CN109275914A - 黑木耳多肽功能食用组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种包含黑木耳多肽、大枣和生姜记取物混合调配对的组合物及其制备方法和应用。所述组合物主要功效成分为黑木耳小分子多肽,易于吸收,功效实验证明对多种亚健康症状的治疗具有良好的辅助作用。组合物的组成原料来源广泛,药食同源,具有良好的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于食品科学技术领域,涉及一种植物为原材料的功能食用组合物,更具体涉及一种含黑木耳复合多肽提取物的功能食用组合物及其制备方法。
背景技术
随着世界经济高速发展,社会节奏日益加快,心理压力不断加大,环境污染危害严重,导致多数人处于亚健康状态,出现神经精神方面、心脑血管方面、消化***方面和运动***方面涉及多个***的活动偏离正常状态。人体处于亚健康状态时,细胞水平上,表现为细胞膜上Na+、K+-ATP酶活性受抑制或失活,不能满足细胞内外钾、钠离子的交换,影响膜电位而引起收缩功能降低;降低葡萄糖、脂肪酸和乳酸等分子跨膜转运,影响细胞内代谢功能,阻碍膜上H+ 和乳酸根转运、Cl-/HCO3-、Na+/H+等膜内外离子交换,降低Na+、 Ca2+-ATP酶活性,使Ca2+输送受阻,超氧自由基增多,改变膜上多肽类、儿茶酚胺激素受体的构型等等,从而引起人体的亚健康状态,最终导致各种疾病的发生与发展。亚健康状态严重影响了人们的生活质量,影响了我们的工作和事业。改善亚健康体质恢复为健康状态成为全世界及我国的重要保健需求。
目前市面上虽然有着名目繁多的改善亚健康体质的产品,但是大多原料昂贵,有的制备工艺复杂,有的口味不佳,有的产品组分的结构特点和产品组分体系造成该产品吸收效率不理想、调理改善的症状指标少。总之,在亚健康调理的功能食用组合物技术领域,我们仍然需要不断开发原料容易获得,工艺简单,口感好,吸收效率高,调理症状类型多的保健功能产品。
黑木耳,是中国自古以来重要的亚健康调理食材。含胶体蛋白和水溶性纤维,黑木耳胶质蛋白和水溶性纤维能够清理肠道垃圾,增加肠道蠕动,治疗便秘,对于清理血管和清除肺部垃圾有显著效果。是理发产、纺织工人等粉尘污染行业的改善亚健康的保健品。但是食用常规形态的黑木耳不利于肠道吸收,作为菜品食用人体吸收率仅为5-8%。
现代营养学研究发现,植物多肽是生物体内重要的低分子物质,具有许多生理功能,除作为RNA、DNA的前体外,也作为生物化学过程的调节物质参与体内代谢,在细胞结构、代谢、和调节功能方面起着重要作用。因此黑木耳多肽则是一种重要的亚健康调理多肽。
枣具有益气养肾、补血养颜、补肝降压、安神壮阳、治虚劳损之功效。″故红枣是极佳的营养滋补品。李时珍在《本草纲目》[1]中说:枣味甘、性温,能补中益气、养血生津,用于治疗“脾虚弱、食少便溏、气血亏虚″等疾病。中国的草药书籍「本经」中记载到,红枣味甘性温、归脾胃经,有补中益气、养血安神、缓和药性的功能;而现代的药理学则发现,红枣含有蛋白质、糖类、有机酸、维生素A、维生素C、多种微量钙以及氨基酸等丰富的营养成份,枣能提高人体免疫力,并可抑制癌细胞。药理研究发现,红枣能促进白细胞的生成,降低血清胆固醇,提高血清白蛋白,保护肝脏,红枣中还含有抑制癌细胞,甚至可使癌细胞向正常细胞转化的物质。枣所含的芦丁,能使血管软化,从而降低血压,对高血压病有防治功效。红枣富含蛋白质、脂肪、糖类、胡萝卜素、B族维生素、维生素C、维生素P以及磷、钙、铁等成分,其中维生素C的含量在果品中名列前茅,有“天然维生素丸″之美称。具有较强的补养作用,能提高人体免疫功能,增强抗病能力;含有黄酮--双-葡萄糖甙A有镇静、催眠和降压作用,其中柚配质C糖甙类有中枢抑制作用,即降低自发运动及刺激反射作用、强直木僵作用,故大枣具有安神、镇静之功;富含的环磷酸腺苷,是人体能量代谢的必需物质,能增强肌力、消除疲劳、扩张血管、增加心肌收缩力、改善心肌营养,对防治心血管疾病有良好的作用。红枣具有补虚益气、养血安神、健脾和胃等功效。红枣对急慢性肝炎、肝硬化、贫血、过敏性紫癜等症有较好疗效。红枣含有三萜类化合物及环磷酸腺苷,有较强的抑癌、抗过敏作用,对防治骨质疏松、产后贫血有重要作用。
(三)生姜的功效:刺激心脏和血管
富含姜辣素,对心脏和血管有一定的刺激作用,可使心跳加快,血管扩张,从而使络脉通畅,供给正常。
亚健康调理功能食用组合物领域内,尚未出现商业化的包含黑木耳多肽,并复合大枣和生姜有效活性成分的复合功能食用组合物组合物。
发明内容
本发明的目的是提供一种弥补现有及似乎的不足,一种原料容易获得,工艺简单,口感好,吸收效率高,调理症状类型多的改善亚健康的包含黑木耳复合多肽的功能食用组合物及其制备方法和医药用途。
