CN109320473A - 噻唑氨基苯甲酰胺乙酸衍生物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具备抗肿瘤活性的噻唑氨基苯甲酰胺乙酸衍生物，其能够用于制备抗癌药物，特别是作为Bcr‑Abl酪氨酸激酶抑制剂，尤其是可作为T315I突变的Bcr‑Abl酪氨酸激酶抑制剂。

Description

噻唑氨基苯甲酰胺乙酸衍生物及其用途
技术领域
本发明涉及药物化学领域，具体涉及一系列噻唑氨基苯甲酰胺乙酸衍生物、其制备方法及其用途。
背景技术
慢性粒细胞白血病(CML)，是一种起源于造血干细胞的恶性骨髓增殖性疾病，占所有白血病的15%~20%，为最常见的骨髓增殖性疾病。其发病根源来自于9号染色体上的原癌基因c-Abl与22号染色体上的Bcr基因融合形成的Bcr-Abl基因。目前，已经证实了Bcr-Abl酪氨酸激酶是治疗CML最理想的分子靶点（Blood, 1996, 87: 3036-3038；Blood, 2000,96:343-356）。围绕着Bcr-Abl酪氨酸激酶，药物工作者们进行了各种努力。目前，成功上市的Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂有伊马替尼、尼洛替尼、拉多替尼、达沙替尼、舒博替尼和普纳替尼。
其中，伊马替尼为第一代Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂，为治疗CML的一线药物，但不同时期的病人，长期服用后会有一部分产生耐药性。耐药可能由多种机制引起，其中，Bcr-Abl点突变是最常见也是影响最大的耐药机制（Nat Rev Drug Discov, 2007, 6 (10):834-848）。
尼洛替尼、拉多替尼、达沙替尼和博舒替尼为第二代Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂。与伊马替尼相比，能够解决大多数突变体产生的耐药，但却不能有效解决T315I突变引起的耐药（Ann Oncol, 2007, 18 (6): 42-46； Eur J Cancer, 2010, 46 (10): 1781-1789；Haematologica, 2014, 99(7): 1191-1196）。
普纳替尼为第三代Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂，能够有效解决T315I突变引起的耐药（Cancer Cell, 2009, 16 (5): 401-412）。但普纳替尼会产生严重及致死性血栓和血管狭窄性疾病，并可诱发心脏病、心肌梗死、中风、四肢缺血甚至组织坏死等并发症（中国药物警戒, 2017, 14(4): 218-221）。
T315I突变发生在Bcr-Abl激酶结构域中被称为“gatekeeper”的315位，野生型Bcr-Abl中的苏氨酸（Thr）被异亮氨酸（Ile）所取代。野生型Bcr-Abl中Thr315可以与伊马替尼和尼洛替尼等形成一个关键的氢键，而当它被Ile315取代后，这个关键的氢键就无法形成。除此之外，突变之后的Ile315由于体积较大，会与伊马替尼产生空间位阻，从而使其对野生型Bcr-Abl有效而对Bcr-AblT315I无效（Cancer Cell, 2002, 2 (2): 117-125；Bioorg Med Chem Lett, 2008, 18: 4907-4912；Leukemia, 2004, 18 (8): 1321-1331）。研究普纳替尼与Bcr-AblT315I的作用发现：普纳替尼结构中的炔键与Thr315和Ile315均不形成氢键，且由于结构较小而不与Ile315产生空间位阻（药学进展, 2014, 38 (5):333-339；Cancer Cell, 2009, 16 (5): 401-412）。
本发明的发明人在前期工作中，设计、合成了系列2-氨基噻唑类化合物，活性测试结果表明其具有良好的抗肿瘤活性（CN102319244A、CN102675303、CN1080031152A、CN107459513A）。因而发明人想到将2-氨基噻唑基团结合到分子结构中，期望能够得到可作为 T315I 突变的 Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂，同时能够降低对人体的毒副作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供了一类噻唑氨基苯甲酰胺乙酸衍生物，其可作为 T315I 突变的 Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂。
本发明的第一个方面，是提供一类通式I化合物及其药学上可接受的盐，具有如下结构：
I
其中：R1各自独立地选自卤素、-OH、-NO2、-CN、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基；
