CN109251947B - 一种甲酰胺酚嗪生物杀菌剂的制备方法 - Google Patents

一种甲酰胺酚嗪生物杀菌剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种甲酰胺酚嗪生物杀菌剂的制备方法：首先将活化的绿针假单胞菌和铜绿假单胞菌分别摇瓶培养，得到种子液A和B；然后将种子液A接种至发酵培养基内，发酵培养20h，接入种子液B，同时补加营养液，继续发酵培养40‑50h，得到发酵液；高速离心发酵液，调pH，萃取、浓缩，得粗品；柱层析，分离得到甲酰胺酚嗪生物杀菌剂。本发明提供的培养基以及培养条件非常适合菌株生长，补加的营养液中含有分支酸，两种菌株混合发酵，发酵液中的甲酰胺酚嗪含量明显提高，经一系列后处理后，分离得到纯度高于99％的产品，产品对植物病原真菌的抑制作用强。

Description

一种甲酰胺酚嗪生物杀菌剂的制备方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，为生物杀菌剂的制备，具体涉及一种甲酰胺酚嗪生物杀菌剂的制备方法。
背景技术
杀菌剂用于防治由各种病原微生物引起的植物病害的一类农药，一般指杀真菌剂。
不同的杀菌剂的作用方式也不同。在病菌侵染前施于植物表面起预防保护作用的，称为保护性杀菌剂即保护剂；在施药部位能消灭已侵染病菌的，称为铲除性杀菌剂；能被植物吸收并在体内传导至病菌侵染的部位而消灭病菌的，称为内吸性杀菌剂，许多铲除剂也是内吸剂，两者大多有化学治疗作用。因此，实际上常简单地将杀菌剂分成保护性和内吸性两种作用方式。它们的作用机理，也可大致分为两类：1、干扰病菌的呼吸过程，抑制能量的产生。2、干扰菌体生命物质如蛋白质、核酸、甾醇等的生物合成。保护性杀菌剂大多为杀菌谱广而杀菌力较低的产品。内吸性杀菌剂一般杀菌力较强，杀菌谱则较窄，其中有些品种对某种病原菌有专一的选择毒性。
天然吩嗪化合物具有广谱的抑制植物病原真菌的作用，可用于农作物病害防治。其作用机制是在细胞内可作为电子载体，传递电子到目标细胞，增加了细胞内的超氧化物自由基，干扰细胞的呼吸链，使目标细胞中毒死亡。该类化合物具有安全可靠，不污染环境，对人畜毒性小，且不易产生抗药性的特点。
吩嗪-1-羧酸(PCA)能够抑制不同的植物病原菌，但是由于PCA中含有一个羧基，故其在酸性环境中的抑菌活性强，在碱性环境中的抑菌活性显著下降。吩嗪-1-甲酰胺(PCN，即甲酰胺酚嗪)是以酰胺基团取代了PCA中的羧基，故在不同pH条件下的抑菌活性稳定。甲酰胺酚嗪主要是通过生物发酵合成获得，是荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌和绿针假单胞菌等假单胞菌的代谢产物。但现有发酵培养方法制备得到的甲酰胺酚嗪产率低，发酵操作复杂，周期长，整体成本高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甲酰胺酚嗪生物杀菌剂的制备方法，采用生物发酵合成的方法制备甲酰胺酚嗪，使用混合菌种发酵，调整培养基、发酵条件和发酵液的后处理方法，明显提高甲酰胺酚嗪的产率和纯度，从而提高对植物土传病害的防治作用，尤其是对植物病原真菌的抑制作用增强。
具体来说，针对现有技术的不足，本发明提供了如下技术方案：
一种甲酰胺酚嗪生物杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.将活化的绿针假单胞菌接种到液体培养基A中，摇瓶培养，得到种子液A；
S2.将活化的铜绿假单胞菌接种到液体培养基B中，摇瓶培养，得到种子液B；
S3.将种子液A接种至发酵培养基内，发酵培养20h，接入种子液B，同时补加营养液，继续发酵培养40-50h，得到发酵液；
