CN109316463B

CN109316463B - 一种复合纳米粒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109316463B
Application number: CN201810880186.2A
Authority: CN
Inventors: 蔡宇; 黄青青; 王冰月; 李倩文; 张荣华; 杨丽; 杜曼玲; 马倩倩
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2018-08-03
Filing date: 2018-08-03
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2038-08-03
Also published as: WO2020024304A1; CN109316463A; US20210069120A1

Abstract

本发明公开了一种复合纳米粒及其制备方法和应用，所述复合纳米粒为同时包载补骨脂素、异补骨脂素和紫杉醇的聚合物‑脂质纳米粒，其制备方法包括如下步骤：S1.将大豆卵磷脂和DSPE‑PEG2000溶于水相中，混匀，预热；S2.将补骨脂素、异补骨脂素、紫杉醇与PLGA溶于油相中，混匀后注入到S1的水相中，加热混匀后即得复合纳米粒。所述纳米粒具结构完整性高、稳定性好、储存性好、稳定性和生物相容性高，具有空缓释作用，包封率达80%以上，可有效提高药效，抗乳腺癌肿瘤转移，在癌症治疗方面具有较大的应用前景。

Description

一种复合纳米粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及纳米药物领域，更具体地，涉及一种纳米药物及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤是当今危害人类健康的主要疾患之一。肿瘤侵袭和转移是恶性肿瘤最普遍的一种生物学行为和最本质的特征，也是影响肿瘤患者生存和愈后的关键因素。因此，抗肿瘤药物是本领域技术人员不断研发的课题。近年来人们转向其他途径寻找逆转肿瘤细胞MDR的有效方法。由于纳米粒子的微小体积和特殊结构，其在改善药物吸收、分布、代谢、***以及毒性等方面显示出独特的优势，因此纳米给药***及纳米粒的制备日渐受到重视。纳米给药***包括纳米脂质体、固体脂质纳米粒(solidlipidnanoparticle，SLN)、聚合物纳米粒(Polymernanoparticle，PLN)、纳米球、纳米囊和微乳等，纳米给药***的粒径一般介于10～500nm之间，通过纳米给药***可起到逆转肿瘤MDR作用。纳米脂质体具有类似生物膜的结构，亲脂或亲水性药物均可设计成脂质体，其具有被动靶向特性，使用聚合物对纳米脂质体修饰可达到不同的治疗需求，如靶向、缓释、环境依赖性等。微乳是由乳化剂、助乳化剂、油相和水相组成的光学上各向同性及热力学稳定的液-液分散体系，药物在微乳中的分散性好，其对难溶性药物具有增溶作用，从而可提高生物利用度。SLN是由脂质材料制备的纳米制剂，且SLN可促进药物穿透P-gp富集的血脑屏障，诸多研究基本集中于化疗药物SLN的制备及其作用机制的研究，现有技术有将抗P-gp小分子抑制剂(如维拉帕米、环孢素A、GG918等)和抗肿瘤药物一起制备SLN的。PLN是以双(2-乙基己基)磺基丁二酸钠为单体，经聚合反应制备的一种亲水性胶团，由于非降解性材料具有潜在生物毒性，目前逐步以聚甲氰基丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚酰胺等为材料制备能定向于溶酶体的可生物降解PLN等。

关于化疗药物纳米粒的研究及产品已有报道和上市，如Abraxane是第一个非溶解纳米白蛋白结合化疗药物，是用白蛋白包裹紫杉醇的纳米颗粒，用于治疗乳腺癌转移；Gliadelwafer是聚苯丙生20包裹卡莫司汀的纳米颗粒，用于治疗高分化恶性神经胶质瘤；DaunoXome是柔红霉素脂质体，用于治疗卡波西肉瘤；Myocet是阿霉素脂质体，与环磷酰胺联用，用于治疗转移性乳腺癌；DOXIL是多柔比星脂质体，用于治疗转移性卵巢癌；阿霉素半乳糖胺与N-(2-羟丙基)异丁烯酰基酰胺的共聚物PK2用于治疗肝癌。以上载药***的各种药物制剂具有一定逆转MDR活性作用，但也存在一些问题，如载药量低、稳定性差及易泄漏等。

