CN116716298A - 一种引导编辑***和目的基因序列的定点修饰方法 - Google Patents
一种引导编辑***和目的基因序列的定点修饰方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116716298A CN116716298A CN202310471764.8A CN202310471764A CN116716298A CN 116716298 A CN116716298 A CN 116716298A CN 202310471764 A CN202310471764 A CN 202310471764A CN 116716298 A CN116716298 A CN 116716298A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- molecule
- pegrna
- expression vector
- sequence encoding
- dna sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 238000002715 modification method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 60
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 51
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims abstract description 45
- TVMXJQZBKOMFQK-OOARYINLSA-L zinc;(6r,7r)-3-(acetyloxymethyl)-7-[[(5r)-5-amino-5-carboxylatopentanoyl]amino]-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylate Chemical compound [Zn+2].S1CC(COC(=O)C)=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C([O-])=O)[C@@H]12 TVMXJQZBKOMFQK-OOARYINLSA-L 0.000 claims abstract description 12
- 229940122964 Deacetylase inhibitor Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims abstract 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 37
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 9
- 229960005184 panobinostat Drugs 0.000 claims description 8
- FWZRWHZDXBDTFK-ZHACJKMWSA-N panobinostat Chemical compound CC1=NC2=CC=C[CH]C2=C1CCNCC1=CC=C(\C=C\C(=O)NO)C=C1 FWZRWHZDXBDTFK-ZHACJKMWSA-N 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 5
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 5
- RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N trichostatin A Chemical compound ONC(=O)/C=C/C(/C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N 0.000 claims description 5
- WAEXFXRVDQXREF-UHFFFAOYSA-N vorinostat Chemical compound ONC(=O)CCCCCCC(=O)NC1=CC=CC=C1 WAEXFXRVDQXREF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N Trichostatin A Natural products ONC(=O)C=CC(C)=CC(C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 229960000237 vorinostat Drugs 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 claims description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 claims description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 claims description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 claims description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 abstract description 7
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 33
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 7
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000011559 double-strand break repair via nonhomologous end joining Effects 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 3