R2选自氢、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基；
R3选自氢、-OH、-NO2、-CN、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C6-C10芳基C1-C6烷基；
n选自0、1、2、3或4。
优选地，R1各自独立地选自卤素、-OH、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷基，更优选为甲基、氯、氟、羟基、三氟甲基；n选自0、1或2，优选为0或1。
优选地，R2选自氢、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基，更优选为甲基、乙基、三氟甲基。
优选地，R3选自氢、-OH、卤素、C1-C4烷基、C1-C6烷氧基、C1-C4卤代烷基、C1-C4卤代烷氧基、苄基，更优选为氢、苄基。
更优选地，本发明所述的式I化合物，其选自如下化合物：
。
本发明的另一方面提供一种制备式I化合物的方法，其反应路线如下：
；
其中，R1、R2、R3和n的定义如前所述，R4选自C1-C6烷基或C1-C6卤代的烷基。
本发明的制备方法具体还包括如下反应步骤：
步骤一：向反应器中加入硫氰酸铵和丙酮，搅拌均匀，然后滴加苯甲酰氯, 溶液由澄清变为白色浑浊液，加热至回流，分批加入间氨基苯甲酸，待反应完毕后，冷却，过滤，将所得固体干燥，得3-（3-苯甲酰基硫脲基）苯甲酸；
步骤二：向反应瓶中加入3-（3-苯甲酰基硫脲基）苯甲酸和碱性水溶液，使pH=13，搅拌，加热回流，直至反应完毕，冷却至室温，加入稀盐酸，将pH调到2，静置24 h，析出固体，过滤，将固体干燥，得3-羧基苯基硫脲；
步骤三：向反应瓶中加入3-羧基苯基硫脲、取代的2-Br-1-苯基烷基酮和冰醋酸，搅拌均匀，加热至回流，反应完毕后，趁热除去反应瓶中的不溶固体，旋蒸部分溶剂，放入通风厨中常温冷却24 h，析出固体，过滤，将所得固体干燥，得中间体噻唑氨基苯甲酸衍生物；
步骤四：在冰浴条件下加入中间体噻唑氨基苯甲酸衍生物、EDCI、HOBT和无水乙醇至反应瓶中，反应2-4 h，加入盐酸盐、DIPEA、DMAP和DMF继续冰浴反应半小时，之后改为室温反应，直至反应完毕，再边搅拌边缓慢加入冰水，直到溶液由澄清变为浑浊，室温搅拌0.5-1.5 h，再放入冰箱析出白色固体，过滤，将所得固体干燥，得式I化合物；
步骤五：向反应瓶中加入中间体4、无水乙醇和蒸馏水，用稀NaOH调节pH至为11-13，37℃搅拌，反应过程监控pH，低于10时及时调为11-13。TLC 监测反应进程，反应完毕后，过滤，弃滤渣，滤液用稀HCl调pH为2-3，放入冰箱析出固体，过滤，干燥得式I化合物。
优选地，步骤一的间氨基苯甲酸、硫氰酸铵和苯甲酰氯的摩尔比为1 : 1-1.5 :1-1.5，优选为1 : 1.2 : 1.3；
优选地，步骤二碱性水溶液为10% NaOH水溶液，稀盐酸浓度为4 mol/L；
优选地，步骤三的3-羧基苯基硫脲和取代的2-Br-1-苯基烷基酮的摩尔比为1 : 1-1.2，优选为1 : 1；
优选地，步骤四中与的摩尔比为1-2 :1，优选为1.5 : 1；
优选地，步骤五中反应过程中的pH优选为12，后处理过程中的pH优选为2-3，稀NaOH为5%-30%的NaOH水溶液，稀HCl为5%-15%的盐酸溶液。
本发明的另一方面提供一种药物组合物，其包含本发明所述的式I所示化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体、赋形剂。
本发明另一方面涉及本发明所述的化合物或包含所述化合物的药物组合物在制备治疗与Bcr-Abl酪氨酸激酶相关癌症的药物中的用途，尤其是针对 T315I 突变的 Bcr-Abl酪氨酸激酶为靶点的癌症。
优选地，所述癌症选自人慢性粒细胞白血病、肝癌（如HepG-2细胞株）、非小细胞肺癌（如A549细胞株），更优选为人慢性髓系白血病（如K562细胞株）、K562耐伊马替尼细胞株（K562/R细胞株）。
定义：
“烷基”是指仅仅由碳和氢原子组成，不含有不饱和度，可为C1-6烷基。在一些实施方案中，烷基具有1至6或1至4个碳原子。代表性饱和直链烷基包括但不限于-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基和-正己基；而饱和支链烷基包括但不限于-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2-甲基-戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基-丁基等。烷基通过单键连接于母体分子。除非在说明书中另外陈述，否则烷基任选被一个或多个独立地包括以下的取代基取代：酰基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基芳基、环烷基。在一非限制性实施方案中，取代的烷基可选自氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、3-氟丙基、羟基甲基、2-羟基乙基、3-羟基丙基、苯甲基和苯乙基。
