CN109232748A - 多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽及其合成方法和应用 - Google Patents

多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽及其合成方法和应用 Download PDF

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Abstract

多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8‑13)相偶联的环化杂合肽及其合成方法和应用，涉及一种环化杂合肽及其合成方法和应用。是要解决现有阿片类药物的抗酶解能力较差，抗神经性疼痛效果不佳的问题。该杂合肽为杂合肽1、杂合肽2、杂合肽3或杂合肽4。方法：一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理；二、脱除“Fmoc”保护基团；三、氨基酸缩合反应；四、肽链的延长；五、二硫键的形成；六、肽链从树脂上的切割；七、粗肽的脱盐与纯化。本发明通过多位点非天然氨基酸替换以及环化修饰也能够增强杂合肽的生物稳定性，并具有抗神经性疼痛的作用。本发明的杂合肽用于制备抗神经性疼痛药物。

Description

多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合 肽及其合成方法和应用
技术领域
本发明涉及一种环化杂合肽及其合成方法和应用。
背景技术
几个世纪以来，阿片及其提取物一直用于镇痛治疗。从阿片中分离出的***就是现在临床应用最广泛的镇痛药物之一。然而***等药物在安全临床使用的缺陷也很多，如抑制呼吸、引起血压降低和心搏徐缓、便秘、易引起精神依赖、成瘾和镇痛耐受等。此外，***对慢性疼痛如神经病理性疼痛的治疗效果不佳。众所周知，阿片肽在痛觉信息的传递和调制过程中起着重要作用。早在1974年，学者们就从猪脑中提取到了两个具有***样阿片活性的五肽，即甲硫氨酸脑啡肽(Met-enkephalin)和亮氨酸脑啡肽(Leu-enkephalin)，两者统称为脑啡肽(enkephalins)。它们对δ-阿片受体具有较高的亲和性和选择性，被认为是δ-阿片受体的内源性配体。两种脑啡肽通过与其受体结合降低神经细胞内cAMP水平和钙离子的传导，抑制痛觉调节***的神经传递，进而发挥镇痛作用。在生理浓度下，甲硫氨酸脑啡肽和亮氨酸脑啡肽均不易对机体产生精神依赖性，且药物耐受形成较慢。然而脑啡肽的镇痛活性相对较弱，明显低于μ-阿片受体激动剂如***等介导的镇痛效果。此外，脑啡肽的生物稳定性较差，镇痛持续时间较短，血脑屏障通透率较低，从而限制了其作为临床镇痛药物的发展。
1973年美国生理学家从牛下丘脑中发现了由13个氨基酸组成的活性神经肽，即神经降压素(neurotensin，NT)。在中枢神经***内，神经降压素作为神经递质或调质而发挥作用,其效应包括降温、镇痛、调节多巴胺能传递和刺激垂体前叶激素释放。神经降压素在抑制痛觉传递过程中与阿片肽有着重要的关系。神经降压素神经末梢及神经降压素受体在中枢神经***内广泛分布于与镇痛有关的区域，而且与内源性阿片肽神经末梢及阿片受体分布相伴行。有研究表明，中枢注射神经降压素产生的镇痛效应与激活阿片***，引起内源性阿片肽的释放有关。此外，已经证实神经降压素的第8-13位氨基酸“Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu”是神经降压素的活性最小片段，其氨基酸序列中有两个带正电的精氨酸。精氨酸的胍基基团能够与细胞表面的阴离子基团形成二价的氢键，增强多肽对生物膜的通透性，如血脑屏障。
发明内容
本发明是要解决现有阿片类药物的抗酶解能力较差，抗神经性疼痛效果不佳的问题，提供多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽及其合成方法和应用。
本发明多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽为杂合肽1、杂合肽2、杂合肽3或杂合肽4；
其中杂合肽1的氨基酸序列为：
Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；
杂合肽2的氨基酸序列为：
Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；
杂合肽3的氨基酸序列为：
Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)-D-Ala-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；
杂合肽4的氨基酸序列为：
Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)-D-Ala-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu。
其中序列“Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)”和“Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)”分别为多位点修饰的环化的甲硫氨酸脑啡肽和亮氨酸脑啡肽的残基序列，“Gly”和“D-Ala”为杂合肽的中间连接子，“NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu”为多位点修饰的神经降压素(8-13)的残基序列。(Dmt代表2,6-二甲基Tyr，NMePhe代表N-甲基Phe，NMeArg代表N-甲基Arg，Tle代表tert-Leu)
上述多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽的合成方法，包括以下步骤：
一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：检查固相合成仪的气密性，将带有一个氨基酸残基的Fmoc-Leu-Wang树脂放入合成仪，加二氯甲烷搅拌30～40min，使树脂充分浸泡溶胀后，减压抽滤溶剂；其中带有一个氨基酸残基的Fmoc-Leu-Wang树脂的质量与二氯甲烷的体积比为1g：(7～12)mL；
二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3～5min，抽干，重复3～5次，然后在树脂中加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5～10min后抽干，重复2～3次，再加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15～20min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂，最后用DMF洗涤除净脱保护溶液，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂；其中树脂的质量与第一次加入的脱保护溶液的体积比为1g：(8～12)mL；树脂的质量与第二次加入的脱保护溶液的体积比为1g：(10～14)mL；