为实现上述发明目的,本发明的一个技术方案是一种功能食用组合物,其包含黑木耳多肽提取物、大枣提取物和生姜提取物。其中,所述黑木耳多肽、生姜提取物和大枣提取物的重量份比例为10~20份:30~60份:5~10份。
其中,所述黑木耳多肽、大枣提取物和生姜提取物的重量份比例为10~20 份:30~60份:5~10份。
本发明的第二个方案是种包含黑木耳多肽提取物、大枣提取物和生姜提取物的功能食用组合物的制备方法,复合蛋白酶分解黑木耳原料获得黑木耳复合多肽浓缩产物,配以大枣和生姜提取物,制得改善人体亚健康的功能复合物。其制备方法包括:处理匀浆,细胞破碎、酶解,提取过滤,按比例添加大枣、生姜提取液,混匀后干燥,得可用于亚健康调理的功能组合物干粉制剂。包括步骤
(1)制备黑木耳小分子肽溶液;
(2)分别制备大枣和生姜混合提取液;
(3)将黑木耳小分子肽溶液、大枣提取液和生姜提取液按照10~20份::
30~60份:5~10的重量份比例混合调配;
(4)将混合物干燥形成干粉混合物。
(5)将步骤(4)所得的干粉混合物作为添加剂,制备功能食用组合物。
在一实施例中,所述功能食用组合物为口服液。
在一实施例中,所述步骤(5)包括如花、灌装、巴氏灭菌、贴标。
在一些实施方式中,所述步骤(2)中大枣提取液的提取方法包括步骤:清洗、清洗、高温蒸煮、打浆、过滤、胶体磨、匀浆。
在一些实施方式中,所述步骤(2)中生姜提取液的提取方法包括步骤:清洗、榨汁、过滤。
在一些实施方式中,所述黑木耳复合小分子肽的制备方法包括步骤:
前处理
(1)物理破碎;
(2)高温水解;
(3)匀浆;
(4)灭菌;
酶解黑木耳多肽
(4)添加复合蛋白酶,保温水解;
(5)离心,分离发酵液;
干燥成型和分装
(6)喷雾干燥;
(7)制粒,分装。
在一些实施方式中,所述过筛是将机械破碎后的黑木耳过20~60目筛。
在一具体实施方式中,所述过筛是将机械破碎后的黑木耳过35目筛。
在一些实施方式中,所述高温水解的温度是80到100。
在一具体实施例中,所述高温水解的温度是100。
在一些实施方式中,所述高温水解的温度是80到100
在一些实施方式中,所述高温水解的时间是1到6小时。
在一具体实施方式中,所述高温水解的时间是3小时。
在一些实施方式中,所述匀浆是高温水解后的黑木耳在研磨匀浆设备中作用0.5~2小时。
在一具体实施方式中,所述匀浆是高温水解后的黑木耳在研磨匀浆设备中作用1小时。
在一具体实施方式中,所述黑木耳复合小分子肽是通过复合蛋白酶分解预处理过的破碎木耳获得。
高效率的蛋白水解酶除了对底物蛋白质应具有较高的水解率外,并应具有使用安全、价格便宜、生产条件要求不高等特点。酶作为一种具有生理活性的
特殊蛋白质,其活化中心不同,相应的水解专一性亦不同,对同一种蛋白质选用不同的蛋白酶进行水解,水解效果会有很大差别。根据pH适用范围不同, 试验采用中性蛋白酶和酸性蛋白酶两种酶联合水解,以获取高的水解率。
在一些实施方式中,所述蛋白酶复合物包括蛋白外切酶、蛋白内切酶和风味酶。
在一些实施方式中,所述蛋白酶包括动物来源,植物来源和微生物来源。
所述动物来源的蛋白酶包括胰蛋白酶、胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶;所述植物来源的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶;所述微生物来源的蛋白酶包括型芽孢杆菌2709、放线菌166、稀土曲霉3.942,As1.389和 As3.350。
在一些实施方式中,所述蛋白内切酶选自包含木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、1.39 中性蛋白酶、2709碱性蛋白酶和酸性蛋白酶的组。
在一些实施方式中,所述蛋白外切酶选自包含米曲霉外切酶、黑曲霉外切酶和米曲黑曲外切酶的组。
在一些实施方式中,所述风味酶包括酵母风味酶、乳酸菌风味酶和枯草杆菌风味酶。
在一些实施方式中,所述蛋白酶复合物选自木瓜内切酶、菠萝蛋白酶、1.398 中性蛋白酶、2709碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、米曲霉外切酶和酵母风味酶中的二种或多种。
在一些实施方式中,所述蛋白酶复合物由米曲霉外切酶、木瓜内切酶和酵母风味酶组成。
底物浓度,加酶量,酶解温度,PH值,时间等适当的条件是影响酶解效果的主要因素。
在一些实施方式中,所述木瓜内切酶和酵母风味酶的摩尔百分组成比例为 1:10~10:1。
在一些实施方试中,所述米曲霉外切酶的用量为1000U/g,所述木瓜内切酶的用量为1000U/g,所述风味酶的用量为100U/g。
在一具体实施方式中,所述木瓜内切酶和酵母风味酶的摩尔百分组成比例为 4:4:2。
在一些实施方式中,所述蛋白水解酶复合物水解黑木耳匀浆包括外切酶作用、内切酶作用。