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N Cephalosporin C Natural products S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 102100034289 Deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase SAMHD1 Human genes 0.000 description 1
- 230000010337 G2 phase Effects 0.000 description 1
- 101001088883 Homo sapiens Lysine-specific demethylase 5B Proteins 0.000 description 1
- 102100033247 Lysine-specific demethylase 5B Human genes 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 108700019718 SAM Domain and HD Domain-Containing Protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101150114242 SAMHD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 229940121372 histone deacetylase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000003276 histone deacetylase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000001776 parthenogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种引导编辑***和目的基因序列的定点修饰方法。所述引导编辑***包含nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白模块、pegRNA模块和Nicking sgRNA模块，其中pegRNA模块为优化的pegRNA分子或包含编码优化的pegRNA分子的DNA序列的表达载体。所述目的基因序列的定点修饰方法包括使用引导编辑***以及任选地加入头孢菌素C锌和/或去乙酰化酶抑制剂的步骤。实验结果表明，本发明提供的引导编辑***和目的基因序列的定点修饰方法能够显著提高基因编辑效率，并拓宽了引导编辑***在农业和生物医学领域的应用范围。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种pegRNA骨架分子、pegRNA分子以及包含它们的引导编辑***。本发明还涉及一种使用引导编辑***的目的基因序列的定点修饰方法。
背景技术
基因编辑技术作为生命科学中发展迅速的重要研究领域，其开发及应用使得生物体的遗传改造进入了前所未有的深度与广度。通过在基因组引入遗传修饰，如替换、***和缺失，可以改善农业性状，加速动植物品种的改良和育种，构建疾病模型以探索疾病的发生和进展以及进行药物筛选，修复或修饰内源致病突变从而实现基因治疗的目的。
目前，成簇的规律性间隔的短回文重复序列(Clustered RegularlyInterspersed Short Palindromic Repeats，CRISPR)编辑***是应用最为广泛的基因编辑器，其具有效率高、通量大和易操作等优点。CRISPR/Cas9蛋白与向导RNA(Guide RNA)结合形成核酸蛋白复合体(Ribonucleoprotein Complex，RNP)，识别并切断靶DNA序列，产生DNA双链断裂(Double Stranded Break，DSB)，进而引发细胞启动两种DNA修复通路，分别是非同源末端连接(Non-Homologous End Joining，NHEJ)和同源重组(HomologousRecombination，HR)。NHEJ发生在整个细胞周期，修复DNA时会随机***或删除几个碱基(Insertion/Deletion，indel)，所以NHEJ快速但不精准。HR只在G2/S期进行修复，通过同源序列模板进行精准修复，所以HR虽然精准但是效率远低于NHEJ。传统的单碱基编辑是通过CRISPR-Cas9编辑***在目标基因组序列切割产生DSB，利用携带点突变的单链寡脱氧核苷酸链(Single Strand Oligonucleotide，ssODN)作为修复供体模板实现基因编辑点突变。但这种方式实现点突变的效率很低，很难拿到阳性结果。
2016年相继报道的碱基编辑器：胞嘧啶碱基编辑器、腺嘌呤碱基编辑器和鸟嘌呤碱基编辑器可以不依赖于DSB、供体模板而实现胞嘧啶(Cytosine，C)到胸腺嘧啶(Thymine，T)、腺嘌呤(Adenine，A)到鸟嘌呤(Guanine，G)以及C到G的碱基编辑，但是编辑类型有限且受限于编辑窗口，这些问题严重限制了碱基编辑器的广泛应用。
2019年，David Liu实验室开发报道了基于CRISPR/Cas9的新型基因编辑***(Prime Editing，PE)。PE由nCas9(H840A)切口酶与逆转录酶(Moloney Murine LeukemiaRetrovirus，MMLV)结合而成的融合蛋白、编码所需的pegRNA(Prime Editing Guide RNA，pegRNA)以及Nicking sgRNA的DNA序列三部分构成。pegRNA是在sgRNA骨架的3'端引入PBS(Primer Binding Site)序列以及逆转录出模板cDNA的逆转录模板(RT)而得到的。引物结合位点与nCas9切口ssDNA链配对从而启动逆转录并将逆转录酶模板的遗传信息整合到基因组中。然后在编辑链的3'端和未编辑链的5'端之间进行平衡、剪接和修复，从而生成所需的编辑。由于PE编辑***在相对较宽的位置范围(+1到+33，从pegRNA诱导的缺口的第一个碱基3'开始计数)产生12种任意的碱基替换以及片段的***和缺失，因此基本上不受PAM的限制，这种强大而全能的技术已被证明可以创造和纠正导致人类细胞遗传疾病的突变。
然而，本申请的发明人在各种动植物中开发和测试了PE编辑器***后发现，虽然PE可实现任意类型的碱基编辑以及片段的***及缺失，但是PE的编辑效率还非常有限，在大部分位点处其效率仅可通过高通量测序才能检测得到，甚至一些位点无法被编辑。
发明内容
基于上述研究现状，本发明主要目的是提供一种能够显著提高碱基编辑效率的引导编辑***。本发明的另一目的是提供一种能够以显著提高的碱基编辑效率的对生物体或生物细胞基因组中的目的基因序列进行定点修饰的方法。特别地，所述引导编辑***和定点修饰方法可用于哺乳动物细胞的基因组编辑。
