ttcttcagtc 2940
gcagcggcaa atcgggctat cgtccagcac tcgaactcag ccaacacctc tcctcaggac 3000
gaaggaaggc ttacg 3015
<210> 3
<211> 4272
<212> DNA
<213> 杏鲍菇Cas9蛋白的基因序列(Pleurotus eryngii Cas9 protein gene)
<400> 3
atggactaca aggaccacga cggcgactac aaggatcacg acatcgacta caaagacgac 60
gacgacaaga tggcgcccaa gaagaagcgc aaggtcggca tccacggcgt ccccgcagct 120
gacaagaaat actccatcgg cctggacatc ggcaccaaca gcgtcggatg ggctgttatc 180
accgacgaat acaaagtccc atccaagaag ttcaaggtcc tcggtaacac cgacagacac 240
tccatcaaga agaacctcat cggagctctc ctcttcgact ccggagaaac cgctgaagcc 300
accagactca aaagaaccgc ccgccgccgc tacacccgca gaaaaaaccg catctgctac 360
ctccaagaaa tcttctccaa cgaaatggct aaggtcgacg actccttctt ccaccgcctc 420
gaagaatcct tcctcgtcga agaagacaag aagcacgaac gccaccctat cttcggcaac 480
atcgtcgacg aagtcgctta ccacgaaaag taccctacca tctaccacct ccgcaagaag 540
ctcgtcgact ccaccgacaa ggctgacctc cgcctcatct acctcgctct cgctcacatg 600
atcaagttcc gcggccactt cctcatcgaa ggcgacctca accctgacaa ctccgacgtc 660
gacaagctct tcatccaact cgtccaaacc tacaaccaac tcttcgaaga aaaccctatc 720
aacgcttccg gcgtcgacgc taaggctatc ctctccgctc gcctctccaa gtcccgccgc 780
ctcgaaaacc tcatcgctca actccctggc gaaaagaaga acggcctctt cggcaacctc 840
atcgctctct ccctcggcct cacccctaac ttcaagtcca acttcgacct cgctgaagac 900
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gaacacatcg ctaacctcgc tggctcccct gctatcaaga agggcatcct ccaaaccgtc 2340
aaggtcgtcg acgaactcgt caaggtcatg ggccgccaca agcctgaaaa catcgtcatc 2400
gaaatggctc gcgaaaacca aaccacccaa aagggccaaa agaactcccg cgaacgcatg 2460
aagcgcatcg aagaaggcat caaggaactc ggctcccaaa tcctcaagga acaccctgtc 2520
gaaaacaccc aactccaaaa cgaaaagctc tacctctact acctccaaaa cggccgcgac 2580
atgtacgtcg accaagaact cgacatcaac cgcctctccg actacgacgt cgaccacatc 2640
gtccctcaat ccttcctcaa ggacgactcc atcgacaaca aggtcctcac ccgctccgac 2700
aagaaccgcg gcaagtccga caacgtccct tccgaagaag tcgtcaagaa gatgaagaac 2760
tactggcgcc aactcctcaa cgctaagctc atcacccaac gcaagttcga caacctcacc 2820
aaggctgaac gcggcggcct ctccgaactc gacaaggctg gcttcatcaa gcgccaactc 2880
gtcgaaaccc gccaaatcac caagcacgtc gctcaaatcc tcgactcccg catgaacacc 2940
aagtacgacg aaaacgacaa gctcatccgc gaagtcaagg tcatcaccct caagtccaag 3000
ctcgtctccg acttccgcaa ggacttccaa ttctacaagg tccgcgaaat caacaactac 3060
caccacgctc acgacgctta cctcaacgct gtcgtcggca ccgctctcat caagaagtac 3120
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<210> 4
<211> 695
<212> DNA
<213> 杏鲍菇U6启动子1(Pleurotus eryngii U6 Promoter1)
<400> 4
cccatatgag catcttgatc aaccaacgaa ggccaagtgg ggcacaggtc ttctaccgtc 60