S4.高速离心发酵液，得到离心液，调节离心液pH，加入萃取剂，将萃取液浓缩，得到粗品；
S5.柱层析，分离得到甲酰胺酚嗪生物杀菌剂。
本发明先分别培养绿针假单胞菌和铜绿假单胞菌，得到生长旺盛的菌株，然后混合发酵培养，得到的发酵液中含有高浓度的甲酰胺酚嗪。
优选地，包括至少一种以下技术特征：
所述液体培养基A包括以下重量份的组分：葡萄糖1-5份、胰蛋白胨1-5份、乙醇0.5-1.5份、丙酮0.5-1份、磷酸二氢钾0.05-0.15份和氯化钠0.05-0.1份，水100-120份，pH6.5-7.3；
所述液体培养基B包括以下重量份的组分：蔗糖0.5-3份、葡萄糖0.5-2份、胰蛋白胨2-5份、甘油1.5-2份、磷酸二氢钾0.05-0.15份、硫酸镁0.05-0.1份和氯化铵0.1-0.2份，水100-120份，pH6.8-7.5；
所述发酵培养基包括以下重量份的组分：玉米粉2-5份、葡萄糖2-5份、胰蛋白胨3-5份、乙醇1-2份、磷酸二氢钾0.05-0.1份、硝酸钾0.1-0.2份、氯化铁0.1-0.2份和氨基酸0.1-0.2份，水100-120份，pH7.0-8.0。
优选地，所述发酵培养基中的氨基酸为苯丙氨酸和/或酪氨酸。
优选地，步骤S3中补加的营养液为葡萄糖、胰蛋白胨、甘油、分支酸、磷酸二氢钾和硝酸铵的混合溶液，配制方法为每100重量份水中加入2-3重量份葡萄糖、2-4重量份胰蛋白胨、1-3重量份甘油、0.02-0.1重量份分支酸、0.05-0.1重量份磷酸二氢钾和0.5-1.5重量份硝酸铵。
补加营养液，促进菌株的生长，而且营养液中的分支酸能促进甲酰胺酚嗪的生物合成。
优选地，步骤S3中补加的营养液体积占发酵培养基体积的20-50％。
优选地，还包括至少一种以下技术特征：
步骤S1中摇瓶培养的条件为：25-30℃的摇床中震荡培养15-20小时，摇床转速为200-250r/min；
步骤S2中摇瓶培养的条件为：30-35℃的摇床中震荡培养15-25小时，摇床转速为150-200r/min。
优选地，绿针假单胞菌的活化方法为：将该绿针假单胞菌接种到固体培养基中，在27℃下培养20-25h；铜绿假单胞菌的活化方法为：将该铜绿假单胞菌接种到固体培养基中，在30℃下活化生长20-25h；固体培养基的组成为：每1L水中含胰蛋白胨15g、葡萄糖10g、甘油10mL、乙醇10mL、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.8g、氯化钠0.5g和琼脂20g，pH7.0-7.2。
优选地，步骤S3中的种子液A的接种量为2-5％，发酵培养的条件为：25-35℃通气培养，通气量(v/v·min)为1:0.5-1.0，搅拌速度为200-220r/min，种子液B的接种量为3-6％。
优选地，步骤S4还包括至少一种以下技术特征：
采用酸调节离心液pH至2-4；
萃取剂与离心液的体积比为1.5-2.5:1；
萃取剂选自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、***、乙酸丁酯中的一种。
本发明还提供了一种采用前述制备方法制得的甲酰胺酚嗪生物杀菌剂。
与现有技术相比，本发明的效果和益处在于：
(1)绿针假单胞菌和铜绿假单胞菌分别活化、摇瓶培养，得到生长旺盛的种子液，在发酵培养绿针假单胞菌20h后，再接入铜绿假单胞菌，同时补充了含有分支酸的营养液，非常有利于两种菌株的生长，且促进了甲酰胺酚嗪的生成。
(2)优化了各种培养基的组成和发酵培养条件，尤其发酵培养基中添加了硝酸钾、氯化铁和氨基酸，结果表明，本发明提供的培养基和培养条件更适合菌株的生长，能促进甲酰胺酚嗪的合成。同时，本发明的发酵周期短，利用生产，成本低。