三、氨基酸缩合反应：依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于DMF中，再加入二异丙基乙胺后混匀得混合溶液，然后将混合溶液加入到步骤二脱除“Fmoc”保护基团的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60～72min；
通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体；
四、肽链的延长：重复步骤二和三，按照杂合肽氨基酸序列的顺序，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂；其中杂合肽1的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；杂合肽2的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；杂合肽3的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)-D-Ala-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；杂合肽4的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)-D-Ala-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；
五、二硫键的形成：称取I2溶于无水甲醇和DMF混合液中，配成I2溶液，并将I2溶液加入到肽树脂中，通入氩气保护，避光搅拌反应3～5小时成环，抽干反应液；其中混合溶液中无水甲醇和DMF的体积比为4：1，I2的质量与混合溶液的体积比为2.6g：100mL，I2溶液与肽树脂的体积比为100mL：1g；
六、肽链从树脂上的切割：将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除，然后用二氯甲烷和甲醇交替洗涤肽树脂，充分抽干溶剂后，向肽树脂中加入切割试剂，于室温下切割反应3～5h；
收集切割试剂并减压旋干，用冰冷***析出沉淀，静置后去除***上清，再用水及乙酸充分溶解沉淀，倒入分液漏斗，并加入乙酸乙酯萃取，收集水相，经冷冻干燥，得白色的固体粉末粗肽；
七、粗肽的脱盐与纯化：以体积浓度10％-20％的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的多肽化合物，再通过反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的固体粉末纯肽。
步骤三中“Fmoc”基团保护的氨基酸的摩尔量为Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔量的2.5-3倍。
步骤三中N-羟基苯并三氮唑的摩尔量为Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔量的2.5-3倍。
步骤三中O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的2.5-3倍。
步骤三中二异丙基乙胺的摩尔量为Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔量的5-6倍。
步骤六中每克肽树脂加入10-25mL的切割试剂。
步骤六中所述切割试剂由三氟乙酸、二异丙基硅烷和水按照体积比95：2.5：2.5混合而成。
步骤六中将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除的具体方法为：
将肽树脂用DMF洗涤3～5min，抽干，重复3～5次，然后在树脂中加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5～10min后抽干，重复2～3次，再加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15～20min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂，最后用DMF洗涤除净脱保护溶液，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂。
上述多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽在制备多肽镇痛药物中的应用。
上述多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽在制备抗神经性疼痛药物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽，是将甲硫氨酸/亮氨酸脑啡肽的氨基酸序列“Tyr-Gly-Gly-Phe-Met/Leu”通过多位点修饰与环化得到“Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)”和“Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)”氨基酸残基序列，将神经降压素(8-13)的氨基酸序列“Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu”通过多位点修饰得到“NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu”氨基酸残基序列，利用中间连接子“Gly”或“D-Ala”将两部分氨基酸残基序列相偶联，构建一种新型高效的杂合肽。
其中多位点修饰是将甲硫氨酸/亮氨酸脑啡肽的氨基酸序列“Tyr-Gly-Gly-Phe-Met/Leu”的1位Tyr用Dmt替代，3位Gly用Cys替代，4位Phe用NMePhe替代，以及6位增加Cys。然后进行环化，具体是将3位和6位Cys通过二硫键环化。
通过多位点非天然氨基酸替换能够增强多肽的抗酶解能力，而且环化修饰也能提高多肽药物的生物稳定性，各种水解酶类不易分解环化多肽的肽键，进一步增强多肽的抗酶解能力，进而增强药物向中枢***的运输能力，提高药物的利用率和效能。
多肽只要通过位点非天然氨基酸修饰，那么各种水解酶类就不易识别非天然氨基酸，不易降解多肽，进而增强多肽的抗酶解能力。多位点修饰，多肽的抗酶解能力就更强。多位点修饰和环化协同作用，显著增强了多肽的酶解稳定性。实验表明，杂合肽1、2、3和4的小鼠脑质膜半衰期分别达到297.1±22.0min、302.6±28.7min、447.1±28.2min、412.0±31.4min，杂合肽1、2、3和4的血清半衰期分别达到267.0±20.1min、258.5±21.4min、339.7±21.7min、311.2±31.9min。