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caacaagagt acggtgcgca agtacggtga gagagtcaag actgcgcgcg attcgagccc 600
acgtgctacc aggcactgcc actgtgatcg aacccagtga gctggacaaa acacagcact 660
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<210> 5
<211> 453
<212> DNA
<213> 杏鲍菇U6启动子2(Pleurotus eryngii U6 Promoter2)
<400> 5
gacctccgcc aactatacat ctaagcacac gccttggaaa atccaagtct ggagaggcga 60
ggacgggttt gttaagagaa tggtgaatgt tgatagtctt gttgtgtcgc ccagtcctgt 120
tgaaaagtta ctccaccccc gttctgaata ttgcagtcaa cctaacacac aggtacgcgt 180
aaagtattta cgccttcgtg acctatcgaa tgttccacgg ccccaaactt ccatgctcta 240
tcaggtacag acacaatcaa acttccgtga tatacgtgcc attcttgaca agtttcctca 300
ggaaatagat caagtcgaaa atacccctac acaaggacag acaataggta tcgcaatgag 360
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tgttgtatcc agtcaacacg agcaacaact att 453
<210> 6
<211> 707
<212> DNA
<213> 杏鲍菇U6启动子3(Pleurotus eryngii U6 Promoter3)
<400> 6
agaaagccca gagttaccgt cagtcattgt cagcaccact gcttgtcaat gtcaatcgct 60
tcttgttgtt cctatatata tactagggat cgcccggcgg cgcttcaaaa tataccttgc 120
gtgggttggc atctcggttt cagtcctgct gcctccgttg ttttgcacac ccatctgtgt 180
cgaacgtcct gctttccaga atcccgcaca gcctcggagc atttcccaac gtctttctgg 240
gttgttatgg taggatacca ttcatttgcc gcgtccatac agaacgttgc tgttgacacg 300
gcacccgagt gaggatctct attccgaaga tgcaaggttg gcggcgctca acaaagatac 360
tgcgcagaag ttcggcaagc agtagggggg actcagagat tcagtgaagg gaacagtaca 420
ttgcgagcga cagtgcaggg agcattcctg tatacaagat taatattatt gtatgaatgt 480
aaattaggtg tgacttctga gggagcgtgg tagcgttgac gaccaccagc gcttcaaacg 540
tgggaatgtg cttgttgaga atcccgacga attgggcgag ttccagggag ggggacctag 600
ctttccaagc aaggtaatat atatataggg gtacacgtga tggacttcgc gaactgaaca 660
aaatacgaag ctcaggtcca gggctccttc ttcatacatt aattaat 707
<210> 7
<211> 793
<212> DNA
<213> 杏鲍菇U6启动子4(Pleurotus eryngii U6 Promoter4)
<400> 7
gcgtgtcatc cttgcgcagg ggccatgcta atcttctctg tatcgttcca attttttcgt 60
atgtcacccc gaaggggaca atagttgttg ctcgtgttga ctggatacaa catgacttgt 120
gcgttttgtt cagcgcgcga gcttcccagg ggtacccgcc aactgaaagg ggctcattgc 180
gattacctat tgtctgtcct tgtgtagggg tattttcgac ttgatctatt tcctgaggaa 240
acttgtcaag aatggcacgt atatcacgga agtttgattg tgtctgtacc tgatagagca 300
tggaagtttg gggccgtgga acattcgata ggtcacgaag gcgtaaatac tttacgcgta 360
cctgtgtgtt agttgactgc aatattcaga acgggggtgg agtaactttt caacaggact 420
gggcgacaca acaagactat caacattcac cattctctaa caaacccgtc ctcgcctctc 480
cagactggat ttttccaagg cgtgtgctta gatgtatagt tggcggaggt ctcgcggacg 540
