CN109283274A

CN109283274A - 一种荷丹片的多成分含量测定方法

Info

Publication number: CN109283274A
Application number: CN201811393244.5A
Authority: CN
Inventors: 曾英姿; 周万辉; 安少凯; 赵磊; 程世娟
Original assignee: NANCHANG JISHUN PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: NANCHANG JISHUN PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2018-11-21
Filing date: 2018-11-21
Publication date: 2019-01-29
Anticipated expiration: 2038-11-21
Also published as: CN109283274B

Abstract

本发明提供一种荷丹片的多成分含量测定方法，包括以下步骤：S1.对照品溶液的制备：分别精密称取丹参素、原儿茶酸、补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、金丝桃苷、番泻苷B、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、荷叶碱、丹酚酸A、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚，溶解于溶剂中，得到对照品储备液；分别精密量取所述对照品储备液加溶剂稀释，得对照品溶液，备用；S2.荷丹片样品溶液的制备；S3.含量测定，采用高效液相色谱法测定。该测定方法测定了荷丹片中丹参素、原儿茶酸、金丝桃苷、番泻苷B、迷迭香酸等17种化学成分的含量，能更好的控制荷丹片的质量。

Description

一种荷丹片的多成分含量测定方法

技术领域

本发明涉及医药检测领域，具体涉及一种荷丹片的多成分含量测定方法。

背景技术

荷丹片是南昌济顺制药有限公司生产，由荷叶、丹参、补骨脂、山楂、番泻叶5味中药制备而成，具有化痰降浊，活血化瘀的功效，适用于高血脂症属痰浊夹瘀者。

荷丹片质量标准收载于2015版《中国药典》，药典中质量标准仅对复方中的荷叶碱进行了含量测定。然而中药药效的产生是多种化学成分协同作用的结果，因此中药的质量控制也应选择多个化学成分作为检测指标。荷丹片成分较为复杂，单一成分作为指标成分具有一定的局限性。因此，对荷丹片进行多成分含量测定显得尤为重要。

发明内容

本发明的发明目的是，针对上述问题，提供一种荷丹片的多成分含量测定方法，测定了荷丹片中丹参素、原儿茶酸、金丝桃苷、番泻苷B、迷迭香酸等17 种化学成分的含量，能更好的控制荷丹片的质量。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种荷丹片的多成分含量测定方法，包括以下步骤：

S1.对照品溶液的制备：

分别精密称取丹参素、原儿茶酸、补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、金丝桃苷、番泻苷B、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、荷叶碱、丹酚酸 A、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚，溶解于溶剂中，得到对照品储备液；

分别精密量取所述对照品储备液加溶剂稀释，得对照品溶液，备用。

S2.荷丹片样品溶液的制备

取荷丹片，粉碎后精密称取，溶解于甲醇中，超声提取，离心，取上清液过滤，即得荷丹片样品溶液，备用。

S3.含量测定：

采用高效液相色谱法，在相同的检测条件下分别获得对照品溶液和对照品溶液的色谱图；并根据对照品溶液的浓度、对照品溶液在色谱图中的峰面积以及荷丹片样品溶液中与对照品溶液相对应成分在色谱图中的峰面积，计算荷丹片样品溶液中与对照品溶液相对应成分的含量。

所述检测条件包括：

色谱柱为Agilent-ZORBAX Eclipse Plus C18；以体积分数0.2％甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流动相流速为0.3mL/min；柱温为 25～40℃。

优选的，步骤S1中，分别取丹参素、原儿茶酸、补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、金丝桃苷、番泻苷B、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、荷叶碱、丹酚酸A、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚10mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加甲醇配制成每1mL 含有丹参素1.056mg、原儿茶酸1.140mg、补骨脂苷1.004mg、异补骨脂苷1.015 mg、金丝桃苷0.952mg、番泻苷B 0.942mg、迷迭香酸1.004mg、紫草酸0.988mg、丹酚酸B 1.007mg、荷叶碱0.939mg、丹酚酸A 0.957mg、补骨脂素1.024 mg、异补骨脂素0.901mg、新补骨脂异黄酮1.118mg、补骨脂宁0.983mg、隐丹参酮1.017mg、补骨脂酚0.813mg的对照品储备液。

