CN109234175A - 一株产重楼皂苷的尖孢镰刀菌dclzj-4菌株及其用途 - Google Patents

一株产重楼皂苷的尖孢镰刀菌dclzj-4菌株及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种产重楼皂苷的尖孢镰刀菌DCLZJ‑4菌株，本菌株是从滇重楼中采用内生真菌分离纯化的方法分离培养获得的，经微生物鉴定为镰刀菌属（Fusarium sp.）。该菌株保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所；邮编100101，保藏日期为2017年10月30日，保藏编号为：CGMCC No.14791；该菌株的ITS rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。上述菌株能够用于发酵制备重楼皂苷。本发明为规模化发酵制备重楼皂苷提供一株性状稳定、培养基简单、生长良好的尖孢镰刀菌菌株、实用简便的发酵及分离提取工艺，其发酵液经提取浓缩后的浸膏可作为止血类药物的活性成分或者是药用载体。

Description

一株产重楼皂苷的尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株及其用途
技术领域
本发明涉及一种尖孢镰刀菌菌株，该菌株可产重楼皂苷，属于微生物技术领域。
背景技术
植物内生菌具有强大的代谢功能，能够产生与宿主相同或相似的活性成分，广泛存在于多种植物中，可通过合适的培养条件从植物中培养分离出来。目前植物内生菌的研究逐渐受到重视，不同植物的各种内生菌相继被发现。内生菌种类的多样性也赋予了其代谢产物的多样性，利用内生菌发酵的方法用于挖掘新资源具有巨大的潜力。随着人们对药用植物内生菌的逐步研究，利用能够代谢产生相应活性成分的内生菌来生产新型、高效、低成本的活性药物，解决珍稀中药植物资源紧缺的现状，将成为药用植物内生菌研究的重点。
中药重楼具有显著的药理活性，临床应用广泛，是云南白药、宫血宁等多种中成药的主要原料之一，但重楼生长周期长、生长速度慢，引种驯化没有取得突破性进展，价格居高不下，道地野生资源破坏严重，重楼资源面临枯竭的危险。研究表明重楼植物中也存在大量内生菌，能够产生活性代谢产物。目前已有一些学者筛选出了一些产皂苷或其类似物的内生菌，但菌株数量及种类都不多，继续筛选出一些新的产皂苷或皂苷元的菌株，对深入开展微生物发酵产皂苷或皂苷元的途径的研究具有重要意义。从重楼植物体中筛选出可代谢产生重楼皂苷的内生菌，为解决重楼紧缺的现状提供了一条新的途径。
Wang Q等采集了嵩明、宝山、鹤庆等地的滇重楼中的内生真菌，从根、块茎、叶中分离到749株内生真菌，魏娟等从野生滇重楼和人工培育的滇重楼中分别分离出44株和40株内生细菌。张鹏等发现了1株能够产重楼皂苷Ⅰ的内生阴沟肠杆菌和2株能够产重楼皂苷Ⅵ的内生大肠杆菌和解淀粉芽孢杆菌。任智，赵明，张晓杰，曹晓东等也分离到了能够产甾体皂苷的重楼内生菌。说明重楼内生菌的品种繁多，具有很强的生物学活性，能够产皂苷类化合物。
重楼内生菌近几年来才开始受到人们的关注，但关于重楼内生菌尤其是能够代谢产生相应甾体皂苷成分的研究依然相对较少，并且大部分集中在华重楼方面，而滇重楼内生菌的研究也主要集中在生物多样性方面，对内生菌产重楼皂苷代谢产物的研究还较少。
发明内容
本发明解决了背景技术中的问题，提供了一种产多种重楼皂苷的尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株。
本发明的目的是提供一种产重楼皂的尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株、制备方法、发酵培养方法及其发酵液制成的浸膏在制备治疗/预防止血类药物中的应用。
本发明的目的是这样实现的，
一种镰刀菌属尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株，其保藏编号为CGMCC No.14791。
镰刀菌属尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株的制备方法，其特征在于包括清洗消毒、接种、分离、培养及保存，具体步骤为：
a) 清洗消毒：将采集的新鲜重楼块茎洗净后，除去表面坏死的硬物部分，用75％的乙醇进行表面消毒20min，然后用无菌水清洗3～5次；
b) 接种：将步骤a)处理的重楼块茎放入事先灭菌备用的研钵中，加5mL无菌水研磨成白色悬浊液；用移液器取300μL悬浊液于各个PDA培养基平板中，用无菌涂棒涂匀；并于第3、5、7、9d分别拍照记录，若真菌长满平板则不再进行分离，并灭菌处理；
c) 接种：将步骤a)处理的重楼块茎横切成1cm2的薄片小块，先用75％的酒精浸泡3～5min，再用无菌水清洗2～3遍，洗去残余的酒精，最后用无菌水浸泡大约5分钟，取出后用灭菌的滤纸吸干表面水分；将处理后的小块贴至PDA固体平板上，每个平板上放5片；并于第3、5、7、9d分别拍照记录，若真菌长满平板则不再进行分离，并灭菌处理；
d) 分离：将步骤b) 或步骤c)得到的PDA培养基平板于28℃恒温培养箱中培养5～9d，及时观察，用接种针接种不同的真菌于PDA固体培养基平板上，反复纯化，直至得到单一的菌落；
e) 培养及保存：将平板上纯化完成的真菌挑取至装有PDA的固体斜面培养基试管中，然后于28℃恒温培养5d后，加入甘油后，塞上硅胶塞，封口膜封口，于-80℃超低温冰箱中保存。
镰刀菌属尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株的发酵培养方法，其特征在于将菌种接种到50ml PDA液体培养基中，于28℃恒温摇床150r/min活化培养，24h后取1ml活化的菌种至装有PDA液体培养基的三角瓶中进行发酵，装液量100ml/ 250ml，28℃、150r/min摇床培养7d；经过以上发酵培养后，收集发酵液。