agctgttcgt tgatttctat accgattcca ggacctgcga aacaaggcgt cagatataaa 600
gtcttagaca acgaagatgc agttgacttg ccatggagca acccaagatg gccttccttg 660
atctcaaaca ccgatgggtg cgaaaggtag gtgtacaagt cagcctcttg atcactttca 720
ggagatacat tgtagtgtat ctatgcaatt acaatatgtt actgcgttaa gcaacgggag 780
tgtgtgataa cgc 793
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 杏鲍菇pyrG基因的靶标位点(Pleurotus eryngii pyrG sgRNA)
<400> 8
ggcaatcatc gacgctgta 19
<210> 9
<211> 920
<212> DNA
<213> WT型杏鲍菇pyrG基因(wild type Pleurotus eryngii pyrG)
<400> 9
atgagctcaa agggagtcca ggcattgtca tatgtccaaa gggctgacaa ctacaccaat 60
cctgctgcga aggaactgct tctcaccatg gaacgcaaga agtccaacct ttccgttagc 120
gtggatgtga cgaaatcaag agatttcctg gcaatcatcg acgctgtagg gccatatgcc 180
tgtttaatca aggtaaaccg acctcatttg ttgcacaata ctcgggatct gatgcccaga 240
tctgcgaaag actcatgttg atatacttga agattttgac tttacgttga ttgaaagctt 300
gcaagctttg agcaaaaaac atgacttcat gatcttcgag gacagaaagt ttgcagacat 360
aggtgccact cttcgtagct caacttgaat cgccgttcac agcgcttgta ggaaacaccg 420
ttgcgttaca gtattcaagt ggcgtgcatc gcatcgcgag ttggtcgcag atcacgaatg 480
cccactcagt ccctggtcca tccatcgtcg cagggctttc ttcagtaggc ttacccctcg 540
gacggggtct cctcctcttg gcagaaatga gcacggcggg aaaccttgct gtgggccaat 600
acacagaaga gacttatcag atggctcgcg atcaccggga cttcgtaatc gggttcattg 660
gacaaagacg cccatctggc gagggagatg aggatttcct agtcctgaca cccggagtag 720
gattggatgt gaaggcagat ggtatggggc agcagtacag aacgcctcgc gaagtcatct 780
tggaatcagg ttgcgatgtg attattgtag gacgagggat atatgggaaa gattacagct 840
tgactgaagc catcgctcag caagcggaga ggtaccggga atcggggtgg agcgcatact 900
tagaaaggtg taaatcgtaa 920
<210> 10
<211> 54
<212> DNA
<213> 杏鲍菇pyrG基因片段转化子1(Pleurotus eryngii pyrG gene segmenttransformant 1)
<400> 10
aatcaagaga tttcctggca atcatcgacc gcttgtaggg ccatatgcct gttt 54
<210> 11
<211> 51
<212> DNA
<213> 杏鲍菇pyrG基因片段转化子2(Pleurotus eryngii pyrG gene segmenttransformant 2)
<400> 11
aatcaagaga tttcctggca atcatcgacg gtagggccat atgcctgttt a 51
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> 杏鲍菇pyrG基因片段转化子3(Pleurotus eryngii pyrG gene segmenttransformant 3)
<400> 12
aatcaagaga tttcctggca atgtagggcc atatgcctgt tta 43
<210> 13
<211> 46
<212> DNA
<213> 杏鲍菇pyrG基因片段转化子4(Pleurotus eryngii pyrG gene segmenttransformant 4)
<400> 13
aatcaagaga tttcctggca atcattgtag ggccatatgc ctgttt 46
<210> 14
<211> 46
<212> DNA
<213> 杏鲍菇pyrG基因片段转化子5(Pleurotus eryngii pyrG gene segmenttransformant 5)
<400> 14
aatcaagaga tttcctggca atcatgtagg gccatatgcc tgttta 46
<210> 15
<211> 120
<212> DNA
