CN109234392A - 标记物在制备乳腺癌检测、诊断或预后监测产品中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了标记物在制备乳腺癌检测、诊断或预后监测产品中的用途,所述生物标记物为GPR56和/或NWD2基因及其表达产物。本发明通过转录组测序发现了2种与乳腺癌的相关的基因,并研究其在乳腺癌早期检测中的应用前景;为进一步研究乳腺癌的病因发病机制,探索乳腺癌早期防治的药物靶点提供了新的方向。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域,具体涉及标记物在制备乳腺癌检测、诊断或预后监测产品中的用途。
背景技术
乳腺癌是一种全身性疾病、其发生和发展是一个涉及多因素、多环节的复杂过程,包括癌基因的激活以及抑癌基因的失活等。因此,基因突变在乳腺癌的发生、发展过程中起着非常重要的作用。
乳腺癌是一个多因素遗传变异性疾病,只有不足10%是由于单基因缺陷引起的。随着高通量基因技术的发展,越来越多与乳腺癌相关基因被发现,这些基因上潜在的遗传变异(单核苷酸多态和拷贝数变异)可能引起乳腺癌药物治疗效果的差异。由于遗传变异的存在使抗肿瘤药物的代谢途径以及药物作用的目标基因可能受到影响,进而影响疗效以及预后。
RCA1和BRCA2是最早被鉴定,也是最常见的家族遗传性乳腺癌特征基因。随着相关新技术的应用,已有大量基因陆续被报道与乳腺癌相关。这些基因大致可以分为“高风险”与“低至中度风险”乳腺癌易感基因,其中“高风险”易感基因包括:BRCA1和BRCA2(在年轻人中发病率高得多);而PTEN,TP53,CHEK2,TGFβ1,PALB2和ATM属于“中度风险”乳腺癌易感基因。研究表明,40岁以前被诊断为乳腺癌患者的女性中,约1%被发现携带p53基因的突变;30岁以前被诊断为乳腺癌患者的女性中,多达4%携带p53基因的突变。携带PTEN同源缺失突变的女性,其患乳腺癌的风险为25-50%,这在年轻女性中更为常见。PALB2基因突变的女性,患乳腺癌和胰腺癌的风险增高。另外还有90个常见“低度风险”突变。上述这些变异仅仅解释了37%的家族性乳腺癌的风险。尚有接近三分之二的家族性乳腺癌发病风险找不到对应的致病基因。
家族性乳腺癌是指一个家族中有两个或以上具有血缘关系的成员患乳腺癌,占乳腺癌总体的5-7%。与散发性乳腺癌相比,家族性乳腺癌的发病率更高,且年轻(<40岁)早发性患者,预后更差,存活率更低。大规模的流行病学研究表明,有一个一级亲属患病的个体,其乳腺癌发病的概率为5.5%;有两个一级亲属患病的个体,其发病率为13.3%。Evans等人进一步的回顾分析表明,与正常对照人群相比,有一级亲属患乳腺癌的家族个体,其发病率增加2-4倍。家族遗传性在年轻早发乳腺癌群体中较为常见。可见,探索寻找族性乳腺癌相关基因,将为家族性乳腺癌的早期诊断、治疗和预后提供新的理论依据和临床指导。
发明内容
为了解决上述问题,本发明的目的在于寻找能够用于乳腺癌早期检测的生物标志物并提供其相关应用。
本发明首先提供标记物在制备乳腺癌检测、诊断或预后监测产品中的用途,所述标记物为GPR56和/或NWD2基因及其表达产物。
进一步地,所述标记物为GPR56和/或NWD2基因在乳腺癌中表达下调。
更进一步,上面所提到的产品包括:通过RT-PCR、Western方法、免疫检测、原位杂交、芯片或试剂盒检测上述基因及其表达产物的表达水平以诊断乳腺癌的产品。
进一步,所述用RT-PCR诊断乳腺癌的产品至少包括一对特异扩增GPR56和/或NWD2基因的引物;所述用免疫检测诊断乳腺癌的产品包括:与GPR56、和/或NWD2蛋白特异性结合的抗体;所述用原位杂交诊断乳腺癌的产品包括:与GPR56和/或NWD2基因的核酸序列杂交的探针;所述用芯片诊断乳腺癌的产品包括:蛋白芯片和基因芯片;其中,蛋白芯片包括与GPR56和/或NWD2蛋白特异性结合的抗体,基因芯片包括与GPR56和/或NWD2基因的核酸序列杂交的探针。
与GPR56和/或NWD2基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制,只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合,任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样,所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长,甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响,所述探针的长度通常至少是14个碱基对,最长一般不超过30个碱基对,与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对,以免影响杂交效率。
进一步,所述GPR56和/或NWD2蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述GPR56和/或NWD2蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰,例如,嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与GPR56和/或NWD2蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的,并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
