CN109280680A - 一种酶促联产的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酶促联产的方法，该方法包括以下步骤：在酶促反应体系中，按比例添加两种或两种以上反应底物、盐离子以及腺苷；向上述体系中添加ATP再生酶、AK酶以及两种或两种以上生产用酶，进行反应。本发明的酶促联产的方法，具有以下优点：1)在一个需要ATP的反应体系中，同时添加两种或两种以上的反应底物和相应生产用酶，可以生成多种有经济价值的产物，简化了反应工序，具有更高的产业价值；2)联产反应节省了ATP再生酶和AK酶，同时节省了反应时间，降低了水、电、人工成本等；3)使用腺苷替代传统的ATP或AMP，为工业生产节约了大量原料成本，腺苷价格低廉，来源广泛。

Description

一种酶促联产的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种酶促联产的方法。
背景技术
三磷酸腺苷(ATP)由一个腺苷(A)和三个磷酸基团(Pi)组成，分子量为507，分子式C10H16N5O13P3。ATP分子呈A-Pi～Pi～Pi结构，远离腺苷的两个磷酸键由～表示，为高能磷酸键，在反应过程中断裂释放大量能量：当一个高能磷酸键断裂时，ATP分子转化为二磷酸腺苷(ADP)，释放能量30.5kJ/mol；当第二个高能磷酸键断裂时，ADP分子转化为腺苷酸(AMP)，可再释放能量27.6kJ/mol。ATP是生物体内能量的转换器和贮存器，被称为“能量通货”。
ATP参与众多酶促反应，包括连接酶(EC 6)参与的反应，如谷胱甘肽、乙酰辅酶A、肌肽、肠菌素、谷氨酰氨、L-茶氨酸、藻青素、D-丙氨酰丙氨酸、DNA和RNA等物质的合成，转移磷酸根基团的转移酶(EC 2.7)所参与的酶促反应，如磷酸肌酸、磷酸精氨酸、6-磷酸己糖、1,6-磷酸果糖、3-磷酸甘油、氧化型辅酶II、胞苷三(二)磷酸(CT(D)P)、鸟苷三(二)磷酸(GT(D)P)、尿苷三(二)磷酸(UT(D)P)等物质的合成，腺苷转移酶参与的反应，如S-腺苷甲硫氨酸的合成，以及环化腺苷酸的合成等。
目前，工业生产中直接使用ATP进行酶促反应成本过高，收益甚微。如何提高ATP的利用率以及建立稳定、有效的ATP再生体系，是目前利用ATP进行工业化生产的研究方向。
工业上生产和再生ATP的常用方法是利用酵母菌的糖酵解途径进行底物水平磷酸化。此法参与催化反应的酶众多，反应过程复杂，反应过程不易控制，产品批次间质量差异较大。同时酵母酶系质量常因供应的厂家不同、批次不同、甚至季节不同而有很大差异。另外反应过程需要加入大量的酵母细胞酶液，引入了许多蛋白、色素等杂质给后期纯化带来一定困难。近年来，ATP再生的研究重点转向使用单一酶或较简单的酶系，获得高效稳定的再生效果。其中，乙酸激酶、氨激酶、丙酮酸激酶等酶均可有效再生ATP。但是，这些酶所利用的底物价值昂贵，如丙酮酸激酶所利用的磷酸烯醇式丙酮酸；且生成的副产物有一定的生物毒性和污染性，如乙酸激酶、氨激酶催化反应的产物分别为乙酸和氨气，因此较难在工业生产中大量使用。
腺苷由腺嘌呤和D-核糖组成，是生物体内合成ATP的前体物质，其价格相对低廉。专利CN201710453365.3使用腺苷代替ATP进行酶促反应，加入腺苷激酶(AK，EC 2.7.1.20)催化腺苷生成AMP，同时使用多聚磷酸激酶(PPK，EC 2.7.4.1)、腺苷酸激酶(ADK，EC2.7.4.3)、多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(PAP，EC 2.7.4.-)三种“ATP再生酶”合理组合生成和再生ATP。使用该方法加入不同底物和生产用酶，可用于生产多种单一物质，其效果稳定，产物污染较小，成本低廉。
发明内容
本发明提供了一种酶促联产的方法，通过该方法可联产两种或两种以上产物，即在反应体系中，加入两种或两种以上的反应底物和相应生产用酶，同时添加腺苷激酶(AK)和ATP再生酶，生成两种或两种以上有经济价值的物质，进一步降低生产成本。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种酶促联产的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)在酶促反应体系中，按比例添加两种或两种以上反应底物、盐离子以及腺苷；
(2)向上述体系中添加ATP再生酶、AK酶以及两种或两种以上生产用酶进行反应。