应用可生物降解的PLN可有效提高药物稳定性，从而起到缓释和控释的作用。目前可用的生物降解载体材料主要有可生物降解的高分子聚合物和天然大分子体系，可生物降解的高分子聚合物包括聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PLG)、聚丙交酯-乙交酯(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚原酸酯(POE)、聚氰基丙烯酸烷基酯(PACA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等；天然大分子体系包括蛋白质、多糖、明胶、聚丙烯酰淀粉、甲壳素及衍生物、海藻酸钠、明胶、白蛋白、卵磷脂、胆固醇等。就上述聚合物，聚丙交酯-乙交酯(PLGA)是由乳酸和羟基乙酸聚合而成的高分子化合物，具有毒性低、成粒性好、生物相容性的优点，PLGA载体材料可在水溶体系中通过酯键的断裂发生降解，降解产生的乳酸和羟基乙酸最终在体内进一步降解成水和二氧化碳排出体外，并通过PLGA自身降解速率达到调节包载药物释放，使药物在较长时间内得以稳定速率释放，维持稳定血药浓度。PLGA能增加脂溶性药物的水溶性，提高脂溶性药物的生物利用度，PLGA已被美国FDA批准用于药物载体等领域中，通过改变PLGA中乳酸和羟基乙酸的比例可影响和改变PLGA降解速率。目前，PLGA纳米粒的制备方法中较为成熟的是复乳溶剂挥发法，对PLGA纳米粒制剂研究报道只见对化疗药物的制备方法和理化性质研究，而对PLGA纳米载体包载耐药逆转剂并应用于抗肿瘤MDR的研究尚未见报道。

补骨脂素(PSO)为从豆科植物中提取的有效成分，脂溶性作用较强，是一种钙离子通道阻滞剂，同时可以抑制P-gp蛋白的泵出，协助化疗药物逆转肿瘤细胞多药耐药作用。紫杉醇是具有抗癌活性的二萜生物碱类化合物，在临床上广泛用于乳腺癌、卵巢癌和肺癌等治疗。目前，补骨脂素和紫杉醇都有单独作用于治疗乳腺癌的研究，但补骨脂素水溶性差，生物利用度低，而紫杉醇具有骨髓功能抑制、过敏反应、心脏毒性和肺炎等副作用。因此需要寻求一种有效制剂，来增加补骨脂素的溶解性，提高生物利用度，同时减少紫杉醇的毒副作用，增强抗肿瘤效果。同时，对于不同的活性药物，PLN制剂的包封率和稳定性等存在显著差异，针对具体的PLN制剂，如何提高其中活性药物的包封率和稳定性等，仍然是目前研究的热点、重点和难点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术中抗肿瘤药物及PLN制剂存在的缺陷和不足，提供一种包封率和稳定性高的复合纳米颗粒，可有效提高药效，逆转肿瘤MDR。

本发明的第一个目的是提供一种复合纳米粒。

本发明的第二个目的是提供所述复合纳米粒的制备方法。

本发明的第三个目的是提供所述复合纳米粒的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种复合纳米粒，为同时包载补骨脂素、异补骨脂素和紫杉醇的聚合物-脂质纳米粒。

优选地，所述复合纳米粒的粒径为96.89±2.12nm。

上述复合纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

S1.将大豆卵磷脂和DSPE-PEG2000溶于水相中，混匀，预热；

S2.将补骨脂素、异补骨脂素、紫杉醇与PLGA溶于油相中，混匀后注入到S1的水相中，加热混匀后即得复合纳米粒。

本发明所述的复合纳米粒是一种基于脂质纳米粒和聚合物纳米粒的新兴纳米药物输送***。在结构上，脂质聚合物纳米粒可分为疏水性的聚合物核和脂质分子层形成的亲水壳，改善纳米粒的稳定性同时增强细胞摄取并提高封装效率。用于脂质聚合物纳米粒制备的聚合物聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)具有良好的生物相容性；两亲性磷脂带有亲水基和疏水链，在自组装过程中，磷脂疏水链形成疏水核心，将聚合物或者药物包载于其中，亲水基形成脂质单分子层或者双分子层；或者添加聚乙二醇-脂质(DSPE-PEG₂₀₀₀)，可嵌入脂质单层中，在脂质壳外形成聚乙二醇化隐形层，从而改善静电和空间稳定性并延长循环时间。