在一些实施方式中,所述蛋白水解酶复合物水解黑木耳匀浆还包括风味酶三个步骤。
在一些实施方式中,所述外切酶作用时间为6~20小时,所述内切酶作用时间为20~100小时,所述风味酶作用时间为10~20小时。
在一些实施方式中,所述外切酶作用时间为12小时,所述内切酶作用时间为60小时,所述风味酶作用时间为15小时。
在一些实施方式中,所述蛋白内切酶的作用PH值为6.0~7.0。
在一具体实施例中,所述蛋白内切酶的作用PH值为6.5。
在一些实施方式中,所述蛋白外切酶的作用温度为50度到60度。
在一些实施方式中,所述蛋白内切酶的作用温度为50度到60度。
在一些实施方式中,所述蛋白风味酶的作用温度为50度到60度。
在一些实施方式中,所述加热方式为蒸气加热。
在一些实施方式中,所述加热方式为微波加热。
在一些实施方式中,所述蛋白外切酶的加入量为30`80g蛋白酶每200g黑木耳。
在一些实施方式中,所述黑木耳复合小分子肽是通过复合芽孢杆菌发酵获得。在一实施方式中,所述芽孢杆菌复合菌由枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌组成,所述孢杆菌复合菌中的草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的菌体数目比例为1::10~10:1。
枯草芽孢杆菌是工业、农业和医药工业等领域广泛应用的一种细菌,中性蛋白酶作为枯草芽孢杆菌产生的一种重要产物,近年来在食品加工工业中的应用越来越引起人们重视。蜡样芽孢杆菌是产生碱性蛋白酶的一种重要菌株。
黑木耳匀浆经过酶解后得到多肽产物具有由于黑木耳的理化特性包括
1)良好的溶解性和高浓度下的低粘度;
2)良好而耐酸和耐热稳定性;
3)黑木耳多肽速溶型性好,NS1值高达85%。;
4)黑木耳多肽具有良好的吸湿性、保湿性和凝胶软化功能。这些良好的理
化特性是黑木耳多肽具有高消化吸收性、高抗氧化性、低抗原性,具有保护和改善人体机能、皮肤养护等多种功能。本发明的第三个技术方案是含黑木耳多肽提取物、大枣提取物和生姜提取物的功能复合物在调理亚健康症状中的应用。
在一些实施方式中,所述调理亚健康的作用包括
1、主动吸收,迅速恢复体能
人体在进行激烈运动时,为了补给能量就需要消耗肌肉中的氨基酸。就是说,身体需要能量的时候就会从肌肉中获取。肌肉中的氨基酸被消耗掉后,肌肉组织就会受到损伤、肌肉产生疲劳感、难以发挥原有的力量。活性肽能比氨基酸更迅速地被人体吸收。在恢复体力方面,活性肽也发挥着优异的功效。
在一些实施方式中,所述调理亚健康的作用包括
2、消除大脑疲劳
大脑疲劳是由氧化血红蛋白浓度的上升引起的,服用木耳活性肽可以抑制氧化血红蛋白浓度的上升,因而能够缓和大脑的精神压力。
在一些实施方式中,所述调理亚健康的作用包括加速脂肪分解:
肽具有阻碍脂肪吸收、加速脂肪分解、促进基础代谢的作用,可以增加饮食后能量的消耗、促进体内脂肪的燃烧。黑木耳低聚肽摄入后,快速进入血液,可满足运动者对蛋白质的代谢需求,防止肌肉、皮肤、血液等因运动消耗蛋白、肌肉受损现象的发生。活性肽可以解决“在生长激素分泌旺盛的时间段内补充蛋白质”的难题,具有快速、整体被吸收功能的特点
在一些实施方式中,所述调理亚健康的作用包括减轻运动引起的肌肉损伤
活性肽与氨基酸相比,活性肽被肠道吸收的速度更快,运动后食用木耳肽可迅速地补充蛋白质,由SRT负荷引起的肌肉损伤及由此产生的肌肉疼痛、肿胀都明显减轻。通过循环的不断重复,肌肉就会变地越来越强壮起来。
在一些实施方式中,所述调理亚健康的作用包括调节血脂、降胆固醇
摄入活性肽后,可刺激人体内的甲状腺体,使甲状腺激素分泌量增加。甲状腺激素具有促进胆固醇酸化、阻碍肠壁对胆固醇吸收而加速排除体外的作用。活性肽对于降低人体胆固醇具有选择作用特性,当人体胆固醇处于正常值状态下,摄入活性肽对胆固醇无降低效应,高胆固醇患者摄入小分子肽后,则产生胆固醇降低效应,而且降低的脂蛋白类型属于对人体有害的低密度脂蛋白,对人体有益的、可以携带血脂分子到肝脏进行分解、排除体外的高密度脂蛋白作用。活性肽可增加褐色脂肪里面线粒体的活性,促进脂肪代谢。还能增加去甲肾上腺素的转化率,减少对脂肪酶的抑制,从而促进脂肪代谢。摄入黑木耳小分子肽,也可以起到防止血清胆固醇和血脂升高的作用。在用肠细胞做的培养试验表明:活性肽通过侵入胆固醇细胞、破坏了胆固醇的DNA结构,抑制了胆固醇的增殖。
在一些实施方式中,所述调理亚健康的作用包括提高免疫力的作用
活性肽里含有可以提高免疫力的氨基酸。其中具有代表性的就是:精氨酸和谷氨酸。精氨酸可以增强免疫细胞中的大食细胞的免疫功能,同时攻击侵入体内的病毒。另外,大量病毒侵入人体的时候,谷氨酸可以产生免疫细胞、击退病毒。所以,活性肽能够改善机体的细胞免疫功能,它可以促进T淋巴细胞增殖,增强巨噬细胞的功能,增强NK细胞的活性。研究报道,活性肽还可以促进肿瘤坏死因子的产生。