优选地,所述产品包括芯片、试剂盒。
进一步,所述固相载体包括无机载体和有机载体,所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等;所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。
进一步,所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒;所述基因检测试剂盒包括用于检测GPR56和/或NWD2基因转录水平的试剂;所述蛋白免疫检测试剂盒包括GPR56和/或NWD2蛋白的特异性抗体。
优选地,所述试剂盒为乳腺癌检测试剂盒,其包含检测GPR56和/或NWD2基因表达水平的工具,以及如何使用所述试剂盒的说明。
所述工具包括用于检测GPR56和/或NWD2基因的引物对或探针。所述GPR56引物对具有SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列;所述NWD2引物对具有SEQ IDNO:3和SEQID NO:4所示的核苷酸序列。
优选地,所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶和SYBR Green荧光染料。
更进一步地,本发明还提供了所述GPR56和/或NWD2基因及其表达产物在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
本发明的药物还可与其他治疗乳腺癌的药物联用,多种药物联合使用可以大大提高治疗的成功率。
本发明的药物还包括药学上可接受的载体,这类载体包括(但并不限于):稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等;粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮;湿润剂如甘油;崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠;吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等;表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等;致湿剂如甘油、淀粉等;吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等;润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。
本发明的药物可以使用不同的添加剂进行制备,例如稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。
稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖,例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等;糖醇,例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等;二糖,例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等;多聚糖,例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。
表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂,例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。
添加剂缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐,例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。
本发明的药物还可包括药学上可接受的涂层材料包括(但不限于),快速分解涂层材料、染色剂、肠溶性聚合物、增塑剂、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散剂。常见快速分解涂层材料包括OPADRY;肠溶性聚合物包括甲基内烯酸聚合物、磷羟丙甲基纤维素苯二甲酸酯、羟丙甲基纤维素乙酸酯、羟丙甲基纤维素琥珀酸酯、羟甲乙基纤维素、乙酰磷苯二甲酸纤维素;增塑剂包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。
本发明药物的单位剂型可以使多种形式,代表性的剂型包括固体剂型如片剂、丸剂、粉剂、干粉剂、颗粒、胶囊等;液态剂型如溶液、悬浮液、乳状液、糖浆、酏剂等。
本发明所述药物可以通过任何途径给予受体,只要能达到目标组织,其可通过口服或非口服的多种途径,如口服给药、鼻内给药、腹腔内给药、肌内给药、皮下给药、皮内给药、肺内给药、直肠内给药、静脉内给药。
有益效果
本发明通过转录组测序发现了2种与乳腺癌的相关的基因,并研究其在乳腺癌早期检测中的应用前景;为进一步研究乳腺癌的病因发病机制,探索乳腺癌早期防治的药物靶点提供了新的方向。
附图说明