优选地，所述水相为无水乙醇。

优选地，所述油相为乙腈。

优选地，S1所述大豆卵磷脂和DSPE-PEG2000的质量比为5～6：1。

优选地，S2所述补骨脂素、异补骨脂素与紫杉醇的质量比为2:2:1。

优选地，所述补骨脂素、异补骨脂素、紫杉醇与的PLGA的质量比为2～4:2～4:1～2:10

优选地，S1所述预热为70℃加热3min。

优选地，S2所述加热混匀为70℃加热搅拌90min。

本发明还请求保护所述复合纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选地，所述肿瘤为乳腺癌。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种同时包载补骨脂素、异补骨脂素和紫杉醇的聚合物-脂质纳米粒，所述纳米粒结构完整性高、稳定性好、储存性好、稳定性和生物相容性高，具有空缓释作用，包封率达80％以上，可有效提高药效，抗乳腺癌肿瘤转移，在癌症治疗方面具有较大的应用前景。

附图说明

图1为PTX对MDA-MB-231的生长抑制作用(48h)。

图2为PSO对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用。

图3为I-PSO MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用。

图4为Blank PLN对MDA-MB-231细胞的毒性作用(48h)。

图5为PTX、PTX+PSO+I-PSO及(PTX+PSO+I-PSO)-PLN对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用的影响。

图6为不同药物组分处理MDA-MB-231细胞后细胞凋亡检测结果；第一行从左往右依次为空白对照、Blank PLN、PTX和PSO，第二行从左往右依次为I-PSO、PTX+PSO+I-PSO和(PTX+PSO+I-PSO)-PLN。

图7为不同药物组分下MDA-MB-231细胞划痕检测结果。

图8为不同药物组分下MDA-MB-231细胞侵袭检测结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明的细胞培养按照以下操作步骤进行：

1、细胞的增殖与传代

本发明所用的人乳腺癌敏感株MDA-MB-231及其耐药细胞株在CO₂浓度为5％，湿度为95％的37℃恒温CO₂培养箱中进行培养，所使用的培养基为含有10％胎牛血清，1％青链霉素双抗的常规DMEM培养基。每日镜下观察培养瓶中培养基颜色变化，注意是否有浑浊，观察细胞状态，包括细胞的形态、密度以及伸展情况，待培养基颜色变淡后，进行换液。若细胞培养过程中发现细胞污染，立即丢弃所有细胞，并对细胞间进行彻底消毒，重新复苏细胞，待细胞状态良好，方可用于试验。

①每日显微镜下观察细胞，直至生长至80～90％的饱和度，准备进行细胞传代；

②对超净台和实验所用的物品进行30分钟的紫外线照射消毒；

③移除培养液，加入PBS(2mL/瓶)，仔细冲洗残留于培养瓶中的培养液以及细胞；

④移除PBS，每瓶加入1mL含有EDTA的0.25％胰蛋白酶，培养箱中静置消化2～3分钟；

⑤显微镜下观察细胞变化，直至细胞收缩变圆，细胞间隙增大，部分细胞脱落，则可认为消化完全，加入与胰酶等量的含有血清的细胞培养基进行终止消化，巴氏吸管反复吹打，直至贴于瓶壁的细胞完全脱落；

⑥将吹打下来的细胞以及胰酶培养基混合液转移至15mL离心管，进行L000rpm离心，离心时间为5分钟。

⑦丢弃离心管中上清液，注意保护离心管底白色沉淀物为离心下来的细胞，防止丢弃细胞，在离心管中加入2mL新鲜细胞培养液，巴氏吸管反复吹打40次，使细胞重悬，形成单细胞悬液；