每1000ml PDA培养基由土豆300g、蔗糖18g组成。
一种含有多种重楼皂苷的浸膏，其特征是以镰刀菌属尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株的发酵液为原料，用正丁醇萃取三次，挥干正丁醇后得到。
含有多种重楼皂苷的浸膏在制备治疗/预防止血类药物中的应用。
药物的剂型为口服剂型或静脉注射剂。
药物的剂型为片剂、硬胶囊、软胶囊、散剂、丸剂、颗粒剂。
一种药物组合物，含有多种重楼皂苷的浸膏作为活性成分或者是药用载体。
本发明人筛选到一株新型菌株，该菌株被命名为 DCLZJ-4，属一种尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，该菌株保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所；邮编100101，保藏日期为2017年10月30日，保藏编号为：CGMCC No.14791；该菌株的ITS rDNA序列如SEQ ID NO .1所示。
上述菌株能够用于发酵制备重楼皂苷。微生物发酵所采用的培养基配方为PDA培养基：土豆300g，蔗糖18g。最优培养条件为：pH值7.0，培养温度28℃，摇床转速150r/min。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明所提供的尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株能够代谢产生多种重楼皂苷。本发明提供的菌株可以在短期内进行大规模发酵培养，且发酵成本较低，又不受时域、季节等条件限制，因此能够通过微生物发酵的途径解决重楼自然资源日益匮乏的现状，保证重楼药用资源的长期可持续利用。
附图说明
图1为尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株的菌落正面。
图2为尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株的菌落背面。
图3为尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株代谢产物的薄层色谱图。
图4为重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ标准品混合液质联用色谱总离子图。
图5为重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ标准品混合液质联用色谱的重楼皂苷Ⅰ标准品的一级质谱图。
图6为重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ标准品混合液质联用色谱的重楼皂苷Ⅰ标准品的二级质谱图。
图7为重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ标准品混合液质联用色谱的重楼皂苷Ⅱ标准品的一级质谱图。
图8为重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ标准品混合液质联用色谱的重楼皂苷Ⅱ标准品的二级质谱图。
图9为重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ标准品混合液质联用色谱的重楼皂苷Ⅵ标准品的一级质谱图。
图10为重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ标准品混合液质联用色谱的重楼皂苷Ⅵ标准品的二级质谱图。
图11为重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ标准品混合液质联用色谱的重楼皂苷Ⅶ标准品的一级质谱图。
图12为重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ标准品混合液质联用色谱的重楼皂苷Ⅶ标准品的二级质谱图。
图13为尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株代谢产物液质联用色谱中重楼皂苷Ⅰ质谱图。
图14为尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株代谢产物液质联用色谱中重楼皂苷Ⅰ离子图。
图15为尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株代谢产物液质联用色谱中重楼皂苷Ⅱ质谱图。
图16为尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株代谢产物液质联用色谱中重楼皂苷Ⅱ离子图。
图17为尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株代谢产物液质联用色谱中重楼皂苷Ⅵ质谱图。
图18为尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株代谢产物液质联用色谱中重楼皂苷Ⅵ离子图。
图19为尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株代谢产物液质联用色谱中重楼皂苷Ⅶ质谱图。
图20为尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株代谢产物液质联用色谱中重楼皂苷Ⅶ离子图。