“烷氧基”是指“烷基”通过氧原子与母体分子相连，其中“烷基”具有如上所述的定义。
“卤代烷基”是指其中所有氢原子部分或全部被选自氟代基、氯代基、溴代基和碘代基的卤素置换的烷基。在一些实施方案中，所有氢原子都各自被氟代基置换。在一些实施方案中，所有氢原子都各自被氯代基置换。卤代烷基的实例包括-CF3、-CF2CF3、-CF2CF2CF3、-CFCl2、-CF2Cl等。
在某些实施方案中，药学上可接受的形式是药学上可接受的盐,药学上可接受的盐在本领域中是熟知的。药学上可接受的盐的实例是诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、高氯酸、乙酸、草酸、顺丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、丁二酸或丙二酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、乳酸、三氟乙酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包覆剂、等张剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体或赋形剂不破坏公开的化合物的药理学活性，并且在以足以递送治疗量的化合物的剂量施用时是无毒的。药物活性物质的所述介质和试剂的使用在本领域中是熟知的。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）本发明提供了一类新的具有抗癌活性的噻唑氨基苯甲酰胺乙酸类化合物，拓宽了现有抗癌化合物的范围，可作为先导化合物继续优化；
（2）本发明化合物对CML细胞株K562、K562耐伊马替尼细胞（K562/R）、人肝癌细胞（HepG-2)和人非小细胞肺癌细胞（A549）有良好的抑制作用，同时对于人正常肝细胞L02具有较低的毒性，在抑制癌细胞的同时，能够避免或减少对人体的毒副作用；
（3）本发明化合物能够与靶标酪氨酸激酶AbI1和AbIlT315I有效地结合，具有很好的作用强度，能够抑制Bcr-AbIlT315I的活性，进而有效地解决T315I突变引起的耐药问题，可作为抗T315I突变的新型Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂。
具体实施方式
下面通过实施例来具体说明本发明的内容。在本发明中，以下实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1（3-((5-甲基-4-苯基噻唑-2-基)氨基)苯甲酰基)甘氨酸
步骤a：
在100 mL带有机械搅拌和冷凝管的斜口反应瓶中加入11.4341 g（0.12 mol）硫氰酸铵和20 mL丙酮，通过机械搅拌搅拌均匀。滴加16.8034 g（0.13 mol）苯甲酰氯（10 min滴完）,溶液由澄清变为白色浑浊液。加热至回流，分4批加入14.1147 g（0.10 mol）间氨基苯甲酸，TLC（乙酸乙酯：石油醚 = 4：1）监测反应过程，8 h反应完毕。冷却，过滤，将所得固体干燥，得28.0041 g的淡黄色粉末3-（3-苯甲酰基硫脲基）苯甲酸，m.p. 184 ~ 186 ℃。
在100 mL带冷凝管的斜口反应瓶中加入0.9913 g（0.12 mol）3-（3-苯甲酰基硫脲基）苯甲酸和 33 mL 10% NaOH，测得pH=13，磁力搅拌，加热回流，TLC（乙酸乙酯：石油醚 =4：1）监测其反应过程，4 h反应完毕。冷却至室温，加入适量的4 mol/L稀盐酸，将pH调到2，静置24 h，析出固体，过滤，将所得固体干燥，称量得0.6142 g的白色粉末，收率为86.72 %，m.p. 186 ~ 187 ℃。 1H NMR（DMSO-D6，400 MHz）, δ：2.51（s，1H，NH）, 3.36（s, 2H, NH2）,7.43-8.03（m, 4H, C6H4 ），9.89（s, 1H, COOH）。
步骤b：3-[(5-乙基-4-苯基噻唑-2-基)氨基]苯甲酸
在100 mL带冷凝管的斜口反应瓶中加入3.9432 g（0.02 mol）3-羧基苯基硫脲、4.5213g（0.02mol）2-Br-1-苯基丁酮和20mL冰醋酸，搅拌均匀，加热至回流，TLC （展开剂: 乙酸乙酯：石油醚 = 4：1） 监测反应进程，反应约24 h。趁热除去反应瓶中的不溶固体，旋蒸部分溶剂。放入通风厨中常温冷却24 h，析出固体，过滤，将所得固体干燥，称量得5.6.163 g的棕黄色粉末，收率为66.54 %，m.p.229 ~ 231 ℃。1H NMR（DMSO-D6，400 MHz），δ：1.25（t，3H，J = 8.0 Hz，CH3），2.85（q，2H，J = 8.0 Hz，CH2），7.32-8.27（m，9H，C6H4，C6H5），10.38（s，1H，COOH）。