在一些实施方式中,所述调理亚健康的作用包括特别适合小肠发生功能性障碍和术后病人食用。
黑木耳活性肽可以增加小肠粘膜绒毛高度,加深隐窝深度,增加肠粘膜的吸收面积,促进小肠腺体发达,增加氨基酸肽酶的活性,因此能够促进小肠吸收功能的改善。在小肠发生功能障碍时,活性肽的吸收功能几乎不受影响,具有极高的营养保健价值。此外,术后病人的肠道容易暴露在病原菌的侵害之下,而活性肽可以阻止病原菌侵入肠道粘膜。
在一些实施方式中,所述调理亚健康的作用包括降血压
活性肽降压效果平稳,不会出现药物降压过程中的大幅波动,也没有药物降压危害肝、肾等其它器官的副作用,尤其对于原发性高血压患者有更为显著的效果。
在一些实施方式中,所述调理亚健康的作用包括缓冲血糖上升
活性肽是构成α-葡萄糖苷酶抑制素的有效成分。人体小肠中含有一种α-葡萄糖苷酶,主要功能是快速分解进入小肠的各种糖,供应人体对葡萄糖的需求。活性肽构成的α-葡萄糖苷酶抑制素具有阻止、延缓α-葡萄糖苷酶对淀粉、蔗糖、低聚糖等碳水化合物的降解作用,缓解碳水化合物向葡萄糖转化、进入血液、导致血糖升高现象,从而达到降低血糖指标的目的,防止血液中血糖上升引起的并发症。
在一些实施方式中,所述调理亚健康的作用包括抗氧化、延缓衰老
活性肽可以提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性,抑制脂质过氧化,清除羟自由基,有利于减少组织氧化,保护机体。维护细胞正常代谢,延缓细胞衰老,使人延年益寿。同时加速受损细胞修复,保持肌体活力,减少色素沉着的发生,从而阻止和推迟"寿斑"的出现。
本发明采取的又一技术方案是:一种复合植物多肽的医药用途,采用黑木耳为主要原料,低温提取复合多肽,配以大枣合生姜提取液制得的医药制剂,用于调节亚健康人群的症状,有效地改善亚健康状况,增强机体的储备力、抵抗力、恢复力,促使亚健康人群向健康转化,防止亚健康人群向疾病方向发展。
在一些实施方式中,所述调理亚健康的作用包括抗过敏
活性肽为恢复期病人、消化功能减退的老年人,特别是对牛乳蛋白过敏的婴幼儿,以及容易引起食物过敏的人们提供了安全、无过敏反应的蛋白营养源。
在一些实施方式中,所述调理亚健康的作用包括加速乙醇分解,降低酒精的毒害作用
在一些实施方式中,所述调理亚健康的作用包括提高血液中的丙氨酸和亮氨酸的含量,在丙氨酸和亮氨酸的共同作用下,可有效的降低血液中的乙醇浓度,加速乙醇分解,降低酒精的毒害作用。亮氨酸可使积聚脑组织的酒精,降低对骨骼的麻痹与异常收缩的作用,减少饮酒者的行为失常、失语等酒精中毒现象的发生。
在一些实施方式中,所述调理亚健康的作用包括提高注意力
本发明采用生物技术,从黑木耳细胞中提取一种小分子多肽,能增加细胞膜Na+、K+-ATP酶活性,有利于机体合成ATP,给提供细胞能源及动力,促进细胞内外物质交换能力,加速新陈代谢,排出体内堆积的酸性物质和超氧自由基,调动细胞活力,提高细胞钠-钾ATP酶的活性,抗氧化,综合调节亚健康人群心身失调阶段的疲劳,失眠,等症状,促使亚健康向健康转化,提高人们的健康水平和生活质量。并且原料来源广泛,药食同源,主要功效成分采用黑木耳经过提取制备获得的高纯度的黑木耳复合多肽,配合大枣和生姜的浓缩提取物混合调配所得的组合物,对多种亚健康疾病的治疗有高效的辅助作用,因此具有极其良好的商业前景。
附图说明、
图1黑木耳破碎匀浆经过酵素产生的复合蛋白酶解的毛细管电泳结果
图2.多肽的分子量标准
图3标准分子量工作曲线
图4蛋白微波酸解多肽凝胶渗透色谱
具体实施方式
下面的实施例用来进一步说明本发明,而不应该是对本发明范围的限制:
实施例一:黑木耳多肽干粉的制备
1.取黑木耳100公斤,挑选、清洗,在机械辊筒中破碎。加入黑木耳重量 5倍55℃的蒸馏水,于高压均质机中,破碎黑木耳组织破碎匀浆2小时。
2.用6.0mol/L HCl溶液,控制pH值5.5。按照底物质量浓度为5%,按米曲霉外切酶用量8%,木瓜蛋白酶液用量15%,在55℃恒温条件下,米曲霉风味酶用量5%,先后用是外切酶作用20小时,木瓜蛋白酶作用60小时,米曲霉风味酶作用10小时。
3.冷却至室温,3000r/min离心5分钟,上清液70℃灭酶50分钟,减压浓缩,得到多肽浓缩液;将离心剩余残渣加入3-5倍的55℃蒸馏水,进行2次酶消化,方法与以上步骤2相同。
(6)分离纯化,用特殊方法,将小分子肽液体中的残留酶和其它物质分离开,小分子肽液提取完成,其分子量在180至480道尔顿。
(7)用反渗透浓缩设置除去水分,成为湿粉,用微波真空机干燥或喷雾干燥成干粉。
(8)用制粒机黑木耳小分子活性肽颗粒制成一定规格的颗粒,用真空包装机包装成所需要的各种定量包装。
4.将步骤3所得浓缩液充分混匀,喷雾干燥,制成颗粒剂或片剂、胶囊;
5.颗粒剂的包装:5g/袋,20袋/盒。
用法用量:早晚各一次,每次1袋,温开水冲服。
实施例二.