一方面，本发明提供了一种pegRNA骨架分子，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
另一方面，本发明提供了一种pegRNA分子，其包含根据本发明的pegRNA骨架分子。该pegRNA分子也可称为优化的pegRNA(Optimized pegRNA)分子，以与未优化的pegRNA分子(其包含的pegRNA骨架分子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)进行区分。
根据本发明的一些具体实施方式，所述pegRNA分子的核苷酸序列包含依次连接的靶点核苷酸序列、优化的pegRNA骨架分子的核苷酸序列、逆转录模板(RT)的核苷酸序列和引物结合位点(PBS)的核苷酸序列，或者由它们组成。优选地，所述pegRNA分子的核苷酸序列如SEQ ID No.11至SEQ ID No.16中的任一项所示。
本发明提供的优化的pegRNA分子与未优化的pegRNA分子相比，能够延长双链体结构，增强与nCas9的结合，将UUUU突变为UUUC消除了假定的转录终止信号，提高了pegRNA分子的表达和靶向切割能力，从而提高了PE介导的靶向编辑的能力。
再一方面，本发明提供了一种载体，其包含优化的的pegRNA分子。
根据本发明的一些实施方式，所述载体是表达载体。优选地，所述表达载体可以选自表达U6启动子的载体，如PLG3U6或PUC-U6。
又一方面，本发明提供了一种引导编辑***，其包含以下模块：
(1)nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白模块，其为nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白或包含编码nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的DNA序列的表达载体；
(2)pegRNA模块，其为优化的pegRNA分子或包含编码优化的pegRNA分子的DNA序列的表达载体；和任选的
(3)Nicking sgRNA模块，其为Nicking sgRNA分子或包含编码Nicking sgRNA分子的DNA序列的表达载体。
根据本发明的一些实施方式，所述引导编辑***包含以下中的一种：
A1.nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白、优化的pegRNA分子和任选的NickingsgRNA分子；
A2.包含编码nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的DNA序列的表达载体、优化的pegRNA分子和任选的Nicking sgRNA分子；
A3.nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白、包含编码优化的pegRNA分子的DNA序列的表达载体和任选的包含编码Nicking sgRNA分子的DNA序列的表达载体；
A4.包含编码nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的DNA序列的表达载体、包含编码优化的pegRNA分子的DNA序列的表达载体和任选的包含编码Nicking sgRNA的DNA序列的表达载体；
A5.包含编码nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的DNA序列和编码优化的pegRNA分子的DNA序列的表达载体。
根据本发明的一些实施方式，所述nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；优选地，所述nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
根据本发明的一些实施方式，所述Nicking sgRNA包含依次连接的靶点核苷酸序列和如SEQ ID No.2所示的pegRNA骨架分子的核苷酸序列，或者由它们组成；更优选地，所述Nicking sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNo.5至SEQ ID No.10中的任一项所示。
另一方面，本发明提供了一种生物体或生物细胞基因组中目的基因序列的定点修饰方法，其包括以下步骤：
S1.向生物体或生物细胞导入引导编辑***；
S2.任选地加入头孢菌素C锌和/或去乙酰化酶抑制剂；优选地，所述去乙酰化酶抑制剂选自帕比司他、伏立诺他、曲古抑菌素A或丁酸钠中的至少一种，优选为帕比司他；更优选地，步骤S2中加入头孢菌素C锌和帕比司他。
根据本发明的一些实施方式，所述引导编辑***包含以下模块：
(1)nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白模块，其为nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白或包含编码nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的DNA序列的表达载体；
(2)pegRNA模块，其为pegRNA分子或包含编码pegRNA分子的DNA序列的表达载体；和任选的
(3)Nicking sgRNA模块，其为Nicking sgRNA分子或包含编码Nicking sgRNA分子的DNA序列的表达载体。
根据本发明的一些实施方式，所述引导编辑***包含以下中的一种：
A1.nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白、pegRNA分子和任选的Nicking sgRNA分子；
A2.包含编码nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的DNA序列的表达载体、pegRNA分子和任选的Nicking sgRNA分子；
A3.nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白、包含编码pegRNA分子的DNA序列的表达载体和任选的包含编码Nicking sgRNA分子的DNA序列的表达载体；
A4.包含编码nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的DNA序列的表达载体、包含编码pegRNA分子的DNA序列的表达载体和任选的包含编码Nicking sgRNA的DNA序列的表达载体；