(3)对发酵液进行高速离心、调酸、萃取，以及柱层析处理，得到纯度在99％以上的甲酰胺酚嗪。该甲酰胺酚嗪对植物病原真菌的抑制作用强，浓度1％甲酰胺酚嗪稀释1000倍，采用常规的叶面喷雾法进行防治试验，防治效果超过95％。
综上，本发明通过优化培养基的组成以及培养条件，对绿针假单胞菌和铜绿假单胞菌进行混合发酵培养，得到的发酵液中含有高浓度的甲酰胺酚嗪(每1L发酵液能分离提纯得到至少5g甲酰胺酚嗪)；再通过离心、调酸、萃取，以及柱层析，得到高纯度(99％以上)的甲酰胺酚嗪生物杀菌剂。该杀菌剂抑制植物病原真菌，防治植物土传病害的效果好，尤其对于番茄叶霉菌、水稻纹枯病菌、西瓜蔓枯病菌和番茄灰霉病菌具有强效抑制作用。
具体实施方式
本发明提供了甲酰胺酚嗪生物杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.将活化的绿针假单胞菌接种到液体培养基A中，摇瓶培养，得到种子液A。其中，液体培养基A包括以下重量份的组分：葡萄糖1-5份、胰蛋白胨1-5份、乙醇0.5-1.5份、丙酮0.5-1份、磷酸二氢钾0.05-0.15份和氯化钠0.05-0.1份，水100-120份，pH6.5-7.3。摇瓶培养的条件为：25-30℃的摇床中震荡培养15-20小时，摇床转速为200-250r/min。
S2.将活化的铜绿假单胞菌接种到液体培养基B中，摇瓶培养，得到种子液B。其中，液体培养基B包括以下重量份的组分：蔗糖0.5-3份、葡萄糖0.5-2份、胰蛋白胨2-5份、甘油1.5-2份、磷酸二氢钾0.05-0.15份、硫酸镁0.05-0.1份和氯化铵0.1-0.2份，水100-120份，pH6.8-7.5。摇瓶培养的条件为：30-35℃的摇床中震荡培养15-25小时，摇床转速为150-200r/min。
S3.将种子液A接种至发酵培养基内，发酵培养20h，接入种子液B，同时补加营养液，继续发酵培养40-50h，得到发酵液。其中，发酵培养基包括以下重量份的组分：玉米粉2-5份、葡萄糖2-5份、胰蛋白胨3-5份、乙醇1-2份、磷酸二氢钾0.05-0.1份、硝酸钾0.1-0.2份、氯化铁0.1-0.2份和氨基酸(苯丙氨酸和/或酪氨酸)0.1-0.2份，水100-120份，pH7.0-8.0。
营养液的配制方法为每100重量份水中加入2-3重量份葡萄糖、2-4重量份胰蛋白胨、1-3重量份甘油、0.02-0.1重量份分支酸、0.05-0.1重量份磷酸二氢钾和0.5-1.5重量份硝酸铵。加入的营养液体积占发酵培养基体积的20-50％。
种子液A的接种量为2-5％，发酵培养的条件为：25-35℃通气培养，通气量(v/v·min)为1:0.5-1.0，搅拌速度为200-220r/min，种子液B的接种量为3-6％。
通气量(v/v·min)是指发酵液与每分钟通气量体积比。
S4.高速离心发酵液，得到离心液，用酸(盐酸、硫酸或乙酸)调节离心液pH2-4，加入萃取剂(乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、***或乙酸丁酯)，萃取剂与离心液的体积比为1.5-2.5:1，将萃取液浓缩，得到粗品。
S5.柱层析，分离得到甲酰胺酚嗪生物杀菌剂。柱层析采用的是硅胶填充柱，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇(二氯甲烷：甲醇的体积比为10-30:1)，分部搜集洗脱液，浓缩得到纯度在99％以上的甲酰胺酚嗪。
下面通过具体的实施例来进一步介绍本发明。本发明中涉及的材料、试剂和设备均为市售，其中绿针假单胞菌和铜绿假单胞菌都购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
实施例1