将杂合肽的甲硫氨酸/亮氨酸脑啡肽与神经降压素(8-13)的修饰序列中间加入小分子氨基酸连接子“Gly”或“D-Ala”，可以提高杂合肽的柔性构象，保留甲硫氨酸/亮氨酸脑啡肽与神经降压素(8-13)两部分修饰序列的生物活性。连接子“D-Ala”因为引入了D型氨基酸，会增加杂合肽的抗酶解能力。而且，通过多位点非天然氨基酸替换以及环化修饰也能够增强杂合肽的生物稳定性。神经降压素(8-13)是神经降压素的最小活性片段，杂合肽的神经降压素(8-13)部分能够通过激活阿片受体***，引起内源性的阿片肽释放，参与镇痛作用的发挥，进而与杂合肽的脑啡肽部分产生高效的镇痛活性。而且，该杂合肽具有两个带正电的氨基酸，能够与细胞表面的阴离子基团形成二价的氢键，增强杂合肽对血脑屏障的穿透能力，进而提高药物的中枢利用率。此外，杂合肽中的神经降压素(8-13)部分能够降低阿片类药物的镇痛耐受和心血管等不良副作用。
此外，本发明的杂合肽3和4还对神经病理学疼痛具有高效的镇痛活性。实验表明，杂合肽3和4的最大镇痛效果均在注射药物10min后产生，且镇痛持续时间较长，可持续至少40min。
本发明的杂合肽1-4具有较高的酶解稳定性。通过中枢给药，杂合肽1-4在热甩尾实验中都具有高效的镇痛活性。而且，杂合肽3和4具有外周给药的高效镇痛效果，及显著的抗神经性疼痛活性。此外，杂合肽3和4的药物镇痛耐受副作用显著降低，尤其杂合肽3具有无镇痛耐受特性，且其对心血管***的副作用也明显降低。
因此，本发明的杂合肽在制备高效、低镇痛耐受和心血管副作用的多肽镇痛药物方面具有潜在的应用价值和科学意义。
附图说明
图1为侧脑室注射杂合肽1的镇痛效应-时间曲线；其中■表示杂合肽1、10nmol，●表示杂合肽1、3nmol，▲表示杂合肽1、1nmol，▼表示杂合肽1、0.3nmol，◆表示生理盐水；
图2为侧脑室注射杂合肽2的镇痛效应-时间曲线；其中■表示杂合肽2、10nmol，●表示杂合肽2、3nmol，▲表示杂合肽2、1nmol，▼表示杂合肽2、0.3nmol，◆表示生理盐水；
图3为侧脑室注射杂合肽3的镇痛效应-时间曲线；其中■表示杂合肽3、10nmol，●表示杂合肽3、3nmol，▲表示杂合肽3、1nmol，▼表示杂合肽3、0.3nmol，◆表示生理盐水；
图4为侧脑室注射杂合肽4的镇痛效应-时间曲线；其中■表示杂合肽4、10nmol，●表示杂合肽4、3nmol，▲表示杂合肽4、1nmol，▼表示杂合肽4、0.3nmol，◆表示生理盐水；
图5为皮下注射杂合肽3和4的外周镇痛效果；其中■表示杂合肽3(10μmol/kg，皮下)，●表示杂合肽4(10μmol/kg，皮下)，▲表示生理盐水(皮下)；
图6为侧脑室注射***的镇痛耐受剂量曲线；其中■表示生理盐水+***，●表示***(10nmol)+***；
图7为侧脑室注射杂合肽3的镇痛耐受剂量曲线；其中■表示生理盐水+杂合肽3，●表示杂合肽3(10nmol)+杂合肽3；
图8为侧脑室注射杂合肽4的镇痛耐受剂量曲线；其中■表示生理盐水+杂合肽4，●表示杂合肽4(10nmol)+杂合肽4；
图9为侧脑室注射杂合肽3的抗神经性疼痛活性；其中■表示杂合肽3、10nmol，●表示杂合肽3、3nmol，▲表示杂合肽3、1nmol，▼表示生理盐水；
图10为侧脑室注射杂合肽4的抗神经性疼痛活性；其中■表示杂合肽4、10nmol，●表示杂合肽4、3nmol，▲表示杂合肽4、1nmol，▼表示生理盐水；
图11为静脉注射***及杂合肽3和4对大鼠***动脉压的作用；
图12为静脉注射***及杂合肽3和4对大鼠心率的作用。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽为杂合肽1、杂合肽2、杂合肽3或杂合肽4；
其中杂合肽1的氨基酸序列为：
Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；
杂合肽2的氨基酸序列为：
Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；
杂合肽3的氨基酸序列为：
Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)-D-Ala-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；
杂合肽4的氨基酸序列为：
Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)-D-Ala-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu。
本实施方式是将甲硫氨酸/亮氨酸脑啡肽的氨基酸序列“Tyr-Gly-Gly-Phe-Met/Leu”通过多位点修饰与环化得到“Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)”和“Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)”氨基酸残基序列，将神经降压素(8-13)的氨基酸序列“Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu”通过多位点修饰得到“NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu”氨基酸残基序列，利用中间连接子“Gly”或“D-Ala”将两部分氨基酸残基序列相偶联，构建一种高效的杂合肽。
通过多位点非天然氨基酸替换能够增强多肽的抗酶解能力，而且环化修饰也能提高多肽药物的生物稳定性，各种水解酶类不易分解环化多肽的肽键，进一步增强多肽的抗酶解能力，进而增强药物向中枢***的运输能力，提高药物的利用率和效能。
具体实施方式二：本实施方式多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽的合成方法，包括以下步骤：
一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：检查固相合成仪的气密性，将带有一个氨基酸残基的Fmoc-Leu-Wang树脂放入合成仪，加二氯甲烷搅拌30～40min，使树脂充分浸泡溶胀后，减压抽滤溶剂；其中带有一个氨基酸残基的Fmoc-Leu-Wang树脂的质量与二氯甲烷的体积比为1g：(7～12)mL；
二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3～5min，抽干，重复3～5次，然后在树脂中加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5～10min后抽干，重复2～3次，再加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15～20min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂，最后用DMF洗涤除净脱保护溶液，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂；其中树脂的质量与第一次加入的脱保护溶液的体积比为1g：(8～12)mL；树脂的质量与第二次加入的脱保护溶液的体积比为1g：(10～14)mL；
三、氨基酸缩合反应：依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于DMF中，再加入二异丙基乙胺后混匀得混合溶液，然后将混合溶液加入到步骤二脱除“Fmoc”保护基团的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60～72min；