实施例一:黑木耳多肽干粉的制备
1.取黑木耳100公斤,挑选、清洗,在机械辊筒中破碎。加入黑木耳重量 5倍55℃的蒸馏水,于高压均质机中,破碎黑木耳组织破碎匀浆2小时。
2.用6.0mol/L HCl溶液,控制pH值5.5。按照底物质量浓度为5%,按米曲霉外切酶用量8%,木瓜蛋白酶液用量15%,在55℃恒温条件下,米曲霉风味酶用量5%,先后用是外切酶作用20小时,木瓜蛋白酶作用60小时,米曲霉风味酶作用10小时。
3.冷却至室温,3000r/min离心5分钟,上清液70℃灭酶50分钟,减压浓缩,得到多肽浓缩液;将离心剩余残渣加入3-5倍的55℃蒸馏水,进行2次酶消化,方法与以上步骤2相同。
(6)分离纯化,用特殊方法,将小分子肽液体中的残留酶和其它物质分离开,小分子肽液提取完成,其分子量在180至480道尔顿。
(7)用反渗透浓缩设置除去水分,成为湿粉,用微波真空机干燥或喷雾干燥成干粉。
实施例二.黑木耳多肽的检测
1材料与方法
1.1原料及仪器实施例一的黑木耳分离蛋白匀浆液,,蛋白含量≥89%;中性蛋白酶,无锡杰能科生物工程有限公司,雪梅牌(食品级);碱性蛋白酶,无锡杰能科生物工程有限公司,雪梅牌(食品级);多肽分子量标准,Amersham Bio2sciences公司,毛细管电泳专用;微波炉,LG电子电器有限公司,MS22089T;甲醛,西安化学试剂厂,分析纯;高效毛细管电泳仪,CE2212,北京大学制造;凝胶渗透色谱仪,24142515,美国Waters。
1.2试验方法取8g黑木耳分离匀浆液,加入90g水,调匀,调溶液 pH值到8.0,加入0.35g中性蛋白酶,微波150W加热1min,取出降温并补足水分,再放入微波炉加热1min,反复数次,如此控温40~45℃,反复加热, 至pH值不变为止,此时溶液pH值为7.0;调节溶液pH值到3.5,加入0.3 g酸性蛋白酶,微波150W加热,控温45~50℃,反复加热,至pH值不变为止,此时pH值为2~3;取出备用供检测。
检测方法
1.水解度及氨基氮的检测用甲醛滴定法(GB/T 14771-1993)。水解度的定义为原料蛋白质中肽键被裂解的百分数,公式为:DH=h/htot×100%= (CNH2/CSPIW)-C0NHI/htot×100%;式中h为水解后蛋白被裂解的肽键数mmol/g,htot为原料蛋白质的肽键数mmol/g;对于某一的特定蛋白质 htot是一个常数,黑木耳蛋白htot=8.8mmol/g;CNH2为水解蛋白液中氨基酸态氮的含量mmol/L,CSPIW为水解蛋白液中蛋白质的含量mg/ml, C0NH2原料蛋白质中游离氨基氮的含量mmol/g;对黑木耳蛋白,取值为0. 43mmol/g。
2.多肽的检测采用毛细管电泳和凝胶渗透色谱法测其分子量
2高效毛细管电泳检测
1)多肽的检测。将蛋白分解物溶于(60mmol/L Tris/HCl+1%SDS+ 5%22巯基乙醇,pH值=6.0)的混合液中,置沸水中5min,离心分离10 min(4 000r/min),取上清液经0.45μm滤膜过滤,超声脱气后进样分析。石英毛细管分别以双蒸水、0.1mol/L NaOH、0.1mol/L HCl冲洗3min后, 用缓冲液(100mmol/L Tris/HCl+0.1%SDS+0.1%PEO,pH值=8.5) 冲洗至基线平稳,不加样品运行缓冲液5min,然后以气动进样的方式进样10 s,加电压10kV运行,阴极紫外(214nm)检测。结果见图1。从图1可以看出:保留时间10.44、11.90、13.22、14.19、14.70、16.16、19.38min处出现肽峰,且峰形独立,无拖尾现象,说明分离效果良好。
2.多肽分子量的确定。取Amersham Biosciences公司多肽标准品按以上同样方法检测,结果见图2。对比图1、2可看出:其中10.44、11.90min 肽峰位于2512Da以下,说明分解物中含有分子量低于2 512Da的小分子肽;13.22、14.19min肽峰位于2 512~6 214标准峰,说明分解物中含有分子量位于2 512~6 214Da的肽;14.70、16.16min肽峰位于6 214~8159标准峰,说明分解物中含有分子量位于6 214~8 159Da的肽;19.38min肽峰位于8 159~10 700标准峰,但靠近8 159标准峰,说明分解物中含有少量分子量大于8 159Da的肽。
另外黑木耳大豆蛋白分解后的多肽分子量集中在2 000~8 000。相比蛋白质大分子量来说(100 000~600 000Da[6]),所得的多肽已经在小分子量范围以内。
3.凝胶渗透色谱检测
3.1凝胶渗透仪器***。Waters 2414视差折光检测器(Refractive IndexDetector);515高压梯度泵;7725i手动进样器;凝胶色谱柱:UltranydrogelTM Linear 7.8×300mm column。色谱条件:流动相0.1M NaNO3,柱温35℃, 流速0.8ml/min。标准样品:聚乙二醇分子量标准(Ploycethylene gloycol Molecular Weight),产地为Polmerstandards service2USA,范围为106、 194、440、628、960、1 460、4 290、7 130、12 900、20600。
2标准曲线的制作。将标准样品用流动相配制成
0.01%的溶液,经0.45μm微孔滤膜过滤后分别进样,以标准分子量的对数ln MW对保留时间作图,可得到标准分子量工作曲线,如图3。
3样品测试结果。将蛋白分解产物用高纯水浸泡过夜,4 000r/min离心分离后取上清液,经0.45μm滤膜过滤,超声脱气后进样分析,结果见图4。