图1为本发明GPR56和NWD2基因在RT-PCR中的乳腺癌病例组中的表达水平。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例中未注明具体条件的实验方法,通常为本领域常规方法。
在本发明的上下文中,“GPR56基因”包括GPR56基因以及GPR56基因的任何功能等同物的多核苷酸。GPR56基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中GPR56基因(NC_000016.10)DNA序列具有70%以上同源性,且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
在本发明的上下文中,“NWD2基因”包括NWD2基因以及NWD2基因的任何功能等同物的多核苷酸。NWD2基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中NWD2基因(NC_000004.12)DNA序列具有70%以上同源性,且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
实施例1不同家族遗传性乳腺癌样本收集和临床资料采集
1、乳腺癌患者家系纳入标准
1)一个家族中除先证者外,在一级亲属中有1例或更多的乳腺癌患者,且至少有1例满足下列条件之一:发病时<40岁;同时或先后出现双侧乳腺癌;同时或先后出现非乳腺恶性肿瘤;
2)术前未接受过任何相关治疗,如放疗、化疗、内分泌治疗以及靶向治疗;
3)符合国际临床分期I-IV期而无禁忌者,行相关手术治疗者(包括乳腺肿物切除术备乳腺癌手术,乳腺癌根治术、改良根治术以及保乳术,结合或不结合腋窝***清扫术)。
2、乳腺癌患者家系排除标准
1)术前行辅助放/化疗治疗;
2)结合临床症状、体征、辅助检查,或者经B超引导下乳腺肿块穿刺活检病理学诊断为良性病变,无明确手术指针者;
3)存在其他手术禁忌症而不能实行手术取材的患者;
4)手术切除后,癌肿过小(最大直径<1cm),存在病理诊断难度的;
5)合并有类风湿性关节炎、风湿热等其他风湿免疫疾病的患者;
6)患有其他严重***性疾病的患者;
7)流行病学资料、临床资料和影像资料不完整者;
8)未获得知情同意者。
3、样本收集
获取5例乳腺癌患者的外周血和5例相对正常的外周血样本。所有患者术前均未接受化疗或放疗,术前已取得患者的知情同意,并通过伦理委员会审核。
样本处理:将EDTA抗凝全血按1:1比例与Trizol混合,充分混匀后置于1.8mL细胞冻存管中,在液氮中迅速冷却30s后置于-80℃的冰箱保存。
实施例2外周血RNA提取
1、匀浆处理
取新鲜的血液,加入3倍体积红细胞裂解液,混匀后室温放置10min,10000rpm离心1min。弃上清,收集白细胞沉淀。每100-200μL血液收集的白细胞沉淀加入1ml Trizol。
2、分层
样本加入Trizol后,室温放置5min,使样本充***解。
每1mL Trizol加入200μL氯仿,剧烈震荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。
3、RNA沉淀
4℃12000rpm离心10-15min。样品会分为3层:黄色有机相,中间层和无色水相,RNA主要在水相中,把水相(通常可吸取550-600μL)转移到新EP管中。注:小心吸取水相,千万不要吸取中间界面,否则将导致RNA样品中有DNA污染。
在上清中加入等体积事先预冷的异丙醇,室温放置10-20min。4℃12000rpm离心10min,弃上清,RNA沉淀于管底。
4、RNA漂洗
RNA沉淀中加入1ml75%乙醇(用RNase-free水配制),温和振荡离心管,悬浮沉淀。没1mL Trizol加入1mL75%乙醇。
4℃5000-8000rpm离心1-2min,弃上清;可短暂快速离心,用移液器小心吸弃上清,注意不要吸弃沉淀。室温放置1-2min晾干沉淀。
5、RNA溶解
沉淀中加入50-100μL RNase-free水,轻弹管壁,以充分溶解RNA,-80℃保存。
6、RNA完整性及纯度检测
完整性:RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件:1.2%胶;0.5×TBE电泳缓冲液;150v,15min)检测完整性。RNA样本中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍,否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度:OD260/OD280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA样品,OD260/OD280比值(10mM Tris,ph7.5)在2.0左右。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品,假定在10mM Tris,ph7.5溶液中测定出的OD260/OD280读数在1.8-2.1之间,在水溶液中所测定读数可能在1.5-1.9之间,但这并不代表RNA不纯。
浓度:去一定量的RNA提取物,用RNase-free水稀释n倍,用RNase-free水将分光光度计调零,取稀释液进行OD260测定,按照以下公式进行RNA浓度的计算:终浓度(ng/μL)=OD260×n(稀释倍数)×40.