<213> 杏鲍菇pyrG基因片段转化子6(Pleurotus eryngii pyrG gene segmenttransformant 6)
<400> 15
aatcaagaga tttcctggca atcatcgacg ctaataatat taatcttgta tacaggaatg 60
ctccctgcac tgtcgctcgc aatgtactgt tcccttcacg tagggccata tgcctgttta 120
<210> 16
<211> 173
<212> DNA
<213> 杏鲍菇pyrG基因片段转化子7(Pleurotus eryngii pyrG gene segmenttransformant 7)
<400> 16
aatcaagaga tttcctggca atcatcgacg ctaaagctcg aggaacggac agtaactctg 60
cccgatccca aaccgaagct gaaactagca cacaaaccta tcattgagac tataggtgat 120
actaacgcgg aaaagtcgag cttgaattcg aagtagggcc atatgcctgt tta 173
<210> 17
<211> 923
<212> DNA
<213> 杏鲍菇pyrG基因左同源臂序列(Pleurotus eryngii pyrG Upstream homologoussequence)
<400> 17
gaatcaaggc tcacctctgc tttataatcc cctcgatctg ggagactccg cgaccgacgt 60
attctgatat ccctacatca gtctctctga acttgtaccc agagccgtct tcagccttct 120
caggtcgagg tacgcctagg agaacgtggc ttgggggtag aatgtcgtcg gcatgcccat 180
ctttgggcgg ggcagtatct gtcgtgactt cgggatcgga ttcctcggaa ggggacgtgg 240
gttctagaga atcctctaat ctagcacgtt ttgaggcgcg ttcaagactc tccgcctcgg 300
cttcgtgttt gagagacatg atcgaagtta ttttgcgaga tggcaagatc acgcgccaga 360
ttgaactcga accatcacca tctcgaggtt tcccacggtt gactcccagt tctcgaggct 420
catcgtcagc cacgcacagg cttccaatgc ctctcttgca ctacgacgac gaggaaaggc 480
agcatggtct cctgccaggg ggtgcttctt ctttaaggag cttaaatgaa gttcacgccc 540
tctgagtcct ggaagggcta tagacttcct ggtgtcggtg ctcccttggt aaaggagctt 600
aaactgggta tatccacgcc tgagtcctgg aatgatgaaa cttccttcgc tatgcctcta 660
tgtccaacac taccttacca accattatca tgcccaccgt ccttgcctgc agcgttaatt 720
cgttgtactc aacccgtacc gcgtcttagt agctttagca tacctgctgc ggtatataaa 780
tgcagacatt aatgaaaata aaaataaaag gcatgatcac gcgcttagta gatgttagat 840
ttcacagccc ctgtctttca ccaaaacgtc ggagccatgt cgaaggttca tccacttccc 900
gaaggcacct actttcaacc atc 923
<210> 18
<211> 996
<212> DNA
<213> 杏鲍菇pyrG基因右同源臂序列(Pleurotus eryngii pyrG downstreamhomologous sequence)
<400> 18
ccgacctcat ttgttgcaca atactcggga tctgatgccc agatctgcga aagactcatg 60
ttgatatact tgaagatttt gactttacgt tgattgaaag cttgcaagct ttgagcaaaa 120
aacatgactt catgatcttc gaggacagaa agtttgcaga cataggtgcc actcttcgta 180
gctcaacttg aatcgccgtt cacagcgctt gtaggaaaca ccgttgcgtt acagtattca 240
agtggcgtgc atcgcatcgc gagttggtcg cagatcacga atgcccactc agtccctggt 300
ccatccatcg tcgcagggct ttcttcagta ggcttacccc tcggacgggg tctcctcctc 360
ttggcagaaa tgagcacggc gggaaacctt gctgtgggcc aatacacaga agagacttat 420
cagatggctc gcgatcaccg ggacttcgta atcgggttca ttggacaaag acgcccatct 480
ggcgagggag atgaggattt cctagtcctg acacccggag taggattgga tgtgaaggca 540