优选地，上述技术方案中，所述反应体系的反应条件如下：
反应温度为：25-60℃，优选温度为30-50℃；
反应pH为：5-10，优选pH为6-9；
反应体系包含：底物；腺苷；多聚磷酸或其盐；镁离子和锰离子的一种或两种的水溶液；
在反应体系中，按比例添加ATP再生酶、AK酶以及两种或两种以上生产用酶，进行反应。
优选地，上述技术方案中，所述反应体系还包括：
铵离子、钾离子或钠离子的一种或几种组合；和/或Tris或磷酸根离子的一种或两种组合。
优选地，上述技术方案中，腺苷浓度为4E-5-0.18M；多聚磷酸或其盐的浓度为0.01-0.3M；镁离子浓度为0.01-0.2M；锰离子浓度为0.005-0.15M。
优选地，上述技术方案中，钾离子浓度为0.01-0.5M；钠离子浓度为0.01-0.5M；铵离子浓度为0.01-0.5M；Tris浓度为0.01-0.1M；磷酸盐浓度为0.01-0.1M。
优选地，上述技术方案中，镁离子选自于氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁和硝酸镁中的一种或多种；锰离子选自于氯化锰和硫酸锰中的一种或多种；多聚磷酸或其盐选自于多聚磷酸钠、多聚磷酸钾和多聚磷酸铵中的一种或多种。
优选地，上述技术方案中，ATP再生酶为多聚磷酸激酶(PPK)、腺苷酸激酶(ADK)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(PAP)的任意两种或三种组合。即使用PPK和ADK组合，或ADK和PAP组合，或PPK和PAP组合，或PPK、ADK和PAP的组合。上述的ATP再生酶和AK酶可来源于任何生物，或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。
优选地，上述技术方案中，ATP再生酶和AK酶为固定化酶或游离酶；其中，PPK酶浓度为0.01-5000U/L、ADK酶浓度为0.01-5000U/L、PAP酶浓度为0.01-5000U/L、AK酶浓度为0.01-8000U/L，其中将1μM底物在1分钟内完全转化定义为1个活性单位(U)。
优选地，上述技术方案中，钾离子选自于氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、氢氧化钾、亚硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、醋酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和柠檬酸钾中的一种或多种；钠离子选自于氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、氢氧化钠、亚硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和柠檬酸钠中的一种或多种；铵离子选自于氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、氨水、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和醋酸铵中的一种或多种。
优选地，上述技术方案中，所述酶促联产反应为需要ATP的酶促反应，所述底物和生产用酶为联产产物对应需要的底物和生产用酶，所述联产产物为谷胱甘肽、乙酰辅酶A、肌肽、肠菌素、谷氨酰氨、L-茶氨酸、藻青素、D-丙氨酰丙氨酸、DNA、RNA、磷酸肌酸、磷酸精氨酸、6-磷酸己糖、1,6-磷酸果糖、3-磷酸甘油、氧化型辅酶II、胞苷三(二)磷酸(CT(D)P)、鸟苷三(二)磷酸(GT(D)P)、尿苷三(二)磷酸(UT(D)P)、S-腺苷甲硫氨酸和环化腺苷酸的至少两种。
优选地，上述技术方案中，上述所有酶可通过基因工程改造、发酵、纯化获得，或以自然提取等其它方式获得；酶可以游离的形式制成酶液或者干粉，也可进一步固定于固定化载体上，制得固定化酶。
优选地，上述技术方案中，酶是通过下列方式固定于固定化载体：吸附、包埋、共价、结合、交联或其组合；所述固定化载体选自于高分子载体、无机载体、磁性高分子微球载体中的一种或多种。其中，高分子载体选自于纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、聚苯乙烯、聚丙烯酸、海藻酸钠、壳聚糖、淀粉、聚乙烯醇、明胶、卡拉胶、尼龙或合成高聚物等；无机载体选自于多孔玻璃、氧化硅、硅胶、活性炭或硅藻土。
