CN116869968B - 一种靶向大脑和脑胶质瘤的纳米粒及其合成方法、应用 - Google Patents

一种靶向大脑和脑胶质瘤的纳米粒及其合成方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向大脑和脑胶质瘤的纳米粒及其合成方法、应用，涉及靶向制剂的合成和应用技术领域，靶向大脑和脑胶质瘤的纳米粒是由PLGA和磷脂、PEG‑PLGA共同混合后制备成磷脂‑PLGA NPs，优选按质量份数计，包括PLGA为8~32份；磷脂为1~10份；PEG‑PLGA为1~10份；其中，PLGA分子量为10000~100000；所述PEG‑PLGA中PLGA分子量为5000~20000、PEG分子量为1000~10000，PLGA与PEG质量比为9~1：1等较为安全的原料制备得到的磷脂‑PLGA纳米粒，具有靶向大脑和脑胶质瘤的能力，可以应用于治疗脑部疾病的产品中。

Description

一种靶向大脑和脑胶质瘤的纳米粒及其合成方法、应用
技术领域
本发明涉及靶向制剂的合成和应用技术领域，具体涉及一种靶向大脑和脑胶质瘤的纳米粒及其合成方法、应用。
背景技术
血脑屏障（BBB）是阻碍药物脑部递送的最主要障碍，重组蛋白、单克隆抗体、基因药物等绝大多数大分子及95%以上的小分子药物均无法跨越血脑屏障，从而大大降低了对脑部疾病的治疗效果。随着纳米技术的发展，一些纳米材料由于其良好的生物相容性及可修饰的特性，为血脑屏障的跨越提供了新的道路。通过对纳米粒进行修饰，研究者们开发了许多不同的脑靶向递药***用于跨越BBB并治疗脑部疾病。然而，在体内过程中，这些设计巧妙的脑靶向递药***往往不能发挥其在体外试验中所展现的功效，递送效率远低于预期，其中一个重要原因是蛋白冠的形成。由于纳米粒体积小、比表面积大，其注射入血后易与血浆蛋白发生相互作用，吸附蛋白从而在其表面形成蛋白冠。蛋白冠可以使得纳米粒代谢速度、生物分布、细胞摄取、毒性等特征发生改变。以往的研究证明，蛋白冠的形成可能加速纳米粒在体内的清除效率，诱导免疫反应，此外，蛋白冠的屏蔽效应还可能影响纳米上修饰的靶向分子与受体的相互作用，从而降低纳米粒的靶向效率。
然而，近年来的研究发现，纳米粒吸附的蛋白中也有一部分具有靶向能力的功能性分子，通过提高它们在蛋白冠中的丰度，或许能赋予纳米粒一定的靶向能力。占等人设计了衍生自Aβ的肽段修饰的脂质体，通过在体内提高载脂蛋白Apo A-I、Apo E、Apo J的吸附以提高载体的脑部靶向效率。该方法在通过调控蛋白冠提高纳米粒靶向性的方向做出了尝试，然而这样通过肽段修饰合成成本较高，且这些新的肽段并没有获得FDA注射审批，安全性需要进一步验证，不利于进一步的临床转化。
又如申请号为“201410018471.5”，名称为“一种靶向SR-BI受体的基因与化疗药物共传输抗肿瘤纳米粒的制备及应用”的发明专利申请中公开了由磷脂、胆固醇、胆固醇酷、载脂蛋白、阳离子脂质、化疗药物、基因药物所制成的靶向清道夫受体的基因与化疗药物共传输抗肿瘤纳米粒，这种在体外预吸附载脂蛋白的纳米粒在实际应用中，容易在体内产生免疫原性的问题，同时，内源性蛋白的竞争性抑制会降低纳米粒的靶向效率，另外从成本上考虑，载脂蛋白等原料蛋白价格昂贵，如重组Apo A-I的成本非常高，同时预吸附蛋白的纳米粒储存条件严格，成本较高，导致最终的抗肿瘤纳米粒产品价格昂贵，不易推广。
发明内容
发明的目的旨在解决上述问题，提供一种靶向大脑和脑胶质瘤的纳米粒及其合成方法、应用，利用PLGA和磷脂共制成纳米载体，具有靶向大脑和脑胶质瘤的能力。
本发明通过下述技术方案实现：
一种靶向大脑和脑胶质瘤的纳米粒，由PLGA和磷脂共组成纳米载体。
进一步的，靶向大脑和脑胶质瘤的纳米粒按质量份数计，包括：
PLGA为8~32份；
磷脂为1~10份；
PEG-PLGA为1~10份；
其中，PLGA分子量为5000~100000；
所述PEG-PLGA中PLGA分子量为5000~20000、PEG分子量为1000~10000，PLGA与PEG质量比为9~1：1。实际应用中，可根据制备靶向大脑和脑胶质瘤的纳米粒产品的规格等不同需求，选择适当分子量的纳米粒 PLGA、PEG等原材料。
为进一步保证制得靶向大脑和脑胶质瘤的纳米粒，以及制备得到的纳米粒的粒径在预期范围内，本发明中提出了一种优选的合成方法，包括下述步骤：
a. 按前述的份数比取原料PLGA、磷脂和PEG-PLGA，并将该部分原料溶解在有机溶剂中，作为油相；
b. 取胆酸钠溶解在超纯水中，作为水相；
c. 将步骤b中的水相加入步骤a中的油相中，低温条件下，超声处理，得到乳液；
d. 去除步骤c中乳液中的有机溶剂，余液控制在4℃及以下，离心，沉淀，超滤浓缩、洗涤，得到磷脂-PLGA NPs。
进一步的，所述磷脂包括磷脂酸类、磷脂酰胆碱类、磷脂酰乙醇胺类、磷脂酰甘油类、磷脂酰丝氨酸类、阳离子脂质类中的任意一种。其中，磷脂酸类：如二棕榈酰磷脂酸（DPPA）、二油酰磷脂酸（DOPA）等；磷脂酰胆碱类：如二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）等；磷脂酰乙醇胺类：如二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）等；磷脂酰甘油类：如二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG）、二油酰磷脂酰甘油（DOPG）等；磷脂酰丝氨酸类：如二棕榈酰磷脂酰丝氨酸（DPPS）等；阳离子脂质类：如(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵（DOTAP）等。
进一步地，所述步骤a中，所述溶剂为氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙腈、乙醇中的至少一种。
进一步地，所述步骤b中，将胆酸钠用超纯水稀释至浓度为2%~10%。
进一步地，步骤c中，在0~10℃下使用超声细胞破碎仪超声处理2~8min，超声功率为80~300W。
进一步地，步骤d中，在30~50℃下采用旋转蒸发仪旋干乳液中有机溶剂。
进一步的，采用如前述的磷脂-PLGA NPs在治疗脑部疾病的产品中的应用，将磷脂-PLGA NPs与治疗脑胶质瘤的药物合成制得载药***。
进一步地，载药***的粒径为40~150nm。该粒径的载药***更有利于纳米粒靶向大脑和脑胶质瘤。另外，该磷脂-PLGA NPs应用于治疗脑部疾病的产品中时，载药***载药量为1~10%，包封率为50%~100%，PDI为0.1~0.3，Zeta电位为-10~50mv，本纳米粒更稳定，有利于送至预期部位。
进一步地，治疗脑胶质瘤的药物包括紫杉醇、阿霉素、替莫唑胺、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、伊布替尼、羟氯喹中的至少一种。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
一、本发明中，根据在先研究结果：载脂蛋白A-I（Apo A-I）是血液中含量丰富的一种载脂蛋白，其在血液中可以与磷脂发生特异性的结合，而Apo A-I的受体清道夫受体B-I（SR-BI）不仅在BBB表面具有一定分布，同时其也在肿瘤特别是脑胶质瘤细胞上高表达。因此，本方案考虑通过合理选择材料构建纳米粒，纳米粒在体内吸附蛋白形成蛋白冠时上调其对ApoA-I蛋白的吸附，并通过BBB与脑胶质瘤上的Apo A-I受体SR-BI，实现药物的脑胶质瘤靶向递送。本方案不再采用纳米粒在体外预吸附功能性蛋白的处理方式，这样的技术，不仅避免了采用其他蛋白修饰纳米粒在应用中的不稳定性，并减少这些蛋白在体内产生的免疫原性，还可以降低产品的成本，如重组Apo A-I的价格非常高，不使用其他蛋白可以显著的降低原料成本，而预吸附蛋白的纳米粒储存运输条件也更为严格，本方案制得的纳米粒能大大降低其储存运输成本。