将图3、4对照可知,25~40min出现6个肽峰(40min以
后小分子峰无法积分出),用Millennium32色谱工作站积分可得,分子量分别是12826、3 735、1 389、945、481、121Da,且大分子量分子含量较少,多数已集中在小分子量阶段,与毛细管电泳检测结果相似。且有更低分子量的分子存在,应是水解过程中产生的氨基酸小分子。采用多次、间断微波加热, 每次1min,在较短的时间(15min)内不会使蛋白酶失活。
采用多次、间断微波加热,每次1
min,在较短的时间(15min)内不会使蛋白酶失活
实施例三.黑木耳多肽复合功能备颗粒剂
取30份黑木耳原料、45份大枣原料和5份生姜原料,按将实施例一方法制得黑木耳多肽浓缩液和大枣及生姜提取液充分混匀,喷雾干燥。用制粒机将实施例一所得黑木耳小分子活性肽干粉制成一定规格的颗粒,用真空包装机包装成所需要的各种定量包装制成颗粒剂。
颗粒剂的包装:5g/袋,20袋/盒。
黑木耳多肽复合功能备颗粒剂用法用量:早晚各一次,每次1袋,温开水冲服。
实施例四.黑木耳多肽复合功能口服液的制备
取20份黑木耳原料、45份大枣原料和3份生姜原料,实施例一所得黑木耳多肽浓缩液和大枣及生姜提取液充分混匀充分混合调配,乳化,灌装,巴氏灭菌,贴标后出厂。将实施例一所得黑木耳多肽浓缩液和大枣及生姜提取液充分混匀,黑木耳小分子肽含量在150mg/100ml以上,产品可溶性固形物3.4g/100g 以上。
实施例五.黑木耳多肽复合功能口服液的制备
取40份黑木耳原料、45份大枣原料和8份生姜原料,实施例一所得黑木耳多肽浓缩液和大枣及生姜提取液充分混匀充分混合调配,乳化,灌装,巴氏灭菌,贴标后出厂。将实施例一所得黑木耳多肽浓缩液和大枣及生姜提取液充分混匀,黑木耳小分子肽含量在150mg/100ml以上,产品可溶性固形物3.4g/100g 以上。
实施例六.实施例四的黑木耳多肽复合功能口服液的功能验证
1.恢复体能和减轻运动引起的肌肉损伤的验证试验
人群分组:验证组60名健康成年人,25~40周岁,男30名,女30名,对照组40人,25~40周岁,男20名,女30名。
试验方法:验证组60名健康成年人和对照组40人分别参与同一场50000米跑步,比赛前验证组服用实施例的功能饮料,对照组未服用该功能饮料。2 万米后,验证族仍能保持原速度前进,而对照组的运动员运动速度开是减慢。验证组在比赛结束后剂58人无肌肉损伤及由此产生的肌肉疼痛、肿胀感觉,2人有轻微酸胀感觉;对照组38人感觉重度到中度肌肉疼痛、肿胀。
结果表明,在运动前、运动中补给活性肽可以给身体提供充足的能量,能够抑制肌肉力量的下降、长时间维持充沛的体力。
2.消除大脑疲劳的验证试验
人群分组:验证组60名健康成年人,25~40周岁,男30名,女30名,对照组40人,25~40周岁,男20名,女30名。
试验方法:安排验证组60名健康成年人和对照组40人都参与阅读4小时,验证组在阅读前服用实施例的功能饮料,对照组未服用该功能饮料。4小时阅读结束后,检测验证组60名健康成年人和对照组40人的血液氧化血红蛋白浓度的上升。结果,验证组60名健康成年人只有5人的血液氧化血红蛋白比例上升1~3%,对照组40名健康成年人有35的血液氧化血红蛋白比例上升 20~30%。
3.阻碍脂肪吸收、加速脂肪分解、促进基础代谢的验证试验
人群分组:验证组60名肥胖成年人,25~40周岁,男30名,女30名,对照组40名肥胖成年人,25~40周岁,男20名,女20名。
试验方法:安排验证组60名健康成年人和对照组40人都参与服用试验,每日服用200mL实施例的功能饮料代替午餐,对照组未服用该功能饮料。3 个月后,验证组56人肥胖体型显著,对照组未有改观。
4.调节血脂、降胆固醇功能的验证
取雄性小鼠60只,按体重随机分为6组,每组10只,分别为正常对照组、模型组、具体实施例1-4。
正常组,饲喂普通蒸馏水;
模型组,饲喂高脂饲料(1%胆固醇、0.5%猪胆盐、12%猪油,基础饲料86.5%) 喂养;
模型组给予深海鱼油(5mg/kg),每天两次,每次2毫升;
具体实施例1-4,饲喂高脂饲料(1%胆固醇、0.5%猪胆盐、12%猪油,基础饲料86.5%)喂养;
具体实施例1-5组,饲喂具体实施例1-4内容物(5mg/kg),每天两次,每次 2毫升;
连续喂养3周。
每日一次,连续给药21天,末次给药后1.5h(禁食12h),小鼠摘眼球取血,分离血清,以试剂盒方法测TG、TC。
统计学分析
所有实验数据均以mean±SD表示,采用t检验进行统计学分析,p<0.05认为有统计学差异。
实验结果
统计学分析
所有实验数据均以mean±SD表示,采用t检验进行统计学分析,p<0.05认为有统计学差异。
实验结果
组别 | TC(mmol/L) | TG(mmol/L) |
验证组 | 2.85±0.12 | 1.28±0.23 |
模型组 | 4.23±0.28 | 2.81±0.21 |
实施例1组 | 3.90±0.29** | 1.91±0.31** |
实施例2组 | 3.83±0.32* | 1.85±0.13* |
实施例3组 | 3.82±0.51** | 1.62±0.35** |
实施例4 | 3.72±0.30** | 1.52±0.22** |
#P<0.01vs正常组;*P<0.05,**P<0.01vs模型组
小结:
具体实施例1-4的内容物能显著降低总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含量,而且具体实施例4中内容物组分的合用具备协同增效作用。
5.提高免疫力功能的验证对小鼠腹腔巨噬细胞功能/活性的影响)