通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体；
四、肽链的延长：重复步骤二和三，按照杂合肽氨基酸序列的顺序，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂；其中杂合肽1的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；杂合肽2的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；杂合肽3的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)-D-Ala-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；杂合肽4的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)-D-Ala-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；
五、二硫键的形成：称取I2溶于无水甲醇和DMF混合液中，配成I2溶液，并将I2溶液加入到肽树脂中，通入氩气保护，避光搅拌反应3～5小时成环，抽干反应液；其中混合溶液中无水甲醇和DMF的体积比为4：1，I2的质量与混合溶液的体积比为2.6g：100mL，I2溶液与肽树脂的体积比为100mL：1g；
六、肽链从树脂上的切割：将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除，然后用二氯甲烷和甲醇交替洗涤肽树脂，充分抽干溶剂后，向肽树脂中加入切割试剂，于室温下切割反应3～5h；
收集切割试剂并减压旋干，用冰冷***析出沉淀，静置后去除***上清，再用水及乙酸充分溶解沉淀，倒入分液漏斗，并加入乙酸乙酯萃取，收集水相，经冷冻干燥，得白色的固体粉末粗肽；
七、粗肽的脱盐与纯化：以体积浓度10％-20％的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的多肽化合物，再通过反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的固体粉末纯肽。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：步骤三中“Fmoc”基团保护的氨基酸的摩尔量为Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔量的2.5-3倍。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：步骤三中N-羟基苯并三氮唑的摩尔量为Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔量的2.5-3倍。其它与具体实施方式二或三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是：步骤三中O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的2.5-3倍。其它与具体实施方式二至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是：步骤三中二异丙基乙胺的摩尔量为Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔量的5-6倍。其它与具体实施方式二至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二至六之一不同的是：步骤六中每克肽树脂加入10-25mL的切割试剂。其它与具体实施方式二至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式七不同的是：步骤六中所述切割试剂由三氟乙酸、二异丙基硅烷和水按照体积比95：2.5：2.5混合而成。其它与具体实施方式七相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式二至八之一不同的是：步骤六中将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除的具体方法为：
将肽树脂用DMF洗涤3～5min，抽干，重复3～5次，然后在树脂中加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5～10min后抽干，重复2～3次，再加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15～20min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂，最后用DMF洗涤除净脱保护溶液，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂。其它与具体实施方式二至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽在制备多肽镇痛药物中的应用。
具体实施方式十一：本实施方式多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽在制备抗神经性疼痛药物中的应用。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
本实施例多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽1的合成方法，包括以下步骤：
一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：检查固相合成仪的气密性，将1g带有一个氨基酸残基的Fmoc-Leu-Wang树脂放入合成仪，加10mL二氯甲烷搅拌30min，使树脂充分浸泡溶胀后，减压抽滤溶剂。
二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3min，抽干，重复3次。在树脂中加入10mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次，再加入12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂，最后用10mL DMF洗涤除净脱保护试剂，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂。
三、氨基酸缩合反应：依次将相当于Fmoc-Leu-Wang树脂2.5-3倍摩尔量的“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于10mL DMF中，再加入相当于Fmoc-Leu-Wang树脂5-6倍摩尔量的二异丙基乙胺后混匀得混合溶液，然后将混合溶液加入到所述脱除保护的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60min。通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体。