二、本发明中，其中以大豆卵磷脂（SPC）为代表的磷脂，提取自植物大豆，易得、廉价且无毒、生物相容性好，其中，SPC已被FDA批准可用于静脉注射。而PLGA是广泛使用的纳米载体，PLGA具有良好的生物相容性与生物可降解性，同样被FDA批准可用于静脉注射，可实现药物的负载并能够大幅度降低药物的生物毒性。在本方案中，采用磷脂与PLGA合成磷脂-PLGA纳米粒，通过在体内形成蛋白冠时上调纳米粒对Apo A-I蛋白的吸附，从而实现靶向BBB与脑胶质瘤，并与紫杉醇、阿霉素、替莫唑胺、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、伊布替尼、羟氯喹等常见抗脑胶质瘤药物相结合，达到靶向治疗的目的。这样的技术，大大降低了使用其他修饰配体修饰纳米粒在应用中可能带来的毒性与制备难度，磷脂与PLGA均可用于静脉注射，并廉价易得，使得成本大大降低。
三、本发明中，原料之一的磷脂可选自磷脂酸类、磷脂酰胆碱类、磷脂酰乙醇胺类、磷脂酰甘油类、磷脂酰丝氨酸类、阳离子脂质类中的任意一种，原料来源广泛，原料选择范围相对较广，适用于制备多种类型的纳米粒，以满足产品对原料的不同需求。
附图说明
图1是银染法考察PLGA NPs和SPC-PLGA NPs表面载脂蛋白A-I和白蛋白吸附情况图。
图2中(A).Western blot 法分析PLGA NPs和SPC-PLGANPs表面载脂蛋白A-I和白蛋白吸附情况；(B).Image J软件半定量分析蛋白吸附情况。将PLGA NPs表面各蛋白吸附量的平均值设为1以进行归一化分析（n=3）。
图3是根据不同分子量进行蛋白冠分类的图示。
图4是根据不同生物功能蛋白的数量、不同生物功能蛋白的占比图示。
图5是SPC-PLGA NPs+S对于PLGA NPs+S的差异表达的图示。
图6是各香豆素6标记的纳米粒的透射电镜成像图。
图7是Cou 6@PLGA NPs 和 Cou 6@SPC-PLGA NPs在不同浓度胎牛血清中的稳定性测试图。（A）5%葡萄糖溶液，即0%胎牛血清，（B）10%胎牛血清，（C）50%胎牛血清（n=3，mean±SD）。
图8是Western blot分析bEnd.3和C6细胞B类I型清道夫受体表达情况图示。
图9是bEnd.3 细胞（A）和C6细胞（B）的B类I型清道夫受体的免疫荧光成像图。
图10是各香豆素6标记的纳米粒对bEnd.3细胞（A）和C6细胞（B）的体外毒性考察图（n=6，mean±SD）。
图11是观察C6细胞对香豆素6标记的纳米粒的摄取的激光共聚焦图。（A）未加抗体（B）加入抗体。
图12是观察bEnd.3细胞对香豆素6标记的纳米粒的摄取的激光共聚焦图。（A）未加抗体（B）加入抗体。
图13是流式细胞术考察C6细胞对香豆素6标记的纳米粒的摄取图示。
图14是流式细胞术考察bEnd.3细胞对香豆素6标记的纳米粒的摄取图示。
图15是bEnd.3 细胞单层在培养若干天后的跨膜电阻值变化情况图示（n=3）。
图16是体外血脑屏障模型中各纳米粒的bEnd.3细胞单层膜透过效率图示（n=3,mean±SD）。
图17是流式分析体外血脑屏障模型中bEnd.3细胞单层对各香豆素6标记的纳米粒的摄取情况图示（n = 3, mean±SD）。
图18是流式分析体外血脑屏障模型中C6细胞对各香豆素6标记的纳米粒的摄取情况图示（n = 3, mean±SD）。
图19是体外血脑屏障模型中bEnd.3细胞单层对各香豆素6标记的纳米粒的摄取情况的共聚焦3D成像图。
图20是体外血脑屏障模型中C6细胞对各香豆素6标记的纳米粒的摄取情况共聚焦成像分析图。
图21是各时间点荷瘤小鼠活体成像图。
图22是小鼠离体器官成像及半定量图示。（A）各器官离体成像（B）脑组织离体成像（C）脑部荧光信号半定量，*p＜0.05。
图23是小鼠脑组织中纳米粒分布的共聚焦成像图，其中，B代表正常脑组织区域，G代表肿瘤区域。
图24是纳米粒的透射电镜图。
图25是PTX@PLGA NPs和PTX@SPC-PLGA NPs在（A）5%葡萄糖溶液、（B）10%胎牛血清和（C）50%胎牛血清中的稳定性（n=3）测试图。
图26是C6-luc细胞的细胞毒性实验图。
图27是C6-luc细胞与负载PTX的纳米粒孵育24h后V-FITC/PI双染分析图。
图28是C6-luc细胞与负载PTX的纳米粒孵育24h后坏死、早期凋亡和晚期凋亡的比例图示，***p<0.001 (n = 3)。
图29是PTX、PTX@PLGA NPs和PTX@SPC-PLGA NPs（10mg/kg，静脉注射）的药时曲线图（n=3）。
图30是给药2h、6h和12h后PTX在各组织中的浓度图示（n=3），图中，A、B、C分别代表给药2h、6h、12h后PTX在各组织中的浓度。
图31是给药2h、6h和12h后PTX在脑胶质瘤中的浓度图示（n=3），*p＜0.05, **p＜0.01。
图32是荷瘤小鼠治疗方案图示。
图33是荷瘤小鼠治疗前后生物发光图像。
图34是荷瘤小鼠治疗前后脑部生物发光半定量分析图示（n=5），*p＜0.05。
图35是荷瘤小鼠生存曲线考察图示（n=8）。
图36是TUNEL染色的荷瘤小鼠脑组织的共聚焦成像图。
图37是T&E染色的荷瘤小鼠脑组织的共聚焦成像图。
图38是治疗过程中小鼠体重变化图。
图39是不同磷脂制备得到的磷脂-PLGA NPs的WB图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
本发明中，主要采用PLGA、磷脂、PEG-PLGA共组成纳米载体，经大量实验证明，磷脂可以选自磷脂酸类、磷脂酰胆碱类、磷脂酰乙醇胺类、磷脂酰甘油类、磷脂酰丝氨酸类、阳离子脂质类中的任意一种。其中，磷脂酸类：如二棕榈酰磷脂酸（DPPA）、二油酰磷脂酸（DOPA）等；磷脂酰胆碱类：如二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）等；磷脂酰乙醇胺类：如二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）等；磷脂酰甘油类：如二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG）、二油酰磷脂酰甘油（DOPG）等；磷脂酰丝氨酸类：如二棕榈酰磷脂酰丝氨酸（DPPS）等；阳离子脂质类：如(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵（DOTAP）等。本发明中采用Western Blot法考察了采用上述不同磷脂制备得到的不同纳米粒对于小鼠血清中ApoA-I的吸附能力，证明采用上述不同种类的磷脂制备的纳米载体，能够提升PLGA NPs对于Apo A-I的吸附能力。
附图39是采用不同磷脂制备得到的磷脂-PLGA NPs的WB图，图中颜色越深，代表相应PLGA NPs对于Apo A-I的吸附能力越强。
下述实施例中，以材料易得、廉价且无毒、生物相容性好的大豆卵磷脂（SPC）为例，制备纳米载体，进一步对本方案进行说明。
实施例1
本实施例中，以一种靶向大脑和脑胶质瘤的纳米粒的合成方法为例，使用的原料为分子量为55000~75000的PLGA，以及分子量为2000的PEG与分子量为5000的PLGA形成的mPEG2000- PLGA5000，以制备粒径约为70~80nm的SPC-PLGA NPs产品。进一步说明本方案。具体包括下述步骤：
a. 称取16mg PLGA、4mg mPEG2000-PLGA5000、不同质量的SPC（2、4、6、8 mg）于5 mLEP管中，加入500μL二氯甲烷（DCM）溶解，作为油相；
b. 同时称取10mg胆酸钠溶于2mL超纯水中，加入上述5mL EP管，作为水相；
c. 冰浴条件下，使用超声细胞破碎仪探头超声5min（超声功率120W，每超声5s暂5s）。
d. 超声完毕后使用旋转蒸发仪旋干所得乳液中DCM，余液在4℃下以6500rpm离心10min，使未形成纳米粒的材料沉淀。所得上清液加入10kDa超滤管，在4℃下以5000rpm超滤浓缩并用超纯水洗涤2遍，即可制备得到SPC2-PLGA NPs、SPC4-PLGA NPs、SPC6-PLGA NPs、SPC8-PLGA NPs。