试验用动物:试验动物为昆明小鼠,雌雄各半,体重18~22克。
取实验用昆明小鼠随机分成4组,空白组每天正常喂食,实验组3组,给予受试产品(实施例1-3制备的组合物),每日给药2次,10天后,于末次给药后 30分钟(空白组于喂食后30分钟),各组小鼠腹腔注射6%鸡红细胞悬液1.5ml/ 只,抽取小鼠腹腔液,于显微镜下观察,记录5分钟内视野中巨噬细胞吞噬鸡红细胞数,并以公式:吞噬百分率=被吞噬的红细胞数/视野内的红细胞总数× 100%;吞噬指数=被吞噬的红细胞总数/视野内的巨噬细胞数。计算吞噬百分率,实验结果见下表。
小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响
表两组疗效比较
组别 | 吞噬百分率 | 吞噬指数 |
空白组 | 25.2±3.89 | 0.41±0.15 |
实施例1组 | 46.4±5.13 | 0.62±0.13 |
实施例2组 | 49.7±4.65 | 0.69±0.35 |
实施例3组 | 52.9±6.25 | 0.72±0.23 |
从上表数据可以看出实验组的小鼠在连续使用本发明药物后,巨噬细胞的总数得到小幅度增强,同时巨噬细胞的活性得到大幅度的提升,可见本发明的药物组合物具有良好的增强抵抗力的作用。
6.缓冲血糖上升的功能验证
in vivo评价
买进7周大小的雄性SD系大白鼠(CHARLES RIVER公司)后,进行1周的预备饲养(饲料用MF颗粒(东洋酵母社制造),然后用于实验。
将实施例1所得到的活性肽组合物(20mg/ml)溶解于去离子水1ml制成样品溶液,用营养导管,经口送入绝食16小时后的大白鼠胃部。5分钟后,强行经口投入糖质(麦芽糖2g/kg),糖质负荷后0分、30分、60分、以及120分钟后从尾部静脉采血。将得到的血液马上进行血糖测定(葡萄糖测试PRO、三和化学研究所)。而对照组则用水代替蜂巢蜡胶溶液。
抑制血糖升高的效果是根据不同时段测定血中葡萄糖量,比较血糖升高面积(AUC)判断的。血糖升高面积根据下式算出:
AUC(h*mg/dl)=(a+2b+3c+4d)/4-2a
上式中a、b、c以及d,分别意味着0分、30分、60分、以及120分钟后的血糖值。
数值用平均值±标准偏差表示,2组间有效差的测定,根据Student的t检验进行。
结果如表3所示。表中的n表示样品数。表及图中的**表示以不足1%的危险率与对照组比较的有效差。
表3
与糖质负荷中仅用水的对照组相比,蜂巢蜡胶的50%甲醇溶离组分的确具备有效的抑制血糖升高的效果,该效果可有效地持续到糖质负荷60分钟后,而对于AUC,对照组为130.7±8.3h*mg/dl、50%甲醇溶离组分为80.7± 4.2h*mg/dl。根据该AUC比较,血糖升高抑制率为38.3%。
7.活性肽同时具有肾素抑制活性和ACE抑制活性从而具有降血压功能的验证 ACE抑制活性检测方法如下:在比色杯中加入1mL 0.5mM FAPGG(全称 N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-L-phenylalanyl-glycyl-glycine)(溶解在 50mM Tris-HCl缓冲液,含0.3MNaCl,pH 7.5),20μL ACE(1U/mL,最终活力20mU),200μL降血压黑木耳活性肽溶液(蛋白浓度为1mg/mL;溶剂为50mM Tris-HCl缓冲液,含0.3M NaCl,pH 7.5),混匀室温下,2min内测定345nm下吸光值的降低速率.空白以Tris–HCl缓冲液代替样品.根据以下公式计算ACE抑制活性:
ACE抑制活性(%)=1-[△A.min-1 (样品)/△A.min-1 (空白)]×100%,
其中,△A.min-1 (样品)和△A.min-1 (空白)分别是表示样品和空白的ACE活性抑制速率。
肾素抑制活性的检测方法如下:降血压菜籽黑木耳活性肽抑制血管紧张素活性的体外测定根据肾素活性试剂盒(购买于Cayman Chemical,编号10006270) 提供方法,按以下步骤测定:96-孔板中依次加入(1)空白:20μL底物,160μL测试用缓冲液,10μL纯水;(2)空白对照:20μL底物,150μL测试用缓冲液,和 10μL纯水;(3)样品:20μL底物,150μL测试用缓冲液,和10μL样品。之后分别在每个孔(除空白外)中加入10μL肾素启动反应。96-孔板室温下震荡10s,在37℃下预热15min,在10min内测定样品的荧光强度,激发波长 340nm,发射波长490nm,根据以下公式计算样品的肾素抑制活性:
其中,100%抑制速率(空白对照)和抑制速率(样品)分别是表示空白对照和样品在10min内的肾素活性抑制速率。其中测试用缓冲液的制备:(1)配制缓冲液:50mM Tris-HCl缓冲液,含0.1M NaCl,pH 8.0;(2)将降血压菜籽活性肽溶解于该缓冲液中,制成蛋白浓度为1mg/mL的溶液,即为测试用缓冲液。
采用上述方法制备的降血压菜籽黑木耳活性肽的ACE抑制活性50.84%、肾素抑制活性75.31%,在降血压方面具有很好的应用前景。
8.抗氧化延缓衰老的功能验证
抗氧化实验:
为了验证本发明的产品是否具有抗氧化的功能性,本发明样品选择实施例1样品进行临床试验,测试过程如下。
受试对象100例年龄40~60岁、身体健康志愿者进行测试。
检测方法:
实验组:50位志愿者按推荐服用方法(每日2粒,一日2次)、服用量每日服用受试产品;
对照组:另外50位志愿者作为对照组服用安慰剂(维生素E)。