分别取丹参素、原儿茶酸、补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、金丝桃苷、番泻苷B、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、荷叶碱、丹酚酸A、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚储备液适量加入50mL容量瓶定容至刻线，混匀，得浓度分别为(42.24μg/mL、11.40μg/mL、 100.40μg/mL、50.75μg/mL、95.20μg/mL、9.42μg/mL、20.08μg/mL、19.76μg/mL、161.12μg/mL、75.12μg/mL、95.70μg/mL、51.10μg/mL、45.05μg/mL、5.59μg/mL、 0.98μg/mL、20.34μg/mL、16.26μg/mL)的对照品溶液。

优选的，步骤S2中，取荷丹片，粉碎，取约0.5g，精密称定，置25mL容量瓶中，加入适量甲醇，密塞，超声处理10min，放冷，定容至刻线，摇匀，取 1mL加50％甲醇1:1稀释，混匀，14000rpm离心10min，取上清液，即得。

优选的，超声处理条件为功率300W，频率40kHz。

优选的，步骤S3中，所述梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：

0-20min，流动相A95％-90％，流动相B 5％-10％；

20-30min，流动相A90％-80％,流动相B 10％-20％；

30-40min，流动相A80％-65％,流动相B 20％-35％；

40-60min，流动相A65％-5％,流动相B 35％-95％。

优选的，所述梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：

0min，流动相A 95％，流动相B 5％；

24min，流动相A 87％,流动相B 13％；

30min，流动相A 80％,流动相B 20％；

38min，流动相A 70％,流动相B 30％；

55min，流动相A 10％,流动相B 90％。

优选的，步骤S2中，检测波长为：0～4.6min(丹参素)，280nm；4.6～6.0 min(原儿茶酸)，254nm；6.0～10.0min，280nm；10.0～24.0min(补骨脂苷、异补骨脂苷)，246nm；24.0～31min(金丝桃苷、番泻苷B)，254nm；31～32.6 min(迷迭香酸)，280nm；32.6～34.0min(紫草酸)，254nm；340～36.0min (丹酚酸B、丹酚酸A、荷叶碱)，280nm；36.0～40.0min(补骨脂素、异补骨脂素)，246nm；40.0～55.0min(新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚)，254nm。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

1.本发明所提供的测定方法，HPLC法具有灵敏度高、抗干扰强、操作简便等优点，能快速高效测定样本中成分的含量。我们采用HPLC法***开展了荷丹片的质量控制研究，测定了荷丹片中丹参素、原儿茶酸、金丝桃苷、番泻苷B、迷迭香酸等17种化学成分的含量，能更好的控制荷丹片的质量。

2.本发明的测定方法具有操作简便、快速，日内、日间精密度、重复性及稳定性良好，符合相关方法学的要求。

说明书附图

图1为本发明实施例1荷丹片样品溶液色谱图；

图2为本发明实施例1对照品溶液色谱图；

图中，1、丹参素；2、原儿茶酸；3、补骨脂苷；4、异补骨脂苷；5、金丝桃苷；6、番泻苷B；7、迷迭香酸；8、紫草酸；9、丹酚酸B；10、荷叶碱；11、丹酚酸A；12、补骨脂素；13、异补骨脂素；14、新补骨脂异黄酮；15、补骨脂宁；16、隐丹参酮；17、补骨脂酚

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

材料：

本发明实施例使用的仪器见下表1。

表1使用仪器

本发明实施例使用试剂为：

对照品：丹参素(批号：D-014-150318)，金丝桃苷(批号：J-012-150826)，番泻苷B(批号：F-004-150729)，紫草酸(批号：Z-008-150324)，荷叶碱(批号：H-042-141122)，丹酚酸A(批号：D-011-150916)，隐丹参酮(批号： Y-002-150802)，均购于成都瑞芬思生物科技有限公司；原儿茶酸(批号： W06-3-41)，迷迭香酸(批号：W10-3-3)，丹酚酸B(批号：W-17-7-1)，购于天津中新药业研究中心；补骨脂素(批号：110738-201313)，异补骨脂素(批号：110739-201115)，购自中国食品药品检定研究院，补骨脂苷、异补骨脂苷(实验室自制，经NMR，MS结构鉴定，经UPLC-UV分析纯度>98％)，新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、补骨脂酚(实验室自制)。各标准品纯度均大于98.0％。各标准品纯度检查见附录。