另外，同时制备未加入SPC的PLGA NPs，作为对照组。其合成方案与前述靶向大脑和脑胶质瘤的纳米粒的合成方法的区别在于，取16mg PLGA、4mg mPEG2000-PLGA5000于5mL EP管中，按上述操作进行。
对于上述制备方法得到的产品，进一步考察其Apo A-I选择性吸附能力。
（1）制备纳米粒蛋白冠复合物
昆明小鼠血清制备：取30-40g健康雄性昆明小鼠，采用摘眼球取血法采集小鼠全血于1.5mL EP管中，静置1h，在4℃下1500g离心10min，取上清液于相同条件下再离心一次以除尽血细胞，取上清液，即得昆明小鼠血清。
纳米粒-蛋白冠复合物的制备：取50mg/mL 的前述过程中合成的纳米粒溶液100μL于2 mL EP管中，加入100μL小鼠血清，混匀。将EP管置于恒温振荡器中，37℃、100rpm孵育1h。而后将上述混合溶液加入1.5mL低蛋白吸附EP管中，在4℃下15000g离心30min，下层沉淀即为纳米粒-蛋白冠复合物。弃去上清液，加入200μL超纯水，重悬纳米粒-蛋白冠复合物，在4℃下15000g离心30 min以洗去未吸附和纳米粒表面未紧密吸附的血清蛋白。
重复上述清洗操作3次，最后一次清洗后弃去上清液，加入200μL超纯水，重悬即得纳米粒-蛋白冠复合物。
I、银染法考察
按上述方法制备纳米粒-蛋白冠复合物，将各纳米粒-蛋白冠复合物浓度均定量至20mg/mL，以15μL/孔上样，通过SDS-PAGE凝胶电泳对蛋白吸附进行考察。银染结果如图1所示。
由图1可知，不同SPC和PLGA比例制得的SPC-PLGA纳米粒的蛋白条带种类与PLGA纳米粒相似，表明各纳米粒的蛋白冠组成相似。在25kDa条带上方（与Apo A-I分子量31kDa相似）的条带颜色整体显著深于PLGA纳米粒，可推测SPC-PLGA NPs上调了纳米粒对于Apo A-I的吸附。
II、Western Blot法考察
将PLGA NPs和SPC4-PLGA NPs（以下简写为SPC-PLGA NPs）按前述银染法电泳并进行了Western blot实验。其中一抗为兔抗ApoA-I多克隆抗体（1：1000）。Western Blot结果如图2-A所示，25kDa marker条带上方存在的条带确实为Apo A-I。由图2-B半定量结果可见SPC-PLGANPs表面Apo A-I的吸附量显著增多，约为PLGA NPs的2.2和2.7倍。
此外，通过image J对银染法中25kDa 条带上方Apo A-I条带与所有蛋白条带进行半定量，分析银染结果中Apo A-I占总蛋白量的比例，结果如表1所示。
表1：各纳米粒表面载脂蛋白A-I的吸附情况半定量
由表1、图2可知，在不同比例SPC修饰的PLGA纳米粒中，SPC4-PLGA NPs+S所吸附的Apo A-I占比最高，即制备过程中SPC含量为17%时可制备得到具有最佳Apo A-I吸附性的纳米粒。因此，后续实验所用SPC-PLGANPs均采用此方案进行制备（后文的SPC4-PLGA NPs简写为SPC-PLGA NPs）。
III、蛋白组学考察
将制备好的PLGA NPs+S与SPC-PLGA NPs+S浓度调为7.5mg/mL，加入1%蛋白酶抑制剂与终浓度为8mM的尿素，超声裂解，并在4℃下12000rpm离心10min，收集上清液并用BCA试剂盒测定其蛋白浓度。结果如表2所示，每毫克PLGA NPs+S和SPC-PLGANPs+S所吸附蛋白量为6.79μg与11.67μg，表明纳米粒在修饰SPC后对蛋白的吸附能力有一定提升。
为进一步考察各纳米粒吸附的蛋白冠的组成情况，我们通过4D Label free定量蛋白组学技术对其进行了详细的考察。结果如图3及表3、4所示。
首先考察两种纳米粒蛋白冠的组成。如图3所示，分子量小于80kDa的蛋白质在两种纳米粒-蛋白冠复合物中占比均超过80%，表明两种纳米粒优先与分子量小于80kDa的蛋白质相结合，而对分子量大于80kDa的蛋白则吸附较少。这可能是由低分子量蛋白的结合能较高（与纳米粒解离率较低）所造成。而对于不同生物功能的蛋白而言，其在两种纳米粒-蛋白冠复合物中分布较为接近，如图4、5所示，尽管检测到各种功能蛋白的数量在SPC-PLGANPs+S中略有降低，但是其在两种纳米粒-蛋白冠复合物的整体中的占比却相近，表明在SPC修饰前后，纳米粒吸附到的蛋白种类是相似的，结合BCA结果可推测，SPC修饰后的纳米粒具有更高的蛋白吸附不在于其吸附了更多新的蛋白，而是增加了某些蛋白的吸附。于是需对差异表达的功能蛋白进行了考察，图5以热图的形式展现了SPC-PLGA NPs+S对于PLGA NPs+S在吸附具有上调和下调生物过程的功能蛋白上的差异，可以发现两种纳米粒对于绝大多数生物功能蛋白的吸附情况相似，然而对于提高脂质代谢转运的相关蛋白，SPC-PLGANPs+S表现出了显著高于PLGA NPs+S的吸附，而在这些提高脂质代谢转运的相关蛋白中，载脂蛋白在生物血液中与纳米粒蛋白冠中均呈现出较高的占比，由此我们推测SPC的修饰提高了纳米粒对于部分载脂蛋白的吸附。为了进一步验证我们的猜想，我们对各纳米粒蛋白冠中丰度排列前12的蛋白进行了统计，如表3所示，在PLGA NPs+S中，载脂蛋白C-IV（Apo C-IV）、载脂蛋白A-II（Apo A-II）、载脂蛋白C-I（Apo C-I）和Apo A-I的占比分别为8.45%、4.36%、2.87%、2.00%，而在SPC-PLGA NPs+S中，这些占比分别提升到了11.31%、9.05%、6.74%、5.66%。其中，纳米粒对于Apo A-I的吸附显著提升，其占比提高了近2.83倍。
表2：PLGA NPs+S与SPC-PLGA NPs+S的蛋白浓度
表3：PLGA NPs+S蛋白冠中丰度最高的12种蛋白
表4：SPC-PLGA NPs+S蛋白冠中丰度最高的12种蛋白
根据表2-4所示，根据蛋白组学结果计算，每mg PLGA NPs+S所吸附的Apo A-I仅为135.8ng，而对于SPC-PLGA NPs+S，其结果为660.52ng。以上结果表明，相比于PLGA NPs，SPC-PLGANPs对于载脂蛋白尤其是Apo A-I具有显著更高的吸附。
IV、SPC-PLGA NPs及其纳米粒-蛋白冠复合物的粒径、Zeta电位考察
取制备好的PLGA NPs、SPC-PLGA NPs及其对应的纳米粒-蛋白冠复合物，加入超纯水以稀释到1mg/mL，分别测量其粒径、PDI、zeta电位，其测定结果如表5所示。
表5：各纳米粒的粒径、PDI及zeta电位（n=3，mean±SD）。
由表5可知，各纳米粒电位均为负值，而在血清孵育前后纳米粒电位有一定变化，表明在纳米粒表面形成蛋白冠后改变了纳米粒的表面电荷；同时各纳米粒粒径均在70-85nm，粒径较小，满足脑部给药的需求，孵育血清后，各纳米粒粒径均增大15nm左右，表明其表面蛋白冠的形成；此外，各纳米粒在孵育血清前后PDI均小于0.3，表明各纳米粒在形成蛋白冠前后均一性良好，可用于后续体内外研究。
体外靶向性评价
I、利用香豆素6标记的纳米粒的合成与表征
a. 香豆素6标记的纳米粒的制备：称取16mg PLGA、4mg mPEG2000-PLGA5000、4mgSPC、80μg香豆素6于5mL EP管中，加入500μL二氯甲烷溶解，作为油相，按前述大豆卵磷脂修饰的纳米粒制备方法制备得到香豆素6标记的纳米粒Cou 6@SPC-PLGA NPs与Cou 6@PLGANPs。
b. 香豆素6标记的纳米粒蛋白冠复合物的制备：将本项a的香豆素6标记的纳米粒按前述纳米粒蛋白冠复合物制备方法制备得到包载香豆素6的纳米粒-蛋白冠复合物Cou6@SPC-PLGA NPs+S与Cou 6@PLGA NPs+S。
c. 香豆素6标记的纳米粒的表征：取制备好的Cou 6@PLGA NPs、Cou 6@SPC-PLGANPs、Cou 6@PLGA NPs+S、Cou 6@SPC-PLGA NPs+S溶液，加入超纯水以稀释到1mg/mL，分别对其粒径、PDI、zeta电位进行表征，其测定结果如表6。各香豆素6标记的纳米粒的透射电镜成像图参考图6。