四、肽链的延长：重复步骤二和三，按照杂合肽1氨基酸序列的顺序Dmt-Gly-Cys-NMePhe-Met-Cys-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂。
五、二硫键的形成：称取2.6g的I2溶于80mL无水甲醇和20mL的DMF混合液中，配成0.1mol/L的I2溶液，并将其加入到肽树脂中，通入氩气保护，避光搅拌反应3～5小时成环，抽干反应液。
六、肽链从树脂上的切割：按照步骤二的方法将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除。用二氯甲烷、甲醇交替洗涤树脂，充分抽干溶剂后，按每克肽树脂加入18mL的切割试剂，切割试剂由三氟乙酸、二异丙基硅烷、水以95：2.5：2.5的体积比混合而成，于室温下切割反应3h。收集切割试剂并减压旋干，用冰冷***析出沉淀，静置片刻后去除***上清，再用水及少量乙酸充分溶解沉淀，倒入分液漏斗，并加入乙酸乙酯萃取，收集水相，经冷冻干燥，得白色的固体粉末粗肽。
七、粗肽的脱盐与纯化：以体积浓度16％的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的多肽化合物。再通过反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的固体终产物杂合肽1。
实施例2：
本实施例多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽1的合成方法，包括以下步骤：
一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：检查固相合成仪的气密性，将1g带有一个氨基酸残基的Fmoc-Leu-Wang树脂放入合成仪，加10mL二氯甲烷搅拌30min，使树脂充分浸泡溶胀后，减压抽滤溶剂。
二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3min，抽干，重复3次。在树脂中加入10mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次，再加入12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂，最后用10mL DMF洗涤除净脱保护试剂，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂。
三、氨基酸缩合反应：依次将相当于Fmoc-Leu-Wang树脂2.5-3倍摩尔量的“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于10mL DMF中，再加入相当于Fmoc-Leu-Wang树脂5-6倍摩尔量的二异丙基乙胺后混匀得混合溶液，然后将混合溶液加入到所述脱除保护的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60min。通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体。
四、肽链的延长：重复步骤二和三，按照杂合肽1氨基酸序列的顺序Dmt-Gly-Cys-NMePhe-Leu-Cys-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂。
五、二硫键的形成：称取2.6g的I2溶于80mL无水甲醇和20mL的DMF混合液中，配成0.1mol/L的I2溶液，并将其加入到肽树脂中，通入氩气保护，避光搅拌反应3～5小时成环，抽干反应液。
六、肽链从树脂上的切割：按照步骤二的方法将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除。用二氯甲烷、甲醇交替洗涤树脂，充分抽干溶剂后，按每克肽树脂加入18mL的切割试剂，切割试剂由三氟乙酸、二异丙基硅烷、水以95：2.5：2.5的体积比混合而成，于室温下切割反应3h。收集切割试剂并减压旋干，用冰冷***析出沉淀，静置片刻后去除***上清，再用水及少量乙酸充分溶解沉淀，倒入分液漏斗，并加入乙酸乙酯萃取，收集水相，经冷冻干燥，得白色的固体粉末粗肽。
七、粗肽的脱盐与纯化：以体积浓度16％的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的多肽化合物。再通过反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的固体终产物杂合肽2。
实施例3：
本实施例多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽1的合成方法，包括以下步骤：
一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：检查固相合成仪的气密性，将1g带有一个氨基酸残基的Fmoc-Leu-Wang树脂放入合成仪，加10mL二氯甲烷搅拌30min，使树脂充分浸泡溶胀后，减压抽滤溶剂。
二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3min，抽干，重复3次。在树脂中加入10mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次，再加入12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂，最后用10mL DMF洗涤除净脱保护试剂，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂。
三、氨基酸缩合反应：依次将相当于Fmoc-Leu-Wang树脂2.5-3倍摩尔量的“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于10mL DMF中，再加入相当于Fmoc-Leu-Wang树脂5-6倍摩尔量的二异丙基乙胺后混匀得混合溶液，然后将混合溶液加入到所述脱除保护的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60min。通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体。
四、肽链的延长：重复步骤二和三，按照杂合肽1氨基酸序列的顺序Dmt-Gly-Cys-NMePhe-Met-Cys-D-Ala-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂。
五、二硫键的形成：称取2.6g的I2溶于80mL无水甲醇和20mL的DMF混合液中，配成0.1mol/L的I2溶液，并将其加入到肽树脂中，通入氩气保护，避光搅拌反应3～5小时成环，抽干反应液。
六、肽链从树脂上的切割：按照步骤二的方法将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除。用二氯甲烷、甲醇交替洗涤树脂，充分抽干溶剂后，按每克肽树脂加入18mL的切割试剂，切割试剂由三氟乙酸、二异丙基硅烷、水以95：2.5：2.5的体积比混合而成，于室温下切割反应3h。收集切割试剂并减压旋干，用冰冷***析出沉淀，静置片刻后去除***上清，再用水及少量乙酸充分溶解沉淀，倒入分液漏斗，并加入乙酸乙酯萃取，收集水相，经冷冻干燥，得白色的固体粉末粗肽。