连续服用30天。所有受试者在试验期间,坚持原生活,饮食不变。测试结束后测试将受试者服用前后血液中丙二醛、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的含量进行对比。
表1:血清中MDA、SOD和GSH-Px水平的检测结果表
注:与试食前比较,aP<0.05;与对照组比较,bP<0.05。
从表1的结果可知:50位服用安慰剂的志愿者血清丙二醛、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的含量水平无明显变化;试验后试食组血清中SOD活力明显升高,与同期对照组及自身试验前比较,差异有统计学意义(P<0.05)。此外,所有志愿者在试验过程中及试验结束后6个月内,均未出现影响机体健康的反应。综合判定本实施例1的组合物具有抗氧化功能。
延缓衰老试验:
为了验证本发明的产品是否具有延缓衰老的功能性,本发明样品进行人体临床测试,测试过程如下:
选取皮肤暗淡、粗糙的30~50岁女性70人,随机等分为发明组和对照组,对照组采用市售普通天然维生素E软胶囊,发明组采用实施例1的产品组合物。
使用方法为:取压缩面膜纸浸入清水中浸泡,将软胶囊刺破,将软胶囊内液体滴入清水中,然后将面膜纸在清水与软胶囊芯液的混合液中浸泡5分钟,取出面膜纸,打开敷在脸上,15分钟后取下面膜纸,用温水将脸洗净即可,每晚一次。每组试验者所用其他脸部护肤品相同,坚持原生活、饮食不变。使用30 天后,对照组有18人的脸部皮肤较使用前细腻、变白并有光泽,发明组有26 人的脸部皮肤较使用前细腻、变白并有光泽。由此可知,本发明所得组合物可改良皮肤品质,延缓衰老,且效果明显好于现有市售普通天然维生素E软胶囊。此外,所有志愿者在试验过程中及试验结束后6个月内,均未出现影响机体健康的反应,可应用与制备用于抗氧化、延缓衰老的保健品。
9.加速乙醇分解的功能验证——针对呼气酒精浓度改善
以6名平均年龄28岁的男性人分2次进行实验,每次实验间隔大于72小时。实验4:空腹,饮42度白酒90ml,酒前饮纯净水300ml。
实验5:空腹,饮42度白酒90ml,酒前饮该配方醒酒饮300ml。
实验6:空腹,饮42度白酒90ml,酒前饮以实施例的黑木耳活性肽功能一和你聊为主的解酒饮300ml。
结论:该配方对酒精呼气浓度具有改善作用,即对乙醇脱氢酶活性具有促进作用,可有效提升乙醇分解效率。
该配方最终可通过溶水饮用后具有激发乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶活性,同时调理体质,从而醒酒护肝的功能。
10.提高注意力的功能验证
本发明组合物干预注意力的临床观察
征集20位自述注意力难以集中的成年人,年龄在19-50岁之间。采用舒尔特方格量表评估志愿者注意力,并按注意力随即均分为2组,1组为治疗组,2 组为对照组。治疗组患者每天食用营养糊30g,其中按实施例3制备的本发明组合物在营养糊中比例为16%。对照组给予不含本发明组合物的营养糊30g。营养糊由红豆、玉米等组成。志愿者食用1个月后再次采用量表进行注意力评估。结果如表2。
表2本发明组合物对干预注意力的临床观察
注:与对照组比较:*P<0.05;**P<0.01
实验结果:食用含有16%本发明组合物的营养糊,可显著提高注意力不集中人群的注意力量表评分,证明本发明组合物具有较好的提高注意力作用。
Claims (9)
1.一种功能食用组合物,其特征是,包含黑木耳多肽、生姜提取物和大枣提取物,所述黑木耳多肽来源于黑木耳原料,所述生姜提取物来源于生姜原料,所述大枣提取物来源于大枣原料。
2.根据权利要求1所述的功能食用组合物,其特征是,所述黑木耳原料、生姜原料和大枣原料的重量份比例为20~40份:30~60份:3~10。
3.根据权利要求1所述的功能食用组合物,其特征是,所述黑木耳多肽、大枣提取物和生姜提取物的重量份比例为30份:45份:4~6份。
4.权利要求1~3任一项所述的功能食用组合物的制备方法,其特征是,包括步骤:
(1)制备黑木耳小分子肽溶液;
(2)制备大枣和生姜混合提取液;
(3)将黑木耳小分子肽溶液、大枣提取液和生姜提取液按照10~20份:30~60份:5~10的重量份比例混合调配;
(4)将混合物干燥形成干粉混合物。
(5)将步骤(4)所得的干粉混合物作为添加剂,制备功能食用组合物。
5.根据权利要求4所述功能食用组合物的制备方法,其特征是,
所述(1)制备黑木耳小分子肽溶液包括步骤:
前处理:
A高温水解;
B匀浆;
C灭菌;
酶解黑木耳多肽:
D加入复合蛋白酶分解;
E离心,分离黑木耳的蛋白酶分解物;
所述(2)制备大枣和生姜混合提取液包括分别清洗、大枣和生姜,浸泡,水煎,过滤,浓缩至比重为1.25~1.38的浓缩液;
所述(3)包括将黑木耳复合多肽浓缩液与大枣、生姜浓缩液按重量份数10~20份:30~60份:5~10的重量份混匀,喷雾干燥,形成混合物干粉,
所述(4)中的干燥包括喷雾干燥或减压真空干燥。
6.根据权利要求5所述功能食用组合物的制备方法,其特征是,所述蛋白酶复合物包括蛋白外切酶、蛋白内切酶和风味酶,所述蛋白外切酶、蛋白内切酶和风味酶。
7.根据权利要求5所述功能食用组合物的制备方法,其特征是,所述蛋白酶复合物由木瓜内切酶和酵母风味酶组成。
8.根据权利要求7所述功能食用组合物的制备方法,其特征是,所述蛋白酶复合物由蛋白外切酶和蛋白内切酶组成,所述蛋白外切酶、蛋白内切酶组成比例为1:10~10:11,或优选1:5`5:1,或更优选1:2~2:1。
9.根据权利要求1~8所述的功能食用组合物,其特征是,所述功能食用组合物包括但不限于胶囊、含片、功能饮品和饼干。
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