表6：各香豆素6标记的纳米粒的粒径分布及电位（n = 3，mean±SD）。
由表6可知，各纳米粒电位、粒径以及孵育血清后电位、粒径的变化情况与前文所合成的空白纳米粒相仿，表明负载Cou 6后并未明显改变其表观性质，且各纳米粒PDI均小于0.2，表明其均一性良好，可用于后续细胞给药。
香豆素6标记的纳米粒的稳定性考察
将胎牛血清（FBS）用5%葡萄糖溶液稀释至10%及50%备用。各取100μL已浓缩的 Cou6@PLGA NPs 和 Cou 6@PLGA SPC-PLGA NPs（50mg/mL），分别用5%葡萄糖溶液、10%及 50%FBS将各纳米粒稀释至1mL，即纳米粒终浓度为5mg/mL。然后置于恒温振荡器中振摇（37℃、90 rpm），于不同时间点（0、1、2、4、6、8、10、12和24h）用粒径仪测定各纳米粒的水合粒径。结果参考图7。
由图7可知，在PBS中，Cou 6@PLGA NPs和Cou 6@SPC-PLGA NPs的粒径在24h之内几乎没有显著变化，表明其在PBS中稳定性良好。在10%和50%FBS中，两种纳米粒在12h之内粒径几乎没有变化，而随着孵育时间延长至24h，纳米粒粒径略微增大，增加至约200nm。以上结果表明纳米粒在一定浓度的血清中具有较好的稳定性，这也是后续体内外实验的基础。
II、细胞受体表达评价
①Western blot 考察
SR-BI是Apo A-I的特异性受体。为考察 bEnd.3和C6细胞SR-BI的表达情况，首先提取了两种细胞的全蛋白，而后通过SDS-PAGE凝胶电泳对两种细胞进行上的SR-BI受体进行考察，结果参考图8。由图8可知，bEnd.3和C6细胞上均由SR-BI的表达，其中C6细胞表达量更多。
②免疫荧光考察
通过对两种细胞进行免疫荧光染色后，在激光共聚焦显微镜下考察两种细胞的SR-BI受体分布情况，结果参考图9。由图9可知，与Western blot实验结果相似，bEnd.3和C6细胞上均由SR-BI的表达，其中C6细胞表达量更多。
III、细胞毒性考察
采用 MTT 法考察各纳米粒对 bEnd.3和C6细胞的毒性。制备各纳米粒（Cou6@PLGANPs、Cou 6@PLGA NPs+S、Cou 6@SPC-PLGA NPs和 Cou 6@SPC-PLGA NPs+S），并用无血清培养基将其逐步稀释为600、400、200、100和50μg/mL备用。将生长状态良好的bEnd.3细胞以2×103个/孔、C6细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板中，每组6个复孔，置于培养箱中培养24h后，将培养基更换为上述纳米粒溶液，与细胞共孵育8h。结束孵育后，弃去含药培养基，加入100μL 0.5 mg/mL的MTT溶液，继续孵育4h，弃去培养基与PBS，加入150μL DMSO。在37℃，75rpm下于恒温振荡器中振荡15min后取出96孔板，测定其490nm处的吸光度，并计算存活率。存活率（%）=（OD实验组-OD空白）/（OD对照组-OD空白）×100%。结果参考图10。
由图10可知，在600μg/mL及以下的浓度下，纳米粒并未表现出对C6和bEnd.3细胞的细胞毒性，这说明SPC-PLGA NPs具有良好的安全性，可以用于后续细胞实验。
IV、C6和bEnd.3细胞对PLGA纳米粒的摄取与摄取抑制
在载药纳米粒的体外评价中，细胞对纳米粒的摄取程度很大影响了载药纳米粒的抗肿瘤效应。在此，我们通过C6和bEnd.3细胞的摄取实验，定性、定量地考察了SPC修饰对于纳米粒摄取情况的影响。同时，为了考察在载药纳米粒靶向细胞的过程中Apo A-I所发挥的效果，我们通过向纳米粒中加入Apo A-I抗体，考察了在缺少Apo A-I的情况下，C6、bEnd.3细胞对于纳米粒的摄取情况。
将制备好的Cou 6@PLGA NPs、Cou 6@SPC-PLGA NPs、Cou 6@PLGA NPs+S、Cou 6@SPC-PLGA NPs+S纳米粒浓度调整至一致，再用同等浓度未包载香豆素6的空白纳米粒PLGANPs、SPC-PLGA NPs、PLGA NPs+S、SPC-PLGANPs+S将各组荧光强度调为一致，并用无血清含双抗DMEM高糖培养基将荧光一致的各组纳米粒稀释至100μg/mL备用。
①定性考察
对于细胞摄取实验，将C6、bEnd.3细胞分别以1.5×105、7.5×104个/孔接种到铺有直径20mm细胞爬片的12孔板中，置于细胞孵箱中孵育24h。弃去12孔板中旧培养基，用PBS洗1遍，每孔加入1mL含药培养基（每组纳米粒3个复孔），孔板于细胞孵箱中孵育2h。取出孔板弃去含药培养基，PBS洗1遍，每孔加入500μL 4%多聚甲醛溶液，固定细胞30min，PBS再洗2遍，每孔加入500μL 0.5 μg/mL DAPI溶液避光染色5min，弃去DAPI溶液，PBS洗2遍。另取洁净病理级载玻片，滴加抗荧光猝灭剂至载玻片上，再用镊子取出细胞爬片，将种有细胞的一面覆盖在载玻片上，再用指甲油封片，并用激光共聚焦显微镜观察。
对于摄取抑制实验，按如上方法培育细胞，给药，制片。不同之处在于在给药前向各组中加入2μL/mg纳米粒的Apo A-I抗体（700μg/mL），在37℃，75rpm下于恒温振荡器中振荡2 h后再加入孔板中。
共聚焦显微镜观察结果如图11、12所示。图11为C6的共聚焦图片，Cou 6@SPC-PLGANPs+S显示出最强的Cou 6荧光，Cou 6@PLGA NPs+S次之，而Cou 6@PLGA NPs和Cou 6@SPC-PLGA NPs的荧光信号处于较低水平。该结果表明了纳米粒形成蛋白冠之后，C6对于Cou6@PLGA NPs和Cou 6@SPC-PLGA NPs的摄取均显著增强，其中Cou 6@SPC-PLGA NPs+S增加幅度更大。而与Apo A-I抗体共孵育后，Cou 6@SPC-PLGA NPs+S和Cou 6@PLGA NPs+S荧光强度均大幅度降低，仅略高于Cou6@PLGA NPs和Cou 6@SPC-PLGA NPs。各组表现出相似的荧光强度且与未同抗体共孵育的Cou 6@PLGA NPs和Cou 6@SPC-PLGA NPs荧光信号相似，即，在ApoA-I被竞争性抑制无法与SR-BI结合的情况下，C6细胞对于Cou 6@PLGA NPs和Cou 6@SPC-PLGA NPs的摄取并没有发生改变，而对于Cou 6@SPC-PLGA NPs+S和Cou 6@PLGA NPs+S则大幅度降低。这就证明了在纳米粒被C6细胞摄取过程中，Apo A-I与SR-BI的特异性结合起到了重要的作用。图12为bEnd.3细胞的共聚焦图片，其结果与C6相似，Cou 6@SPC-PLGANPs+S显示出最强的Cou 6荧光，Cou 6@PLGA NPs+S次之且在与Apo A-I抗体共孵育后，bEnd.3细胞对此两种纳米粒的的摄取均大幅度降低。
以上结果表明，Apo A-I在纳米粒被C6与bEnd.3细胞摄取过程中起到了相当重要的作用，Apo A-I通过与相应受体SR-BI结合，促进细胞对纳米粒的摄取。而摄取结果与前文中所验证的SPC修饰的纳米粒对Apo A-I具有更高的吸附相一致，表明SPC-PLGA NPs通过上调蛋白冠中Apo A-I的吸附，提高了纳米粒的入胞效率。
②定量考察
对于细胞摄取实验，将C6、bEnd.3细胞分别以1.5×105、7.5×104个/孔接种到12孔板中，置于细胞孵箱中孵育24h。弃去12孔板中旧培养基，用PBS洗1遍，每孔加入1mL含药培养基（每组纳米粒3个复孔），孔板于细胞孵箱中孵育2h。取出孔板弃去含药培养基，PBS洗1遍，加入200μL 0.25%胰酶消化1.5min，加入600μL培养基终止消化，小心吹打收集细胞，加入1.5 mL EP管，2000rpm离心3min，弃去上清液，加入500μL PBS洗1遍，加入400μL PBS重悬细胞，加入流式管中用流式细胞仪测定各组细胞的荧光强度。
对于摄取抑制实验，按如上方法用流式细胞仪检测各组细胞荧光强度。不同之处在于在给药前加入2μL/mg纳米粒的Apo A-I抗体（700μg/mL），在37℃，75rpm下于恒温振荡器中振荡2h后再加入孔板中。