⑧将重悬为单细胞悬液的细胞，吸取1mL加入到新的25cm²细胞培养瓶，并在培养瓶中加入3mL新鲜培养基；

⑨分别吸取重悬细胞1mL，加入到上述准备好的培养瓶中，并将培养瓶放平后左右上下轻微晃动，使细胞均匀铺满培养瓶底面；

⑩镜下观察细胞，标记细胞名称及传代时间，再次置于培养箱中继续培养；将超净台整理整齐后再用75％的酒精擦拭超净台台面，熄灭酒精灯，紫外消毒。

2、细胞计数

①将细胞计数板及盖玻片用75％酒精擦拭干净，在酒精灯火焰上左右晃动数次烘干后，将盖玻片完全覆盖在计数板上，放平，勿使盖玻片滑动；

②按照细胞传代方法加入胰蛋白酶消化细胞，将收集的细胞转移到10mL无菌离心管中并且进行单细胞悬液的制备；

③移液枪吸取10μL单细胞悬液小心注入计数板上和盖玻片之间；

④显微镜下对细胞计数板中四个象限的细胞进行细胞计数；

⑤记录细胞计数结果，计算每瓶细胞密度。

3、细胞冻存

①选取生长状态良好的3～4代细胞进行冻存，在冻存细胞之前的24小时对细胞进行培养基的更换；

②吸出培养瓶中的培养基，应用PBS对瓶中细胞进行冲洗，将培养瓶放平，轻柔地上下左右晃动培养瓶，小心冲洗细胞，减少残留培养基；

③对细胞进行常规消化，待细胞完全消化，加入含有血清的DMEM高糖培养基，终止消化过程，巴氏吸管反复吹打成单细胞悬液；

④应用移液枪将吹打好的细胞悬液移入15mL离心管中进行1500rpm离心，离心时间设定为5分钟；

⑤移液枪移除上清液，注意保护离心管底细胞，加入新配好的细胞冻存液，巴氏吸管吹打，使其成为单细胞悬液；

⑥应用移液枪吸取1mL吹打好的细胞悬液，分装到细胞冻存管中，每管1mL，酒精灯消毒，封口膜封口；

⑦冻存管壁记录冻存信息，包括冻存细胞名称、代数以及冻存日期；

⑧将分装好细胞的冻存管置于冰箱4℃，30分钟后放入冰箱-20℃，1～2h后将冻存细胞装入冻存盒，做好记录，转移至-80℃冰箱冻存，次日转移至液氮罐中保存。

实施例1聚合物-脂质纳米粒(PLN)的制备

1、配置反应液

大豆卵磷脂(PC)：称取适量PC溶于无水乙醇中，配成40mg/mL；

DSPE-PEG2000：称取适量DSPE溶于无水乙醇中，配成5mg/mL；

补骨脂素(PSO)：称取适量补骨脂素溶于乙腈中，配成6mg/mL；

异补骨脂素(I-PSO)：称取适量补骨脂素溶于乙腈中，配成6mg/mL；

紫杉醇(PTX)：称取适量补骨脂素溶于乙腈中，配成6mg/mL；

PLGA：称取适量PLGA溶于乙腈中，配成10mg/mL。

2、制备方法

S1.取量筒称取18mL无水乙醇于烧杯中，按步骤1中配好的溶液浓度计算相应的体积加入大豆卵磷脂(PC)25.5mg，DSPE-PEG2000 4.5mg，混匀，70℃预热3min；

S2.取注射针按步骤1中配好的溶液浓度计算相应的体积，把补骨脂素2mg、异补骨脂素2mg、紫杉醇1mg(质量比2:2:1)和PLGA 10mg混匀后注入到步骤S1的水相中，70℃加热搅拌90min，制备得到同时包载补骨脂素、异补骨脂素和紫杉醇三种药物的聚合物-脂质纳米粒(PTX+PSO+I-PSO)-PLN。

同时，按照上述制备方法，唯一不同在于S2仅取PLGA加入到S1的水相中，制备得到不包载药物的空白聚合物-脂质纳米粒Blank PLN。

3、结果

制备的纳米粒约为96nm；PDI为0.244，说明纳米粒的粒度分散性良好；Zeta电位在-25mV左右，表明纳米子之间静电排斥作用较大，有利于维持溶液体系稳定，防止纳米粒子聚集沉淀；将PLN置于PBS，RPMI1640培养基，10％胎牛血清的完全培养基，10％(v/v)人血浆中，于37℃温育120小时，纳米粒的粒径和多分散性没有显著变化，这表明由PEG化的脂质单分子层稳定了聚合物核心并防止了纳米粒子在120小时内聚集，稳定性高；经测试，药物的包载率高达82％。将上述制备得到的复合纳米粒进行实施例4～7所述细胞试验。

实施例2

1、配置反应液

大豆卵磷脂(PC)：称取适量PC溶于无水乙醇中，配成40mg/mL；

DSPE-PEG2000：称取适量DSPE溶于无水乙醇中，配成5mg/mL；

补骨脂素(PSO)：称取适量补骨脂素溶于乙腈中，配成6mg/mL；

紫杉醇(PTX)：称取适量补骨脂素溶于乙腈中，配成6mg/mL；

PLGA：称取适量PLGA溶于乙腈中，配成10mg/mL。

2、制备方法

S1.取量筒称取18mL无水乙醇于烧杯中，按步骤1中配好的溶液浓度计算相应的体积加入大豆卵磷脂(PC)27mg，DSPE-PEG2000 4.5mg，混匀，70℃预热3min；