A5.包含编码nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的DNA序列和编码pegRNA分子的DNA序列的表达载体。
根据本发明的一些实施方式，所述pegRNA分子为优化的pegRNA分子，即包含核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的pegRNA分子；或者，所述pegRNA分子为未优化的pegRNA分子，将优化的pegRNA分子中核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的pegRNA骨架分子替换为核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的pegRNA骨架分子得到的pegRNA分子。
根据本发明的一些实施方式，所述pegRNA分子的核苷酸序列如SEQ ID No.11至SEQ ID No.22中的任一项所示。
根据本发明的一些实施方式，步骤S1中的引导编辑***包含以下模块：
(1)nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白模块，其为nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白或包含编码nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的DNA序列的表达载体；
(2)pegRNA模块，其为优化的pegRNA分子或包含编码优化的pegRNA分子的DNA序列的表达载体；和任选的
(3)Nicking sgRNA模块，其为Nicking sgRNA分子或包含编码Nicking sgRNA分子的DNA序列的表达载体。
根据本发明的一些实施方式，所述引导编辑***包含以下中的一种：
A1.nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白、优化的pegRNA分子和任选的NickingsgRNA分子；
A2.包含编码nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的DNA序列的表达载体、优化的pegRNA分子和任选的Nicking sgRNA分子；
A3.nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白、包含编码优化的pegRNA分子的DNA序列的表达载体和任选的包含编码Nicking sgRNA分子的DNA序列的表达载体；
A4.包含编码nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的DNA序列的表达载体、包含编码优化的pegRNA分子的DNA序列的表达载体和任选的包含编码Nicking sgRNA的DNA序列的表达载体；
A5.包含编码nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的DNA序列和编码优化的pegRNA分子的DNA序列的表达载体。
根据本发明的一些实施方式，所述nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；优选地，所述nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
根据本发明的一些实施方式，所述Nicking sgRNA包含依次连接的靶点核苷酸序列和如SEQ ID No2所示的pegRNA骨架分子的核苷酸序列，或者由它们组成；更优选地，所述Nicking sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNo.5至SEQ ID No.10中的任一项所示。
本发明还发现头孢菌素C锌(CPC)可通过抑制SAMHD1水解dNTP来增强逆转录过程，从而提高了PE***编辑基因组的效率。
根据本发明的一些实施方式，步骤S2中加入的头孢菌素C锌的浓度为1.1～11μM，优选为11μM。
本发明还发现了去乙酰化酶抑制剂(Histone Deacetylase Inhibitor，HDACi)能够通过提高PE***的转录及表达效率来提高PE***的编辑效率。本发明可选的HDACi包括帕比司他(panobistat)、伏立诺他(SAHA)、曲古抑菌素A(TSA)或丁酸钠(NAB)。
根据本发明的一些实施方式，步骤S2中加入的帕比司他的浓度为50～200nM，优选为100nM。
根据本发明的一些实施方式，步骤S2中加入的伏立诺他的浓度为10～40μM，优选为40μM。
根据本发明的一些实施方式，步骤S2中加入的曲古抑菌素A的浓度为100～300nM，优选为300nM。
根据本发明的一些实施方式，步骤S2中加入的丁酸钠的浓度为1～10mM，优选为5mM。
根据本发明的一些实施方式，所述导入选自以下中的任一项：
Y1.化学介导；优选地，所述化学介导选自磷酸钙转染或脂质体转染；
Y2.物理介导；优选地，所述物理介导选自显微注射、基因枪法或电穿孔法中的任一种；
Y3.生物介导；优选地，所述生物介导选自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或土壤农杆菌中的任一种。
根据本发明的引导编辑***或根据本发明的目的基因序列的定点修饰方法可用于对生物体或生物细胞的目的基因序列的靶向修饰，提高生物体或生物细胞的目的基因序列的靶向编辑效率，制备生物体或生物细胞的目的基因序列的靶向修饰的产品。
根据本发明的一些实施方式，所述生物体为植物和/或动物；所述生物细胞为植物细胞和/或动物细胞。
本文所用的术语“载体”指用于将核苷酸编码信息转移到宿主细胞内的任一种分子(例如，核酸、质粒或病毒等)。术语“表达载体”指适于在宿主细胞内表达目的基因(待表达的核苷酸序列)的载体，通常包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分。
本发明提供的pegRNA骨架分子、包含该pegRNA骨架分子的优化的pegRNA以及包含该pegRNA分子的引导编辑***具有更高的基因编辑效率。
另外，本发明提供的对生物体或生物细胞基因组中的目的基因序列进行定点修饰的方法在使用优化的pegRNA和/或药物(即CPC和/或去乙酰化酶抑制剂)后，能够显著提高编辑效率。
