CN109254001B - 一种淀粉速测卡的制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纳米材料、催化及分析化学领域，具体包括一种淀粉速测卡的制备和应用。该方法利用具有仿过氧化物酶活性的四氧化三钴纳米球、糖化酶、葡萄糖氧化酶和显色剂修饰滤纸上得到一个快速检测的速测卡，实现简单、快速的淀粉的检测。这种新颖的比色淀粉检测方法实用性强，因此，该方法在食品检测、分析化学、环境工程和农业领域有着广阔的应用前景。

Description

一种淀粉速测卡的制备和应用
技术领域
本发明涉及纳米材料、催化及分析化学领域，具体包括一种淀粉速测卡的制备和应用。
背景技术
淀粉（starch）是一种多糖，分子式为(C6H10O5)n，是植物贮存能量的一种方式。淀粉可以看作是葡萄糖的高聚体。淀粉除食用外，工业上用于制糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等，也用于调制印花浆、纺织品的上浆、纸张的上胶、药物片剂的压制等。多种方法已被报道用来检测淀粉，例如，Chattopadhyay等人在《Co-immobilization of glucoamylase andglucose oxidase for electrochemical sequential enzyme electrode for starchbiosensor and biofuel cell》利用电化学的方法检测淀粉（Biosensors andBioelectronics 2014, 51, 158-163）。Beckles等人在《Structural Investigations andMorphology of Tomato Fruit Starch》利用凝胶电泳的方法检测番茄中的淀粉（Journalof Agricultural and Food Chemistry 2009, 57, 282-291）。然而，这些方法都存在操作过程复杂且成本较高等缺点，因此，需要发展一种灵敏、简单、快捷的淀粉检测方法。
试纸条作为一种便携式的快速检测方法在生活中已有广泛的应用，如血糖试纸条、尿液分析试纸条等等。因此，许多文献也对试纸条做了一定的研究。Yan等人在《Nanozyme-strip for rapid local diagnosis of Ebola》一文中将传统试纸条中的胶体金替换为磁性纳米酶，通过显色的方法检测埃博拉病毒，并且使试纸条的灵敏度提高了100倍（Biosensors and Bioelectronics 2015,74, 134-141）。Cai等人在《A simple andrapid colloidal gold-based immunochromatogarpicstriptest for detection ofFMDV derotype A》一文中将免疫分析与试纸条相结合用来检测***病毒（ACS AppliedMaterials & Interfaces 2014,6, 21624-21631）。虽然试纸条已有一定程度的应用，但是现有的方法制作过程比较复杂且成本较高，并且上述试纸条作用机理与淀粉检测的作用机理有本质区别。因此，需要发展一种新的方法实现简单、快速的制备和淀粉检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种淀粉速测卡的制备和应用。
一种淀粉速测卡的制备，其特征在于：所述淀粉速测卡由基底、复合催材料和显色剂构成，复合催化材料是修饰有糖化酶和葡萄糖氧化酶（GOx）的四氧化三钴纳米球（Co3O4NPs），复合催化材料与显色剂固定到基底上。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种淀粉速测卡的制备，其特征在于所述淀粉速测卡的制备过程如下：
（1）将质量浓度为1%的牛血清蛋白（BSA）溶液滴在基底上，静置1小时并在室温下干燥；
（2）将质量浓度为2%的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）分别滴在步骤（1）中所述修饰有BSA的基底上，静置5小时，水洗并在室温下干燥；
（3）将复合催化材料的溶液均匀滴涂到步骤（2）中所得的基底上，4℃下过夜，水洗并干燥；
（4）将有机显色剂溶液滴涂到步骤（3）中所述修饰有复合催化材料的基底上，4℃下干燥，得到速测卡。
复合催化材料的制备过程，其特征在于该方法包括如下步骤：
（1）向含有BSA和二价钴离子的混合溶液中加入一定量的硼氢化钠，反应、离心、干燥得到Co3O4 NPs；
（2）将一定量的四氧化三钴纳米球（Co3O4 NPs）加入到0.2 mM的氨基甲酸叔丁酯（BOC）溶液中，静置2小时后水洗、干燥；