优选地，上述技术方案中，本发明添加的底物、酶及各类盐可一次性加入反应体系，也可按照工业生产工艺流程分批次流加补入。
上述酶促合成反应所需的生产用酶及底物见下表1。表1所列生产用酶可以来源于任何生物、或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶，可商购获得。
表1.本发明所涉及的酶促反应生产用酶及底物
本发明的上述技术方案，具有如下有益效果：
1)在一个需要ATP的反应体系中，同时添加两种或两种以上的反应底物和相应生产用酶，可以生成多种有经济价值的产物，简化了反应工序，具有更高的产业价值；
2)联产反应节省了ATP再生酶和AK酶，同时节省了反应时间，降低了水、电、人工成本等；
3)使用腺苷替代传统的ATP或AMP，为工业生产节约了大量原料成本，腺苷售价仅为ATP的10％或AMP的30％左右，价格低廉，来源广泛。
附图说明
图1为大肠杆菌表达的PPK酶、ADK酶、PAP酶和AK酶的SDS-PAGE图。
图2为实施例2检测S-腺苷甲硫氨酸的高效液相色谱(HPLC)图。
图3为实施例2检测谷胱甘肽的高效液相色谱(HPLC)图。
图4为对比例1检测S-腺苷甲硫氨酸的高效液相色谱(HPLC)图。
图5为对比例2检测谷胱甘肽的高效液相色谱(HPLC)图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。
本发明以下实施例及对比例中使用的各种物质，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1粗酶的制备
本发明方法中的ATP再生酶和AK酶可以商购获得，或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。
酶的制备过程如下：
根据PPK酶、ADK酶、PAP酶和AK酶各酶基因序列设计引物，通过PCR分别扩增出基因片段，并将其分别连接至表达载体(市售)，经测序正确后，分别转入E.coli BL21(DE3)菌株(市售)。
将转化后的E.coli BL21(DE3)单克隆接入LB培养基，培养至对数期后，加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导5小时收集菌体，使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)筛选高表达菌株。
将筛选出的高表达菌株在无菌条件下接入种子培养基，培养至对数生长期后扩大培养，最终接入含500L发酵培养基的发酵罐中，培养至OD600值20-30时加入1mM IPTG诱导5小时后，离心收集菌体。
其中LB培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％NaCl；种子培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％氯化钠；发酵培养基成分为：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠、5％磷酸氢二钠、1％磷酸二氢钠、0.01％硫酸镁和1％甘油。
图1为大肠杆菌表达的PPK酶、ADK酶、PAP酶和AK酶的SDS-PAGE图。如图1所示：泳道1为蛋白标志物14.4-116kDa(市售)；泳道2为PPK酶，40kDa；泳道3为ADK酶，25kDa；泳道4为PAP酶，55kDa；泳道5为AK酶，40kDa。
收获的菌体经超声或高压匀浆破菌后，离心收集上清。通过沉淀和过滤方法制得粗酶。
实施例2联产S-腺苷甲硫氨酸和谷胱甘肽
联产S-腺苷甲硫氨酸和谷胱甘肽的操作步骤如下：
在100L的反应体系中加入底物：2.5kg L-谷氨酸、2.5kg L-半胱氨酸、1.5kg甘氨酸、1.5kg L-甲硫氨酸、2.5kg腺苷，以及4.2kg六偏磷酸钠、0.27kg氯化铵、0.37kg氯化钾、1.0kg对甲苯磺酸钠、1.0kg六水氯化镁、0.1kg一水氯化锰和0.5kg磷酸氢二钠，搅拌均匀，调节pH值至7.0，温度至35℃。在反应体系中添加双功能谷胱甘肽合成酶(GshF)800U/L、PPK酶500U/L、ADK酶500U/L、PAP酶500U/L以及AK酶1000U/L开始反应，所添加酶的制备参见实施例1。