保藏生物材料的说明
菌株的保藏：该菌株保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所；邮编100101，保藏日期为2017年10月30日，保藏编号为：CGMCC No.14791；该菌株的ITS rDNA序列如SEQ ID NO .1所示。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
一种镰刀菌属尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株，其保藏编号为CGMCC No.14791。
镰刀菌属尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株的制备方法，其特征在于包括清洗消毒、接种、分离、培养及保存，具体步骤为：
a) 清洗消毒：将采集的新鲜重楼块茎洗净后，除去表面坏死的硬物部分，用75％的乙醇进行表面消毒20min，然后用无菌水清洗3～5次；
b) 接种：将步骤a)处理的重楼块茎放入事先灭菌备用的研钵中，加5mL无菌水研磨成白色悬浊液；用移液器取300μL悬浊液于各个PDA培养基平板中，用无菌涂棒涂匀；并于第3、5、7、9d分别拍照记录，若真菌长满平板则不再进行分离，并灭菌处理；
c) 接种：将步骤a)处理的重楼块茎横切成1cm2的薄片小块，先用75％的酒精浸泡3～5min，再用无菌水清洗2～3遍，洗去残余的酒精，最后用无菌水浸泡大约5分钟，取出后用灭菌的滤纸吸干表面水分；将处理后的小块贴至PDA固体平板上，每个平板上放5片；并于第3、5、7、9d分别拍照记录，若真菌长满平板则不再进行分离，并灭菌处理；
d) 分离：将步骤b) 或步骤c)得到的PDA固体平板培养基于28℃恒温培养箱中培养5～9d，及时观察，用接种针接种不同的真菌于PDA固体培养基平板上，反复纯化，直至得到单一的菌落；
e) 培养及保存：将平板上纯化完成的真菌挑取至装有PDA的斜面固体培养基试管中，然后于28℃恒温培养5d后，加入甘油后，塞上硅胶塞，封口膜封口，于-80℃超低温冰箱中保存。
镰刀菌属尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株的发酵培养方法，其特征在于将菌种接种到50ml PDA液体培养基中，于28℃恒温摇床150r/min活化培养，24h后取1ml活化的菌种至装有PDA液体培养基的三角瓶中进行发酵，装液量100ml/ 250ml，28℃、150r/min摇床培养7d；经过以上发酵培养后，收集发酵液。
PDA培养基由土豆300g、蔗糖18g组成。
一种含有多种重楼皂苷的浸膏，其特征是以镰刀菌属尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株的发酵液为原料，用正丁醇萃取三次，挥干正丁醇后得到。
含有多种重楼皂苷的浸膏在制备治疗/预防止血类药物中的应用。
药物的剂型为口服剂型或静脉注射剂。
药物的剂型为片剂、硬胶囊、软胶囊、散剂、丸剂、颗粒剂。
一种药物组合物，含有多种重楼皂苷的浸膏作为活性成分或者是药用载体。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例及试验数据，对本发明作进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不是对本发明技术方案的限定。
实施例1
菌株的分离、培养：
将采集的新鲜重楼块茎洗净后，除去表面坏死的硬物部分，用75％的乙醇进行表面消毒20min，然后用无菌水清洗3～5次，放入事先灭菌备用的研钵中，加5mL无菌水研磨成白色悬浊液。用移液器取300μL悬浊液于各个PDA培养基平板中，用无菌涂棒涂匀，于28℃恒温培养箱中培养5～9d，及时观察，用接种针接种不同的真菌于PDA固体培养基平板上，反复纯化，直至得到单一的菌落。并于第3、5、7、9d分别拍照记录，若真菌长满平板则不再进行分离，并灭菌处理。
同时将表面消毒的块茎洗净，然后横切成1cm2的薄片小块，先用75％的酒精浸泡3～5min，再用无菌水清洗2～3遍，洗去残余的酒精，最后用无菌水浸泡大约5分钟，取出后用灭菌的滤纸吸干表面水分。将处理后的小块贴至PDA固体平板上，每个平板上放5片，于28℃恒温培养箱中培养5～9d，及时观察，用接种针接种不同的真菌于PDA固体培养基平板上，反复纯化，直至得到单一的菌落。并于第3、5、7、9d分别拍照记录，若真菌长满平板则不再进行分离，并灭菌处理。
将平板上纯化完成的真菌挑取至装有PDA的斜面固体培养基试管中，然后于28℃恒温培养5d后，加入甘油后，封口膜封口，于-80℃超低温冰箱中保存，每个菌株至少保存3份。
图1为尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株的菌落正面。
图2为尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株的菌落背面。
实施例2
菌株的发酵培养：
将保存的菌种接种到50ml PDA液体培养基中，于28℃恒温摇床150r/min活化培养，24h后取1ml活化的菌种至装有PDA液体培养基的三角瓶中进行发酵，装液量100ml/ 250ml，28℃、150r/min摇床培养7d。经过以上发酵培养后，收集发酵液。
实施例3
菌株的筛选：
各菌株发酵液样品用正丁醇萃取三次，每次100ml，挥干正丁醇后用甲醇溶解得到代谢产物，利用硅胶薄层色谱检测代谢产物中重楼皂苷I、II、VI、VII。使用的展开剂为（氯仿-甲醇-水）***，显色剂为磷钼酸，筛选得到能够产甾体皂苷类的真菌。