流式细胞仪检测结果如图13、14所示，其结果与定性考察结果相似，在C6细胞的摄取中，Cou 6@SPC-PLGA NPs+S具有最高的荧光信号，是未形成蛋白冠的Cou6@SPC-PLGA NPs的1.87倍，而Cou 6@PLGA NPs+S则具有次高的荧光信号，为Cou 6@PLGA NPs的1.83倍而在孵育ApoA-I抗体后，Cou 6@SPC-PLGA NPs 与Cou 6@PLGA NPs细胞荧光信号无显著变化，而Cou 6@SPC-PLGA NPs+S下降了34%，Cou 6@PLGA NPs+S则下降了27%。在bEnd.3细胞对纳米粒的摄取中，各组具有与C6细胞摄取相似的趋势，最高的荧光信号的Cou 6@SPC-PLGA NPs+S为Cou 6@SPC-PLGA NPs 的1.36倍，而Cou 6@PLGA NPs+S是Cou6@PLGA NPs的1.14倍，其相对上升比率低于C6细胞可能是由于bEnd.3细胞上的SR-BI受体表达量少于C6细胞。而在形成蛋白冠后，Cou 6@SPC-PLGA NPs+S与Cou 6@PLGA NPs+S的荧光信号分别下降了21%和13%。以上结果表明，SPC-PLGA NPs通过上调蛋白冠中ApoA-I的吸附提高了纳米粒的入胞效率。
V、体外BBB模型穿透考察
将生长状态良好的bEnd.3细胞以1×105个/孔的密度接种于12孔transwell 培养板的上室。各上室加培养基0.5mL，下室加培养基1.5mL，每隔1-2天换液一次。采用跨膜电阻仪每天测定 细胞单层的跨膜电阻值（TEER），其变化情况如图15所示。
可见，TEER值呈现先增加后降低的趋势，当细胞接种9天后，该TEER值达到最大，约为160 Ω/cm2，表明此时细胞连接最紧密，可视为细胞单层膜已形成，可用于实验。
①bEnd.3细胞单层膜透过效率考察
制备香豆素6标记的纳米粒（Cou 6@PLGA NPs+S 和Cou 6@SPC-PLGA NPs+S），并按照相应的定量方法将各纳米粒浓度及荧光强度调整一致，并用Hank’s平衡盐溶液（Hank'sBalancedSalt Solution, HBSS）将其浓度稀释为100μg/mL备用。取0.5mL各纳米粒溶液加入模型的上室，取1mL HBSS 加入下室，每组4个复孔。于给药后 20min、40min、1h、2h、4h、6h和8h，用移液枪轻轻吹匀下室液体，并从下室采集0.15mL液体，同时补加等体积新鲜HBSS继续孵育。计算各时间点时纳米粒的累积穿透量如图16所示。
在大多数时间点，Cou 6@PLGA NPs+S和Cou 6@SPC-PLGA NPs+S的bEnd.3细胞单层累积穿透量均分别显著多于相应的未形成蛋白冠的纳米粒。Cou 6@SPC-PLGA NPs+S的BBB累积穿透量为Cou 6@SPC-PLGANPs的1.3–2.2倍，而Cou 6@PLGA NPs+S的BBB累积穿透量仅为Cou 6@PLGA NPs的1.1–1.4倍，表明与Cou 6@PLGA NPs相比，Cou 6@SPC-PLGA NPs与形成蛋白冠后能在更大程度上增加纳米粒BBB跨膜转运效率。对结果进一步分析可知，Cou 6@SPC-PLGA NPs+S的BBB累积穿透量为Cou 6@PLGA NPs+S的1.3–1.7倍，表明 Cou 6@SPC-PLGA NPs+S的BBB穿透量显著高于Cou 6@PLGA NPs+S，进一步表明Cou 6@SPC-PLGA NPs+S具有最优的BBB跨膜转运效率。与PLGA NPs相比，SPC-PLGA NPs形成蛋白冠后能显著上调Apo A-I的吸附。以上结果表明SPC-PLGANPs通过上调Apo A-I的吸附提高了纳米粒的BBB跨膜转运效率。
②体外BBB模型中细胞摄取考察
按照前述方法建立体外BBB模型，并在其即将达到最大值前36h，将生长状态良好的C6细胞以5×104个/孔的密度接种于另一个全新的transwell 12孔板的下室中，孵育36h后，用其替换transwell模型中的12孔板。
制备香豆素6标记的纳米粒（Cou 6@PLGA NPs+S 和Cou 6@SPC-PLGA NPs+S），并按照相应的定量方法将各纳米粒浓度及荧光强度调整一致，并用空白无血清培养基将其浓度稀释为100μg/mL。取0.5mL各纳米粒溶液（100μg/mL）加入模型的上室，取1.5mL空白无血清培养基加入下室，每组3个复孔。与细胞共孵育4h后，将transwell上室和下室分开取出，用PBS洗涤后使用流式细胞仪测定其荧光强度。结果如图17、18所示。
可见，对于bEnd.3细胞单层，与血清孵育后Cou 6@SPC-PLGA NPs的摄取量比未孵育的显著增加了0.4倍，而对照组 Cou6@PLGA NPs 与血清孵育后摄取则未显著提高，这可能与 Cou 6@SPC-PLGA NPs表面吸附的 Apo A-I 通过SR-BI介导入胞有关。而在各纳米粒跨过bEnd.3细胞单层后进入到模型下室，从而被C6细胞所摄取的过程中，Cou 6@PLGA NPs和Cou 6@SPC-PLGA NPs与血清孵育后的摄取量均比相应未与血清孵育的纳米粒显著提高，分别提高了0.6倍和1.2倍。此外，Cou 6 @SPC-PLGANPs 吸附蛋白后的摄取量是 Cou 6@PLGA NPs 吸附蛋白后摄取量的1.4倍。
以上结果表明：Cou 6@SPC-PLGA NPs形成蛋白冠后具有最佳的脑肿瘤细胞靶向性，进一步说明SPC-PLGA NPs通过上调Apo A-I的吸附，提高了纳米粒的脑肿瘤细胞靶向性。
此外，按照上述定量考察方案建立体外BBB模型和给药，不同之处在于接种C6细胞前在12孔板中放入圆形玻片，以便C6细胞能贴附在玻片上生长。孵育结束后，将transwell上室和下室分开取出，用PBS分别洗涤上室和下室细胞，然后分别用4%多聚甲醛固定20min，PBS再清洗2遍，各加入0.5μg/mL的DAPI溶液，室温避光染色5min，再用PBS洗3遍。而后将上、下室分别封片后采用共聚焦显微镜扫描成像，结果见图19、20。
可见，和其他几组纳米粒相比，Cou 6@SPC-PLGA NPs+S组在bEnd.3细胞单层中的荧光信号是最强的，表明Cou 6@SPC-PLGA NPs在形成蛋白冠后具有最佳的BBB 靶向性。同时，与形成蛋白冠后的Cou 6@PLGA NPs和Cou 6@SPC-PLGA NPs在C6细胞内的荧光信号均比相应的未形成蛋白冠的纳米粒高，且Cou 6@SPC-PLGA NPs+S组的荧光信号显著强于Cou 6@PLGA NPs+S组。以上结果共同表明Cou 6@SPC-PLGA NPs通过上调蛋白冠中Apo A-I的吸附表现出最佳的体外脑肿瘤细胞靶向性。
三、体内靶向性考察
I、Did标记的纳米粒的合成
称取16mg PLGA、4mg mPEG2000-PLGA5000、4mg SPC、80μg Did于5mL EP管中，加入500μL二氯甲烷溶解，作为油相。按制备大豆卵磷脂修饰的纳米粒的方法制备得到Did标记的纳米粒Did@SPC-PLGA NPs与Did@PLGANPs。
II、荷C6-luc原位脑胶质瘤小鼠模型的建立
待培养皿中C6-luc细胞涨至80%以上，消化并收集细胞，通过细胞计数仪计数，然后加入适量的PBS重悬细胞为单细胞悬液并使得细胞密度为5×104个/μL，将细胞置于冰浴之中保存。为使注入小鼠脑内的细胞活性较好，每一皿细胞使用40min后，重新消化一皿C6-luc细胞使用。