七、粗肽的脱盐与纯化：以体积浓度16％的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的多肽化合物。再通过反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的固体终产物杂合肽3。
实施例4：
本实施例多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽1的合成方法，包括以下步骤：
一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：检查固相合成仪的气密性，将1g带有一个氨基酸残基的Fmoc-Leu-Wang树脂放入合成仪，加10mL二氯甲烷搅拌30min，使树脂充分浸泡溶胀后，减压抽滤溶剂。
二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3min，抽干，重复3次。在树脂中加入10mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次，再加入12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂，最后用10mL DMF洗涤除净脱保护试剂，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂。
三、氨基酸缩合反应：依次将相当于Fmoc-Leu-Wang树脂2.5-3倍摩尔量的“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于10mL DMF中，再加入相当于Fmoc-Leu-Wang树脂5-6倍摩尔量的二异丙基乙胺后混匀得混合溶液，然后将混合溶液加入到所述脱除保护的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60min。通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体。
四、肽链的延长：重复步骤二和三，按照杂合肽1氨基酸序列的顺序Dmt-Gly-Cys-NMePhe-Leu-Cys-D-Ala-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂。
五、二硫键的形成：称取2.6g的I2溶于85mL无水甲醇和10mL的DMF混合液中，配成0.1mol/L的I2溶液，并将其加入到肽树脂中，通入氩气保护，避光搅拌反应3～5小时成环，抽干反应液。
六、肽链从树脂上的切割：按照步骤二的方法将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除。用二氯甲烷、甲醇交替洗涤树脂，充分抽干溶剂后，按每克肽树脂加入18mL的切割试剂，切割试剂由三氟乙酸、二异丙基硅烷、水以95：2.5：2.5的体积比混合而成，于室温下切割反应3h。收集切割试剂并减压旋干，用冰冷***析出沉淀，静置片刻后去除***上清，再用水及少量乙酸充分溶解沉淀，倒入分液漏斗，并加入乙酸乙酯萃取，收集水相，经冷冻干燥，得白色的固体粉末粗肽。
七、粗肽的脱盐与纯化：以体积浓度16％的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的多肽化合物。再通过反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的固体终产物杂合肽4。
以上实施例制备的杂合肽的最终产率均达到25％以上，质谱和色谱分析检测结果如表1所示。
表1.杂合肽1-4的质谱和色谱分析检测结果
表1的结果表明，本发明得到的杂合肽1-4的检测值与理论值相符。
本实施例1-4制备的多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽的生物活性实验如下：
1、离体酶解稳定性实验
制备100％小鼠血清和15％脑质膜样品，取10μL多肽母液(10-2M)，加入到190μL的100％小鼠血清或15％脑质膜中，立即振荡混匀，然后迅速取出20μL混合液，加入离心管中计时为0min，余者于37℃下继续孵育，并分别在5min，10min，15min，30min，60min，120min，240min取出20μL。酶解过程的终止：于取出的样品中加入90μL乙腈振荡混匀，样品置于冰上放置5min，再用90μL 0.5％的冰冷乙酸稀释以确保酶解过程停止。13,000g离心15min，收集上清，-80℃冻存，直至RP-HPLC分析。
实验结果见表2。表2的结果显示，杂合肽1的小鼠脑质膜半衰期长于血清半衰期，杂合肽2的小鼠脑质膜和血清半衰期与杂合肽1相当。而杂合肽3和4的脑质膜和血清半衰期都显著长于杂合肽1和2，表明空间连接子“D-Ala”因为引入了D型氨基酸，增强了杂合肽的抗酶解能力。其中，杂合肽3在两种样品中的半衰期最长，即酶解稳定性最高。该结果表明通过多位点非天然氨基酸修饰，空间连接子“D-Ala”的引入以及多肽环化，能够显著提高杂合肽3和4的酶解稳定性。
表2.杂合肽1-4的脑质膜和血清半衰期
2、热甩尾镇痛实验
实验采用昆明系雄性小鼠，18-22g，环境温度：20℃，水浴温度：50±0.5℃。给药前先测定小鼠的基础痛阈(control latency，CL)，将小鼠鼠尾的1/3-1/2浸入水浴，记录鼠尾从刚浸入水浴至发生收缩的时间。过于敏感(<3s)或迟钝的(>5s)小鼠弃去不用，截止时间10s，以防止小鼠烫伤。侧脑室给药后第5,10,15,20,25,30,40and 50min各测一次甩尾潜伏期(test latency，TL)，皮下给药后第5,10,15,20,25,30,45,60and 90min各测一次TL，0.9％生理盐水作为空白对照。结果以最大可能效应百分比(maximum possible effect，％MPE)表示：％MPE＝100×(TL-CL)/(10-CL)。
中枢给药的小鼠热甩尾镇痛实验结果如图1、2、3和4所示，侧脑室注射0.3-10nmol剂量的杂合肽1-4均具有显著的镇痛活性，并且呈浓度依赖型，最大镇痛效果在注射药物10min后产生。其中，中枢注射10nmol高剂量的杂合肽3和4，其最大镇痛％MPE值分别为92.46％和87.91％。此外，杂合肽1-4具有较长的镇痛持续时间，可持续至少50min以上，这表明杂合肽具有高效的中枢镇痛活性。另外，外周给药的镇痛实验结果如图5所示，通过皮下注射10μmol/kg剂量的杂合肽3和4，结果发现杂合肽3和4仍然具有高效的镇痛活性。杂合肽3和4的最大镇痛效果在注射药物15min后产生，其最大镇痛％MPE值分别为85.16％和81.78％。在给药后90min测定杂合肽3和4的镇痛％MPE值仍能达到31.68％和28.26％，表明外周注射杂合肽3和4的镇痛持续时间可达到90min以上，即杂合肽3和4的镇痛持续时间较长。上述结果表明多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的新型环化杂合肽显著增强了药物的镇痛活性和持续时间，具备了高效镇痛活性的特点。