反应2小时后，添加甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)650U/L，继续反应，控制pH值为7.0，温度为35℃。
图2、图3为本发明实施例2的HPLC图谱。如图2所示，反应6小时后，高效液相色谱(HPLC)检测S-腺苷甲硫氨酸的生成量为25g/L。HPLC检测条件为：Kromasil C18色谱柱(购于AKZO NOBEL公司)(150×4.6mm)，检测波长260nm，检测温度25℃，流动相为含有流动相为含有1％冰醋酸、2.0g/L庚烷磺酸钠和10％甲醇的水溶液。如图3所示，反应6小时后，高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量为32g/L，图中未标出峰为氨基酸等物质。HPLC检测条件为：Kromasil C18色谱柱(购于AKZO NOBEL公司)(150×4.6mm)，检测波长210nm，检测温度25℃，流动相为含有6.8g/L磷酸二氢钾、2.0g/L庚烷磺酸钠和3％甲醇的水溶液，pH＝3.0。
实施例3联产磷酸肌酸和谷氨酰胺
联产磷酸肌酸和谷氨酰胺的操作步骤如下：
在100L的反应体系中加入底物：2.0kg肌酸、2.5kg谷氨酸，以及0.2kg腺苷、2.0kg四聚磷酸、0.4kg氯化钾、0.5kg六水氯化镁和0.6kg Tris，搅拌均匀，调节pH值至8.8，温度至32℃。在反应体系中添加肌酸激酶1000U/L、谷氨酰胺合成酶800U/L、PPK酶500U/L、ADK酶500U/L以及AK酶1000U/L开始反应，所添加酶的制备参见实施例1。反应期间控制pH值为8.8，温度为32℃。
反应6小时后，高效液相色谱(HPLC)检测磷酸肌酸生成量为30g/L。HPLC检测条件为：Kromasil C18色谱柱(购于AKZO NOBEL公司)(150×4.6mm)，检测波长210nm，检测温度25℃，检测流速1ml/min，流动相为含有0.2％磷酸二氢钾、0.1％四丁基氢氧化铵和5％乙腈的水溶液(pH值6.6)。高效液相色谱(HPLC)检测谷氨酰胺的生成量为20g/L。HPLC检测条件为：Kromasil C18色谱柱(购于AKZO NOBEL公司)(150×4.6mm)，检测波长210nm，检测温度25℃，流动相为含有流动相为含有0.05％磷酸、0.1％庚烷磺酸钠和5％乙腈的水溶液。
实施例4联产肌肽、L-茶氨酸和环化腺苷酸
联产肌肽、L-茶氨酸和环化腺苷酸(cAMP)的操作步骤如下：
在100L的反应体系中加入底物：1.5kg谷氨酸钠、0.7kg盐酸乙胺、1.5kg L-组氨酸、0.7kgβ-丙氨酸，以及1.0kg腺苷、3.0kg四聚磷酸、1.0kg六水氯化镁和0.5kg磷酸氢二钠，搅拌均匀，调节pH值至7.0，温度至30℃。在反应体系中添加肌肽合成酶800U/L、茶氨酸合成酶500U/L、ADK酶800U/L、PAP酶800U/L以及AK800U/L酶开始反应，所添加酶的制备参见实施例1。反应期间控制pH值为7.0，温度为30℃。
反应1小时后，添加腺苷酸环化酶500U/L，继续反应，控制pH值为7.0，温度为30℃。
反应6小时后，肌肽生成量为13g/L，环化腺苷酸生成量6g/L。HPLC检测条件为：Kromasil C18色谱柱(购于AKZO NOBEL公司)(150×4.6mm)，检测波长210nm，检测温度25℃，检测流速0.8ml/min，流动相为含有80mM磷酸盐缓冲液和15％甲醇的水溶液。L-茶氨酸生成量为12g/L。HPLC检测条件为：Kromasil C18色谱柱(购于AKZO NOBEL公司)(150×4.6mm)，检测波长203nm，检测温度30℃，检测流速1ml/min，流动相为含有0.05％TFA和5％乙腈的水溶液。
实施例5使用固定化酶联产1,6-二磷酸果糖和谷胱甘肽
使用固定化酶联产1,6-二磷酸果糖和谷胱甘肽的操作步骤如下：
(1)生产用酶、ATP再生酶和AK酶的固定：
生产用酶果糖激酶(FK)和磷酸果糖激酶(PFK)通过商购获得，同双功能谷胱甘肽合成酶(GshF)以及实施例1中初步纯化的PPK酶、PAP酶和AK酶一同以商业化的环氧基固定化载体LX1000EP固定。
将FK、PFK、GshF、PPK、PAP和AK酶按照活性比2：2：2：1：1：1混合配成混合酶液，酶液中AK酶活性为2000U/L。在恒温搅拌罐中加入LX1000EP湿载体2kg与上述酶液混合，在20℃条件下，150rpm搅拌12小时。过滤收集载体，用0.02M pH 8.0磷酸钾缓冲液清洗2遍，即得固定化混合酶。