gatggtatgg ggcagcagta cagaacgcct cgcgaagtca tcttggaatc aggttgcgat 600
gtgattattg taggacgagg gatatatggg aaagattaca gcttgactga agccatcgct 660
cagcaagcgg agaggtaccg ggaatcgggg tggagcgcat acttagaaag gtgtaaatcg 720
taaaaaggtg taaatcgtaa ttgatccatt acacccttgc aaactagaaa agcgtatatc 780
tgcacagaca gtctatcggc cacttcaggc ttttgtcgta gaagaaagga aaataacgta 840
caaagagtgg tttccgctta acccgcccta ttgatttggt tcgtattgta cacatggcgc 900
agctcaatca tcgatatcga agacatcttc attatcttgt ttcgaccgtg aagcggacga 960
aaccttgtaa agctgatcta tctggtttgt tggcgc 996
<210> 19
<211> 2636
<212> DNA
<213> 杏鲍菇pyrG基因左右同源臂***GFP序列(Pleurotus eryngii pyrG genehomologous sequence and GFP)
<400> 19
gaatcaaggc tcacctctgc tttataatcc cctcgatctg ggagactccg cgaccgacgt 60
attctgatat ccctacatca gtctctctga acttgtaccc agagccgtct tcagccttct 120
caggtcgagg tacgcctagg agaacgtggc ttgggggtag aatgtcgtcg gcatgcccat 180
ctttgggcgg ggcagtatct gtcgtgactt cgggatcgga ttcctcggaa ggggacgtgg 240
gttctagaga atcctctaat ctagcacgtt ttgaggcgcg ttcaagactc tccgcctcgg 300
cttcgtgttt gagagacatg atcgaagtta ttttgcgaga tggcaagatc acgcgccaga 360
ttgaactcga accatcacca tctcgaggtt tcccacggtt gactcccagt tctcgaggct 420
catcgtcagc cacgcacagg cttccaatgc ctctcttgca ctacgacgac gaggaaaggc 480
agcatggtct cctgccaggg ggtgcttctt ctttaaggag cttaaatgaa gttcacgccc 540
tctgagtcct ggaagggcta tagacttcct ggtgtcggtg ctcccttggt aaaggagctt 600
aaactgggta tatccacgcc tgagtcctgg aatgatgaaa cttccttcgc tatgcctcta 660
tgtccaacac taccttacca accattatca tgcccaccgt ccttgcctgc agcgttaatt 720
cgttgtactc aacccgtacc gcgtcttagt agctttagca tacctgctgc ggtatataaa 780
tgcagacatt aatgaaaata aaaataaaag gcatgatcac gcgcttagta gatgttagat 840
ttcacagccc ctgtctttca ccaaaacgtc ggagccatgt cgaaggttca tccacttccc 900
gaaggcacct actttcaacc atcatgagta aaggagaaga acttttcact ggagttgtcc 960
caattcttgt tgaattagat ggtgatgtta atgggcacaa attttctgtc agtggagagg 1020
gtgaaggtga tgcaacatac ggaaaactta cccttaaatt tatttgcact actggaaaac 1080
tacctgttcc atggccaaca cttgtcacta ctttctctta tggtgttcaa tgcttttcaa 1140
gatacccaga tcatatgaag cggcacgact tcttcaagag cgccatgcct gagggatacg 1200
tgcaggagag gaccatcttc ttcaaggacg acgggaacta caagacacgt gctgaagtca 1260
agtttgaggg agacaccctc gtcaacagga tcgagcttaa gggaatcgat ttcaaggagg 1320
acggaaacat cctcggccac aagttggaat acaactacaa ctcccacaac gtatacatca 1380
tggccgacaa gcaaaagaac ggcatcaaag ccaacttcaa gacccgccac aacatcgaag 1440
acggcggcgt gcaactcgct gatcattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg 1500
tccttttacc agacaaccat tacctgtcca cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg 1560