（3）将步骤（2）所得的Co3O4 NPs加入到质量浓度为2%的EDC和NHS混合溶液中，静置5小时，水洗、干燥；
（4）将步骤（3）所得的Co3O4 NPs加入到糖化酶（Glucoamylase）和葡萄糖氧化酶（GOx）的混合液中，4℃下过夜反应，水洗、干燥，制得复合催化材料。
一种淀粉速测卡的制备和应用，所述的复合催化材料可用于淀粉的检测。
优选是，所述基底可以为硝酸纤维素膜、乙酸纤维素膜、聚酯纤维、玻璃纤维、无纺布等；所述有机显色剂为2,2’-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、多巴胺或苯酚。
更优是，所述的一种淀粉速测卡的检测应用，其特征在于应用过程如下：
（1）取两个速测卡，一个在速测卡上加一定量的淀粉溶液，另一个速测卡上不加淀粉，放置5分钟，使淀粉与复合催化材料充分反应；
（2）观察速测卡的颜色变化以实现对淀粉的定性检测，若与不加淀粉的速测卡对比加淀粉的速测卡变色，则说明可以用速测卡实现对淀粉的检测；
（3）用智能手机拍照，在拍照时可以在LED灯照射下进行以防止照片模糊。通过使用手机的颜色识别软件读取照片中速测卡的具体的RGB值，由BN=B/(R+G+B)计算得到BN，代入BN-浓度工作曲线方程以计算淀粉的浓度，实现对淀粉的定量检测。
本发明的效果是：
1.本发明利用具有仿过氧化物酶活性的四氧化三钴纳米球与糖化酶和葡萄糖氧化酶的串联反应，构建快速检测淀粉的传感器。
2.本发明合成的复合催化材料及所制备试纸条实现了一锅法淀粉检测，避免了分步反应的进行。
3.本发明在实际的生活中有一定的实用价值，并且可扩展到食品发酵、生物医药、化工、环境、生物技术等领域的定量分析和催化剂等方面。
附图说明
图1为本发明实施例提供的速测卡的制备流程图。
图2为本发明实施例提供的速测卡的检测原理图。
图3为本发明实施例提供的速测卡检测的可行性。
图4为本发明实施例提供的复合催化材料的一锅法pH优化。
图5为本发明实施例提供的速测卡的定性检测照片。
图6为本发明实施例提供的淀粉定量测定的标准工作曲线。
具体实施方式
为了深入地说明本发明的内容，下面将进一步列举一些实施例，但本发明不局限于所列举的实施例。下列实施例中具体实验条件或方法如未注明，均按本领域的常规条件或方法进行。
实施例1
复合催化材料的制备过程，其特征在于该方法包括如下步骤：
（1）向含有BSA和二价钴离子的混合溶液中加入一定量的硼氢化钠，通过硼氢化钠的还原和氧气的氧化作用得到Co3O4 NPs，离心、干燥得到固体；
（2）将一定量的Co3O4 NPs加入到0.2 mM的BOC溶液以保护Co3O4 NPs上的氨基，静置2小时后水洗、干燥；
（3）将步骤（2）所得的Co3O4 NPs加入到质量浓度为2%的EDC和NHS混合溶液中以活化Co3O4 NPs上的羧基，静置5小时，水洗、干燥；
（4）将步骤（3）所得活化羧基后的Co3O4 NPs加入到糖化酶和GOx的混合液中，糖化酶和GOx上的氨基会与Co3O4 NPs上的羧基发生酰胺反应使其固定到Co3O4 NPs上，4℃下过夜反应，水洗、干燥，制得复合催化材料。
实施例2
速测卡的制备流程（图1）：
（1）将质量浓度为1%的BSA溶液滴在纤维素膜上，静置1小时并在室温下干燥；
（2）将质量浓度为2%的EDC和NHS分别滴在步骤（1）中所述修饰有BSA的纤维素膜（选用吸水性好的硝酸纤维素膜）上以活化BSA的羧基，静置5小时，水洗并在室温下干燥；
（3）将复合催化材料的溶液均匀滴涂到步骤（2）中所得的纤维素膜上，复合催化材料上的氨基会与BSA上的羧基发生酰胺反应使其固定到纤维素膜上，4℃下过夜，水洗并干燥；
（4）将有机显色剂溶液滴涂到步骤（3）中所述修饰有复合催化材料的纤维素膜上，4℃下干燥，得到速测卡。
速测卡的检测原理（图2）：
淀粉速测卡由基底、酶和显色剂构成，基底采用硝酸纤维素滤纸，将连接有糖化酶和GOx的Co3O4 NPs与显色剂固定到基底上，其检测的基本原理为：当加入淀粉时，淀粉首先在糖化酶的催化作用下生成葡萄糖，生成的葡萄糖继续与GOx反应生成H2O2, 之后具有仿过氧化物酶活性的Co3O4 NPs会催化H2O2使ABTS变色，测速卡由无色变为绿色；不加淀粉速测卡的颜色变化较小或不变色，可以根据速测卡的变色情况实现淀粉的定量分析。
实施例3
速测卡检测的可行性：
催化反应体系（a）将比色卡剪碎放到淀粉（1 mmol/L）溶液中（pH=5.0），反应5分钟后取反应液进行全波长扫描。另做一组对照实验（b）将比色卡剪碎放到缓冲溶液中（pH=5.0），反应5分钟后取反应液中进行全波长扫描。
如图3所示，催化反应体系（a）有明显的紫外吸收峰，催化反应体系（b）无紫外吸收峰，证明只有在淀粉存在的条件下催化反应才能进行。
实施例4
复合催化材料的一锅法pH优化：