图3为尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株代谢产物的薄层色谱图。从图3中可以看到，发酵液（左二）和用甲醇提取重楼标准药材中重楼皂苷的化合物(右一)有很多蓝色斑点的位移是一致的，推测此菌株代谢产物中有多种重楼皂苷，为验证是否确实是重楼皂苷需进行液质联用色谱法鉴定。
实施例4
将实施例3得到的能够产甾体皂苷的真菌代谢产物，用液质联用色谱法进行检测，将其谱图、数据与标准品数据进行比对，大致确定样品中是否含有相应重楼皂苷。
将重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ标准品混合进行液质联用色谱分析。图4为液质联用色谱的总离子图，图5和图6分别为重楼皂苷Ⅰ标准品的一级质谱图和二级质谱图，图7和图8分别为重楼皂苷Ⅱ标准品的一级质谱图和二级质谱图，图9和图10分别为重楼皂苷Ⅵ标准品的一级质谱图和二级质谱图，图11和图12分别为重楼皂苷Ⅶ标准品的一级质谱图和二级质谱图。
将实施例3得到的尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株代谢产物进行液质联用色谱分析，图13和图14分别为重楼皂苷Ⅰ质谱图和离子图，图15和图16分别为重楼皂苷Ⅱ质谱图和离子图，图17和图18分别为重楼皂苷Ⅵ质谱图和离子图，图19和图20分别为重楼皂苷Ⅶ质谱图和离子图。
从图3-图20来看，尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株代谢产物中含有重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ。
将保存的尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株按照实施例2和实施例3的方法进行发酵培养和后处理，得到另外7份尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株代谢产物样品，分别进行液质联用色谱分析，结果显示样品中均含有重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ。
实施例5
对该菌株进行分子鉴定。上游引物：ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3’)，下游引物：ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’) 。测序结果在GenBank核酸数据库中进行Blast相似性分析，经Blast序列比对及进化树分析， DCLZJ-4菌株与尖孢镰刀菌的同源性为99.0％，确定其为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。
实施例6
发酵条件的优化：微生物的发酵培养基组分必须能够满足菌株快速生长繁殖的需要，同时最适的发酵培养条件又能够保证其次生代谢物的大量积累。本发明通过单因素及正交试验实验对DCLZJ-4菌株的发酵培养基成分进行了优化，优化后的最适培养基配方为：确定了培养基组分及对应浓度之后，再进一步对该菌株代谢产生重楼皂苷的最适初始pH值、培养温度及摇床转速进行了优化，最终确定DCLZJ-4菌株的最适培养基是：土豆300g，蔗糖18g。最优培养条件为：pH值7.0，培养温度28℃，摇床转速150r/min。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南中医学院
<120> 一株产重楼皂苷的尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株及其用途
<130> 2018
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 548
<212> DNA
<213> 菌株的ITS rDNA序列
<400> 1
ttttcctccg cttattgata tgcttaagtt cagcgggtat tcctacctga tccgaggtca 60
acattcagaa gttggggttt aacggcgtgg ccgcgacgat taccagtaac gagggtttta 120
ctactacgct atggaagctc gacgtgaccg ccaatcaatt tgaggaacgc gaattaacgc 180
gagtcccaac accaagctgt gcttgagggt tgaaatgacg ctcgaacagg catgcccgcc 240
agaatactgg cgggcgcaat gtgcgttcaa agattcgatg attcactgaa ttctgcaatt 300
cacattactt atcgcatttt gctgcgttct tcatcgatgc cagaaccaag agatccgttg 360
ttgaaagttt tgatttattt atggttttac tcagaagtta catatagaaa cagagtttag 420
gggtcctctg gcgggccgtc ccgttttacc gggagcgggc tgatccgccg aggcaacaag 480
tggtatgttc acaggggttt gggagttgta aactcggtaa tgatccctcc gcaggttcac 540
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<211> 20
<212> DNA
<213> ITS4
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Claims (9)