3、结果

制备的纳米粒约为95nm；PDI为0.249，说明纳米粒的粒度分散性良好；Zeta电位在-26mV左右，表明纳米子之间静电排斥作用较大，有利于维持溶液体系稳定，防止纳米粒子聚集沉淀；将PLN置于PBS，RPMI1640培养基，10％胎牛血清的完全培养基，10％(v/v)人血浆中，于37℃温育120小时，纳米粒的粒径和多分散性没有显著变化，这表明由PEG化的脂质单分子层稳定了聚合物核心并防止了纳米粒子在120小时内聚集，稳定性高；经测试，药物的包载率高达85％。

实施例3

1、配置反应液

大豆卵磷脂(PC)：称取适量PC溶于无水乙醇中，配成40mg/mL；

DSPE-PEG2000：称取适量DSPE溶于无水乙醇中，配成5mg/mL；

补骨脂素(PSO)：称取适量补骨脂素溶于乙腈中，配成6mg/mL；

紫杉醇(PTX)：称取适量补骨脂素溶于乙腈中，配成6mg/mL；

PLGA：称取适量PLGA溶于乙腈中，配成10mg/mL。

2、制备方法

S2.取注射针按步骤1中配好的溶液浓度计算相应的体积，把补骨脂素4mg、异补骨脂素4mg、紫杉醇2mg(质量比2:2:1)和PLGA 10mg混匀后注入到步骤S1的水相中，70℃加热搅拌90min，制备得到同时包载补骨脂素、异补骨脂素和紫杉醇三种药物的聚合物-脂质纳米粒(PTX+PSO+I-PSO)-PLN。

3、结果

制备的纳米粒约为102nm；PDI为0.25，说明纳米粒的粒度分散性良好；Zeta电位在-27mV左右，表明纳米子之间静电排斥作用较大，有利于维持溶液体系稳定，防止纳米粒子聚集沉淀；将PLN置于PBS，RPMI1640培养基，10％胎牛血清的完全培养基，10％(v/v)人血浆中，于37℃温育120小时，纳米粒的粒径和多分散性没有显著变化，这表明由PEG化的脂质单分子层稳定了聚合物核心并防止了纳米粒子在120小时内聚集，稳定性高；经测试，药物的包载率高达87％。

实施例4不同药物或制剂对MDA-MB-231的作用

1、紫杉醇(PTX)对MDA-MB-231的增殖抑制作用

将4×10^3个/孔MDA-MB-231细胞接种于96孔板，100μL/孔，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h，24h后去上清液，加入200μL含药培养基。MDA-MB-231细胞中加入PTX的终浓度为0.0039μmol/L、0.0078μmol/L、0.0156μmol/L、0.03125μmol/L、0.0625μmol/L、0.125μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L，同时设对照组(加入等量培养液)和空白调零组，每孔6个复孔，置于CO₂培养箱中继续培养48h，实验终止前4h加入MTT溶液20μL/孔(5mg/mL)，4h后每孔加入DMSO150μL，充分震荡10min，于酶标仪570nm处测量OD值。

以空白组调零，实验重复3次，计算细胞存活率及IC50：

细胞存活率＝(药物处理组OD值/对照组OD值)×100％

结果如图1所示，细胞存活率随着PTX浓度升高而减少，IC50为1.02μmol/L。

2、补骨脂素(PSO)对MDA-MB-231的增殖抑制作用

将4×10^3个/孔MDA-MB-231细胞接种于96孔板，100μL/孔，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h，24h后去上清液，加入200μL含药培养基。MDA-MB-231细胞中加入PSO的终浓度为100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L、3.125μmol/L、1.5625μmol/L、0.78μmol/L、0.39μmol/L，同时设对照组(加入等量培养液)和空白调零组，每孔6个复孔，置于CO2培养箱中继续培养48h，实验终止前4h加入MTT溶液20μL/孔(5mg/mL)，4h后每孔加入DMSO150μL，充分震荡10min，于酶标仪570nm处测量OD值。