一种甲酰胺酚嗪生物杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.将活化的绿针假单胞菌接种到液体培养基A中，摇瓶培养，得到种子液A。其中，液体培养基A包括以下重量份的组分：葡萄糖3份、胰蛋白胨3份、乙醇1份、丙酮0.6份、磷酸二氢钾0.1份和氯化钠0.07份，水110份，pH7.0。摇瓶培养的条件为：27℃的摇床中震荡培养18小时，摇床转速为220r/min。
S2.将活化的铜绿假单胞菌接种到液体培养基B中，摇瓶培养，得到种子液B。其中，液体培养基B包括以下重量份的组分：蔗糖2份、葡萄糖1份、胰蛋白胨4份、甘油1.7份、磷酸二氢钾0.1份、硫酸镁0.06份和氯化铵0.15份，水110份，pH7.2。摇瓶培养的条件为：32℃的摇床中震荡培养20小时，摇床转速为180r/min。
本实施例使用的绿针假单胞菌的生物保藏登记号为CGMCC NO.1.2785，铜绿假单胞菌的生物保藏登记号为CGMCC NO.1.4526。
绿针假单胞菌的活化方法为：将菌株接种到固体培养基中，在27℃下培养23h；铜绿假单胞菌的活化方法为：将菌株接种到固体培养基中，在30℃下活化生长23h。固体培养基的组成为：每1L水中含胰蛋白胨15g、葡萄糖10g、甘油10mL、乙醇10mL、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.8g、氯化钠0.5g和琼脂20g，pH7.0。
S3.将种子液A接种至发酵培养基内，发酵培养20h，接入种子液B，同时补加营养液，继续发酵培养45h，得到发酵液。其中，发酵培养基包括以下重量份的组分：玉米粉3份、葡萄糖4份、胰蛋白胨4份、乙醇1.5份、磷酸二氢钾0.08份、硝酸钾0.15份、氯化铁0.15份和氨基酸(苯丙氨酸：酪氨酸重量比为1:1)0.15份，水110份，pH7.5。
营养液的配制方法为每100重量份水中加入3重量份葡萄糖、3重量份胰蛋白胨、2重量份甘油、0.06重量份分支酸、0.08重量份磷酸二氢钾和1.0重量份硝酸铵。加入的营养液体积占发酵培养基体积的35％。
种子液A的接种量为3％，发酵培养的条件为：28℃通气培养，通气量(v/v·min)为1:0.7，搅拌速度为210r/min，种子液B的接种量为4％。
S4.高速离心发酵液，转速为8000r/min，离心15min，得到离心液，用1moL/L盐酸调节离心液pH至3，加入二氯甲烷萃取，二氯甲烷与离心液的体积比为2:1，将萃取液浓缩，得到粗品。
S5.柱层析，分离得到甲酰胺酚嗪生物杀菌剂。柱层析采用的是硅胶填充柱，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇(二氯甲烷：甲醇体积比为20:1)，分部搜集洗脱液，浓缩得到甲酰胺酚嗪。每1L升发酵液能分离得到5.5g甲酰胺酚嗪产品，其结构经核磁共振氢谱、碳谱以及LC-MS得到确证；经HPLC检测，制得的甲酰胺酚嗪的纯度为99.6％。
实施例2
一种甲酰胺酚嗪生物杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.将活化的绿针假单胞菌接种到液体培养基A中，摇瓶培养，得到种子液A。其中，液体培养基A包括以下重量份的组分：葡萄糖1份、胰蛋白胨1份、乙醇0.5份、丙酮0.5份、磷酸二氢钾0.05份和氯化钠0.05份，水100份，pH6.5。摇瓶培养的条件为：25℃的摇床中震荡培养20小时，摇床转速为200r/min。
S2.将活化的铜绿假单胞菌接种到液体培养基B中，摇瓶培养，得到种子液B。其中，液体培养基B包括以下重量份的组分：蔗糖0.5份、葡萄糖0.5份、胰蛋白胨2份、甘油1.5份、磷酸二氢钾0.05份、硫酸镁0.05份和氯化铵0.1份，水100份，pH6.8。摇瓶培养的条件为：30℃的摇床中震荡培养25小时，摇床转速为150r/min。