步骤c：(3-((5-甲基-4-苯基噻唑-2-基)氨基)苯甲酰基)甘氨酸甲酯
在冰浴条件下加入0.4153g（0.003mol）3 -[（5-乙基-4-苯基噻唑-2-基）氨基]苯甲酸、0.5812g（0.003mol）EDCI、0.4154g（0.003mol）HOBT和18ml无水乙醇至三口烧瓶，反应约3h后，加入0.2502g（0.002mol）甘氨酸甲酯盐酸盐、0.8ml DIPEA、0.0979g（0.0008mol）DMAP和18mlDMF继续冰浴反应半小时，之后改为室温反应，TLC（乙酸乙酯：石油醚 = 4：1）监测反应过程，约21小时反应完毕。边搅拌边缓慢加入冰水，直到溶液由澄清变为浑浊，约为40ml，室温搅拌30min，再放入冰箱析出白色固体。过滤，将所得固体干燥，得0.2112 g的白色粉末，m.p. 135 ~ 137℃。1H NMR（CDCl3，400 MHz），δ：1.30（t，J = 8.0 Hz，3H，CH2CH3），1.41（s，3H，OCH3），2.89（q，J = 8.0 Hz，2H，CH2CH3），4.39（d，J = 4.0 Hz，2H，NHCH2），7.26-8.00（m，9H，C6H5，C6H4）。
步骤d：(3-((5-甲基-4-苯基噻唑-2-基)氨基)苯甲酰基)甘氨酸
50ml三口烧瓶中加入(3-((5-甲基-4-苯基噻唑-2-基)氨基)苯甲酰基)甘氨酸甲酯0.1532g（0.4mmol）、15ml无水乙醇和3ml蒸馏水，用稀NaOH调节pH约为12，37℃搅拌，反应过程监控pH，低于10时及时调为12。TLC （展开剂: 乙酸乙酯：石油醚 = 1：1） 监测反应进程，反应约2h。反应完毕后，过滤，弃滤渣，滤液用稀HCl调Ph为2-3，放入冰箱析出固体，过滤，干燥得0.0865g黄色粉末，收率56.78 %，m.p. 200-202-℃。1H NMR（DMSO-D6，400 MHz），δ：1.22（t，J = 8.0 Hz，3H，CH2CH3），2.82（q，J = 8.0 Hz，2H，CH2CH3），3.93（d，J = 4.0 Hz，2H，NHCH2），7.37-8.07（m，9H，C6H4，C6H5），8.87（t，J = 4.0 Hz，1H，CONH），10.79（s，1H，COOH）。
实施例2 （3-((5-甲基-4-(对甲苯基)噻唑-2-基)氨基)苯甲酰基)甘氨酸
操作同上，得0.0934g的褐色粉末，收率61.28%，m.p.225-228℃。1H NMR（DMSO-D6，400MHz），δ：2.36（s，3H，CH3），2.41（s，3H，CH3），3.93（d，J = 8.0 Hz，2H，NHCH2），7.26-8.08（m，8H，2×C6H4），8.82（t，J = 8.0 Hz，1H，CONH），10.49（s，1H，COOH）。
实施例3 3-((4-(4-氯苯基)-5-甲基噻唑-2-基)氨基)苯甲酰基)甘氨酸
操作同上，得0.09492g的黄色粉末，收率59.18%，m.p.238-240℃。1H NMR（DMSO-D6，400MHz），δ：2.43（s，3H，CH3），3.91（d，J = 8.0 Hz，2H，NHCH2），7.26-8.08（m，8H，2×C6H4），8.75（t，J = 8.0 Hz，1H，CONH），10.25（s，1H，COOH）。
实施例4 （3-（（4-（4-氯苯基）-5-乙基噻唑-2-基）氨基）苯甲酰基）甘氨酸
操作同上，得0.1194g的黄色粉末，收率71.86%，m.p161-163.℃。1H NMR（CDCl3，400MHz），δ：1.28（t，J = 8.0 Hz，3H，CH2CH3），2.18（q，J = 8.0 Hz，2H，CH2CH3），4.26（d，J =8.0 Hz，2H，NHCH2），6.95-7.79（m，9H，2×C6H4）。
实施例5 (3-((4-(4-羟基苯基)-5-甲基噻唑-2-基)氨基)苯甲酰基)甘氨酸
操作同上，得0.0772g的黄色粉末，收率50.36%，m.p.194-197℃。1H NMR（DMSO-D6，400MHz），δ：2.43（s，3H，CH3），3.93（d，J = 8.0 Hz，2H，NHCH2），7.26-8.08（m，8H，2×C6H4），8.75（t，J = 8.0 Hz，1H，CONH），10.25（s，1H，COOH）。
实施例6 （3-（（4-（4-氟苯基）-5-甲基噻唑-2-基）氨基）苯甲酰基）甘氨酸
操作同上，得0.1528g的浅绿色粉末，收率80.59%，m.p.211-213℃。1H NMR（DMSO-D6，400 MHz），δ：2.43（s，3H，CH3），3.93（d，J = 8.0 Hz，2H，NHCH2），7.26-8.08（m，8H，2×C6H4），8.75（t，J = 8.0 Hz，1H，CONH），10.25（s，1H，COOH）。
实施例7 （3-（（5-甲基-4-苯基噻唑-2-基）氨基）苯甲酰基）甘氨酸