以空白组调零，实验重复3次，计算细胞存活率：

细胞存活率＝(药物处理组OD值/对照组OD值)×100％

结果如图2所示，在0.39～100μmol/L浓度范围内PSO对MDA-MB-231细胞作用48h无明显毒性。

3、异补骨脂素(IPSO)对MDA-MB-231的增殖抑制作用

将4×10^3个/孔MDA-MB-231细胞接种于96孔板，100μL/孔，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h，24h后去上清液，加入200μL含药培养基。MDA-MB-231细胞中加入IPSO的终浓度为100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L、3.125μmol/L、1.5625μmol/L、0.78μmol/L、0.39μmol/L，同时设对照组(加入等量培养液)和空白调零组，每孔6个复孔，置于CO₂培养箱中继续培养48h，实验终止前4h加入MTT溶液20μL/孔(5mg/mL)，4h后每孔加入DMSO150μL，充分震荡10min，于酶标仪570nm处测量OD值。

以空白组调零，实验重复3次，计算细胞存活率：

细胞存活率＝(药物处理组OD值/对照组OD值)×100％

结果如图3所示，在0.39-100μmol/L浓度范围内PSO对MDA-MB-231细胞作用48h无明显毒性。

4、Blank PLN对MDA-MB-231细胞的毒性作用

将4×10^3个/孔MDA-MB-231细胞接种于96孔板，100μL/孔，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h，24h后去上清液，加入200μL含药培养基。以补骨脂素为基准，MDA-MB-231细胞中加入空白PLN的终浓度为200μmol/L、100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L、3.125μmol/L、1.5625μmol/L、0.78μmol/L，同时设对照组(加入等量培养液)和空白调零组，每孔6个复孔，置于CO2培养箱中继续培养48h，实验终止前4h加入MTT溶液20μL/孔(5mg/mL)，4h后每孔加入DMSO150μL，充分震荡10min，于酶标仪570nm处测量OD值。

空白组调零，实验重复3次，计算细胞存活率：

细胞存活率＝(药物处理组OD值/对照组OD值)×100％

结果如图4所示，在0.39～100μmol/L浓度范围内，空白PLN对MDA-MB-231敏感细胞株无明显毒性。

5、PTX、PTX+PSO+I-PSO及(PTX+PSO+I-PSO)-PLN对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用的影响

分别将不同剂量的PTX、PTX+PSO+I-PSO和(PTX+PSO+I-PSO)-PLN加入细胞中，置于CO₂培养箱中继续培养48h，酶标仪检测OD值，细胞存活率。

细胞存活率＝(药物处理组OD值/对照组OD值)×100％

结果如图5所示，与PTX和PTX+PSO+I-PSO组相比，(PTX+PSO+I-PSO)-PLN作用于MDA-MB-231细胞的IC50为0.063μmol/L，对细胞的毒性作用明显增强。

实施例5流式细胞仪检测不同药物组分对MDA-MB-231细胞的凋亡作用

1、方法

分别用Blank PLN、PTX、PSO、I-PSO、PTX+PSO+I-PSO和(PTX+PSO+I-PSO)-PLN作用MDA-MB-231细胞后，同时设置不用药物处理的空白对照，收集细胞，分别加入Annexin V-FITC缓冲液和碘化丙啶(PI)染色液，用流式细胞仪检测细胞凋亡，绿色荧光为Annexin V-FITC，红色荧光为PI。晚期凋亡细胞和死亡细胞以Annexin V-FITC/PI双染色为主，在流式细胞分析图上为右上区位置，早期凋亡细胞以AnnexinV-FITC染色为主，在流式细胞分析图上为右下区位置，实验重复3次。

2、结果

检测结果如图6和表1所示，空白PLN凋亡率为0.3％，说明空白PLN对细胞无明显毒性作用，这与MTT实验结果一致。除了空白PLN，与空白对照组相比，不同给药组都有促进MDA-MB-231细胞凋亡作用，尤其是(PTX+PSO+I-PSO)-PLN组，凋亡率达45.3％。

表1不同药物组分处理后MDA-MB-231细胞凋亡率(％)

实施例6不同药物组分下MDA-MB-231细胞划痕检测

人乳腺癌细胞MDA-MB-231用0.25％EDTA胰蛋白酶消化，用新鲜的培养液吹下细胞制成细胞悬液，用血球计数板计数，并调整细胞浓度到2×10⁵/mL，按2×10⁵细胞数/孔铺于12孔板中过夜，12孔板底部事先画好标记线，当细胞长到90％汇合度时，用灭菌20μL移液器枪头对细胞进行划痕损伤，每孔于中线上划痕1次。用PBS洗三遍，以除去刮下的细胞。将板上12孔分为4组，每组3个重复。分别加入含以下药物组分：PTX、PSO、I-PSO、PTX+PSO+I-PSO和(PTX+PSO+I-PSO)-PLN的无血清培养液诱导，并将细胞培养板放在10×10的显微镜下摄影，摄影时以标记线为起点，拍摄划痕的宽度，定为第0h的宽度。