绿针假单胞菌的活化方法为：将菌株接种到固体培养基中，在27℃下培养20h；铜绿假单胞菌的活化方法为：将菌株接种到固体培养基中，在30℃下活化生长20h。固体培养基的组成为：每1L水中含胰蛋白胨15g、葡萄糖10g、甘油10mL、乙醇10mL、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.8g、氯化钠0.5g和琼脂20g，pH7.0。
S3.将种子液A接种至发酵培养基内，发酵培养20h，接入种子液B，同时补加营养液，继续发酵培养40h，得到发酵液。其中，发酵培养基包括以下重量份的组分：玉米粉2份、葡萄糖2份、胰蛋白胨3份、乙醇1份、磷酸二氢钾0.05份、硝酸钾0.1份、氯化铁0.1份和酪氨酸0.1份，水100份，pH7.0。
营养液的配制方法为每100重量份水中加入2重量份葡萄糖、2重量份胰蛋白胨、1重量份甘油、0.02重量份分支酸、0.05重量份磷酸二氢钾和0.5重量份硝酸铵。加入的营养液体积占发酵培养基体积的20％。
种子液A的接种量为2％，发酵培养的条件为：25℃通气培养，通气量(v/v·min)为1:0.5，搅拌速度为200r/min，种子液B的接种量为3％。
S4.高速离心发酵液，转速为9000r/min，离心15min，得到离心液，用1moL/L硫酸调节离心液pH2，加入氯仿萃取，氯仿与离心液的体积比为1.5:1，将萃取液浓缩，得到粗品。
S5.柱层析，分离得到甲酰胺酚嗪生物杀菌剂。柱层析采用的是硅胶填充柱，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇(二氯甲烷：甲醇为10:1)，分部搜集洗脱液，浓缩得到纯度为99.8％的甲酰胺酚嗪。每1L升发酵液能分离得到5.2g甲酰胺酚嗪产品。
实施例3
一种甲酰胺酚嗪生物杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.将活化的绿针假单胞菌接种到液体培养基A中，摇瓶培养，得到种子液A。其中，液体培养基A包括以下重量份的组分：葡萄糖5份、胰蛋白胨5份、乙醇1.5份、丙酮1份、磷酸二氢钾0.15份和氯化钠0.1份，水120份，pH7.3。摇瓶培养的条件为：30℃的摇床中震荡培养15小时，摇床转速为250r/min。
S2.将活化的铜绿假单胞菌接种到液体培养基B中，摇瓶培养，得到种子液B。其中，液体培养基B包括以下重量份的组分：蔗糖3份、葡萄糖2份、胰蛋白胨5份、甘油2份、磷酸二氢钾0.15份、硫酸镁0.1份和氯化铵0.2份，水120份，pH7.5。摇瓶培养的条件为：35℃的摇床中震荡培养15小时，摇床转速为200r/min。
绿针假单胞菌的活化方法为：将菌株接种到固体培养基中，在27℃下培养25h；铜绿假单胞菌的活化方法为：将菌株接种到固体培养基中，在30℃下活化生长25h。固体培养基的组成为：每1L水中含胰蛋白胨15g、葡萄糖10g、甘油10mL、乙醇10mL、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.8g、氯化钠0.5g和琼脂20g，pH7.2。
S3.将种子液A接种至发酵培养基内，发酵培养20h，接入种子液B，同时补加营养液，继续发酵培养50h，得到发酵液。其中，发酵培养基包括以下重量份的组分：玉米粉5份、葡萄糖5份、胰蛋白胨5份、乙醇2份、磷酸二氢钾0.1份、硝酸钾0.2份、氯化铁0.2份和苯丙氨酸0.2份，水120份，pH8.0。
营养液的配制方法为每100重量份水中加入3重量份葡萄糖、4重量份胰蛋白胨、3重量份甘油、0.1重量份分支酸、0.1重量份磷酸二氢钾和1.5重量份硝酸铵。加入的营养液体积占发酵培养基体积的50％。
种子液A的接种量为5％，发酵培养的条件为：35℃通气培养，通气量(v/v·min)为1:1.0，搅拌速度为220r/min，种子液B的接种量为6％。
S4.高速离心发酵液，转速为9000r/min，离心15min，得到离心液，用1moL/L盐酸调节离心液pH4，加入乙酸丁酯萃取，乙酸丁酯与离心液的体积比为2.5:1，将萃取液浓缩，得到粗品。
S5.柱层析，分离得到甲酰胺酚嗪生物杀菌剂。柱层析采用的是硅胶填充柱，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇(二氯甲烷：甲醇为30:1)，分部搜集洗脱液，浓缩得到纯度为99.6％的甲酰胺酚嗪。每1L升发酵液能分离得到5.8g甲酰胺酚嗪产品。
实施例4
一种甲酰胺酚嗪生物杀菌剂的制备方法，其制备步骤和方法与实施例1仅区别于，本实施例中营养液的配制方法为每100重量份水中加入3重量份葡萄糖、4重量份胰蛋白胨、3重量份甘油、0.1重量份分支酸、0.1重量份磷酸二氢钾和1.5重量份硝酸铵。加入的营养液体积占发酵培养基体积的40％。
其余同实施例1。每1L升发酵液能分离得到5.8g甲酰胺酚嗪产品，纯度为99.7％。
实施例5
一种甲酰胺酚嗪生物杀菌剂的制备方法，其制备步骤和方法与实施例3仅区别于，发酵培养基中含有苯丙氨酸0.1份，酪氨酸0.1份。
其余同实施例3。每1L升发酵液能分离得到6.0g甲酰胺酚嗪产品，纯度为99.5％。
对比例1
一种甲酰胺酚嗪生物杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.将活化的绿针假单胞菌接种到液体培养基A中，摇瓶培养，得到种子液A。其中，液体培养基A包括以下重量份的组分：葡萄糖3份、胰蛋白胨3份、乙醇1份、丙酮0.6份、磷酸二氢钾0.1份和氯化钠0.07份，水110份，pH7.0。摇瓶培养的条件为：27℃的摇床中震荡培养18小时，摇床转速为220r/min。
绿针假单胞菌的活化方法为：将菌株接种到固体培养基中，在27℃下培养23h。固体培养基的组成为：每1L水中含胰蛋白胨15g、葡萄糖10g、甘油10mL、乙醇10mL、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.8g、氯化钠0.5g和琼脂20g，pH7.0。
S2.将种子液A接种至发酵培养基内，发酵培养65h，得到发酵液。发酵培养基包括以下重量份的组分：玉米粉3份、葡萄糖4份、胰蛋白胨4份、乙醇1.5份、磷酸二氢钾0.08份、硝酸钾0.15份、氯化铁0.15份和氨基酸(苯丙氨酸：酪氨酸为1:1)0.15份，水110份，pH7.5。种子液A的接种量为3％，发酵培养的条件为：28℃通气培养，通气量(v/v·min)为1:0.7，搅拌速度为210r/min。
发酵液的后处理方法同实施例1中的步骤S4和S5。
本对比例制得的甲酰胺酚嗪纯度为92.3％，每1L升发酵液能分离得到1.9g甲酰胺酚嗪产品。
对比例2
一种甲酰胺酚嗪生物杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.将活化的铜绿假单胞菌接种到液体培养基B中，摇瓶培养，得到种子液B。其中，液体培养基B包括以下重量份的组分：蔗糖2份、葡萄糖1份、胰蛋白胨4份、甘油1.7份、磷酸二氢钾0.1份、硫酸镁0.06份和氯化铵0.15份，水110份，pH7.2。摇瓶培养的条件为：32℃的摇床中震荡培养20小时，摇床转速为180r/min。
铜绿假单胞菌的活化方法为：将菌株接种到固体培养基中，在30℃下活化生长23h。固体培养基的组成为：每1L水中含胰蛋白胨15g、葡萄糖10g、甘油10mL、乙醇10mL、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.8g、氯化钠0.5g和琼脂20g，pH7.0。
S2.将种子液B接种至发酵培养基内，发酵培养65h，得到发酵液。发酵培养基包括以下重量份的组分：玉米粉3份、葡萄糖4份、胰蛋白胨4份、乙醇1.5份、磷酸二氢钾0.08份、硝酸钾0.15份、氯化铁0.15份和氨基酸(苯丙氨酸：酪氨酸为1:1)0.15份，水110份，pH7.5。种子液B的接种量为4％，发酵培养的条件为：28℃通气培养，通气量(v/v·min)为1:0.7，搅拌速度为210r/min。
发酵液的后处理方法同实施例1中的步骤S4和S5。
本对比例制得的甲酰胺酚嗪纯度为92.4％，每1L升发酵液能分离得到1.6g甲酰胺酚嗪产品。
对比例3
本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤S3中加入种子液B后，没有补加营养液。其余同实施例1。
本对比例制得的甲酰胺酚嗪纯度为90.1％，每1L升发酵液能分离得到1.2g甲酰胺酚嗪产品。
对比例4
本对比例与实施例1的区别仅在于，营养液的配制过程中没有添加分支酸。其余同实施例1。
本对比例制得的甲酰胺酚嗪纯度为98.5％，每1L升发酵液能分离得到2.0g甲酰胺酚嗪产品。
对比例5
本对比例与实施例1的区别仅在于，发酵培养基的组成为：玉米粉5份、豆饼粉8份、蛋白胨3份、磷酸氢二钾0.03份、磷酸二氢钾0.03份、无水硫酸镁0.08份、甘油0.3份，余量为水，培养基的pH为7.5。
其余同实施例1。
本对比例制得的甲酰胺酚嗪纯度为98.6％，每1L升发酵液能分离得到0.9g甲酰胺酚嗪产品。
对比例6
本对比例采用与实施例1相同的方法制备得到发酵液，但是发酵液的后处理方法为：直接过滤发酵液，往滤液中加入相同体积的乙酸乙酯萃取，将萃取液浓缩，得到甲酰胺酚嗪产品。
本对比例制得的甲酰胺酚嗪产品纯度为80.4％，每1L升发酵液能分离得到6.0g甲酰胺酚嗪产品。
对比例7
本对比例与实施例1的区别在于，种子液A的接种量为1％，发酵培养15h后，按照2％接入种子液B，发酵培养条件为：30℃通气培养，通气量(v/v·min)为1:0.4，静置培养。
其余同实施例1。
本对比例制得的甲酰胺酚嗪纯度为89.8％，每1L升发酵液能分离得到1.8g甲酰胺酚嗪产品。
测试例1
各实施例和对比例制得的甲酰胺酚嗪，均通过HPLC进行检测，采用外标法计算产品纯度。HPLC的条件为：C18柱(250×4.6mm，5μm)，流动相的组成为：0-5min，10％乙腈-90％20mM乙酸铵；5-20min，乙腈浓度从10％升至50％，乙酸铵浓度从90％下降至50％；20-21分钟，10％乙腈-90％20mM乙酸铵；流动相流速为0.5mL/min，柱温30℃，紫外检测波长为254nm，进样量10μL。表1列出了各实施例和对比例制备的甲酰胺酚嗪的纯度，以及每1L发酵液经处理后分离得到的甲酰胺酚嗪产量(以甲酰胺酚嗪纯度为100％计)。
Figure BDA0001759778810000121
表1.
从表1的数据可以明显看到，实施例1-5通过发酵合成得到的甲酰胺酚嗪产量明显高于对比例1-7，各实施例产品纯度也普遍高于各对比例，说明是否菌株混合培养，是否补加营养液、营养液的组成，培养基的组成和发酵条件，以及发酵液后处理方法均会影响甲酰胺酚嗪产品的产量和纯度。其中，发酵液后处理方法(对比例6)对产品的产量影响小，但对产品纯度影响最大。
测试例2
测定各实施例和对比例制备的甲酰胺酚嗪生物杀菌剂对植物病原菌病的防治效果：将甲酰胺酚嗪生物杀菌剂制成1％(按甲酰胺酚嗪纯品计)的混悬剂，然后稀释1000倍，采用常规的叶面喷雾法进行防治试验。试验结果见表2。
Figure BDA0001759778810000131
表2.
从表2的数据可以明显看到，实施例1-5制备的甲酰胺酚嗪生物杀菌剂对植物病原真菌病的防治效果在95％以上，远高于各对比例。对比例1，仅发酵培养绿针假单胞菌；对比例2，仅发酵培养铜绿假单胞菌；对比例3，加入种子液B后没有补加营养液；对比例4，补加的营养液中不含分支酸；对比例5，发酵培养基的组成不同，其中不含有硝酸钾、氯化铁和氨基酸；对比例6，发酵液的后处理方法不同，没有离心、调pH，以及层析提纯的操作；对比例7，发酵培养的条件不合适。此外，试验过程中，各实施例制备的杀菌剂对试验植物的叶、花和果实没有任何伤害；而对比例1、对比例2、对比例3和对比例6制得的杀菌剂会导致番茄叶子枯萎。
综上，本发明提供的技术方案中，绿针假单胞菌和铜绿假单胞菌的混合发酵培养方法、条件，培养基组成，补加的营养液组成，以及发酵液的后处理方法，不仅会影响甲酰胺酚嗪生物杀菌剂的产量和纯度，还会影响杀菌剂对植物病原真菌病的防治效果。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种甲酰胺酚嗪生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将活化的绿针假单胞菌接种到液体培养基A中，摇瓶培养，得到种子液A；
S2.将活化的铜绿假单胞菌接种到液体培养基B中，摇瓶培养，得到种子液B；
S3.将种子液A接种至发酵培养基内，发酵培养20h，接入种子液B，同时补加营养液，继续发酵培养40-50h，得到发酵液；
S4.高速离心发酵液，得到离心液，调节离心液pH，加入萃取剂，将萃取液浓缩，得到粗品；
S5.柱层析，分离得到甲酰胺酚嗪生物杀菌剂；
所述发酵培养基包括以下重量份的组分：玉米粉2-5份、葡萄糖2-5份、胰蛋白胨3-5份、乙醇1-2份、磷酸二氢钾0.05-0.1份、硝酸钾0.1-0.2份、氯化铁0.1-0.2份和氨基酸0.1-0.2份，水100-120份，pH7.0-8.0；所述氨基酸为苯丙氨酸和/或酪氨酸；
所述液体培养基A包括以下重量份的组分：葡萄糖1-5份、胰蛋白胨1-5份、乙醇0.5-1.5份、丙酮0.5-1份、磷酸二氢钾0.05-0.15份和氯化钠0.05-0.1份，水100-120份，pH6.5-7.3；
所述液体培养基B包括以下重量份的组分：蔗糖0.5-3份、葡萄糖0.5-2份、胰蛋白胨2-5份、甘油1.5-2份、磷酸二氢钾0.05-0.15份、硫酸镁0.05-0.1份和氯化铵0.1-0.2份，水100-120份，pH6.8-7.5；
步骤S3中补加的营养液为葡萄糖、胰蛋白胨、甘油、分支酸、磷酸二氢钾和硝酸铵的混合溶液，配制方法为每100重量份水中加入2-3重量份葡萄糖、2-4重量份胰蛋白胨、1-3重量份甘油、0.02-0.1重量份分支酸、0.05-0.1重量份磷酸二氢钾和0.5-1.5重量份硝酸铵；
步骤S3中补加的营养液体积占发酵培养基体积的20-50％；
步骤S1中摇瓶培养的条件为：25-30℃的摇床中震荡培养15-20小时，摇床转速为200-250r/min；
步骤S2中摇瓶培养的条件为：30-35℃的摇床中震荡培养15-25小时，摇床转速为150-200r/min；
步骤S3中的种子液A的接种量为2-5％，发酵培养的条件为：25-35℃通气培养，通气量v/v·min为1:0.5-1.0，搅拌速度为200-220r/min，种子液B的接种量为3-6％。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，绿针假单胞菌的活化方法为：将该绿针假单胞菌接种到固体培养基中，在27℃下培养20-25h；铜绿假单胞菌的活化方法为：将该铜绿假单胞菌接种到固体培养基中，在30℃下活化生长20-25h；固体培养基的组成为：每1L水中含胰蛋白胨15g、葡萄糖10g、甘油10mL、乙醇10mL、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.8g、氯化钠0.5g和琼脂20g，pH7.0-7.2。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4还包括至少一种以下技术特征：
采用酸调节离心液pH至2-4；
萃取剂与离心液的体积比为1.5-2.5:1；
萃取剂选自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、***、乙酸丁酯中的一种。
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