取25g左右健康雄性昆明小鼠建模。将小鼠麻醉，用刮毛刀小心将小鼠头部双眼与双耳之间的毛发剃净，用棉签蘸取75%乙醇对此处裸露的皮肤消毒，而后用镊子夹起中央皮肤，用75%乙醇消毒后的剪刀沿纵向剪开一个小口，此处切口不宜过大，否则不利于术后缝合与愈合。用棉签蘸取10%过氧化氢溶液，在切口处反复涂抹，消化头骨处隔膜组织，待消化完毕后，可见头部的十字纹路。取上述制备好的单细胞悬液，低速涡旋使细胞重新分散，用微量进样器吸取5μL单细胞悬液（即每只小鼠注入2.5×105个C6-luc细胞）。然后将小鼠固定在脑立体定位仪上保持其头部水平，并将微量进样器安装在脑定位仪上，调整微量进样器位置使针尖对准小鼠头部的十字纹路交点，然后将进样器向后方移动0.6mm，再向下移动2mm，此时针尖所指处即是进针注入细胞的海马区位置。取2mL注射器针头，用酒精消毒后在进针处钻一个小孔，再将微量进样器从小孔处缓缓***小鼠脑部，缓慢地将微量进样器下降4mm再上升1mm，匀速缓慢地将5μL单细胞悬液注入海马区，注射完毕后将进样器驻留在海马区5min，再缓慢取出进样器。用骨蜡涂抹封住进样口，用75%乙醇消毒后的缝合线缝合皮肤切口，并在手术处涂抹青链霉素以防伤口感染。将术后的小鼠置于标准室温环境中饲养，7天后，荷C6-luc原位脑胶质瘤小鼠模型即建成。
III、小动物成像法考察
取制备好的Did@PLGA NPs与Did@SPC-PLGA NPs加入超纯水将其浓度调为25mg/mL，再用同浓度的PLGA NPs和SPC-PLGA NPs将各组Did荧光强度调为一致。通过小动物活体成像***考察建模7天后的荷瘤小鼠肿瘤体积大小，通过对生物发光信号进行半定量，将荷瘤小鼠按信号值大小平均分为两组。小鼠禁食过夜后分别尾静脉注射给以Did@PLGA NPs与Did@SPC-PLGA NPs（Did浓度250μg/kg），在注射完毕后的2h、6h、12h、24h将小鼠置于小动物活体成像仪下观察成像（Ex=640nm，Em=710nm）。拍摄完毕后，处死小鼠，用10mL PBS（pH=7.4）与10mL 4%多聚甲醛溶液对小鼠进行心脏灌流，而后取出心脏、肝、脾、肺、肾和脑组织。将各组织放置于活体成像仪下进行观察成像，并对其荧光发光强度进行半定量处理。结果如图21和22。由图21中各时间点活体成像图可见，Did@SPC-PLGA NPs组在各时间点的脑部荧光强度均高于Did@PLGANPs组，图22-B中脑部离体成像证实了这一点，Did@SPC-PLGA NPs组在荷瘤小鼠脑组织中主要分布在海马体附近的肿瘤部位，其积蓄显著高于Did@PLGANPs，根据图22-C中半定量结果可知，Did@SPC-PLGA NPs组的肿瘤部位荧光信号强度为Did@PLGA NPs的3.18倍，表明SPC-PLGA NPs具有更强的脑胶质瘤靶向性。此外，图22-A中各器官离体成像可见，给药后Did@PLGA NPs与Did@SPC-PLGANPs主要分布在肝部位，这可能是与其进入体内后吸附蛋白而被单核巨噬细胞***摄取从而经肝代谢有关。以上结果表明，SPC-PLGA NP通过体内吸附Apo A-I能够显著提高其脑胶质瘤靶向性。
IV、脑组织冰冻切片考察
采用对脑组织冰冻切片染色并通过显微镜观察来进一步考察组织内各纳米粒的分布。将前述取出的小鼠脑组织切片后用DAPI染色，染色后的切片于共聚焦显微镜下观察，结果如图23所示。可见，在脑组织中，纳米粒主要分布于肿瘤区域，而在正常脑组织区域分布较少，同时，Did@SPC-PLGA NPs在肿瘤区域的分布显著高于Did@PLGA NPs，这与活体、离体成像的结果相一致。上述结果表明，采用本方案制备得到的SPC-PLGA对脑胶质瘤具有靶向能力。
四、包载紫杉醇的SPC-PLGA NPs考察
为考察SPC-PLGA NPs在抗脑胶质瘤方面的应用价值，使用SPC-PLGA NPs包载常见抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)，考察了其抗脑胶质瘤的效果。
I、PTX@SPC-PLGA NPs的合成与表征
a. 包载PTX的纳米粒的合成：称取16mg PLGA、4mg mPEG2000-PLGA5000、4mg SPC、1.2mg PTX于5mL EP管中，加入500μL二氯甲烷溶解，作为油相。按前述方法制备得到包载PTX的纳米粒PTX@SPC-PLGA NPs和PTX@PLGA NPs。
b. 包载PTX的纳米粒蛋白冠复合物的合成：将制备的包载PTX的纳米粒按前述“制备纳米粒蛋白冠复合物”的方法制备得到相应的蛋白冠-纳米粒复合物PTX@PLGA NPs+S和PTX@SPC-PLGA NPs+S。
①PTX@SPC-PLGA NPs及其纳米粒-蛋白冠复合物的粒径、Zeta电位及形态考察
取制备好的PTX@PLGA NPs和PTX@SPC-PLGA NPs溶液及其对应的纳米粒-蛋白冠复合物，加入超纯水以稀释到1mg/mL，分别测量其粒径、PDI、zeta电位，其测定结果如表7，各纳米粒电位均为负值，且载有紫杉醇的纳米粒与空白纳米粒电位略有变化，表明载药后略微改变了纳米粒的电位；而在血清孵育前后纳米粒电位有一定变化，表明在纳米粒表面形成蛋白冠后改变了纳米粒的表面电荷；同时各纳米粒粒径均在70-85nm，粒径较小，满足脑部给药的需求，孵育血清后，各纳米粒粒径均增大20nm左右，表明其表面蛋白冠的形成；此外，各纳米粒在孵育血清前后PDI均小于0.2，表明各纳米粒在形成蛋白冠前后均一性良好，可用于后续体内外研究。
进一步使用透射电子显微镜（TEM）对载药的纳米粒形态进行观察。结果如图24所示，载药纳米粒孵育血清前后均呈规则球形，形态完整。
表7：各包载PTX的纳米粒的粒径、PDI及zeta电位（n=3）
②PTX@SPC-PLGA纳米粒稳定性考察
取胎牛血清（FBS）加入5%葡萄糖溶液稀释至10%和50%待用。平行各取3份40μL 50mg/mL的PTX@PLGA NPs、PTX@SPC-PLGA NPs溶液于4mL EP管中，分别加入1.96 mL 5%葡萄糖溶液、10% FBS、50%FBS，混匀，使纳米粒终浓度为1mg/mL。将各稀释后的纳米粒溶液置于恒温振荡器中，37℃、100rpm恒温振荡。使用粒径仪测定各纳米粒溶液0、1、2、4、8、12、24h的粒径。结果如图25所示，两种纳米粒在5%葡萄糖溶液、10%FBS、50%FBS中放置24h，粒径仅稍有增加，并未展现出较大变化，表明该纳米粒在等渗溶液及血清中具有较好的稳定性，可满足后续给药需求。
II、PTX@SPC-PLGA NPs对C6-luc细胞的毒性研究
将制备好的PTX@PLGA NPs、PTX@SPC-PLGA NPs、PTX@PLGA NPs+S和PTX@SPC-PLGANPs+S浓度调整至一致，再用同等浓度未包载PTX的空白纳米粒PLGANPs、SPC-PLGA NPs、PLGA NPs+S、SPC-PLGA NPs+S将各组的PTX浓度调为1mg/mL，同时，称取PTX溶于DMSO和吐温80的混合溶液中（DMSO：吐温80=2；1，v/v）配置成100mg/mL的储备液（为避免DMSO与吐温80对细胞活性的损伤，其浓度需要低于0.1%）。将C6-luc细胞以8×103个/孔接种到96孔板中（最外圈不种细胞，加入100μL PBS），置于细胞孵箱中孵育24h。弃去96孔板中旧培养基，用无血清含双抗DMEM高糖培养基将各组PTX浓度稀释至0.001、0.01、0.05、0.01、0.5、1、5、10和30μg/mL ，每孔加入100μL含药培养基（每组纳米粒3个复孔）。与细胞孵育24h后，按细胞毒性考察方法处理并计算细胞存活率。
PTX浓度与C6-luc细胞存活率的变化曲线如图26所示，可见无论是游离PTX，还是PTX@PLGA NPs、PTX@SPC-PLGA NPs、PTX@PLGA NPs+S和PTX@SPC-PLGA NPs+S，均可以引起细胞的凋亡，且随着PTX浓度的提升，细胞存活率不断下降。通过计算可以得到各组的半数致死量（IC50），PTX、PTX@PLGA NPs、PTX@SPC-PLGA NPs、PTX@PLGA NPs+S和PTX@SPC-PLGA NPs+S的IC50分别为27.77、6.08、8.65、3.12和0.19μg/mL。其中PTX@SPC-PLGA NPs+S的毒性远大于其他各组，表明PTX@SPC-PLGA NPs通过吸附Apo A-I靶向C6-luc细胞能显著增强诱导C6-luc细胞凋亡的能力。并展现出更强的肿瘤细胞增殖抑制效果。
III、PTX@SPC-PLGA NPs诱导C6-luc细胞凋亡的能力