根据本发明的引导编辑***或目的基因序列的定点修饰的方法不仅能够提高的编辑效率，还能够实现不可编辑靶点的编辑。本发明拓展了PE***在农业和生物医学领域中的应用范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为实施例5的结果测定图。
具体实施方式
以下参照具体实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂或试剂盒等，如无特殊说明，均为可市售购买产品。
以下实施例中，猪胎儿成纤维细胞(Porcine Embryonic Fibroblast Cell，PEF)为自制分离和培养得到的，具体分离和培养方法可参照J Yao，Y Wang等在“CRISPR/Cas13d-mediated efficient KDM5B mRNA knockdown in porcine somatic cells andparthenogenetic embryos”，《Frontiers in Bioengineering&Biotechnology》中的报道。
以下实施例中，nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的表达质粒(PE质粒)来自Addgene。
实施例1pegRNA和优化的pegRNA的表达载体的构建
将pegRNA的骨架序列由北京擎科生物科技股份有限公司(Tsingke)合成单链寡核苷酸，并通过程序性退火获得双链DNA序列。设计包含目标pegRNA序列的正向引物和包含PBS+RT序列的反向引物。以上述DNA为模板进行PCR扩增获得同时携带间隔区-骨架-3'延伸的***序列。以PUC57-U6启动子为模板，进行PCR扩增出pegRNA骨架。通过In-Fusion的方式将其与***序列克隆在一起，以通用引物U6-F进行Sanger测序确定质粒构建成功。
pegRNA的表达载体与优化的pegRNA的表达载体的构建方式相同，构建时的相关序列如下表1和表2所示。
测序后，pegRNA分子的核苷酸序列如SEQ ID No.17至SEQ ID No.22之一所示；优化的pegRNA分子的核苷酸序列如SEQ ID No.11至SEQ IDNo.16之一所示。
表1
表2
实施例2Nicking sgRNA表达载体的构建
首先用Bsa I限制性核酸内切酶切割pGL3-U6-sgRNA-tdTomato质粒，37℃过夜酶切，通过胶回收/DNA纯化试剂盒(Vazyme)纯化回收线性化的质粒。接着将Nicking sgRNA识别序列通过PCR退火，使其由单链核苷酸通过变性和复性合成双链寡核苷酸，再通过T4 DNA连接酶(NEB)将Nicking sgRNA的识别序列双链DNA与线性化的载体质粒pGL3-U6-tdTomato进行连接。使用DH5α(Tsingke)进行转化，涂板，挑菌，摇菌，进一步通用引物U6-F测序鉴定阳性菌液，大提质粒扩繁，-80℃下保存备用。
相关序列列于下表3中。
测序后，Nicking sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.5至SEQ ID No.10之一所示。
表3
实施例3细胞培养和转染
将猪胎儿成纤维细胞(PEF)维持在包含15％胎牛血清、1％Glutamax、1％最低必需培养基非必需氨基酸溶液和余下为最低必需培养基-α的环境下，39℃、5％CO2下培养。
提前配制nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白表达质粒、pegRNA分子表达质粒、nicking sgRNA分子表达质粒(平行制备3份)以及nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白表达质粒、优化的pegRNA分子表达质粒、Nicking sgRNA分子表达质粒(平行制备2份)并混合均匀，使用处于对数生长期(细胞密度为70％-80％)的PEF进行转染。然后将细胞消化下来，放入离心机中以1200rpm离心2min。离心结束后使用吸液泵将上清液吸除，将5×105个细胞使用100μL的电转液(Lonza)重悬，向100μL细胞悬液中加入质粒混合液，并将其转移至电转杯中。用核电转仪(Lonza)的U-023程序进行转染，将转染后的细胞悬液转移至12孔板中。
实施例4药物处理
在包含转染后细胞的培养基中分别进行如下表4中所述的实验。
表4
表4中，CPC指的是头孢菌素C锌，DMSO指的是二甲基亚砜。
实施例5结果测定与分析
1.在转染后72小时，使用流式分选(BD)富集tdTomato阳性细胞。将收集的细胞放置在离心机中以5000rpm离心3min，去上清，使用微量样品基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)提取DNA。完成提取后使用核酸测定仪测量DNA浓度，然后使用高保真酶(VAZYME)进行巢式PCR扩增，扩增结束后通过胶回收纯化试剂盒(VAZYME)进行纯化回收，纯化后通过使用核酸测定仪测量DNA浓度，混合的样品总量不低于1.5μg。送公司(Tsingke)进行高通量测序—PCR产物PE150测序。相关引物序列列于下表5中。
表5
/>
/>
/>
/>
2.结果分析
由图1，得到的相关结果可参见下表6所示：
由图1和上表6可知，分别使用优化的pegRNA或药物均能明显提高在PEF中的编辑效率，而将优化的pegRNA结合药物一起使用，则编辑效率的提升更为显著。
尽管以上已经对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员应该理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。本发明的权利范围并不限于上文所作的详细描述，而应归属于权利要求书。
Claims (11)
1.一种pegRNA骨架分子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种pegRNA分子，其包含根据权利要求1所述的pegRNA骨架分子。
3.根据权利要求2所述的pegRNA分子，其核苷酸序列包含依次连接的靶点核苷酸序列、根据权利要求1所述的pegRNA骨架分子的核苷酸序列、逆转录模板(RT)的核苷酸序列和引物结合位点(PBS)的核苷酸序列，或者由它们组成；
优选地，所述pegRNA分子的核苷酸序列如SEQ ID No.11至SEQ IDNo.16中的任一项所示。
4.一种载体，其包含根据权利要求2或3所述的pegRNA分子；
优选地，所述载体是表达载体；进一步优选地，所述表达载体选自表达U6启动子的载体，如PLG3U6或PUC-U6。