结果如图7所示，细胞对照组在划痕48h，MDA-MB-231细胞通过迁移能够较快的填满划痕区域；与对照组比较，不同给药组划痕区域的愈合情况分别受到不同程度的抑制而减慢，尤其是(PTX+PSO+I-PSO)-PLN组，受到明显的抑制，在划痕72h细胞仍没有明显的迁移。

实施例7不同药物组分下MDA-MB-231细胞侵袭检测

(1)实验前准备工作

将Matrigel解冻后取出1mL置于4℃冰箱备用。将200μL枪头、无血清DMEM培养液，含数个Transwell的24孔细胞培养板及适当大小的操作盒置于-20度冰箱预冷过夜，目的在避免实验操作时Matrigel因回温而发生凝固，造成实验上的误差。另配制含0.1％BSA的无血清DMEM培养液备用。

(2)包被Matrigel基质胶

整个实验操作流程均在冰上进行，以保持低温，并随时注意温度变化。取出适量的Matrigel以无血清的细胞培养液稀释300ng/mL。将稀释的Matrigel按每孔100μL均匀注入Transwell小室中，加Transwell时，注意不要产生气泡并保持水平，之后将整个装置移入37℃细胞培养箱直至胶凝固，需时30min～1h。

(3)细胞准备

在等待Matrigel凝固的时间内即可开始细胞准备。已贴壁MDA-MB-231细胞与不同不同药物组分：PTX、PSO、I-PSO、PTX+PSO+I-PSO和(PTX+PSO+I-PSO)-PLN在含DMEM的培养基(10％胎牛血清)作用24h，0.25％胰酶消化，1000rmp/min离心2min，弃上清，PBS洗3次。0.1％BSA无血清DMEM培养基悬浮MDA-MB-231细胞，以台盼兰计数细胞，并调整为1×10⁶个/mL。

(4)接种细胞

取出Transwell，先在下室加入肿瘤细胞趋化因子600μL完全培养基(含15％胎牛血清)，然后将已包被好Matrigel的Transwell小心浸泡在含培养液的孔中，再把调配好的细胞悬液各取100μL(含8×10⁴)细胞接种于已凝固的Matrigel上(小心不要有气泡产生)随后将装置移于37℃，5％CO₂细胞培养孵育24h。

(5)细胞染色

孵育结束后用PBS稍稍水洗，用棉签擦去滤膜上表面未穿膜的肿瘤细胞及Matrigel。将Transwell浸泡在1ml甲醇中固定10min，风干后再以500μL结晶紫染色5min。(固定完之后用0.1％的结晶紫染色30min)，自来水冲洗(PBS洗3遍)Transwell后，显微镜下观察membrane下表面的细胞分布。

(6)OD值

24孔板加入500μL 33％醋酸，将小室置于其中，浸膜，震荡10min，充分溶解，取出小室，24孔板于酶标仪上570nm测OD值，间接反应细胞数。

结果如图8所示，与其他给药组相比，(PTX+PSO+I-PSO)-PLN组细胞透过Transwell膜的细胞明显减少。

Claims

1.一种复合纳米粒，其特征在于，所述复合纳米粒为同时包载补骨脂素、异补骨脂素和紫杉醇的聚合物-脂质纳米粒；

所述复合纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

S1.将大豆卵磷脂和DSPE-PEG2000溶于水相中，混匀，预热；

S2.将补骨脂素、异补骨脂素、紫杉醇与PLGA溶于油相中，混匀后注入到S1的水相中，加热混匀后即得复合纳米粒；

所述复合纳米粒的粒径为96.89±2.12nm；所述水相为无水乙醇；所述油相为乙腈；

S1所述大豆卵磷脂和DSPE-PEG2000的质量比为5～6：1；

S2所述补骨脂素、异补骨脂素与紫杉醇的质量比为2:2:1；

所述补骨脂素、异补骨脂素、紫杉醇与的PLGA的质量比为2～4:2～4:1～2:10；

S2所述加热混匀为70℃加热搅拌90min。

2.权利要求1所述的复合纳米粒在制备抗乳腺癌药物或制剂中的应用。