操作同上，得0.0962g黄色粉末，，收率81.29 %，m.p.283-285℃。1H NMR（DMSO-D6，400MHz），δ：2.44（s，3H，CH3），3.93（d，J = 8.0 Hz，2H，NHCH2），7.69-8.05（m，9H，C6H4，C6H5），8.77（t，J = 8.0 Hz，1H，CONH），10.24（s，1H，COOH）。
实施例8 (3-((5-甲基-4-(4-(三氟甲基)苯基)噻唑-2-基)氨基)苯甲酰基)甘氨酸
操作同上，得0.1349g黄色粉末，，收率81.29 %，m.p.183-186℃。1H NMR（DMSO-D6，400MHz），δ：2.45（s，3H，CH3），3.95（d，J = 8.0 Hz，2H，NHCH2），7.29-8.10（m，8H，2×C6H4），8.78（t，J = 8.0 Hz，1H，CONH），10.27（s，1H，COOH）。
实施例9（3 -（（5-乙基-4-苯基噻唑-2-基）氨基）苯甲酰基）苯丙氨酸
操作同上，得0.1182g白色粉末，，收率62.74%，m.p.199-202℃。1H NMR（DMSO-D6，400MHz），δ：1.24（t，J = 8.0 Hz，3H，CH2CH3）2.84（q，J = 8.0 Hz，2H，CH2CH3），3.18（m，2H，CH2C6H5），4.63 (m，1H，CH)，7.16-7.97（m，14H，2×C6H5，C6H4），8.66（d，J = 8.0 Hz，1H，CONH），10.27（s，1H，COOH）。
实施例10（3-（（5-甲基-4-（对甲苯基）噻唑-2-基）氨基）苯甲酰基）苯丙氨酸
操作同上，得0.1183g白色粉末，，收率62.79%，m.p.223-225℃。1H NMR（DMSO-D6，400MHz），δ：2.37（s，3H，CH3），2.45（s，3H，CH3），3.10（m，2H，CH2C6H5），4.65(m，1H，CH），7.07-7.98（m，13H，2×C6H4，C6H5），8.66（d，J = 8.0，1H，CONH），10.21（s，1H，COOH）。
实施例11（3-（（4-（4-氯苯基）-5-甲基噻唑-2-基）氨基）苯甲酰基）苯丙氨酸
操作同上，得0.1401g白色粉末，，收率71.34%，m.p.237-239℃。1H NMR（DMSO-D6，400MHz），δ：2.50（s，3H，CH3），3.8（m，2H，CH2C6H5），4.62 (m，1H，CH)，7.17-7.95（m，13H，2×C6H4，C6H5），8.65（d，J = 8.0，1H，CONH），10.29（s，1H，COOH）。
实施例12（3 -（（4-（4-氯苯基）-5-乙基噻唑-2-基）氨基）苯甲酰基）苯丙氨酸
操作同上，得0.1280g白色粉末，，收率66.03%，m.p192-194.℃。1H NMR（DMSO-D6，400MHz），δ：1.23（t，J = 8.0 Hz，3H，CH2CH3）2.84（q，J = 8.0 Hz，2H，CH2CH3），3.07（m，2H，CH2C6H5），4.13(m，1H，CH)，7.19-7.92（m，13H，2×C6H4，C6H5），7.98（s，1H，CONH），10.59（s，1H，COOH）。
实施例13 (3-((4-(4-羟基苯基)-5-甲基噻唑-2-基)氨基)苯甲酰基)苯丙氨酸
操作同上，得0.1048g白色粉末，，收率55.37%，m.p.156-158℃。1H NMR（DMSO-D6，400MHz），δ：2.39（3，3H，CH3），3.11（m，2H，CH2C6H5），4.62 (m，1H，CH），6.83-7.94（m，13H，2×C6H4，C6H5），8.65（d，J = 8.0，1H，CONH），10.18（s，1H，COOH）。
实施例14（3 -（（4-（4-氟苯基）-5-甲基噻唑-2-基）氨基）苯甲酰基）苯丙氨酸
操作同上，得0.1289g白色粉末，，收率67.82%，m.p.228-130℃。1H NMR（DMSO-D6，400MHz），δ：2.45（s，3H，CH3），3.11（m，2H，CH2C6H5），4.62 (m，1H，CH)，7.20-7.96（m，13H，2×C6H4，C6H5），8.65（d，J = 8.0，1H，CONH），10.24（s，1H，COOH）。
实施例15（3 -（（5-甲基-4-苯基噻唑-2-基）氨基）苯甲酰基）苯丙氨酸
操作同上，得0.1190g白色粉末，，收率63.18%，m.p.207-210℃。1H NMR（DMSO-D6，400MHz），δ：2.47（3，3H，CH3），3.11（m，2H，CH2C6H5），4.62 (m，1H，CH)，7.20-7.98（m，14H，2×C6H5，C6H4），8.65（d，J = 8.0，1H，CONH），10.26（s，1H，COOH）。
实施例16 (3-((5-甲基-4-(4-(三氟甲基)苯基)噻唑-2-基)氨基)苯甲酰基)苯丙氨酸