按“PTX@SPC-PLGA NPs对C6-luc细胞的毒性研究”下操作将各组用无血清含双抗DMEM高糖培养基稀释至PTX浓度为300μg/mL。将C6-luc细胞以1.5×105个/孔接种到12孔板中，置于细胞孵箱中孵育24h。弃去12孔板中旧培养基，用PBS洗1遍，每孔加入1mL含药培养基（每组纳米粒3个复孔），孔板于细胞孵箱中孵育24h。取出孔板弃去含药培养基，PBS洗1遍，加入200μL 0.25%胰酶消化1.5min，加入600μL培养基终止消化，小心吹打收集细胞，加入1.5 mL EP管，3000rpm离心5min，弃去上清液，加入500μL PBS洗1遍，加入100μL BindingBuffer重悬细胞并加入2.5μL Annexin V-FITC染液与5μL PI染液，室温避光染色10min。染色完毕后加入400μL Binding Buffer混匀，将细胞悬液加入流式管并置于冰上，用流式细胞仪测定各组荧光信号。
结果如图27与图28所示。在AnnexinV-FITC/PI双染分析中，位于第一、第二、第三和第四象限的细胞分别为晚期凋亡及部分坏死、机械性坏死、正常和早期凋亡细胞。Control组于正常无血清培养基中培养，故其正常细胞在90%以上，而PTX组的则具有19.85±0.3%的早期凋亡和 7.66±0.8%晚期凋亡细胞占比，表明游离PTX具有一定诱导C6-luc细胞凋亡的能力。而相比于Control和PTX组，PTX@PLGA NPs、PTX@SPC-PLGA NPs、PTX@PLGANPs+S组的早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞均有一定程度的增加，PTX@PLGA NPs组早期凋亡和晚期凋亡比例分别为55.17±1.98%和9.60±0.50%，PTX@SPC-PLGA NPs组为51.84±2.76%和9.14±0.26%，PTX@PLGA NPs+S组为59.68±1.70和9.25±1.10%，表明PTX@PLGANPs在形成蛋白冠后能在一定程度上提高其诱导C6-luc细胞凋亡的能力，这可能是因为其吸附了较少的Apo A-I蛋白。而PTX@SPC-PLGANPs+S的早期凋亡细胞比例进一步增加。根据图28中统计，PTX@SPC-PLGA NPs+S的早期和晚期凋亡细胞比例分别为71.73±1.3 %和9.51±0.02%，均高于其他组，这表明PTX@SPC-PLGA NPs+S具有更强的诱导C6-luc细胞凋亡的能力及更强的肿瘤抑制效率。
IV、PTX@SPC-PLGA NPs的药动学和组织分布研究
①将制备好的PTX@PLGA NPs和PTX@SPC-PLGA NPs浓度调为一致，再用未载药的PLGA NPs和SPC-PLGA NPs将各组PTX浓度调为一致。同时，称取10mg PTX，加入1 mL乙醇-蓖麻油聚氧乙烯醚混合溶液（乙醇：蓖麻油聚氧乙烯醚=1：1，v/v）超声溶解，即得10mg/mL PTX储备液。临用前以5%葡萄糖溶液稀释即可（储备液：5%葡萄糖溶液=1：5，v/v）。
按前述方法建立荷C6-luc原位脑胶质瘤的模型小鼠。建模7天后，通过小动物活体成像***考察荷瘤小鼠肿瘤体积大小，通过对生物发光信号进行半定量，将荷瘤小鼠按信号值大小平均分为3组。小鼠禁食过夜后分别尾静脉注射给以PTX、PTX@PLGA NPs和PTX@SPC-PLGA NPs（PTX浓度均为10mg/kg）。于给药完毕后的5min、15min、1h、2h、4h、8h、12h用沾有肝素钠的毛细管对小鼠眼眶采血100μL，血液用含有肝素钠的1.5mL EP管（称取50mg素钠，加入5mL超纯水溶解得10mg/mL肝素钠溶液。按10μL/管加入1.5mL EP管中，涡旋使之均匀分散在EP管内表面，而后为防溶液对血液的稀释，将EP管置于37℃烘箱中烘干，即得）收集，取血毛细管与EP管中加入肝素钠以防血液在取血过程中发生凝血。取血后略微摇动EP管，使血液与肝素钠均匀混合，而后在4℃下以1500g离心10min，取上清液于相同条件下再离心一遍以除尽血细胞，上层淡黄色清液即为小鼠血浆。将各小鼠血浆处理并进样进行LC-MS分析，可计算出小鼠各时间点血药浓度，根据血药浓度和取血时间绘制药时曲线，并用DAS软件通过统计矩模型拟合计算药动学参数，结果如图29所示。
由于本次实验采用静脉推注给药，游离药及纳米粒直接入血，故药物的血药浓度在注射时即为峰值，而后随着时间延长，血药浓度逐渐下降。由药时曲线与药动学参数可知，PTX在血液中迅速清除，其半衰期与药时曲线下面积（AUC）均较短。而PTX@PLGANPs的半衰期相比于游离药物提高了3.3倍达到了3.62±0.44h，表明使用PLGA包载PTX能够大大延长其血液循环时间。PTX@SPC-PLGA NPs具有最长的半衰期，为5.06±0.79h，同时具有最大的AUC，其AUC0-∞为11035.50±1827.61，表明SPC-PLGA NPs具有更长的血液循环时间，这可能是由于SPC带来了更多的Apo A-I吸附，而Apo A-I被证明具有实现纳米载体长循环的效果。
②PTX@SPC-PLGA NPs的组织分布研究
将荷瘤小鼠平均分为3组并尾静脉注射PTX、PTX@PLGA NPs和PTX@SPC-PLGA NPs（PTX浓度均为10mg/kg）。在给药后2h、6h和12h分别随机取3只小鼠处死，用15mL PBS（pH=7.4）对其进行心脏灌流以排除血液中PTX的在后续检测中的干扰。然后取出小鼠心、肝、脾、肺、肾和脑，测量各组织中PTX浓度。
给药2h、6h及12h后PTX在各组织中的浓度如图30所示，各器官中PTX浓度随时间的推移而呈下降趋势。在各个时间点，肝脏均为PTX浓度最高的器官，这符合PTX通过肝脏代谢的特点，同时对于PTX@SPC-PLGA NPs组，其在2h、6h、12h均表现出低于PTX@PLGA NPs的肝脏积蓄，这与离体器官成像结果一致，而对于心、脾、肺、肾四个器官，除了6小时脾脏中浓度不一致外，PTX@SPC-PLGA NPs与PTX@PLGA NPs在各时间点表现出相似的浓度。为了更清晰的观察在脑胶质瘤中各组PTX浓度差异，将各组各时间点的脑胶质瘤中PTX浓度单独列出，如图31所示。显而易见的是，在各个时间点，PTX@SPC-PLGA NPs组在脑胶质瘤中的PTX浓度均显著高于游离PTX组。在2h时，PTX@SPC-PLGA NPs组在脑胶质瘤中的PTX浓度是游离PTX组的6.61倍，6h时为14.0倍，12h时则增加到了67.3倍，这表明游离PTX在静脉注射后很难穿过血脑屏障并靶向脑肿瘤。同时，在以上3个时间点，PTX@SPC-PLGANPs组在脑胶质瘤中的PTX浓度也远高于PTX@PLGA NPs组，其倍率分别为3.2倍、4.0倍和2.9倍，这个结果SPC-PLGA NPs具有更高的脑胶质瘤靶向效率，使得PTX在脑胶质瘤中有着更高的积蓄浓度。
V、PTX@SPC-PLGA NPs抗脑胶质瘤的药效学评价
①荷C6-luc原位脑胶质瘤小鼠模型的给药方案
建立荷C6-luc原位脑胶质瘤的模型小鼠。建模7天后，通过小动物活体成像***考察荷瘤小鼠肿瘤体积大小，通过对生物发光信号进行半定量，将荷瘤小鼠按信号值大小平均分为5组，分别为Control组（给以5%葡萄糖溶液）、PTX组（PTX浓度为10mg/kg）、PTX@PLGANPs组（PTX浓度为10mg/kg），PTX@SPC-PLGA NPs-L组（低剂量组，PTX浓度为2.5mg/kg），PTX@SPC-PLGA NPs组（正常剂量组，PTX浓度为10mg/kg）。在分组当天即建模后第7、10、13、16、19天静脉注射相应药物治疗。其简易流程图如图32所示。
②PTX@SPC-PLGA NPs对脑胶质瘤的抑制情况
治疗完毕后第2天即建模后第20天，取各组小鼠通过小动物活体成像***考察荷瘤小鼠肿瘤体积大小，将该日小鼠的生物发光信号与建模后第7天分组时的生物发光信号对比，以评价不同给药方案的肿瘤抑制效率。