样品：荷丹片批号分别为20150901、20150902、20150903、20150904、 20150905、20151001、20151002、20151003、20151004、20151005、20151006、 20151007、20151008、20150906(方法学研究)，由南昌济顺制药有限公司提供。

实施例1

一种荷丹片的多成分含量测定方法，包括以下步骤：

S1.对照品溶液的制备：

分别取丹参素、原儿茶酸、补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、金丝桃苷、番泻苷B、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、荷叶碱、丹酚酸A、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚10mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加甲醇配制成每1mL含有丹参素1.056mg、原儿茶酸1.140mg、补骨脂苷1.004mg、异补骨脂苷1.015mg、金丝桃苷0.952mg、番泻苷B 0.942mg、迷迭香酸1.004mg、紫草酸0.988mg、丹酚酸B 1.007mg、荷叶碱0.939mg、丹酚酸A0.957mg、补骨脂素1.024mg、异补骨脂素0.901mg、新补骨脂异黄酮1.118mg、补骨脂宁0.983mg、隐丹参酮1.017mg、补骨脂酚0.813mg的对照品储备液。

分别取丹参素、原儿茶酸、补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、金丝桃苷、番泻苷B、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、荷叶碱、丹酚酸A、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚储备液适量加入50mL容量瓶定容至刻线，混匀，得浓度分别为(42.24μg/mL、11.40μg/mL、 100.40μg/mL、50.75μg/mL、95.20μg/mL、9.42μg/mL、20.08μg/mL、19.76μg/mL、 161.12μg/mL、75.12μg/mL、95.70μg/mL、51.10μg/mL、45.05μg/mL、5.59μg/mL、 0.98μg/mL、20.34μg/mL、16.26μg/mL)的对照品溶液。

S2.荷丹片样品溶液的制备：

取荷丹片，粉碎，取约0.5g，精密称定，置25mL容量瓶中，加入适量甲醇，密塞，超声处理10min，放冷，定容至刻线，摇匀，取1mL加50％甲醇1:1 稀释，混匀，14000rpm离心10min，取上清液，即得。

优选的，超声处理条件为功率300W，频率40kHz。

S3.含量测定：

所述检测条件包括：

检测波长为：0～4.6min(丹参素)，280nm；4.6～6.0min(原儿茶酸)，254 nm；6.0～10.0min，280nm；10.0～24.0min(补骨脂苷、异补骨脂苷)，246nm； 24.0～31min(金丝桃苷、番泻苷B)，254nm；31～32.6min(迷迭香酸)，280 nm；32.6～34.0min(紫草酸)，254nm；340～36.0min(丹酚酸B、丹酚酸A、荷叶碱)，280nm；36.0～40.0min(补骨脂素、异补骨脂素)，246nm；40.0～55.0min(新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚)，254nm。

所述梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：

0min，流动相A 95％，流动相B 5％；

24min，流动相A 87％,流动相B 13％；

30min，流动相A 80％,流动相B 20％；

38min，流动相A 70％,流动相B 30％；

55min，流动相A 10％,流动相B 90％。

分别取供试品溶液和对照品溶液进HPLC测定，色谱图如图1和图2所示，得出荷丹片样品含量测定结果如表2所示。

表2荷丹片样品含量测定结果(mg/片)

实验例：

1.提取条件考察

本实验从提取时间、提取料液比、提取溶剂三个方面考察了荷丹片提取丹参素、原儿茶酸、补骨脂苷、异补骨脂苷、金丝桃苷、番泻苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、荷叶碱、丹酚酸A、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚提取效率的影响因素。结果见表3。

表3提取条件考察

注：1、丹参素；2、原儿茶酸；3、补骨脂苷；4、异补骨脂苷；5、金丝桃苷；6、番泻苷B；7、迷迭香酸；8、紫草酸；9、丹酚酸B；10、荷叶碱；11、丹酚酸A；12、补骨脂素；13、异补骨脂素；14、新补骨脂异黄酮；15、补骨脂宁；16、隐丹参酮；17、补骨脂酚(“*”代表料液比)