1.一种镰刀菌属尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株，其保藏编号为CGMCC No.14791。
2.一种如权利要求1所述的镰刀菌属尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株的制备方法，其 特征在于包括清洗消毒、接种、分离、培养及保存，具体步骤为：
a) 清洗消毒：将采集的新鲜重楼块茎洗净后，除去表面坏死的硬物部分，用75％的乙醇进行表面消毒20min，然后用无菌水清洗3～5次；
b)接种：将步骤a)处理的重楼块茎放入事先灭菌备用的研钵中，加5mL无菌水研磨成白色悬浊液；用移液器取300μL悬浊液于各个PDA固体培养基平板中，用无菌涂棒涂匀；并于第3、5、7、9d分别拍照记录，若真菌长满平板则不再进行分离，并灭菌处理；
c)接种：将步骤a)处理的重楼块茎横切成1cm2的薄片小块，先用75％的酒精浸泡3～5min，再用无菌水清洗2～3遍，洗去残余的酒精，最后用无菌水浸泡大约5分钟，取出后用灭菌的滤纸吸干表面水分；将处理后的小块贴至PDA固体培养基平板上，每个平板上放5片；并于第3、5、7、9d分别拍照记录，若真菌长满平板则不再进行分离，并灭菌处理；
d)分离：将步骤b) 或步骤c)得到的PDA培养基平板于28℃恒温培养箱中培养5～9d，及时观察，用接种针接种不同的真菌于PDA固体培养基平板上，反复纯化，直至得到单一的菌落；
e)培养及保存：将平板上纯化完成的真菌挑取至装有PDA的固体斜面培养基试管中，然后于28℃恒温培养5d后，加入甘油后，塞上硅胶塞，封口膜封口，于-80℃超低温冰箱中保存。
3.一种如权利要求1所述的镰刀菌属尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株的发酵培养方法，其特征在于将菌种接种到50ml PDA液体培养基中，于28℃恒温摇床150r/min活化培养，24h后取1ml活化的菌种至装有PDA液体培养基的三角瓶中进行发酵，装液量100ml/ 250ml，28℃、150r/min摇床培养7d；经过以上发酵培养后，收集发酵液。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述的PDA培养基每1000ml培养基由土豆300g、蔗糖18g加水组成。
5.一种含有多种重楼皂苷的浸膏，其特征是以权利要求1所述的镰刀菌属尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株的发酵液为原料，用正丁醇萃取三次，挥干正丁醇后得到。
6.一种如权利要求5所述的浸膏在制备治疗/预防止血类药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的药物的剂型为口服剂型或静脉注射剂。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的药物的剂型为片剂、硬胶囊、软胶囊、散剂、丸剂、颗粒剂。
9.一种药物组合物，其特征是包含权利要求5~8任一所述的浸膏作为活性成分或者是药用载体。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110016519A (zh) * 2019-04-30 2019-07-16 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 一种香蕉枯萎菌4号生理小种dcl基因缺失突变体及其小rna
CN113832039A (zh) * 2021-09-27 2021-12-24 黑龙江省农业科学院经济作物研究所 一株具有抗真菌活性的工业***内生真菌及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107723245A (zh) * 2017-10-18 2018-02-23 湖北文理学院 一种襄麦冬内生镰刀菌属真菌及在制备甾体皂苷中的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107723245A (zh) * 2017-10-18 2018-02-23 湖北文理学院 一种襄麦冬内生镰刀菌属真菌及在制备甾体皂苷中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TAO LIU等: "Levels of rhizome endophytic fungi fluctuate in Paris polyphylla var.yunnanensis as plants age", 《PLANT DIVERSITY》 *
魏超: "产皂苷的重楼内生真菌的分离、鉴定及退化研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110016519A (zh) * 2019-04-30 2019-07-16 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 一种香蕉枯萎菌4号生理小种dcl基因缺失突变体及其小rna
CN113832039A (zh) * 2021-09-27 2021-12-24 黑龙江省农业科学院经济作物研究所 一株具有抗真菌活性的工业***内生真菌及其应用
CN113832039B (zh) * 2021-09-27 2023-08-01 黑龙江省农业科学院经济作物研究所 一株具有抗真菌活性的工业***内生真菌及其应用

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