催化反应体系包括复合催化材料（30 μg/mL）、淀粉（1 mmol/L）和不同pH的缓冲液（pH 1.0−2.0，甘氨酸-盐酸缓冲液；pH 3.0−6.0，醋酸-醋酸酸钠缓冲液；pH 7.0−8.0，磷酸盐缓冲液；pH 9.0，Tris-盐酸缓冲液）。在室温（25 °C）下反应5分钟后，测反应液在650 nm处的吸光度。如图4（a）所示，最适pH为4.0左右。
另做一组对照实验，催化反应体系包括Co3O4 NPs（30 μg/mL）、糖化酶（0.3mg/mL）、GOx（0.1mg/mL）、淀粉（1 mmol/L）和不同pH的缓冲液（pH 1.0−2.0，甘氨酸-盐酸缓冲液；pH3.0−6.0，醋酸-醋酸酸钠缓冲液；pH 7.0−8.0，磷酸盐缓冲液；pH 9.0−10.0，Tris-盐酸缓冲液）。在室温（25 °C）下反应5分钟后，测反应液在650 nm处的吸光度。如图4（b）所示，在pH为3.0−4.5左右都有较高活性，但其活性小于4（a）的活性。
实施例5
速测卡的定性检测：
（1）取三个速测卡，速测卡（a）不加淀粉，速测卡（b）加1mM淀粉，速测卡（c）加100mM的淀粉，放置5分钟，使有淀粉与复合催化材料充分作用；
（2）用智能手机拍照，在拍照时可以在LED灯照射下进行以防止照片模糊。如图5所示，不加淀粉的速测卡（a）不变色，加较小浓度淀粉的速测卡（b）较速测卡（a）颜色变深，加较大浓度淀粉速测卡（c）较速测卡（b）颜色变深，说明速测卡（c）上滴加的淀粉浓度最大，速测卡（b）次之，速测卡（a）没加淀粉，这再次证明了此淀粉速测卡检测淀粉的可行性，因此，此淀粉速测卡可以实现对淀粉的检测。
实施例6
淀粉定量测定的标准工作曲线：
（1）取12个速测卡，速测卡上滴加不同浓度的淀粉（0-10 mM），放置5分钟，使淀粉与复合催化材料充分作用；
（2）用智能手机拍照，在拍照时可以在LED灯照射下进行以防止照片模糊。通过使用手机的颜色识别软件读取照片中速测卡的具体的RGB值，由BN=B/(R+G+B)计算得到BN，得到标准曲线，具体工作曲线如图6所示，线性范围为0-0.3 mM，方程为y= 0.6062x+0.0998（R2=0.9918）。

Claims (4)

1.一种淀粉速测卡的制备方法，其特征在于：所述淀粉速测卡由基底、复合催材料和显色剂构成，复合催化材料是修饰有糖化酶和葡萄糖氧化酶(GOx)的四氧化三钴纳米球(Co3O4NPs)，复合催化材料与显色剂固定到基底上；所述淀粉速测卡的制备方法的步骤如下：
(1)将质量浓度为1％的牛血清蛋白(BSA)溶液滴在基底上，静置1小时并在室温下干燥；
(2)将质量浓度为2％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分别滴在步骤(1)中所述修饰有BSA的基底上，静置5小时，水洗并在室温下干燥；
(3)将复合催化材料的溶液均匀滴涂到步骤(2)中所得的基底上，4℃下过夜，干燥并水洗；
(4)将有机显色剂溶液滴涂到步骤(3)中所述修饰有复合催化材料的基底上，4℃下干燥，得到速测卡。
2.根据权利要求1所述的一种淀粉速测卡的制备方法，其特征在于，所述的复合催化材料的制备步骤如下：
(1)向含有BSA和二价钴离子的混合溶液中加入硼氢化钠，反应、离心、干燥得到Co3O4NPs；
(2)将Co3O4 NPs加入到0.2mM的氨基甲酸叔丁酯(BOC)溶液中，静置2小时后水洗、干燥；
(3)将步骤(2)所得的Co3O4 NPs加入到质量浓度为2％的EDC和NHS混合溶液中，静置5小时，水洗、干燥；
(4)将步骤(3)所得的Co3O4 NPs加入到糖化酶和GOx的混合液中，4℃下过夜反应，水洗、干燥，制得复合催化材料。
3.根据权利要求1所述的一种淀粉速测卡的制备方法，其特征在于：所述基底为硝酸纤维素膜、乙酸纤维素膜、聚酯纤维、玻璃纤维、无纺布等；所述有机显色剂为2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、多巴胺或苯酚。
4.根据权利要求1所述的一种淀粉速测卡的制备方法，其特征在于，所述的一种淀粉速测卡的检测应用步骤如下：
(1)取两个速测卡，一个在速测卡上加淀粉溶液，另一个速测卡上不加淀粉，放置5分钟，使淀粉与复合催化材料充分反应；
(2)观察速测卡的颜色变化以实现对淀粉的定性检测，若与不加淀粉的速测卡对比加淀粉的速测卡变色，则说明可以用速测卡实现对淀粉的检测；
(3)用智能手机拍照，在拍照时在LED灯照射下进行以防止照片模糊，通过使用手机的颜色识别软件读取照片中速测卡的具体的RGB值，由BN＝B/(R+G+B)计算得到BN，代入BN-浓度工作曲线方程以计算淀粉的浓度，实现对淀粉的定量检测。
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