实施例3 RNA-seq测序文库构建与质检
1、数据质量评估
cDNA文库的构建及测序,委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成。所有样品的测序数据经过测序错误率检查、GC含量分布检查及原始数据过滤,获得后续分析使用的clean reads,数据汇总。通常认为RNA-seq数据进行不同文库间的基因差异表达分析,库总读段数至少为10M,数据整体GC含量保持在40%-60%,Q30在80%以上则为合理。本次测序所获数据中clean bases占7.2G以上,Q2碱基占95.18%以上,Q3碱基占89.15%以上,GC含量在样本间保持稳定,在54.29%-56.80%之间,说明整体测序质量良好,满足下游分析质量需求。
2、比对结果分析
将所有样品的clean reads用STAR软件比对到参考基因组序列,平均每个样品的比对率达到92.51%以上,Uniquely mapping rate是指比对到基因组单一位置的reads数占总cleanreads数的百分比,只有Uniquely mapped reads才能用于表达量统计,本研究中参考基因组单一位点的平均比对率为76.956%。
3、定量结果分析
3.1定量结果说明
每个样本平均产出6Gb数据。将测序reads比对到参考基因组并重构转录本之后,根据FPKM表达量计算得到10个样品中所有的基因的表达水平。随后,我们用bowtie将reads比对到基因上,每个样本平均检测到11552个基因。
对每个样本分别进行基因水平或转录本水平定量,再合并得到所有样本的表达矩阵,第一列为基因或转录本ID,其余列为各样本的原始readcount值。
3.2表达水平分布
RNA-seq的基因表达值通常用RPKM或FPKM表示。RPKM用于单端测序,FPKM用于双端测序,先对测序深度进行校正,再对基因或转录本的长度进行校正。
3.3相关性分析
我们要求生物学重复样品间R2至少要大于0.8,否则需要对样品做出合适的解释,或者重新进行实验。根据各样本所有基因的表达值(RPKM或FPKM),计算组内及组间样本的相关性系数,绘制成热图,可直观显示组间样本差异及组内样本重复情况。样本间相关性系数越高,其表达模式越为接近。
4、差异结果分析
基因差异分析的输入数据为基因定量中得到的原始readcount数据。本研究采用DESeq2软件对正常组及患病组进行对比分析,筛选正常组与患病组。最终共筛选出1500个差异表达基因,经过聚类分析、GO功能富集和KEGG信号通路功能富集分析,发明人筛选到乳腺癌标记物为GPR56和NWD2基因,这些基因在乳腺癌中为下调基因。
实施例4乳腺癌患者DNA中各标记物基因表达情况
1.实验材料
获取自2013年1月至2017年12月于深圳二院接受乳腺癌手术的30例患者的乳腺癌新鲜样本组织、20例相对正常的新鲜样本。所有患者术前均未接受化疗或放疗,术前已取得患者的知情同意,并通过伦理委员会审核。
样本处理:所有样本均经病理学检查证实,编号后置-80℃低温冰箱保存。
2.样本RNA的提取
参照实施例2。
3.逆转录合成cDNA
3.1第一链cDNA合成试剂盒(RevertAid Premium Reverse Transcriptase)(Thermo ScientificTMEP0733)
3.2 cDNA第一链合成
(1)在冰浴的nuclease-free PCR管中加入以下试剂:
(2)轻轻混匀后离心3~5s,反应混合物在65℃温浴5min后,冰浴2min,然后离心3~5s。
(3)将试管冰浴,再加入下列试剂:
4.0μL 5*RT Buffer
0.5μL Thermo Scientific RiboLock RNase Inhibitor(20U)
1.0μL RevertAid Premium Reverse Transcriptase(200U)
(4)轻轻混匀后离心3~5s
(5)在PCR仪上按照下列条件进行反转录反应
①25℃孵育10min
②cDNA合成 50℃30min
③终止反应 85℃5min,处理后,置于冰上放置
(6)将上述溶液-20℃保存。
4.Real-Time PCR
引物设计
采用在线引物设计软件Primer-BLAST设计引物,在NCBI数据库中利用各基因的mRNA序列设计引物,内参选GAPDH,引物设计后由上海生工公司合成。具体引物序列如下:
表1 Real-Time PCR引物序列
操作过程如下:
(一)反应体系:用PowerGreen PCR Master Mix进行扩增,实验操作按产品说明书进行。扩增程序为:95℃3min预反应,进行45个循环(95℃3s,60℃30s)的扩增反应。
表2 Real-Time PCR反应体系
组分 | 加入量 |
2×mix | 10μL |
上游引物(10μM) | 0.4μL |
下游引物(10μM) | 0.4μL |
模板 | 2μL |
加入灭菌蒸馏水 | 至20μL |
(二)样品Real-Time PCR检测
将各样品cDNA10倍稀释后取2μL作模板,分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。
5.实验结果
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚,扩增曲线整体平行性好,表明各反应管的扩增效率相近,极限平而无上扬现在,曲线指数期斜率较大,说明扩增效率较高。样本扩增产物溶解曲线都是单峰,说明扩增产物只有一条,为特异性扩增。根据qRT-PCR的相对定量公式,比较各基因在乳腺癌病例组和对照组中的表达水平。结果如图1显示:qRT-PCR扩增结果稳定,GPR56、和NWD2基因在乳腺癌病例组中的表达水平分别为对照组织的0.46、0.27倍。该结果也证明了转录组测序得到的差异基因GPR56和NWD2在乳腺癌低表达的结果,为基因快速早期筛查乳腺癌提供了可能。