3、急性耐受实验
实验选取昆明系雄性小鼠，18-22g，环境温度：20℃。利用PE-10插管对小鼠侧脑室埋管，手术后3天给药。根据杂合肽的镇痛活性，确定药物剂量，测定急性镇痛耐受。小鼠提前1小时侧脑室注射药物或生理盐水1次，之后分别注射不同剂量的药物，测定疼痛阈值变化，进而对杂合肽进行镇痛耐受评估，通过***作为阳性对照。
中枢注射***、杂合肽3和4的镇痛耐受结果如图6、7和8所示，提前1小时对小鼠侧脑室注射生理盐水，之后侧脑室注射0.3-10nmol不同剂量的***、杂合肽3和4均产生明显的镇痛效果，且呈浓度依赖型特点，表明对小鼠提前注射生理盐水并不影响***、杂合肽3和4等镇痛药物的活性。然而，通过提前1小时侧脑室注射10nmol剂量的***，之后再注射0.3-10nmol不同剂量的相对应药物***，其药物镇痛剂量曲线明显右移，中枢镇痛活性显著降低，即***产生了明显的药物镇痛耐受。但是，提前1小时侧脑室注射10nmol剂量的杂合肽3，再注射0.3-10nmol不同剂量的杂合肽3，其镇痛剂量曲线与提前注射生理盐水的镇痛剂量曲线几乎重合，并没有产生明显的左移或者右移。该结果表明提前注射杂合肽3对第二次急性注射杂合肽3的镇痛活性几乎没有影响，表明杂合肽3具有无耐受副作用的镇痛特性。此外，提前1小时侧脑室注射10nmol剂量的杂合肽4，再注射0.3-10nmol不同剂量的杂合肽4，其药物镇痛剂量曲线与***相比，右移程度较小，表明杂合肽4的镇痛耐受明显降低。以上结果表明，杂合肽3和4的药物镇痛耐受副作用显著降低，尤其杂合肽3具有无耐受的高效镇痛特性。
4、抗神经性疼痛实验
通过小鼠坐骨神经分支选择损伤的方法稳定建立神经病理性疼痛动物模型。实验选取昆明系雄性小鼠，20-25g，紧扎并切断小鼠一侧的坐骨神经末端三分支的其中两支，即胫神经和腓总神经分支，保留腓肠神经分支。术后24小时开始出现持续性的疼痛，持续时间达7周以上，即诱导了稳定的神经性疼痛动物模型。通过Von Frey纤维测定机械痛阈，研究中枢注射药物的抗神经性疼痛活性。
中枢注射杂合肽3和4的抗神经性疼痛作用结果如图9和10所示，侧脑室注射1-10nmol的杂合肽3和4剂量依赖的引起缩足反应阈值升高，证明杂合肽3和4具有明显的抗神经性疼痛活性。杂合肽3和4的最大镇痛效果均在注射药物10min后产生，且镇痛持续时间较长，可持续至少40min，表明杂合肽3和4对神经病理学疼痛具有高效的镇痛活性。
5、在体大鼠血压实验
采用Wistar大鼠，200-300g，用20％的氨基甲酸乙酯麻醉(l.2g/kg,i.p.)，为了保持麻醉状态良好，可能需要临时补加***物。切开大鼠的气管，清除管内粘液，动物能自主呼吸。PE-50导管***到颈外静脉以备静脉给药，PE-50导管***颈大动脉，并与YP-100压力传感器相连，记录给药后血压的变化。***动脉压和心率数据主要通过成都泰盟BL-420F生物记录***平均化处理获得。药物静脉每次注射100μL，10～15秒内注射完成。
***、杂合肽3和4对大鼠心血管作用的实验结果如图11和12所示(图11和12中表示***，表示杂合肽3，表示杂合肽4)，静脉注射1-10nmol剂量的***、杂合肽3和4显著降低大鼠***动脉血压，并且呈剂量依赖型。然而所有浓度下杂合肽3和4降低动脉血压的效果明显低于对应浓度下的***。此外，静脉注射1-10nmol剂量的***、杂合肽3和4剂量依赖的降低大鼠的心率。与***动脉压类似，所有浓度下杂合肽3和4对大鼠心率降低的效果明显低于对应浓度下的***。该结果表明，杂合肽3和4对在体心血管***的作用效果明显低于***，即具有较低的心血管副作用的优点。
综上所述，本发明多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽，是将甲硫氨酸/亮氨酸脑啡肽的氨基酸序列“Tyr-Gly-Gly-Phe-Met/Leu”通过多位点修饰与环化得到“Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)”和“Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)”氨基酸残基序列，将神经降压素(8-13)的氨基酸序列“Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu”通过多位点修饰得到“NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu”氨基酸残基序列，利用中间连接子“Gly”或“D-Ala”将两部分氨基酸残基序列相偶联，构建一种新型高效的杂合肽。将杂合肽的甲硫氨酸/亮氨酸脑啡肽与神经降压素(8-13)的修饰序列中间加入小分子氨基酸连接子“Gly”或“D-Ala”，可以提高杂合肽的柔性构象，保留甲硫氨酸/亮氨酸脑啡肽与神经降压素(8-13)两部分修饰序列的生物活性。通过多位点非天然氨基酸修饰，空间连接子“D-Ala”的引入以及多肽环化能够显著增强杂合肽的抗酶解能力。而且，杂合肽中的神经降压素(8-13)部分能够降低阿片类药物的镇痛耐受和心血管等不良副作用，解决现有阿片类药物的抗酶解能力较差，镇痛活性较低和持续时间较短，抗神经性疼痛效果不佳，及具有镇痛耐受和心血管***副作用的问题。
通过离体生物稳定性实验，镇痛与急性耐受实验，抗神经病理性疼痛活性实验以及在体血压实验，对本发明合成的杂合肽进行药理学活性鉴定。结果表明，本发明的杂合肽具有较高的抗酶解能力。通过中枢给药，杂合肽1-4在热甩尾实验中都具有高效的镇痛活性。而且，杂合肽3和4具有外周给药的高效镇痛效果，及显著的抗神经性疼痛活性。此外，杂合肽3和4的药物镇痛耐受副作用显著降低，尤其杂合肽3具有无镇痛耐受特性，且其对心血管***的副作用也明显降低。因此，本发明的杂合肽在制备高效、低镇痛耐受和心血管副作用的多肽镇痛药物方面具有潜在的应用价值。

Claims (10)

1.多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽，其特征在于该杂合肽为杂合肽1、杂合肽2、杂合肽3或杂合肽4；
其中杂合肽1的氨基酸序列为：
Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；
杂合肽2的氨基酸序列为：
Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；
杂合肽3的氨基酸序列为：
Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)-D-Ala-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；
杂合肽4的氨基酸序列为：
Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)-D-Ala-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu。