小鼠生物发光图像结果如图33，为便于分析，对其信号进行了半定量处理，结果如图34。在建模后第七天时，根据生物发光信号平均分组，故各组肿瘤信号均无显著性差异，而在治疗结束后，以Control组脑胶质瘤发展未受抑制作为对比，PTX组仅有较低的肿瘤抑制效果，肿瘤抑制率仅为8.8%，这可能与游离紫杉醇在血液清除速率较快，难以跨越血脑屏障并靶向脑胶质瘤有关。此外，PTX@PLGA NPs组与PTX@SPC-PLGA NPs-L组具有相似的脑胶质瘤抑制效果，肿瘤抑制率提高到了73.3%和71.7%，这说明将PTX包载在PLGA纳米粒中能在一定程度上提高其对脑胶质瘤的靶向性，同时也说明在较低剂量的治疗下，PTX@SPC-PLGA对于脑胶质瘤仍具有可观的抑制效果。而对于PTX@SPC-PLGA NPs组，其表现出最强的抗肿瘤效应，其肿瘤抑制率达到了88.3%，这说明PTX@SPC-PLGA NPs具有最强的抗脑胶质瘤效应。
③PTX@SPC-PLGA NPs对荷瘤小鼠生存期的影响
脑胶质瘤在肿瘤发展过程中会不断对大脑进行侵袭，并最终对小鼠中枢神经***产生影响从而导致小鼠死亡。为进一步考察不同方案的治疗对于脑胶质瘤的效果，对治疗完毕的小鼠进行了生存期观察（每组8只），记录每一只小鼠的生存状态及死亡时间，结果如图35。其中Control组中位生存期为22天，表明在未经治疗的状态下，患有脑胶质瘤的小鼠会很快的死亡。而PTX组的中位生存期为24.5天，略高于Control组，表明游离的PTX治疗具有一定的抑制肿瘤效果，但由于游离PTX较难跨越血脑屏障并靶向脑胶质瘤，使得其效果不佳。而对于PTX@PLGA NPs组与PTX@SPC-PLGA NPs-L组其中位生存期为29.5天和27天，比之Control组提高了34.1%和22.7%。相较于其他治疗方案，PTX@SPC-PLGA NPs组则具有最好的治疗效果，该组小鼠中位生存期比Control组提高了84.0%，达到了40.5天。生存期结果与前述“细胞受体表达评价”中生物发光信号结果相一致，表明了PTX@SPC-PLGA NPs具有最佳的肿瘤抑制效果。
④TUNEL染色评价PTX@SPC-PLGA NPs的对胶质瘤细胞的凋亡的影响
为了探究PTX@SPC-PLGA NPs是否通过诱导了更多的脑胶质瘤细胞凋亡从而发挥了最佳的胶质瘤抑制效果，我们通过TUNEL染色考察了治疗完毕后的小鼠脑胶质瘤细胞凋亡水平。
TUNEL染色结果如图36所示。Control组未给予治疗，故只有极少数凋亡细胞。而PTX组仅存在少量的凋亡细胞与该组展现出的较差的治疗效果相符合，一方面表明PTX具有能够诱导脑胶质瘤细胞凋亡从而抑制肿瘤的能力，但同时游离PTX较难跨越血脑屏障并靶向脑胶质瘤，其抑瘤效果较差。对于PTX@PLGA NPs组与PTX@SPC-PLGA NPs-L组则观察到明显的凋亡细胞存在，表明将PTX负载在PLGA纳米粒中能够有效增加其对脑胶质瘤的靶向性，提高PTX在肿瘤区域的富集程度，发挥更好的抑瘤效果。PTX@SPC-PLGANPs组观察到了最多的凋亡细胞，这与生存期及生物发光信号结果相互印证，表明PTX@SPC-PLGA NPs能够有效引发肿瘤细胞凋亡并抑制脑胶质瘤。
⑤H&E染色评价PTX@SPC-PLGA NPs的肿瘤抑制情况及安全性
心脏毒性与肝肾毒性是PTX常见的器官毒性表现，为评价制剂的安全性，我们在治疗完毕后处死小鼠，取其心、肝、脾、肺、肾组织制备各器官的H&E染色切片，观察各器官是否存在损伤。同时为直观考察荷瘤小鼠的治疗情况，取各组小鼠脑组织同法制备H&E染色切片，观察肿瘤的抑制情况。
H&E染色切片的观察结果如图37与38所示。
图37为脑组织H&E染色图，通过观察肿瘤区域大小，可以较为明显的考察各治疗方案对肿瘤的抑制情况。对于未经治疗的Control组，其肿瘤细胞快速大量增殖，肿瘤区域细胞核致密分布呈现深蓝紫色，而在游离PTX的治疗下，胶质瘤细胞的面积出现了一定程度的降低。而对于载药纳米粒组，胶质瘤细胞覆盖的面积和密度进一步的降低，其中PTX@SPC-PLGANPs组仅观察到少量的肿瘤细胞，肿瘤面积及密度为各组中最低，表现出最好的抑瘤效果，这与前文实验结果相一致，表明PTX@SPC-PLGA NPs具有更好的治疗效果。
图38为治疗过程中小鼠体重变化图，可见在治疗过程中小鼠体重并未发生明显变化，表明该治疗方案符合动物伦理，且载药纳米粒具有较好的生物安全性。
实施例2
本实施例中，进一步考察采用不同分子量的PLGA，对制备出的磷脂-PLGA NPs产品的性能（包括产品粒径、PDI值）影响。本实施例中，按下述表8中各小组的不同PLGA分子量取16mg PLGA、4mg SPC溶于500μL二氯甲烷作为油相，其余操作相同，可制得由PLGA、SPC组成的纳米粒。
表8：不同PLGA分子量制备得到的纳米粒的尺寸、PDI值的统计表
表8可知，采用MW为5000~60000及不同LA:GA比例的PLGA制备的SPC-PLGA NPs均与实施例1具有相似的粒径，且PDI＜0.2，表现出较好的均一性。其中，第6组中得到的纳米粒的粒径大小为85.2±0.5，PDI为0.176±0.004，Zeta电位为-50.5±0.3。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种靶向大脑和脑胶质瘤的纳米粒的合成方法，其特征在于：靶向大脑和脑胶质瘤的纳米粒，按质量份数计，由原料PLGA8~32份、磷脂1~10份、PEG-PLGA1~10份，共同混合后制备成磷脂-PLGA NPs；
其中，PLGA分子量为5000~100000；
所述PEG-PLGA中PLGA分子量为5000~20000、PEG分子量为1000~10000，PLGA与PEG质量比为9~1：1；
所述磷脂包括大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酸、二油酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵中的任意一种；
靶向大脑和脑胶质瘤的纳米粒的合成方法包括下述步骤：
a. 按上述原料及份数比取原料PLGA、磷脂和PEG-PLGA，并将该部分原料溶解在有机溶剂中，作为油相；
b. 取胆酸钠溶解在超纯水中，作为水相；
c. 将步骤b中的水相加入步骤a中的油相中，0~10℃条件下，超声处理，得到乳液；
d. 去除步骤c中乳液中的有机溶剂，余液控制在4℃及以下，离心，沉淀，超滤浓缩、洗涤，得到磷脂-PLGA NPs。
2.根据权利要求1所述的一种靶向大脑和脑胶质瘤的纳米粒的合成方法，其特征在于：所述步骤a中，所述溶剂为氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙腈、乙醇中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种靶向大脑和脑胶质瘤的纳米粒的合成方法，其特征在于：所述步骤b中，将胆酸钠用超纯水稀释至浓度为2%~10%。
4.根据权利要求1所述的一种靶向大脑和脑胶质瘤的纳米粒的合成方法，其特征在于：步骤c中，在0~10℃下使用超声细胞破碎仪超声处理2~8min，超声功率为80~300W。
5.根据权利要求1所述的一种靶向大脑和脑胶质瘤的纳米粒的合成方法，其特征在于：步骤d中，在30~50℃下采用旋转蒸发仪旋干乳液中有机溶剂。
6.采用如权利要求1所述的合成方法制备得到的磷脂-PLGA NPs。
7.采用如权利要求6所述的磷脂-PLGA NPs在制备治疗脑部疾病的产品中的应用，其特征在于：将磷脂-PLGA NPs与治疗脑胶质瘤的药物合成制得载药***。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于：载药***的粒径为40~150nm。
9.根据权利要求7所述应用，其特征在于：治疗脑胶质瘤的药物包括紫杉醇、阿霉素、替莫唑胺、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、伊布替尼、羟氯喹中的至少一种。
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