(2)在反应柱中生成1,6-二磷酸果糖和谷胱甘肽：
使用固定化酶联产1,6-二磷酸果糖和谷胱甘肽的操作步骤如下：
配制反应液，每100L体系含有底物1.8kg果糖、2.5kg L-谷氨酸、2.5kg L-半胱氨酸、1.5kg甘氨酸，以及0.5kg腺苷、3.0kg六偏磷酸钠、0.5kg氯化铵、0.5kg七水硫酸镁、0.2kg硫酸锰和0.85kg磷酸氢二钠，配制时均匀搅拌防止出现沉淀。调节pH值至6.8，温度升为35-40℃。
将上述步骤(1)中的混合固定酶10kg装入反应柱，排尽气泡后制得酶反应柱。使用恒流泵将反应液以30L/h流速由下而上缓慢通过酶反应柱，反应期间控制温度为37℃。循环反应6小时后，收集反应液，检测1,6-二磷酸果糖的生成量为30g/L，谷胱甘肽生成量22g/L。HPLC检测条件为：Kromasil C18色谱柱(购于AKZO NOBEL公司)(150×4.6mm)，检测波长210nm，检测温度25℃，流动相为含有6.8g/L磷酸二氢钾、2.0g/L庚烷磺酸钠和3％甲醇的水溶液，pH＝3.0。
固定化酶循环反应20次以上或者-4℃储存时间一月以上，酶活性降低10-15％，需按比例补加或更换部分新酶。
实施例6联产S-腺苷甲硫氨酸和谷胱甘肽
联产S-腺苷甲硫氨酸和谷胱甘肽的操作步骤如下：
在100L的反应体系中加入底物：4.0kg L-谷氨酸、4.0kg L-半胱氨酸、2.5kg甘氨酸、3.0kg L-甲硫氨酸、4.8kg腺苷，以及10.1kg四聚磷酸、2.34kg氯化钠、2.0kg对甲苯磺酸钠、4.07kg六水氯化镁和2.16kg一水氯化锰，搅拌均匀，调节pH值至5.0，温度至60℃。在反应体系中添加双功能谷胱甘肽合成酶(GshF)1000U/L、PPK酶500U/L、ADK酶500U/L、PAP酶500U/L以及AK酶1000U/L开始反应，所添加酶的制备参见实施例1。
反应1小时后，添加甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)800U/L，继续反应，控制pH值为5.0，温度为60℃。
反应6小时后，高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量为15g/L，S-腺苷甲硫氨酸的生成量为18g/L。HPLC检测条件同实施例2。
实施例7联产磷酸肌酸和谷氨酰胺
联产磷酸肌酸和谷氨酰胺的操作步骤如下：
在100L的反应体系中加入底物：0.2kg肌酸、0.2kg谷氨酸，以及0.001kg腺苷、0.34kg四聚磷酸、0.05kg氯化铵、0.2kg六水氯化镁、0.072kg一水氯化锰和0.12kg Tris，搅拌均匀，调节pH值至10.0，温度至25℃。在反应体系中添加肌酸激酶10U/L、谷氨酰胺合成酶10U/L、PPK酶0.01U/L、ADK酶0.01U/L以及AK酶0.01U/L开始反应，所添加酶的制备参见实施例1。反应期间控制pH值为10.0，温度为25℃。
反应8小时后，高效液相色谱(HPLC)检测磷酸肌酸生成量为1g/L，谷氨酰胺的生成量为0.3g/L。HPLC检测条件同实施例3。
实施例8使用固定化酶联产1,6-二磷酸果糖和谷胱甘肽
使用固定化酶联产1,6-二磷酸果糖和谷胱甘肽的操作步骤如下：
(1)生产用酶、ATP再生酶和AK酶的固定：
生产用酶果糖激酶(FK)和磷酸果糖激酶(PFK)通过商购获得，同双功能谷胱甘肽合成酶(GshF)以及实施例1中初步纯化的ATP再生酶PPK酶和PAP酶分别以商业化的环氧基固定化载体LX1000EP或含氨基合成高聚物载体LX1000HA固定。
分别将FK、PFK、GshF、PPK、PAP和AK酶制成酶液，各3L，FK、PFK、GshF和AK酶液活性均为8000U/L，PPK和PAP酶液活性均为5000U/L。
在恒温搅拌罐中加入LX1000EP湿载体1kg与FK酶液3L混合，在20℃条件下，150rpm搅拌12小时。过滤收集载体，用0.02M pH 8.0磷酸钾缓冲液清洗2遍，即得固定化FK酶。PFK、GshF酶以相同方法固定。
在恒温搅拌罐中加入LX1000HA湿载体1kg与PPK酶液3L混合，在20℃条件下，150rpm搅拌12小时。过滤收集载体，用0.02M pH 8.0磷酸钾缓冲液清洗2遍，即得固定化PPK酶。PAP和AK酶以相同方法固定。
(2)在反应柱中生成1,6-二磷酸果糖和谷胱甘肽：