2.如权利要求1所述的多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽的合成方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：检查固相合成仪的气密性，将带有一个氨基酸残基的Fmoc-Leu-Wang树脂放入合成仪，加二氯甲烷搅拌30～40min，使树脂充分浸泡溶胀后，减压抽滤溶剂；其中带有一个氨基酸残基的Fmoc-Leu-Wang树脂的质量与二氯甲烷的体积比为1g：(7～12)mL；
二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3～5min，抽干，重复3～5次，然后在树脂中加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5～10min后抽干，重复2～3次，再加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15～20min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂，最后用DMF洗涤除净脱保护溶液，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂；其中树脂的质量与第一次加入的脱保护溶液的体积比为1g：(8～12)mL；树脂的质量与第二次加入的脱保护溶液的体积比为1g：(10～14)mL；
三、氨基酸缩合反应：依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于DMF中，再加入二异丙基乙胺后混匀得混合溶液，然后将混合溶液加入到步骤二脱除“Fmoc”保护基团的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60～72min；
通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体；
四、肽链的延长：重复步骤二和三，按照杂合肽氨基酸序列的顺序，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂；其中杂合肽1的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；杂合肽2的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；杂合肽3的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Met-Cys)-D-Ala-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；杂合肽4的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Cys)-D-Ala-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；
五、二硫键的形成：称取I2溶于无水甲醇和DMF混合液中，配成I2溶液，并将I2溶液加入到肽树脂中，通入氩气保护，避光搅拌反应3～5小时成环，抽干反应液；其中混合溶液中无水甲醇和DMF的体积比为4：1，I2的质量与混合溶液的体积比为2.6g：100mL，I2溶液与肽树脂的体积比为100mL：1g；
六、肽链从树脂上的切割：将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除，然后用二氯甲烷和甲醇交替洗涤肽树脂，充分抽干溶剂后，向肽树脂中加入切割试剂，于室温下切割反应3～5h；
收集切割试剂并减压旋干，用冰冷***析出沉淀，静置后去除***上清，再用水及乙酸充分溶解沉淀，倒入分液漏斗，并加入乙酸乙酯萃取，收集水相，经冷冻干燥，得白色的固体粉末粗肽；
七、粗肽的脱盐与纯化：以体积浓度10％-20％的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的多肽化合物，再通过反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的固体粉末纯肽。
3.根据权利要求2所述的多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽的合成方法，其特征在于：步骤三中“Fmoc”基团保护的氨基酸的摩尔量为Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔量的2.5-3倍。
4.根据权利要求2或3所述的多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽的合成方法，其特征在于：步骤三中N-羟基苯并三氮唑的摩尔量为Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔量的2.5-3倍。
5.根据权利要求4所述的多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽的合成方法，其特征在于：步骤三中O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的2.5-3倍。
6.根据权利要求5所述的多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽的合成方法，其特征在于：步骤三中二异丙基乙胺的摩尔量为Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔量的5-6倍。
7.根据权利要求6所述的多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽的合成方法，其特征在于：步骤六中每克肽树脂加入10-25mL的切割试剂。
8.根据权利要求7所述的多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽的合成方法，其特征在于：步骤六中所述切割试剂由三氟乙酸、二异丙基硅烷和水按照体积比95：2.5：2.5混合而成。
9.根据权利要求8所述的多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽的合成方法，其特征在于：步骤六中将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除的具体方法为：
将肽树脂用DMF洗涤3～5min，抽干，重复3～5次，然后在树脂中加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5～10min后抽干，重复2～3次，再加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15～20min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂，最后用DMF洗涤除净脱保护溶液，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂。
10.多位点修饰的脑啡肽与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽在制备抗神经性疼痛药物中的应用。
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