实施例5检测试剂盒的制作
基于实施例4得到的引物,组装本发明所述用于乳腺癌检测的试剂盒,所述试剂盒包括特异扩增GPR56和/或NWD2基因的引物对如表1所示;具体为:
1、试剂盒一包括特异性扩增GPR56的引物对:SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2;
2、试剂盒二包括特异性扩增NWD2的引物对:SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4;
3、试剂盒三包括特异性扩增GPR56和NWD2的引物对:SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2;SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4;
本发明的试剂盒还包括特异扩增管家基因(GAPDH)的引物对:SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示;还包括SYBR Green聚合酶链式反应体系,如PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTPs。所述PCR缓冲液的成分为25mM KCl,2.5mM MgCl2,200mM(NH4)2SO4。通过对引物浓度和退火温度的优化,最终确定反应体系如表3所示:
表3 PCR反应体系
组分 | 加入量 |
SYBR Green聚合酶链式反应体系 | 12.5μL |
上游引物(10μM) | 0.5μL |
下游引物(10μM) | 0.5μL |
模板cDNA | 2.0μL |
加入灭菌蒸馏水 | 至25μL |
最佳反应条件为:95℃预变性5min,(95℃变性15sec,60℃退火45sec,72℃延伸35sec)×40个循环,72℃延伸15min。
为方便使用,试剂盒还可包含对照:上述基因一种或几种的正常cDNA样本。
取受检者生物学样本,使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从生物学样本中提取RNA,使用试剂盒中试剂,按照最佳反应体系与条件进行PCR反应,使用试剂盒中正常cDNA作为Real-Time PCR定量检测中的对照cDNA,检测受试者生物学样本中GPR56和/或NWD2基因的表达量相对正常cDNA的表达量变化。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京致成生物医学科技有限公司
<120> 标记物在制备乳腺癌检测、诊断或预后监测产品中的用途
<130> P18093
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> DNA sequence
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Claims (10)
1.标记物在制备乳腺癌检测、诊断或预后监测产品中的用途,其特征在于,所述标记物为GPR56和/或NWD2基因及其表达产物。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述基因在乳腺癌中表达下调。
3.如权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述产品包括:通过RT-PCR、Western方法、免疫检测、原位杂交、芯片或试剂盒检测权利要求1所述基因及其表达产物的表达水平以诊断乳腺癌的产品。
4.一种乳腺癌检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含检测GPR56、和/或NWD2基因表达水平的工具,以及如何使用所述试剂盒的说明。
5.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述工具包括用于检测GPR56和/或NWD2基因的引物对或探针。
6.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述GPR56引物对具有SEQ IDNO:1和SEQID NO:2所示的核苷酸序列;所述NWD2引物对具有SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
7.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶和SYBR Green荧光染料。
8.GPR56和/或NWD2基因及其表达产物在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的药物,其特征在于,所述药物还包括其他治疗乳腺癌的药物。
10.如权利要求8或9所述的药物,其特征在于,所述药物还包括药学上可接受的载体。
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-
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Title |
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