5.一种引导编辑***，其包含以下模块：
(1)nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白模块，其为nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白或包含编码nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的DNA序列的表达载体；
(2)pegRNA模块，其为根据权利要求2或3所述的pegRNA分子或包含编码根据权利要求2或3所述pegRNA分子的DNA序列的表达载体；和任选的(3)Nicking sgRNA模块，其为NickingsgRNA分子或包含编码Nicking sgRNA分子的DNA序列的表达载体；
优选地，所述引导编辑***包含以下中的一种：
A1.nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白、根据权利要求2或3所述的pegRNA分子和任选的Nicking sgRNA分子；
A2.包含编码nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的DNA序列的表达载体、根据权利要求2或3所述的pegRNA分子和任选的Nicking sgRNA分子；
A3.nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白、包含编码根据权利要求2或3所述的pegRNA分子的DNA序列的表达载体和任选的包含编码Nicking sgRNA分子的DNA序列的表达载体；
A4.包含编码nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的DNA序列的表达载体、包含编码根据权利要求2或3所述的pegRNA分子的DNA序列的表达载体和任选的包含编码NickingsgRNA的DNA序列的表达载体；
A5.包含编码nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的DNA序列和编码根据权利要求2或3所述的pegRNA分子的DNA序列的表达载体。
6.根据权利要求5所述的引导编辑***，其中所述nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；优选地，所述nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
优选地，所述Nicking sgRNA包含依次连接的靶点核苷酸序列和如SEQ ID No.2所示的pegRNA骨架分子的核苷酸序列，或者由它们组成；更优选地，所述Nicking sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.5至SEQ IDNo.10中的任一项所示。
7.一种生物体或生物细胞基因组中目的基因序列的定点修饰方法，其包括以下步骤：
S1.向生物体或生物细胞导入引导编辑***；
S2.任选地加入头孢菌素C锌和/或去乙酰化酶抑制剂；
优选地，所述去乙酰化酶抑制剂选自帕比司他、伏立诺他、曲古抑菌素A或丁酸钠中的至少一种，优选为帕比司他；更优选地，步骤S2中加入头孢菌素C锌和帕比司他。
8.根据权利要求7所述的定点修饰方法，其中所述引导编辑***包含以下模块：
(1)nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白模块，其为nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白或包含编码nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的DNA序列的表达载体；
(2)pegRNA模块，其为pegRNA分子或包含编码pegRNA分子的DNA序列的表达载体；和任选的(3)Nicking sgRNA模块，其为Nicking sgRNA分子或包含编码Nicking sgRNA分子的DNA序列的表达载体；
优选地，所述引导编辑***包含以下中的一种：
A1.nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白、pegRNA分子和任选的Nicking sgRNA分子；
A2.包含编码nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的DNA序列的表达载体、pegRNA分子和任选的Nicking sgRNA分子；
A3.nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白、包含编码pegRNA分子的DNA序列的表达载体和任选的包含编码Nicking sgRNA分子的DNA序列的表达载体；
A4.包含编码nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的DNA序列的表达载体、包含编码pegRNA分子的DNA序列的表达载体和任选的包含编码Nicking sgRNA的DNA序列的表达载体；
A5.包含编码nCas9切口酶与逆转录酶的融合蛋白的DNA序列和编码pegRNA分子的DNA序列的表达载体；
进一步优选地，所述引导编辑***为权利要求5或6所述的引导编辑***。
9.根据权利要求7或8所述的定点修饰方法，其中步骤S2中加入的头孢菌素C锌的浓度为1.1～11μM，优选为11μM；
优选地，步骤S2中加入的帕比司他的浓度为50～200nM，优选为100nM；
优选地，步骤S2中加入的伏立诺他的浓度为10～40μM，优选为40μM；
优选地，步骤S2中加入的曲古抑菌素A的浓度为100～300nM，优选为300nM；
优选地，步骤S2中加入的丁酸钠的浓度为1～10mM，优选为5mM。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的定点修饰方法，其中，所述导入选自以下中的任一项：
Y1.化学介导；优选地，所述化学介导选自磷酸钙转染或脂质体转染；
Y2.物理介导；优选地，所述物理介导选自显微注射、基因枪法或电穿孔法中的任一种；