操作同上，得0.1586g白色粉末，，收率56.47%，m.p.193-196℃。1H NMR（DMSO-D6，400MHz），δ：2.46（s，3H，CH3），3.08（m，2H，CH2C6H5），4.62 (m，1H，CH)，7.17-8.66（m，13H，2×C6H4，C6H5），8.65（d，J = 8.0，1H，CONH），10.21（s，1H，COOH）。
实施例17 化合物与靶标酪氨酸激酶Abl(PDB:2GQG)及Bcr-AblT315I（PDB：3IK3）进行对接打分
利用分子模拟软件sybyl对所设计、合成的化合物与靶标Bcr-AblT315I（PDB：3IK3）进行对接。对接强度越强，表明对于靶标激酶的抑制效果越好。测试步骤如下（各步骤的具体操作可根据软件要求进行设置）：
2.1获取蛋白
登陆网址http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do下载蛋白（PDB：3IK3）；将拟测试化合物用chemdream 3D pro 将其用mol2格式保存在SLN文件中。
2.2导入蛋白 按照软件操作方法导入拟对接的蛋白。
2.3蛋白质准备
2.4分析蛋白质结构并准备对接
2.5检测其他设置
2.6指定要对接的配体和提交工作
2.7浏览Surflex-Dock的结果
在结束所有相互作用对接运行后，打分结果会主动在Results Browser对话框中弹出，用Application>Docking Suite>Analyze Results可分批次运行中读取结果，并在对话框右上角选择jobname。点击View可以详细参阅这些化学结构式与Abl和Bcr-AblT315I激酶的对接图。
打分结果如下：
化合物编号 Abl（2GQG） Abl<sup>T315I</sup>（3IK3）
实施例1 6.7384 4.1356
实施例2 7.7483 4.5895
实施例3 7.0082 5.1886
实施例4 7.0082 4.4911
实施例5 7.8749 6.4907
实施例6 5.4287 4.1189
实施例7 9.9196 4.3985
实施例8 8.0825 5.0091
实施例9 9.6593 6.7628
实施例10 11.0930 8.2173
实施例11 6.0868 6.7832
实施例12 7.3708 6.2569
实施例13 10.1033 8.0148
实施例14 7.0016 7.3846
实施例15 9.6431 8.2938
实施例16 6.9344 8.7044
打分结果显示本申请的化合物对于Abl激酶和Bcr-AblT315I激酶具有良好的结合能力，能够抑制Abl和Bcr-AblT315I的活性，进而有效地解决T315I突变引起的耐药问题，可作为抗T315I突变的新型Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂。
实施例18 目标蛋白激酶活性测试结果
ADP-GloTM激酶检测
1 仪器与试剂
工作台 苏州净化设备有限公司
酶标仪 美国Biotek仪器有限公司
移液枪 美国ThermoFisher SCIENTIFIC
转移摇床 中国海门其林贝尔仪器制造有限公司
全白384孔板 德国Greiner
ADP-GloTM+ABL Kinase Enzyme System Promega（北京）生物技术有限公司
ADP-GloTM+ABLT315I Kinase Enzyme System Promega（北京）生物技术有限公司
2 激酶检测缓冲液的准备
按照说明书配置激酶缓冲液和/或激酶检测试剂，激酶检测试剂配好后应立即使用，或者分装存储于-20℃。配好的试剂经过几次冻融后检测信号没有损失。
3 制作ATP-ADP标准转化曲线
3.1用1X激酶反应缓冲液（试剂盒提供的是5X激酶反应缓冲液，需提前稀释）稀释试剂盒提供的Ultra Pure ATP和ADP，制成1ml 1mM ATP和500ul 1mM ADP（1ml 1mM ATP：取100ulATP,900ul 1 X 激酶缓冲液配成；500ul 1mM ADP：取50ul ADP，450ul 1X激酶缓冲液配成）。
3.2将第一步配好的1ml 1mM ATP和500ul 1mM ADP按表3加入到0.2 ml的EP管的A1-A12孔中混匀，这是1mM 系列。
3.3在B1-B12孔中稀释成25µM系列，用来制作ABL1的ATP-ADP转化标准曲线。
3.4在C1-C12孔中稀释成5µM系列，用来制作ABLT315I的ATP-ADP转化标准曲线。
3.5从所配的25µM、5µM ATP+ADP系列0.2ml EP管B1-B12移5ul至384孔板的A1-A12,B1-B12；0.2ml EP管C1-C12移5ul至384孔板的C1-C12,D1-D12。
3.6室温孵育40min。
3.7 384孔板每孔加入5ul ADP-GloTM试剂来终止激酶反应，同时耗尽未转化的ATP，只留下ADP。
3.8按表4，室温孵育一定时间。
3.9加入10ul激酶检测试剂将ADP转化为ATP，并引进荧光素酶和荧光素来检测ATP（384孔板A1-A12,B1-B12每孔加入10ul激酶检测试剂。