配制反应液，每100L体系含有底物3.0kg果糖、2.0kg L-谷氨酸、2.0kg L-半胱氨酸、2.0kg甘氨酸，以及0.8kg腺苷、5.0kg六偏磷酸钠、1.2kg氯化铵、4.93kg七水硫酸镁和1.56kg磷酸氢二钠，搅拌均匀，调节pH值至6.0，温度至50℃。
将上述步骤(1)中的混合固定酶10kg装入反应柱，排尽气泡后制得酶反应柱。使用恒流泵将反应液以30L/h流速由下而上缓慢通过酶反应柱，反应期间控制温度为37℃。循环反应6小时后，收集反应液，检测1,6-二磷酸果糖的生成量为24g/L，谷胱甘肽生成量19g/L。HPLC检测条件为：Kromasil C18色谱柱(购于AKZO NOBEL公司)(150×4.6mm)，检测波长210nm，检测温度25℃，流动相为含有6.8g/L磷酸二氢钾、2.0g/L庚烷磺酸钠和3％甲醇的水溶液，pH＝3.0。
固定化酶循环反应20次以上或者-4℃储存时间一月以上，酶活性降低10-15％，需按比例补加或更换部分新酶。
对比例1酶促法生产S-腺苷甲硫氨酸
生产S-腺苷甲硫氨酸的操作步骤如下：
在100L的反应体系中加入底物：1.5kg L-甲硫氨酸、6kg ATP，以及0.27kg氯化铵、0.37kg氯化钾、1.0kg对甲苯磺酸钠、1.0kg六水氯化镁、0.1kg一水氯化锰和0.5kg磷酸氢二钠，搅拌均匀，调节pH值至7.0，温度至35℃。在反应体系中添加MAT 650U/L开始反应，所添加酶的制备参见实施例1。反应期间控制pH值为7.0，温度为35℃。
图4为本对比例的HPLC图谱。如图4所示，反应4小时后，高效液相色谱(HPLC)检测S-腺苷甲硫氨酸的生成量为25g/L。HPLC检测条件同实施例2。
对比例2酶促法生产谷胱甘肽
生产谷胱甘肽的操作步骤如下：
在100L的反应体系中加入底物：2.5kg L-谷氨酸、2.5kg L-半胱氨酸、1.5kg甘氨酸、16kg ATP，以及0.27kg氯化铵、0.37kg氯化钾、1.0kg六水氯化镁、0.1kg一水氯化锰和0.5kg磷酸氢二钠，搅拌均匀，调节pH值至7.0，温度至35℃。在反应体系中添加GshF 800U/L开始反应，所添加酶的制备参见实施例1。反应期间控制pH值为7.0，温度为35℃。
图5为本对比例的HPLC图谱。如图5所示，反应6小时后，高效液相色谱(HPLC)检测谷胱甘肽的生成量为32g/L。HPLC检测条件同实施例2。
对比实施例2可以看出：在同一体系中，可联产两种或两种以上有经济价值的物质，节约了大量原料和酶成本，更加适合运用于规模化生产。另外，使用腺苷代替传统的ATP，加入AK酶和ATP再生酶进行酶促反应，虽然反应总体需要的酶量增加，但是腺苷比ATP用量少、价格低。
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种酶促联产的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)在酶促反应体系中，按比例添加两种或两种以上反应底物、盐离子以及腺苷；
(2)向上述体系中添加ATP再生酶、AK酶以及两种或两种以上生产用酶，进行反应。
2.根据权利要求1所述的一种酶促联产的方法，其特征在于，所述反应体系的反应条件如下：
反应温度为：25-60℃，优选温度为30-50℃；
反应pH为：5-10，优选pH为6-9；
反应体系包含：底物；腺苷；多聚磷酸或其盐；镁离子和锰离子的一种或两种的水溶液；
在反应体系中，按比例添加ATP再生酶、AK酶以及两种或两种以上生产用酶，进行反应。
3.根据权利要求2所述的一种酶促联产的方法，其特征在于，所述反应体系还包括：
铵离子、钾离子或钠离子的一种或几种组合；和/或Tris或磷酸根离子的一种或两种组合。
4.根据权利要求2所述的一种酶促联产的方法，其特征在于，腺苷浓度为4E-5-0.18M；多聚磷酸或其盐的浓度为0.01-0.3M；镁离子浓度为0.01-0.2M；锰离子浓度为0.005-0.15M。
5.根据权利要求3所述的一种酶促联产的方法，其特征在于，钾离子浓度为0.01-0.5M；钠离子浓度为0.01-0.5M；铵离子浓度为0.01-0.5M；Tris浓度为0.01-0.1M；磷酸盐浓度为0.01-0.1M。
6.根据权利要求2所述的一种酶促联产的方法，其特征在于，镁离子选自于氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁和硝酸镁中的一种或多种；锰离子选自于氯化锰和硫酸锰中的一种或多种；多聚磷酸或其盐选自于多聚磷酸钠、多聚磷酸钾和多聚磷酸铵中的一种或多种。