aaaagagaga ccacatggtc cttcttgagt ttgtaacagc tgctgggatt acacatggca 1620
tggatgaact atacaaataa ccgacctcat ttgttgcaca atactcggga tctgatgccc 1680
agatctgcga aagactcatg ttgatatact tgaagatttt gactttacgt tgattgaaag 1740
cttgcaagct ttgagcaaaa aacatgactt catgatcttc gaggacagaa agtttgcaga 1800
cataggtgcc actcttcgta gctcaacttg aatcgccgtt cacagcgctt gtaggaaaca 1860
ccgttgcgtt acagtattca agtggcgtgc atcgcatcgc gagttggtcg cagatcacga 1920
atgcccactc agtccctggt ccatccatcg tcgcagggct ttcttcagta ggcttacccc 1980
tcggacgggg tctcctcctc ttggcagaaa tgagcacggc gggaaacctt gctgtgggcc 2040
aatacacaga agagacttat cagatggctc gcgatcaccg ggacttcgta atcgggttca 2100
ttggacaaag acgcccatct ggcgagggag atgaggattt cctagtcctg acacccggag 2160
taggattgga tgtgaaggca gatggtatgg ggcagcagta cagaacgcct cgcgaagtca 2220
tcttggaatc aggttgcgat gtgattattg taggacgagg gatatatggg aaagattaca 2280
gcttgactga agccatcgct cagcaagcgg agaggtaccg ggaatcgggg tggagcgcat 2340
acttagaaag gtgtaaatcg taaaaaggtg taaatcgtaa ttgatccatt acacccttgc 2400
aaactagaaa agcgtatatc tgcacagaca gtctatcggc cacttcaggc ttttgtcgta 2460
gaagaaagga aaataacgta caaagagtgg tttccgctta acccgcccta ttgatttggt 2520
tcgtattgta cacatggcgc agctcaatca tcgatatcga agacatcttc attatcttgt 2580
ttcgaccgtg aagcggacga aaccttgtaa agctgatcta tctggtttgt tggcgc 2636

Claims (5)

1.一种用于杏鲍菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体为将Cas9蛋白、U6启动子、sgRNA的核苷酸序列装载到质粒上，得到用于编辑杏鲍菇基因的重组载体；所述U6启动子的核苷酸序列选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQID NO.7；所述 Cas9蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述sgRNA的核苷酸序列如SEQID NO.8所示。
2.根据权利要求1所述的用于杏鲍菇基因编辑的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，所述重组载体中还包括GFP核苷酸序列以及目标基因的左右同源臂核苷酸序列。
3.一种应用于如权利要求1或权利要求2所述的CRISPR/Cas9载体的U6启动子，其特征在于，所述U6启动子的核苷酸序列选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ IDNO.7。
4.一种杏鲍菇菌株基因组片段的编辑方法，其特征在于，将如权利要求1或权利要求2所述的CRISPR/Cas9载体转化杏鲍菇菌株，对杏鲍菇菌株的目的基因进行编辑。
5.根据权利要求4所述的杏鲍菇菌株基因组片段的编辑方法，其特征在于，所述菌株为Cbx R 抗性菌株。
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Gene-edited CRISPR mushroom escapes US regulation;EMILY WALTZ;《nature》;20160421;第532卷;全文 *
Y. Honda et al.Carboxin resistance transformation of the homobasidiomycete fungus Pleurotus ostreatus.《Curr Genet》.2000,第37卷参见摘要、第211页右栏第2段. *
基于CRISPR/Cas9***的金针菇基因组编辑载体构建;罗润等;《食品工业科技》;20160726;第37卷(第20期);参见摘要以及第1.2.1-1.2.4部分、第233页左栏最后一段至右栏第1段 *
罗润等.基于CRISPR/Cas9***的金针菇基因组编辑载体构建.《食品工业科技》.2016,第37卷(第20期),参见摘要以及第1.2.1-1.2.4部分、第233页左栏最后一段至右栏第1段. *

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