室温孵育30-60min，孵育时间长短取决于激酶反应过程中使用的ATP浓度（都为30min），用化学发光仪进行检测。
4 优化激酶反应条件
激酶的量可以参照说明书的用量使用（ABLT315I为1.4ng，ABL1为1ng）。
5利用ADP-GloTM激酶检测筛选化合物步骤
5.1试剂准备
药物稀释：取8个1.5ml EP 管，2-8号加双蒸水600ul，1号加双蒸水1110.18ul，测试化合物9.22ul，倍半稀释，即可。
药物浓度为： 2 4 8 16 32 64 128 256 （µMol/L）
DMSO稀释：取8个1.5ml EP 管，2-8号加双蒸水600ul，1号加双蒸水1110.18ul，DMSO9.22ul，倍半稀释，即可。
1X Buffer：取1.5ml EP管，加800ul 双蒸水，200ul 5 X Buffer，0.5ul DTT，混匀，即可（配制前先算用量）。
62.5µM ATP：取1.5ml EP管，加397.5ul 1X Buffer，2.5ul Ultra Pure ATP，混匀，即可。
12.5µM ATP:取1.5ml EP管，加200ul 1X Buffer，再加配好的25µM ATP取50ul，混匀，即可。
2.5ng/ul ABL1蛋白激酶：取1.5ml EP管，加117.0ul 1X Buffer，加3.0ul ABL1,Active，混匀，即可。
3.5ng/ul ABLT315I蛋白激酶：取1.5ml EP管，加115.8ul 1X Buffer，加4.2ulABLT315I ,Active，混匀，即可。
5.2 ABLT315I激酶检测
1.取0.2ml EP管，记为①，不加底物，加18ul 3.5ng/ul ABLT315I蛋白激酶，18ul 1XBuffer，36 ul 12.5µM ATP，混匀，待用。
2.取0.2ml EP管，记为②，加90 ul 3.5ng/ul ABLLT315I蛋白激酶，90 ul底物，180ul 12.5µM ATP，混匀，待用。
3. 取8个0.2ml EP管（1号EP管），从低到高加2ul DMSO
取8个0.2ml EP管（2号EP管），从低到高加2ul DMSO
取8个0.2ml EP管（3-6号EP管），从低到高加2ul 化合物（4个化合物）
3. 1号0.2ml EP管，每孔加8ul 0.2ml① EP管溶液，2-6号0.2ml EP管，每孔加8ul ②0.2ml EP管溶液，混匀，转至384孔板，每孔5ul。
5.室温孵育60min。
6.每孔加入5ul ADP-GloTM，孵育40min。
7.每孔加入10ul激酶检测试剂，孵育30min，检测。
部分化合物的蛋白激酶Bcr-AblT315I活性如下表所示：
ND：Not detected。
实施例19 体外抗肿瘤活性测试
细胞株选用人慢性髓系白血病细胞(K562)，K562耐伊马替尼细胞(K562/R)，人肝癌细胞（HepG-2），人非小细胞肺癌细胞（A549），人正常肝细胞（L02）。
1）K562细胞、K562/R细胞、HepG-2细胞、A549细胞和L02细胞分别用含1%双抗和10%FBS的1640培养基培养于含5%CO2、37℃的饱和湿度培养箱中，2天传代一次。K562/R细胞用含1%双抗和10%FBS、4µMol/L的1640培养基于含5%CO2、37℃的饱和湿度培养箱中，2-3天传代一次。
选取对数生长期的K562细胞、K562/R细胞，用含10%FBS的1640培养基配成浓度为4×104/mL的细胞悬液，接种到96孔培养板中，每孔加入100μL细胞悬液。在5%CO2、37℃的饱和湿度培养箱中继续培养24h后，分别加入化合物浓度为8、16、32、64、128µM的培养基100μL（设置3个副孔），继续培养48h后，加入20μL MTS，放入培养箱培养4h后，用酶标仪于490nm波长处测定吸光度值(OD)。平行重复3次。
选取对数生长期的HepG-2细胞、A549细胞、L02细胞，用含10%FBS的培养基配成浓度为5×104/mL的细胞悬液，接种到96孔培养板中，每孔加入100μL细胞悬液。在5%CO2、37℃的饱和湿度培养箱中继续培养24h后，移弃培养液，再分别加入化合物浓度为8、16、32、64、128uM的培养基200μL（设置3个副孔），继续培养48h后，加入20μL MTT，放入培养箱培养4h后，弃去培养基，每孔加入150uL DMAO，置摇床上低速、避光振摇10min使结晶溶解完全，用酶标仪于490nm波长处测定吸光度值(OD)。平行重复3次。
细胞存活率(cell viability)计算公式如下：Cell viability=(ODDrug-ODBlank)/(ODControl-ODBlank )×100%
测试结果如下：
由上表可知，本发明化合物对于CML细胞株K562和K562耐伊马替尼细胞(K562/R)有良好的抑制作用，即对于具有伊马替尼耐药性的K562细胞同样具有良好的抑制活性；同时对于人正常肝细胞L02具有较低的毒性，在抑制癌细胞的同时，能够避免或减少对人体的毒副作用。