7.根据权利要求2所述的一种酶促联产的方法，其特征在于，ATP再生酶为多聚磷酸激酶(PPK)、腺苷酸激酶(ADK)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(PAP)的任意两种或三种组合。
8.根据权利要求7所述的一种酶促联产的方法，其特征在于，ATP再生酶和AK酶为固定化酶或游离酶；其中，PPK酶浓度为0.01-5000U/L、ADK酶浓度为0.01-5000U/L、PAP酶浓度为0.01-5000U/L、AK酶浓度为0.01-8000U/L。
9.根据权利要求3所述的一种酶促联产的方法，其特征在于，钾离子选自于氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、氢氧化钾、亚硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、醋酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和柠檬酸钾中的一种或多种；钠离子选自于氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、氢氧化钠、亚硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和柠檬酸钠中的一种或多种；铵离子选自于氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、氨水、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和醋酸铵中的一种或多种。
10.根据权利要求1所述的一种酶促联产的方法，其特征在于，所述酶促联产反应为需要ATP的酶促反应，所述底物和生产用酶为联产产物对应需要的底物和生产用酶，所述联产产物为谷胱甘肽、乙酰辅酶A、肌肽、肠菌素、谷氨酰氨、L-茶氨酸、藻青素、D-丙氨酰丙氨酸、DNA、RNA、磷酸肌酸、磷酸精氨酸、6-磷酸己糖、1,6-磷酸果糖、3-磷酸甘油、氧化型辅酶II、胞苷三(二)磷酸(CT(D)P)、鸟苷三(二)磷酸(GT(D)P)、尿苷三(二)磷酸(UT(D)P)、S-腺苷甲硫氨酸和环化腺苷酸的至少两种。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110777180A (zh) * 2019-12-04 2020-02-11 美亚药业海安有限公司 一种固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法
CN110804634A (zh) * 2019-12-04 2020-02-18 深圳瑞德林生物技术有限公司 酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺
CN111235084A (zh) * 2020-04-01 2020-06-05 湖南福来格生物技术有限公司 重组大肠杆菌工程菌及利用其制备s-腺苷甲硫氨酸的方法
CN111269928A (zh) * 2020-03-17 2020-06-12 河南科技大学 通过动态调控atp促进谷胱甘肽合成的重组质粒、工程菌及其应用
CN111979206A (zh) * 2019-05-24 2020-11-24 深圳瑞德林生物技术有限公司 固定化融合酶及用其制备谷胱甘肽的方法
CN112063669A (zh) * 2019-06-11 2020-12-11 百瑞全球有限公司 酶法反应组合物、增加酶法反应中三磷酸腺苷(atp)量的方法及其应用
CN113122593A (zh) * 2019-12-31 2021-07-16 安徽古特生物科技有限公司 一种利用多聚磷酸盐制备核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102978267A (zh) * 2012-06-15 2013-03-20 北京天开易达生物科技有限公司 酶法制备谷胱甘肽的方法
CN105219823A (zh) * 2015-11-10 2016-01-06 深圳市古特新生生物科技有限公司 一种酶法制备谷胱甘肽的方法