结果表明，料液比为1:50时各成分浓度合适、分离度好，且节约溶剂；提取时间为30min，用甲醇作溶剂时各成分提取率相对最高。因此，选择提取条件定为取荷丹片粉末0.5g于25mL容量瓶中，加入适量甲醇，密塞，超声30min，取出放冷，用甲醇定容至刻线，摇匀，取1mL，用50％甲醇1:1稀释，涡匀，14000 rpm，离心10min。

2.线性关系考察

将实施例1中的对照品溶液用50％甲醇逐级稀释一系列标准品溶液，取2μL 注入液相色谱仪，分别计算同一保留时间下的峰面积，以浓度x为横坐标，以峰面积y为纵坐标绘制标准曲线。计算出标准曲线的回归方程和相关系数。结果表明：各对照品在各自的浓度范围内线性关系良好，线性关系见表4。

表4各指标成分的线性回归方程和线性范围

3.精密度试验

3.1日内精密度试验

精密吸取同一供试品溶液，进样2μL，重复进样6次，测定含量，计算其RSD。结果表明：日内精密度RSD值范围在0.19～1.26％，说明该法精密度良好，结果见表5。

表5日内精密度试验结果(n＝6)

3.2日间精密度试验

精密吸取同一供试品溶液，进样2μL，重复进样6次，连续测定三天，每天制备一份供试品溶液，测定各成分的含量，计算其RSD。结果表明：日间精密度RSD值为0.08～0.66％，说明该法精密度良好，结果见表6。

表6日间精密度试验结果(n＝3)(mg/g)

4.重复性试验

平行精密称取6份荷丹片粉末，分别按照实施例1方法制备荷丹片供试品溶液6份，将处理好的供试品溶液进行分析，测定各定量成分的含量，计算其RSD 值，考察该方法的重现性。结果表明：丹参素的含量为0.576mg/g、原儿茶酸的含量为0.130mg/g、补骨脂苷的含量为0.960mg/g、异补骨脂苷的含量为0.588mg/g、金丝桃苷的含量为2.202mg/g、番泻苷B的含量为0.052mg/g、迷迭香酸的含量为0.209mg/g、紫草酸的含量为0.219mg/g、丹酚酸B的含量为3.030mg/g、荷叶碱的含量为1.105mg/g、丹酚酸A的含量为0.555mg/g、补骨脂素的含量为0.399mg/g、异补骨脂素的含量为0.309mg/g、新补骨脂异黄酮的含量为0.034mg/g、补骨脂宁的含量为0.012mg/g、隐丹参酮的含量为0.252mg/g、补骨脂酚的含量为0.111mg/g；RSD值范围在0.70～2.86％，表明该方法的重现性良好，结果见表7。

表7荷丹片指标成分含量测定的重复性试验结果(mg/g)

5.稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液(批号20150906)，在室温下保存，分别于0、2、 4、6、8、12h的时间间隔，精密吸取2μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算RSD，考察荷丹片在常温实验条件下稳定性是否良好。结果表明：RSD值范围在0.16～1.02％，表明荷丹片在常温实验条件下稳定性良好，结果见表8。

表8稳定性试验结果(mg/g)

6.加样回收率试验

取已知含量的荷丹片样品(批号20150906)约0.25g，精密称定6份，加入与样品中各成分含有量相当的对照品的溶液，按实施例1方法制备供试溶液，依法测定峰面积并计算回收率值。回收率范围在97.61～103.0％，符合相关规定，结果见表9。

表9样品中17种成分的加样回收率结果(n＝6)

经过***的方法学考察表明，所选取的17个化合物的线性关系良好，r²均大于0.999；日内精密度RSD值在0.19～1.26％，日间精密度RSD值0.08～0.61％，重复性的RSD值0.70～2.86％；丹参素、原儿茶酸、补骨脂苷和异补骨脂苷等的平均回收率为97.61～102.9％，稳定性的RSD值0.16～1.02％，结果表明：该方法日内、日间精密度、重复性及稳定性良好，符合相关方法学的要求，可用于样品的含量测定。