Claims (10)

1.一种式I化合物或其药学上可接受的盐，其具有如下结构：
I
其中：R1各自独立地选自卤素、-OH、-NO2、-CN、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基；
R2选自氢、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基；
R3选自氢、-OH、-NO2、-CN、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C6-C10芳基C1-C6烷基；
n选自0、1、2、3或4。
2.如权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐，R1各自独立地选自卤素、-OH、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷基，优选为甲基、氯、氟、羟基、三氟甲基；n选自0、1或2，优选为0或1。
3.如权利要求1或2所述的式I化合物或其药学上可接受的盐，R2选自氢、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基，优选为甲基、乙基、三氟甲基；R3选自氢、-OH、卤素、C1-C4烷基、C1-C6烷氧基、C1-C4卤代烷基、C1-C4卤代烷氧基、苄基，优选为氢、苄基。
4.如权利要求1或2所述的式I化合物，其选自如下化合物：
。
5.一种制备如权利要求1所述的式I化合物的方法，其反应路线如下：
；
其中，R1、R2、R3和n的定义如权利要求1所述，R4选自C1-C6烷基或C1-C6卤代的烷基。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于包括如下反应步骤：
步骤一：向反应器中加入硫氰酸铵和丙酮，搅拌均匀，然后滴加苯甲酰氯, 溶液由澄清变为白色浑浊液，加热至回流，分批加入间氨基苯甲酸，待反应完毕后，冷却，过滤，将所得固体干燥，得3-（3-苯甲酰基硫脲基）苯甲酸（即中间体1）；
步骤二：向反应瓶中加入3-（3-苯甲酰基硫脲基）苯甲酸和碱性水溶液，使pH=13，搅拌，加热回流，直至反应完毕，冷却至室温，加入稀盐酸，将pH调到2，静置24 h，析出固体，过滤，将固体干燥，得3-羧基苯基硫脲（即中间体2）；
步骤三：向反应瓶中加入3-羧基苯基硫脲、取代的2-Br-1-苯基烷基酮和冰醋酸，搅拌均匀，加热至回流，反应完毕后，趁热除去反应瓶中的不溶固体，旋蒸部分溶剂，放入通风厨中常温冷却24 h，析出固体，过滤，将所得固体干燥，得中间体噻唑氨基苯甲酸衍生物（3）；
步骤四：在冰浴条件下加入中间体噻唑氨基苯甲酸衍生物、EDCI、HOBT和无水乙醇至反应瓶中，反应2-4 h，加入盐酸盐、DIPEA、DMAP和DMF继续冰浴反应半小时，之后改为室温反应，直至反应完毕，再边搅拌边缓慢加入冰水，直到溶液由澄清变为浑浊，室温搅拌0.5-1.5 h，再放入冰箱析出白色固体，过滤，将所得固体干燥，得中间体4;
步骤五：向反应瓶中加入中间体4、无水乙醇和蒸馏水，用稀NaOH调节pH至为11-13，37℃搅拌，反应过程监控pH，低于10时及时调为11-13；TLC 监测反应进程，反应完毕后，过滤，弃滤渣，滤液用稀HCl调pH为1-4，放入冰箱析出固体，过滤，干燥得式I化合物。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：
步骤一的间氨基苯甲酸、硫氰酸铵和苯甲酰氯的摩尔比为1 : 1-1.5 : 1-1.5，优选为1 : 1.2 : 1.3；
步骤二碱性水溶液为10% NaOH水溶液，稀盐酸浓度为4 mol/L；
步骤三的3-羧基苯基硫脲和取代的2-Br-1-苯基烷基酮的摩尔比为1 : 1-1.2；优选为1 : 1；
步骤五中反应过程中的pH优选为12，后处理过程中的pH优选为2-3，稀NaOH为5%-30%的NaOH水溶液，稀HCl为5%-15%的盐酸溶液。
8.一种药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项的式I所示化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体、赋形剂。
9.权利要求1-5中任一项所述的化合物或权利要求8所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途，优选地，所述癌症是以Bcr-Abl酪氨酸激酶为靶点的癌症，尤其是针对T315I 突变的 Bcr-Abl酪氨酸激酶为靶点的癌症。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述癌症选自人慢性粒细胞白血病、肝癌、非小细胞肺癌，优选为人慢性髓系白血病、K562耐伊马替尼细胞株。
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