CN105603028A (zh) * 2016-03-22 2016-05-25 深圳市古特新生生物科技有限公司 酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法
CN105861598A (zh) * 2016-04-27 2016-08-17 深圳市古特新生生物科技有限公司 一种酶法再生atp的方法及其应用
CN106191170A (zh) * 2016-08-09 2016-12-07 深圳市古特新生生物科技有限公司 一种酶法制备三磷酸腺苷的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102978267A (zh) * 2012-06-15 2013-03-20 北京天开易达生物科技有限公司 酶法制备谷胱甘肽的方法
CN105219823A (zh) * 2015-11-10 2016-01-06 深圳市古特新生生物科技有限公司 一种酶法制备谷胱甘肽的方法
CN105603028A (zh) * 2016-03-22 2016-05-25 深圳市古特新生生物科技有限公司 酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法
CN105861598A (zh) * 2016-04-27 2016-08-17 深圳市古特新生生物科技有限公司 一种酶法再生atp的方法及其应用
CN106191170A (zh) * 2016-08-09 2016-12-07 深圳市古特新生生物科技有限公司 一种酶法制备三磷酸腺苷的方法

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111979206A (zh) * 2019-05-24 2020-11-24 深圳瑞德林生物技术有限公司 固定化融合酶及用其制备谷胱甘肽的方法
CN112063669A (zh) * 2019-06-11 2020-12-11 百瑞全球有限公司 酶法反应组合物、增加酶法反应中三磷酸腺苷(atp)量的方法及其应用
WO2020248855A1 (zh) * 2019-06-11 2020-12-17 百瑞全球有限公司 酶法反应组合物、增加酶法反应中三磷酸腺苷(atp)量的方法及其应用
US20220315905A1 (en) * 2019-06-11 2022-10-06 Sup Yin Tsang Enzymatic Reaction Composition, Method for Increasing Amount of Adenosine Triphosphate (ATP) in Enzymatic Reaction and Application Thereof
CN110777180A (zh) * 2019-12-04 2020-02-11 美亚药业海安有限公司 一种固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法
CN110804634A (zh) * 2019-12-04 2020-02-18 深圳瑞德林生物技术有限公司 酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺
CN113122593A (zh) * 2019-12-31 2021-07-16 安徽古特生物科技有限公司 一种利用多聚磷酸盐制备核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸的方法
CN111269928A (zh) * 2020-03-17 2020-06-12 河南科技大学 通过动态调控atp促进谷胱甘肽合成的重组质粒、工程菌及其应用
CN111269928B (zh) * 2020-03-17 2022-03-01 河南科技大学 通过动态调控atp促进谷胱甘肽合成的重组质粒、工程菌及其应用
CN111235084A (zh) * 2020-04-01 2020-06-05 湖南福来格生物技术有限公司 重组大肠杆菌工程菌及利用其制备s-腺苷甲硫氨酸的方法
CN111235084B (zh) * 2020-04-01 2021-08-20 湖南福来格生物技术有限公司 重组大肠杆菌工程菌及利用其制备s-腺苷甲硫氨酸的方法

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