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims

1.荷丹片的多成分含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.对照品溶液的制备：

分别精密称取丹参素、原儿茶酸、补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、金丝桃苷、番泻苷B、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、荷叶碱、丹酚酸A、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚，溶解于溶剂中，得到对照品储备液；

分别精密量取所述对照品储备液加溶剂稀释，得对照品溶液，备用；

S2.荷丹片样品溶液的制备：

取荷丹片，粉碎后精密称取，溶解于甲醇中，超声提取，离心，取上清液过滤，即得荷丹片样品溶液，备用；

S3.含量测定：

采用高效液相色谱法，在相同的检测条件下分别获得对照品溶液和对照品溶液的色谱图；并根据对照品溶液的浓度、对照品溶液在色谱图中的峰面积以及荷丹片样品溶液中与对照品溶液相对应成分在色谱图中的峰面积，计算荷丹片样品溶液中与对照品溶液相对应成分的含量；

所述检测条件包括：

色谱柱为Agilent-ZORBAX Eclipse Plus C18；以体积分数0.2％甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流动相流速为0.3mL/min；柱温为25～40℃。

2.根据权利要求1所述的荷丹片的多成分含量测定方法，其特征在于，步骤S1中，分别取丹参素、原儿茶酸、补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、金丝桃苷、番泻苷B、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、荷叶碱、丹酚酸A、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚10mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，加甲醇配制成每1mL含有丹参素1.056mg、原儿茶酸1.140mg、补骨脂苷1.004mg、异补骨脂苷1.015mg、金丝桃苷0.952mg、番泻苷B 0.942mg、迷迭香酸1.004mg、紫草酸0.988mg、丹酚酸B 1.007mg、荷叶碱0.939mg、丹酚酸A 0.957mg、补骨脂素1.024mg、异补骨脂素0.901mg、新补骨脂异黄酮1.118mg、补骨脂宁0.983mg、隐丹参酮1.017mg、补骨脂酚0.813mg的对照品储备液；

分别取所述对照品储备液加入50mL容量瓶定容至刻线，混匀，得对照品溶液。

3.根据权利要求1所述的荷丹片的多成分含量测定方法,其特征在于,步骤S2中，取荷丹片，粉碎，取约0.5g，精密称定，置25mL容量瓶中，加入适量甲醇，密塞，超声处理10min，放冷，定容至刻线，摇匀，取1mL加50％甲醇1:1稀释，混匀，14000rpm离心10min，取上清液，即得荷丹片样品溶液。

4.根据权利要求3所述的荷丹片的多成分含量测定方法,其特征在于,超声处理条件为功率300W，频率40kHz。

5.根据权利要求1所述的荷丹片的多成分含量测定方法,其特征在于,步骤S3中，所述梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：

0-20min，流动相A95％-90％，流动相B 5％-10％；

20-30min，流动相A90％-80％,流动相B 10％-20％；

30-40min，流动相A80％-65％,流动相B 20％-35％；

40-60min，流动相A65％-5％,流动相B 35％-95％。

6.根据权利要求5所述的荷丹片的多成分含量测定方法,其特征在于,所述梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：

0min，流动相A 95％，流动相B 5％；

24min，流动相A 87％,流动相B 13％；

30min，流动相A 80％,流动相B 20％；

38min，流动相A 70％,流动相B 30％；

55min，流动相A 10％,流动相B 90％。

7.根据权利要求1所述的荷丹片的多成分含量测定方法,其特征在于,步骤S2中，检测波长为：0～4.6min(丹参素)，280nm；4.6～6.0min(原儿茶酸)，254nm；6.0～10.0min，280nm；10.0～24.0min(补骨脂苷、异补骨脂苷)，246nm；24.0～31min(金丝桃苷、番泻苷B)，254nm；31～32.6min(迷迭香酸)，280nm；32.6～34.0min(紫草酸)，254nm；340～36.0min(丹酚酸B、丹酚酸A、荷叶碱)，280nm；36.0～40.0min(补骨脂素、异补骨脂素)，246nm；40.0～55.0min(新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、隐丹参酮、补骨脂酚)，254nm。