Y3.生物介导；优选地，所述生物介导选自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或土壤农杆菌中的任一种。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的定点修饰方法，其中所述生物体为植物和/或动物；所述生物细胞为植物细胞和/或动物细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310471764.8A CN116716298A (zh) | 2023-04-27 | 2023-04-27 | 一种引导编辑***和目的基因序列的定点修饰方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310471764.8A CN116716298A (zh) | 2023-04-27 | 2023-04-27 | 一种引导编辑***和目的基因序列的定点修饰方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116716298A true CN116716298A (zh) | 2023-09-08 |
Family
ID=87874074
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310471764.8A Pending CN116716298A (zh) | 2023-04-27 | 2023-04-27 | 一种引导编辑***和目的基因序列的定点修饰方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116716298A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117720672A (zh) * | 2024-02-07 | 2024-03-19 | 深锐(天津)生物医学有限公司 | 先导编辑***及其应用 |
-
2023
- 2023-04-27 CN CN202310471764.8A patent/CN116716298A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117720672A (zh) * | 2024-02-07 | 2024-03-19 | 深锐(天津)生物医学有限公司 | 先导编辑***及其应用 |
| CN117720672B (zh) * | 2024-02-07 | 2024-04-30 | 深锐(天津)生物医学有限公司 | 先导编辑***及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yang et al. | Optimization of scarless human stem cell genome editing | |
| JP6835726B2 (ja) | Ｃｒｉｓｐｒハイブリッドｄｎａ／ｒｎａポリヌクレオチドおよび使用方法 | |
| CN108546716A (zh) | 一种基因组编辑方法 | |
| CN106834347A (zh) | 一种山羊cdk2基因敲除载体及其构建方法 | |
| CN113215193B (zh) | 小分子化合物提高基因敲除和碱基编辑***活性的方法及其应用方法 | |
| US20210198699A1 (en) | Kit for reparing fbn1t7498c mutation, combination for making and repairing mutation, and method of repairing thereof | |
| EP4159853A1 (en) | Genome editing system and method | |
| US20220213458A1 (en) | Mad nucleases | |
| CN116716298A (zh) | 一种引导编辑***和目的基因序列的定点修饰方法 | |
| CN113881708A (zh) | 对动物受精卵进行电转染基因编辑的方法及其应用 | |
| WO2022156188A1 (en) | Method for producing target dna sequence and cloning vector | |
| Boyne et al. | Efficient multitool/multiplex gene engineering with TALE-BE | |
| CN110819592A (zh) | 一种通用供体干细胞及其制备方法 | |
| WO2023060539A1 (en) | Compositions and methods for detecting target cleavage sites of crispr/cas nucleases and dna translocation | |
| WO2023016021A1 (zh) | 一种碱基编辑工具及其构建方法 | |
| CN111088253A (zh) | 针对hbb-28地中海贫血基因的crispr单碱基供体修复体系 | |
| WO2022271725A1 (en) | Detecting crispr genome modification on a cell-by-cell basis | |
| US20210062248A1 (en) | Methods of performing guide-seq on primary human t cells | |
| JP2024501892A (ja) | 新規の核酸誘導型ヌクレアーゼ | |
| JPWO2018015995A1 (ja) | 長鎖一本鎖ｄｎａを調製する方法 | |
| Watanabe et al. | Lipofection with Lipofectamine™ 2000 in a heparin‐free growth medium results in high transfection efficiency in chicken primordial germ cells | |
| CN114045310A (zh) | 一种用于提高基因修复效率的方法 | |
| CN114891791B (zh) | 特异性靶向犬Rosa26基因的sgRNA及其应用 | |
| WO2024119461A1 (en) | Compositions and methods for detecting target cleavage sites of crispr/cas nucleases and dna translocation | |
| CN113403342A (zh) | 一种单碱基突变方法及采用的*** |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |