CN109251887A - 一种软骨细胞引物层的制备方法及软骨组织 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及软骨组织工程领域，具体而言，涉及一种软骨细胞引物层的制备方法及软骨组织。一种软骨细胞引物层的制备方法，将载体和自体软骨细胞进行三维动态共培养，即得；所述三维动态共培养的培养条件包括：36.5～37.5℃，4.5～5.5％CO2，9～11％O2；所述三维动态共培养的培养体系中包括9～12ng/mL碱性成纤维细胞生长因子；在所述三维动态共培养前，所述初代自体软骨细胞在所述载体中的密度为1.6～2.0×105/cm2；所述载体包括骨水泥；所述三维动态共培养的培养体系的组成包括：DMEM培养基、4～5mM L‑谷氨酰、体积分数为9～11％的血清和双抗生素。制得的软骨细胞引物层利于与自体软骨细胞融合，具有较好的生物相容性。

Description

一种软骨细胞引物层的制备方法及软骨组织
技术领域
本发明涉及软骨组织工程领域，具体而言，涉及一种软骨细胞引物层的制备方法及软骨组织。
背景技术
人体软骨在运动型损伤和各种关节炎发生后不能自身自然修复，因此，人工培育软骨组织对于改善老年人生活质量，延长运动员职业生涯有着不可替代的作用。人工软骨其实分为两种：一种不含软骨细胞，这是目前研究较多的；另一种则不仅含软骨细胞，且包含软骨细胞培养支架体系，可称为组织工程化人工软骨。组织化工程人工软骨至今没有商业化产品。
目前研究较多的人工软骨类型，这类人工软骨植入材料主要分为两类，即人工合成的材料和天然生物材料，具体而言，天然生物材料生物相容性好，但缺乏一定的机械强度，难于塑形。人工材料的软骨假体虽然在一定程度上能起到替代软骨的作用，但还存在易磨损松动、界面润滑性差、缺乏生物活性等等不足，其性能有待进一步提高。而组织工程软骨相容性高，具有更明显的优势，也更适合患者。但价格昂贵是患者无法接受的，在国外，拇指盖大小的软骨球，售价在650美元，限制了组织工程软骨在国内的开展与应用。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种软骨细胞引物层的制备方法，其将载体和自体软骨细胞进行三维动态共培养，即得。制得的软骨细胞引物层利于与自体软骨细胞融合，具有较好的生物相容性。
本发明的第二目的在于提供一种基于人自体细胞的软骨组织，可以在同样费用的条件下培养成本更低的软骨组织，同时具有较好的生物相容性，满足患者的需求。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种软骨细胞引物层的制备方法，将载体和自体软骨细胞进行三维动态共培养，即得；
所述三维动态共培养的培养条件包括：36.5～37.5℃，4.5～5.5％CO2，9～11％O2；
所述三维动态共培养的培养体系中包括10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子；
在所述三维动态共培养前，所述自体软骨细胞在所述载体中的密度为1.6～2.0×105/cm2；
所述载体包括骨水泥；
所述三维动态共培养的培养体系的组成包括：DMEM培养基、4～5mML-谷氨酰、体积分数为9～11％的血清和双抗生素。
一种基于人自体细胞的软骨组织，由上述的方法制备得到的软骨细胞引物层和连接于其上的自体软骨组织组成；
所述软骨细胞引物层用于连接骨和所述自体软骨组织。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明是基于人自体细胞培育的可移植用人组织工程软骨，不是人工软骨，与人体有更好的适应性。
(2)技术操作上来说，本发明是自体细胞培育，非干细胞培育，不存在患者出现排斥反应等情况。
(3)可以在同样费用的条件下培养成本更低的软骨组织，同时具有较好的生物相容性，满足患者的需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为一个实施例中的人自体软骨组织的免疫荧光染色图；
图2为一个实施例中的本申请制备得到的软骨组织的免疫荧光染色图。
具体实施方式
一种软骨细胞引物层的制备方法，将载体和自体软骨细胞进行三维动态共培养，即得；所述三维动态共培养的培养条件包括：36.5～37.5℃，4.5～5.5％CO2，9～11％O2；所述三维动态共培养的培养体系中包括10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子；在所述三维动态共培养前，所述自体软骨细胞在所述载体中的密度为1.6～2.0×105/cm2；所述载体包括骨水泥；所述三维动态共培养的培养体系的组成包括：DMEM培养基、4～5mM L-谷氨酰、体积分数为9～11％的血清和双抗生素。
在一些实施例中，所述三维动态共培养在生物反应器中进行。
在一些实施例中，所述三维动态共培养的培养条件还可以为：37℃，5％CO2，10％O2。
骨水泥，化学名称为聚乙烯吡咯烷酮，是一种用于填充骨与植入物间隙或骨腔并具有自凝特性的生物材料。
在一些实施方式中，所述三维动态共培养的培养体系为培养基，所述培养基为添加了的4.5mM L-谷氨酰，双抗生素，10％(v/v)小牛血清，10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子的DMEM培养基。优选地，所述双抗生素包括100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
在一些实施方式中，所述三维动态共培养的培养时间为14～16天。在3～10天内软骨细胞便可以形成高密度生长情况，约两周在载体上形成软骨细胞引物层。优选地，培养过程中，每周更换两次培养基。
本发明的另一方面在于提供一种基于人自体细胞的软骨组织，由上述的方法制备得到的软骨细胞引物层和连接于其上的自体软骨组织组成；所述软骨细胞引物层用于连接骨和所述自体软骨组织。
在一些实施方式中，将所述软骨细胞引物层和培养后的自体软骨细胞共培养得到所述人工软骨组织。
在一些实施方式中，所述软骨细胞引物层和培养后的自体软骨细胞共培养为三维动态培养，所述三维动态培养的培养条件包括36.5～37.5℃，4.5～5.5％CO2，9～11％O2。在一些实施例中，所述三维动态共培养的培养条件还可以为：37℃，5％CO2，10％O2。
在一些实施方式中，所述培养后的自体软骨细胞由自体软骨细胞经三维静态培养后得到。
在一些实施方式中，所述三维静态培养为将初代自体软骨细胞和水凝胶共培养。在一些实施方式中，所述初代自体软骨细胞和水凝胶共培养的方法包括：将所述初代自体软骨细胞和水凝胶前体溶液混合后，加入胶凝液，形成软骨细胞和水凝胶复合体，培养后分离出软骨细胞。
所述软骨细胞和水凝胶复合体即软骨细胞藻酸盐珠。
在一些实施方式中，所述混合时，所述初代自体软骨细胞的接种密度为0.8×106～1.2×106/mL。
在一些实施例中，所述初代自体软骨细胞的接种密度还可以为0.9×106/mL、1.0×106/mL、1.1×106/mL等，此范围内结果基本一致。
在一些实施方式中，所述水凝胶在所述水凝胶前体溶液中的质量体积浓度为1.1％～1.3％。
水凝胶前体溶液含有1.1～1.3％(W/V)水凝胶，在一些实施例中还包括20mmol/LHEPES。水凝胶前体溶液的使用量为2mL。
在一些实施例中，所述水凝胶在所述水凝胶前体溶液中的质量体积浓度还可以为1.2％。
在一些实施方式中，所述水凝胶包括海藻酸基水凝胶。
在一些实施方式中，所述水凝胶前体溶液包括藻酸钠溶液或藻酸钙溶液。
在一些实施方式中，所述胶凝液为包括二价阳离子的溶液；所述二价阳离子选自钙、铜或锌的一种或多种。
在一些实施方式中，所述二价阳离子为钙。
在一些实施方式中，所述二价阳离子在所述凝胶液中的摩尔浓度为90～110mmol/L。
在一些实施例中，所述二价阳离子在所述凝胶液中的摩尔浓度还可以为100mmol/L。
在一些实施例中，将自体软骨细胞接种到水凝胶前体溶液得到细胞悬液，将细胞悬液滴加入不断搅拌着的胶凝液中。使聚集为软骨细胞和水凝胶复合体；在一些实施例中，所述聚集的时间为10min。
在一些实施方式中，所述分离出软骨细胞的方法包括：清洗后，使用胶原蛋白酶消化，离心即得。
在一些实施方式中，所述清洗的方法为使用HEPES缓冲液清洗所述软骨细胞和水凝胶复合体孵育15min，然后除去HEPES缓冲液；优选地，所述HEPES缓冲液的组成包括：50mmol/L EDTA和10mmol/L HEPES。
在一些实施方式中，所述胶原蛋白酶的在培养基中的质量浓度为0.06％。优选地，胶原蛋白酶的孵育时间为30min。
在一些实施方式中，所述三维静态培养的培养体系中还包括9～11ng/mL转化生长因子β，90～110ng/mL***I。
在一些实施例中，所述转化生长因子β的质量体积浓度还可以为10ng/mL；所述***I的质量体积浓度还可以为100ng/mL。
在一些实施方式中，所述三维静态培养的培养体系中还包括240～260μg/mL L-抗坏血酸2磷酸钠。
在一些实施例中，所述L-抗坏血酸2磷酸钠的质量体积浓度还可以为250μg/mL。
在一些实施方式中，所述三维静态培养的培养体系的组成包括：DMEM培养基、4～5mM L-谷氨酰、体积分数为9～11％的血清和抗生素。
在一些实施方式中，所述抗生素溶液为双抗生素溶液。所述双抗生素溶液包括100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
在一些实施例中，所述L-谷氨酰的摩尔浓度还可以为5mM；所述血清的体积分数还可以为10％。
在上述的培养体系及培养基中进行培养，使自体软骨细胞进行扩大培养。海藻酸基水凝胶是良好的细胞外基质的暂时替代物，为细胞的增殖创造了良好的物理支撑和微环境，对细胞粘附增殖和分化有重要作用。
在一些实施例中，先将形成的软骨细胞和水凝胶复合体进行清洗，再共培养。优选地，所述清洗为使用氯化钠清洗。
在一些实施方式中，所述自体软骨细胞和水凝胶共培养的培养条件包括：在37℃，5％CO2的条件下培养12～16天。
在一些实施方式中，所述软骨细胞引物层和培养后的自体软骨组织共培养所用的培养体系与所述三维静态培养的培养体系相同。
在一些实施方式中，所述软骨细胞引物层和培养后的自体软骨细胞共培养的方法包括：在37℃，5％CO2，10％O2条件下培养20～23天。即形成软骨样组织。
在一些实施方式中，所述初代软骨细胞取自人软骨组织。
在一些实施方式中，所述人软骨组织由髌骨外侧沟活检取样。
在一些实施方式中，所述人软骨组织的大小为4-5mm，剪切为1x2mm后，清洗，然后酶消化。
在一些实施方式中，所述酶消化为依次使用链霉蛋白酶和胶原蛋白酶消化。
在一些实施方式中，所述链霉蛋白酶消化的方法包括：加入链霉蛋白酶后，在37℃，转速为110rpm条件下，孵育30min。
在一些实施方式中，所述胶原蛋白酶为II型胶原蛋白酶；所述胶原蛋白酶的酶活为200U/mL。优选地，所述胶原蛋白酶小环的方法包括：从链霉蛋白酶分离出软骨细胞，然后加入胶原蛋白酶，在37℃，转速为110rpm条件下，孵育18～24h。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
所用溶液配方如下：
PBS：不含Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲生理盐水，pH7.2，可以添加双抗生素溶液(100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素)。
培养液I：DMEM培养液按1：1加入Ham F-12营养液，附加双抗生素溶液(青霉素100U/mL；链霉素100μg/mL)以及250ng/mL两性霉素B。
培养液II：培养液按1：1加入Ham F-12营养液，附加10％小牛血清，50μg/mL抗坏血酸2磷酸钠以及双抗生素溶液(青霉素100U/mL；链霉素100μg/mL)。
培养液III：DMEM中加入4～5mM L-谷氨酰，双抗生素溶液，9～11％(v/v)血清，9～12ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。
培养液IV：DMEM中加入4～5mM L-谷氨酰，双抗生素溶液，9～11％(v/v)血清，9～11ng/ML转化生长因子β，90～110ng/mL***I，240～260μg/mL L抗坏血酸2磷酸钠，1mM半胱氨酸。
藻酸钠溶液：1.1～1.3％(w/v)藻酸钠，用20mmol/L HEPES和0.15mol/L氯化钠配制
0.06％胶原蛋白酶：用Ham F12配制，加入10％FCS，用0.22μm滤器过滤除菌。
实施例
1.软骨细胞活检取样
1.1“绝对”无菌条件下，在髌骨外侧沟活检取样软骨组织4-5mm，置于培养液I中。
1.2在培养皿中把软骨组织切成小块，1x2mm大小，放入250mL的空烧瓶中，PBS清洗2次。
1.3加入40mL链霉蛋白酶溶液，37摄氏度下，轻轻搅动软骨组织30分钟(110rpm)。
1.4从链霉蛋白酶中取出，37度下，在40mL 200U/mL的胶原蛋白酶内放置18-24小时，并轻轻搅动(110rpm)。
1.5用70μm孔筛网过滤悬浮液，放入50mL猎鹰管中。室温下离心(300xg)10分钟。
1.6弃上清液，PBS清洗细胞球2次。
1.7在适量(20-50mL)培养液II中重悬细胞。
1.8取10μL细胞悬浮液，用90μL台盼蓝稀释染色，细胞计数。
2.软骨细胞引物层的制备
2.1在载体上每平方厘米种植1.8x105步骤1得到的初代自体软骨细胞，培养于三维动态共培养的培养体系中即mL培养液III(血清为小牛血清)，每孔3mL培养液III，培养于生物反应器。每周更换培养液2次。反应条件为：37℃，5％CO2，10％O2。
2.2 3-10天内细胞便可以形成高密度生长情况。
2.3 2周后在载体上形成软骨细胞引物层。
3.软骨细胞藻酸盐珠(即软骨细胞和水凝胶复合体)培养
3.1在锥形瓶内用2mL藻酸钠溶液混悬细胞，然后逐渐稀释直至细胞密度1×106/mL。
3.2通过21G针头将细胞悬液滴加入适度磁力搅拌着的胶凝液(102mmol/L氯化钙，5mmol/L HEPES，pH 7.4)中，使藻酸盐聚集10min。
3.3 2周内形成微珠。
3.4用5倍容量的0.15mol/L氯化钠将微珠洗3次。
3.5将5mL微珠(1×107个细胞)进行三维静态培养即放入含有培养液IV(血清为猪血清)的培养瓶中，于37℃，5％CO2的条件下培养，培养液每2天换一次。
3.6培养2周，吸出培养液。
3.7将两倍容量的HEPES缓冲液(50mmol/L EDTA，10mmol/L HEPES，pH 7.4)加在微珠上。
3.8在37℃条件下孵育15min。然后离心(76x g，10min)。
3.9用含有0.06％胶原蛋白酶的培养液IV(血清为猪血清)混悬细胞。
3.10在37℃以及湿润的5％CO2的条件下，培养30min。然后离心(76x g，10min)。
3.11用培养液IV(血清为猪血清)混悬细胞，然后用血细胞计数板计数。
3.12离心(76x g，10min)。
3.13用培养液IV混悬细胞，离心(76x g，10min)。
4.软骨组织合并生长(即软骨细胞引物层和培养后的自体软骨细胞的共培养)
4.1将经步骤3培养后得到的软骨细胞，移植于软骨细胞引物层，每孔3mL培养液IV(血清为猪血清)。
4.2在37度，5％CO2，10％O2，培养液每2天更换一次，培养3周，即形成软骨样组织。
实验例
软骨组织的免疫荧光染色实验。
取本发明制备得到的软骨组织及源软骨分别做切片，经免疫荧光染色后观察并对比二者的密度。可见，本发明之制备得到的软骨组织密度(图2)和源软骨(图1)的密度十分接近。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种软骨细胞引物层的制备方法，其特征在于，将载体和初代自体软骨细胞进行三维动态共培养，即得；
所述三维动态共培养的培养条件包括：36.5～37.5℃，4.5～5.5％CO2，9～11％O2；
所述三维动态共培养的培养体系中包括9～12ng/mL碱性成纤维细胞生长因子；
在所述三维动态共培养前，所述初代自体软骨细胞在所述载体中的密度为1.6～2.0×105/cm2；
所述载体包括骨水泥；
所述三维动态共培养的培养体系的组成包括：DMEM培养基、4～5mM L-谷氨酰、体积分数为9～11％的血清和双抗生素。
2.一种基于人自体细胞的软骨组织，其特征在于，由权利要求1所述的方法制备得到的软骨细胞引物层和连接于其上的自体软骨细胞组成；
所述软骨细胞引物层用于连接骨和所述自体软骨组细胞。
3.根据权利要求2所述的软骨组织，其特征在于，将所述软骨细胞引物层和培养后的自体软骨细胞共培养得到所述人工软骨组织；
优选地，所述软骨细胞引物层和培养后的自体软骨细胞共培养为三维动态培养，所述三维动态培养的培养条件包括36.5～37.5℃，4.5～5.5％CO2，9～11％O2。
4.根据权利要求3所述的软骨组织，其特征在于，所述培养后的自体软骨细胞由自体软骨细胞经三维静态培养后得到；
优选地，所述三维静态培养为将初代自体软骨细胞和水凝胶共培养。
5.根据权利要求3所述的软骨组织，其特征在于，所述初代自体软骨细胞和水凝胶共培养的方法包括：将所述初代自体软骨细胞和水凝胶前体溶液混合后，加入胶凝液，形成软骨细胞和水凝胶复合体，培养后分离出软骨细胞；
优选地，所述混合时，所述初代自体软骨细胞的接种密度为0.8×106～1.2×106/mL；
优选地，所述水凝胶在所述水凝胶前体溶液中的质量体积浓度为1.1％～1.3％。
6.根据权利要求5所述的软骨组织，其特征在于，所述水凝胶包括海藻酸基水凝胶；
优选地，所述水凝胶前体溶液包括藻酸钠溶液或藻酸钙溶液；
优选地，所述胶凝液为包括二价阳离子的溶液；所述二价阳离子选自钙、铜或锌的一种或多种；
优选地，所述二价阳离子为钙；
优选地，所述二价阳离子在所述凝胶液中的摩尔浓度为90～110mmol/L。
7.根据权利要求5所述的软骨组织，其特征在于，所述分离出软骨细胞的方法包括：清洗后，使用胶原蛋白酶消化，离心即得。
8.根据权利要求3所述的软骨组织，其特征在于，所述三维静态培养的培养体系中还包括9～11ng/mL转化生长因子β，90～110ng/mL***I；
优选地，所述三维静态培养的培养体系中还包括240～260μg/mL L-抗坏血酸2磷酸钠。
9.根据权利要求8所述的软骨组织，其特征在于，所述三维静态培养的培养体系的组成包括：DMEM培养基、4～5mM L-谷氨酰、体积分数为9～11％的血清和抗生素。
10.根据权利要求3～9任一项所述的软骨组织，其特征在于，所述软骨细胞引物层和培养后的自体软骨组织共培养所用的培养体系与所述三维静态培养的培养体系相同。
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